Importancia de la Biologa Molecular en el Estudio de las Enfermedades Infecciosas del Sistema

Nervioso Central:

FUNDAMENTO DE LA PCR:

El estudio etiolgico de las infecciones del sistema nervioso central se ha realizado

tradicionalmente con cultivos bacterianos. Los cultivos bacterianos pueden disminuir su
rendimiento en pacientes que hayan usado antibiticos previos a la toma de muestra. La adicin
de la PCR a los mtodos microbiolgicos convencionales de diagnstico en las infecciones del
sistema nervioso central aumenta significativamente la probabilidad de detectar el agente causal.
La incorporacin rutinaria del diagnstico molecular permitira un manejo ms oportuno y
racional.

Actualmente sabemos que la misin de la PCR es copiar millones de veces una secuencia especfica
de ADN blanco mediante una poderosa catlisis llevada a cabo por una enzima conocida como
ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeas de ADN pueden ser sintetizadas y
copiadas fielmente.

Fundamentos: Qu es la PCR?

La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia especfica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada fielmente. Para ello, la reaccin aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En la reaccin,
si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le
conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en ingls). Esta conversin se logra
mediante una reaccin conocida como transcripcin reversa y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este mtodo fue
copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en
ADN duplicarse en millones de partculas virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la
expresin del ARNm de algn gen de inters.

Los elementos importantes en la reaccin son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los
oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina,
citosina y guanina), el in magnesio (Mg +), una solucin amortiguadora o buffer y H2O. Todos
estos elementos interactan en tres etapas principales de las que se compone la PCR:
desnaturalizacin, hibridacin y extensin. Los equipos en donde se realiza la reaccin son
llamados termocicladores, los cuales estn diseados para establecer un sistema homogneo en
donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los
ciclos. Al final de la reaccin, para corroborar si se amplific la secuencia blanco de inters, los
productos de la PCR o tambin llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para
confirmar si la reaccin fue exitosa. A continuacin se explicarn cada uno de los puntos
mencionados.
Qu elementos qumicos se necesitan?

El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza qumica ofrece ventajas para su
manipulacin. Para entrar en contexto, es importante recordar que la molcula de ADN est
formada por tres componentes: un azcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada (adenina, timina, guanina o citosina) que es complementaria con la base de otra
cadena (Figura 1), de tal forma, que el ADN se estructura en una doble hlice.3 La
complementariedad entre las bases est dada por puentes de hidrgeno e interacciones
hidrofbicas, generando estabilidad a la doble hlice, la carga elctrica del ADN es negativa y est
dada por los grupos fosfatos. En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y
funcionan como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia
blanco de inters. Por su parte, la ADN polimerasa se encarga de la catlisis de la reaccin,
sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima ms usada con
frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4 que proviene de una bacteria termfila llamada
Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN
polimerasa es capaz de soportar ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue a esta enzima
bacteriana de otras ADN polimerasas de otros organismos es su capacidad para mantener su
funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se le considera una enzima termoestable. Tambin
hay otras enzimas que se utilizan como la Vent, obtenida de la bacteria Thermococcus litoralis. 5
Normalmente, casi todas las enzimas que se venden comercialmente son eficientes y
generalmente cuando fallan lo hacen por una manipulacin incorrecta del usuario. Para que la
enzima funcione con alta especificidad y la reaccin transcurra exitosamente, tambin se necesita
de los elementos ya mencionados como primers, dNTPs, Mg +, buffer y H2O.

Los primers son secuencias de oligonucletidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que
se desea amplificar y son complementarios a sta. Generalmente su tamao oscila entre 15-25
pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser ms del 55% de la secuencia. Si no se respetan
estas reglas, existe la posibilidad de la formacin de dmeros de primers, es decir, de productos
inespecficos. Esto repercutira en el rendimiento de la reaccin, as como en la especificidad del
producto esperado. Son dos secuencias diferentes de primers las que se utilizan en la PCR, una
denominada forward o sentido y otra reward o antisentido; ambas deben estar diseadas
para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq
polimerasa en direccin 5-3 (como sucede endgenamente). Con la finalidad de garantizar la
formacin de un complejo estable entre el templado y los primers, hoy en da existen programas
informticos para disear primers con alta especificidad, por lo que se evita la formacin de
productos inesperados. Incluso, hay laboratorios de biologa molecular que se dedican a
disearlos, sintetizarlos y validarlos para garantizar su especificidad, facilitndole el trabajo al
usuario que slo elige el de su inters y los manda a comprar. Por su parte, los dNTPs son los
ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN.
Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reaccin, por ello es importante
que su concentracin sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la funcin de la Taq
polimerasa. Normalmente, se utilizan a una concentracin que oscila entre 0.2 a 1.0 mM. El buffer
es la solucin amortiguadora que se usa en la reaccin y generalmente est compuesta de Tris-
HCL (pH = 8) cuya concentracin final de trabajo debe ser 1X. Tambin se usan otros buffers de
composicin distinta que son fcilmente comprados en el mercado. El magnesio es un cofactor
enzimtico que influye en la especificidad de la reaccin, por eso se debe tener una concentracin
adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su concentracin
oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que
agregar. El agua es el disolvente en la reaccin y se usa en su forma destilada libre de nucleasas,
enzimas que degradan a los cidos nucleicos.

Cmo funciona la reaccin?

Recordemos que cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalizacin,
hibridacin y extensin (Figura 2). A continuacin explicaremos qu sucede en cada una.
Desnaturalizacin. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado,
es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser necesario ms tiempo para romper sus uniones debido a
que el apareamiento de estas bases est formado por tres enlaces, uno ms que las bases de A-T.
Adems, depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto vara
de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que
servirn como templado para el siguiente paso.

Hibridacin. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-
primers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura melting (Tm) sea la
ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el correcto y la
temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo ser eficiente.

Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y empieza
su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios para crear las
cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la sntesis del ADN, es
decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya que a esa temperatura la
enzima es funcional. Al fi nal del ciclo, se habrn formado los amplicones con un tamao dictado
por el nmero total de pares de bases (pb) que deber ser conocido por el investigador.
PCR multiplex

En esta modificacin de la PCR se incluyen dentro de la misma reaccin de amplificacin mltiples

pares de cebadores especficos para diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificacin
de diferentes dianas.

Esta modificacin tiene las siguientes ventajas:

se pueden testear grandes regiones de una nica secuencia de ADN en busca de alteraciones o
modificaciones.

se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana.

se pueden incluir controles internos de amplificacin de la muestra.

se puede testear una misma muestra contra diferentes patgenos.

Kits de alcance comercial para realizar PCR Mltiple estn disponibles y son utilizados por muchos
laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradadas. En el campo de las
enfermedades infecciosas, esta tcnica ha demostrado ser un mtodo valioso para la
identificacin de virus, bacterias, hongos, y parsitos

Real time-PCR o PCR en tiempo real

Los procesos de amplificacin y deteccin se producen simultneamente.

Disminucin del riesgo de contaminacin.

 Por deteccin fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en cada momento
durante la amplificacin .

Posibilidad de cuantificacin

La emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de ADN

formado.

Los sistemas de deteccin por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos
tipos:

Agentes intercalantes: fluorocromos que aumentan la emisin de fluorescencia al unirse al ADN

de doble hlice. Baja especificidad.

Sondas de hibridacin especficas: sondas marcadas con 2 fluorocromos (un donador y un

aceptor) y el fenmeno de Transferencia de energa fluorescente mediante resonancia (FRET).

del mismo modo que la PCR convencional (punto final), un molde de ADN, al menos un par de
cebadores especficos, dNTPs, un tampn de reaccin adecuado, y una ADN polimerasa
termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorforo que, en un
termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorforo a la
longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generacin de uno o ms productos
especficos.1 Dicha medicin, se realiza luego de cada ciclo de amplificacin y es por esto que
tambin se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultnea). En muchos
casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que
puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripcin de
cido ribonucleico (ARN); en este caso, la tcnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o
RT-Q-PCR

PCR en tiempo real es la recoleccin continua de seal fluorescente de

una o ms reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) en un intervalo de

ciclo de amplificacin.

PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) es la conversin de las seales

fluorescentes de cada reaccin en un valor numrico para cada muestra.

Nested-PCR o PCR anidada

Ventajas:
 Mejor sensibilidad.

Se puede detectar una sola copia de

la diana sin necesidad de hibridar

con sondas marcadas.

Mejor especificidad.

La re-amplificacin con el par de cebadores internos sirve para verificar la especificidad de la

primera ronda de amplificacin.

RT-PCR

En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una
enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante
una PCR tradicional

La amplificacin exponencial mediante PCR en transcripcin reversa supone una tcnica altamente
sensible, que puede detectar un nmero de copias de ARN muy bajo.

Los principales usos de la RT-PCR estn relacionados con el campo del diagnstico molecular y con
la investigacin cientfica. Puede utilizarse como mtodo de deteccin molecular de genes, para
estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por ejemplo, el VIH) o el virus de la gripe

Extraccin de RNA n

El RNA se extrajo con isotiocianato de guanidina

y fenol, de acuerdo con el procedimiento descrito por

Chomczynski.23 Las concentraciones de RNA de todos

los extractos se determinaron por fotometra.

Las muestras se almacenaron a -70 C.

1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORTICA

Polisacrido extrado de algas.

Electroforesis rpida, pero con una resolucin limitada.

Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su
concentracin.

Un fragmento de ADN migra a

diferentes velocidades a travs de

los geles segn la concentracin

de agarosa.

AGAROSA

Cmo se analiza el producto de amplificacin?

Al final de la PCR, para saber si la reaccin transcurri eficientemente, los amplicones son
visualizados a travs de una electroforesis en geles de agarosa.6 La electroforesis consiste en la
separacin de grandes molculas como los cidos nucleicos a travs de una matriz slida que
funciona como un filtro para separar las molculas en un campo elctrico de acuerdo a su tamao
y carga elctrica. Esta separacin se hace bajo un buffer o tampn que puede ser TAE o TBE. En el
caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por lo que durante
la electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se prepara un gel diluyendo una cantidad
de agarosa en el buffer, se calienta hasta que la agarosa hierva lo suficiente y posteriormente se
vaca a un recipiente que sirve de base para que solidifique. Generalmente el porcentaje al que se
prepara el gel es al 1.2% aunque, dependiendo del tamao de las molculas, puede ser de hasta el
2%. Otro ingrediente que se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una
molcula intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV
emite una seal que permite la visualizacin de los amplicones en forma de bandas. Es importante
manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es mutagnico y teratgeno.

Cuando los amplicones son corridos en el gel, stos deben ser cargados junto con un marcador
molecular que contenga un nmero determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita
la identifi cacin de los amplicones y si su tamao corresponde con el esperado. El tamao est
dado por el nmero de pares de pases del amplicn. El marcador de peso molecular es fcilmente
adquirido en el mercado, ya que se ofrece una gama de marcadores con distintos pesos
moleculares para elegir el de nuestro inters. Finalmente, la visualizacin de los amplicones se
lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV (Figura 3);
adicionalmente un procesador de imgenes se encarga de analizar las bandas observadas.

La combinacin adecuada de todos los elementos qumicos mencionados hacen posible la sntesis
in vitro del ADN utilizando la PCR. Los cambios que ha sufrido la PCR como plataforma tecnolgica
han sido muy notables; conforme los paradigmas de estudio de los cidos nucleicos han ido
cambiando, la necesidad de ir mejorando la tcnica se convirti en una prioridad para los
investigadores; es por ello que la PCR ha sufrido modificaciones para ofrecer una tecnologa ms
innovadora apegada a los retos inherentes que implica el estudio del ADN. Actualmente, el
panorama de la PCR promete estar a la altura de los objetivos de los investigadores, tan es as que
ahora la modalidad de la PCR en tiempo real ofrece la gran ventaja de usar un sistema
cuantitativo.

Los casos de meningitis tuberculosa (TBC) o meningitis micticas son difciles de diagnosticar por
cultivo o en el extendido. Son positivos entre 52 a 83% de los casos de meningitis TBC y en 75% de
los casos de criptococosis menngea. La sensibilidad y especificidad de los cultivos en estos dos
grmenes se aumenta hasta en 87% con cultivos repetidos y con grandes volmenes (hasta 25 ml)
de LCR.

Las pruebas de ltex para identificacin de antgenos de los grmenes son rpidas requiriendo
entre 10 a 15 minutos para realizarlas y sin un entrenamiento riguroso. (La sensibilidad y
especificidad de algunas de las pruebas se muestra en la Tabla 3). Adems tienen la ventaja de
tener pocos falsos positivos. Por ejemplo, para criptococo puede haber falsos positivos ante la
presencia de factor reumatoideo. En el caso de meningitis por Histoplasma capsulatum, las
pruebas son muy sensibles pero la especificidad es baja por tener reactividad cruzada con
criptococo, candida y Coccidiodes inmitis.

La PCR es la prueba ms til para el diagnstico de meningitis y encefalitis viral.

Adems tiene la ventaja de cuantificar el cido nucleico en las muestras de LCR con lo cual se
puede determinar la progresin de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. La prueba se
fundamenta en realizar mediante un sistema trmico cclico una copia y amplificacin de hasta un
milln de veces del contenido de ADN del germen presente en el LCR. El resultado final puede
estar en un trmino de dos das la mayora de las veces, pero en laboratorios experimentados
puede tardar solo unas seis horas. La sensibilidad y especificidad de la PCR para los virus ms
frecuentemente involucrados en infeccin del sistema nervioso se muestra en la Tabla 4.

En los casos de meningitis TBC los resultados de sensibilidad para la PCR en diferentes estudios
han sido variables (entre 54-100%) y la especificidad entre 89-100%. Sin embargo hay evidencia
consistente de que la PCR es ms sensible que el examen microscpico y el cultivo para TBC.

La adenosin deaminasa (ADA) es una enzima que est asociada con enfermedades que producen
una respuesta inmunolgica celular; es de mucha ayuda para el diagnstico de meningitis TBC. Sin
embargo, pueden observarse resultados positivos de esta prueba en linfomas con compromiso
menngeo, sarcoidosis, neurobrucelosis y hemorragia subaracnoidea. Tambin puede haber falsos
negativos. Los diferentes estudios muestran una sensibilidad y especificidad para el diagnstico de
90% con ttulos mayores de 10 unidades internacionales por litro (UI/L) siendo los ttulos de corte
entre 5-10 UI/L. Los resultados de la ADA pueden elevarse en las dos primeras semanas de
tratamiento.

La utilizacin de la biologa molecular representa una alternativa de eleccin para el

sistema de salud nacional permitiendo perfeccionar el diagnstico y los estudios epidemiolgicos
de las infecciones del SNC de etiologa no bacteriana, actualmente est siendo usa da en muchos
pases y abundan las citas bibliogrficas sobre el tema,

Sin embargo, a nivel nacional encontramos es casas publicaciones, por lo cual

consideramos de importancia este reporte que puede estimular el uso de esta tecnologa y una
aplicacin mas frecuente del mtodo a la prctica mdica.

Investigacin Clnica 47(4): 2006, 344 Zambrano y col. Maracay Estado Aragua.