IJPST [] Desember , 2016

Penetapan kadar flavonoid total ekstrak sebagai kuersetin dan penentuan

kadar kuersetin menggunakan metode spektrofotometri uv-vis
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang

Ayu Apriliani 078, Putri raraswati 079, Ummi habibah 080, Ayyu widyazmara 081
, Anggia Amaliah 082

Abstrak

Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang terbentuk melalui

jalur sikimat. Flavonoid berpotensi sebagai antioksidan dan mempunyai aktivitas
sebagai anti bakteri, anti inflamasi, anti alergi dan anti thrombosis Tujuan dari
praktikum ini adalah menentukan kadar flavonoid total ekstrak sebagai kuersetin dan
penetapan kadar kuersetin dengan menggunakan spektro uv-vis dan dan melakukan
parameter validasi metode. Metode spektrofotometri UV-Visible karena metode
ini menghasilkan sensitifitas yang tinggi, sehingga dapat digunakan untuk
mengetahui kandungan kuersetin dalam ekstak. Didapatkan kadar sampel
sambiloto yang sebesar 2,797 %. Melalui parameter validasi yang telah dilakukan
dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki akurasi yang kurang baik dengan
%R 1,7246%, presisi sedikit melebihi dengan nilai rsd 3,026 dan linieritasnya
baik yaitu 0,9912 serta stabilitas dengan nilai %difference kuersetin 1-2 jam =-
0,594 % , %difference kuersetin 1-3 jam = -2.335 % , %difference kuersetin 1-24
jam =-3,6%.

Kata kunci: flavonoid, spektrofotometri UV-Visible, validasi , kadar

1
IJPST [] Desember , 2016

Abstract

Flavonoids are secondary metabolite compounds formed through the path

of cyclic. Flavonoids are potent as antioxidants and have anti-bacterial, anti-
inflammatory, anti-allergic and anti-thrombotic activity. The objective of this lab
is to determine the total flavonoid content of the extract as quercetin and the
determination of quercetin levels by using spectro uv-vis and and perform method
validation parameters. UV-Visible spectrophotometric method because this
method produces high sensitivity, so it can be used to determine the quercetin
content in the extension. Sambiloto samples obtained amounted to 2.797%.
Through the validation parameters that have been done can be concluded that this
method has a poor accuracy with% R 1.7246%, the precision slightly exceeds the
value of rsd 3.026 and the linearity is good that is 0.9912 and stability with the
value of difference of quirtin 1-2 hours = -0.594%, quiftin quackin difference 1-3
hours = -2.335%,% difference quersetin 1-24 hours = -3.6 %

Keywords: flavonoids, UV-Visible spectrophotometry, validation, levels

2
IJPST [] Desember , 2016

I. Pendahuluan

Tujuan dari praktikum kali ini hubungan linieritas antara absorban

adalah melakukan validasi untuk dengan konsentrasi larutan analit dan
metode penentuan kadar kuersetin dalam berbanding terbalik dengan
ekstrak dengan Spektrofotometer UV- transmitan (Peshkova & Gromova,
Vis. Prinsip yang digunakan dalam 1961). 2
praktikum ini adalah kuersetin,
Flavonoid merupakan
validasi dan spektrofotometri UV-
senyawa metabolit sekunder yang
Vis.
terdapat pada tanaman hijau, kecuali
Kuersetin adalah senyawa alga dan hornwort . Flavonoid
golongan flavonoid jenis flavonol termasuk senyawa fenolik alam
dan flavon yang berkhasiat terbesar yang terdapat dalam hampir
diantaranya untuk mengobati semua tumbuhan. Dalam tumbuhan,
kerapuhan pembuluh kapiler pada aglikon flavonoid (flavonoid tanpa
1
manusia. gula terikat) terdapat dalam berbagai
bentuk struktur. Semuanya
Prinsip kerja spektrofotometri
mengandung 15 atom karbon dalam
UV-Vis adalah interaksi yang terjadi
inti dasarnya, yang tersusun dalam
antara energi yang berupa sinar
konfigurasi C6-C3-C6 yaitu dua
monokromatis dari sumber sinar
cincin aromatik yang dihubungkan
dengan materi yang berupa molekul.
oleh satuan tiga karbon yang dapat
Besar energi yang diserap
atau tidak dapat membentuk cincin
menyebabkan elektron tereksitasi
ketiga. 3
dari orbital dasar ke orbital yang
memiliki energi lebih tinggi.
Konsentrasi dari analit di dalam
larutan bisa ditentukan dengan
mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer. Gambar 1 Struktur Kimia
Hukum Lambert-Beer menyatakan Flavonoid

3
IJPST [] Desember , 2016

Quercetin merupakan flavanoid flavonoid dalam bentuk aglikon

yang banyak terdapat di alam. (flavonoid tunggal) sehingga kadar
Quercetin memiliki aktivitas sebagai kuersetin dalam bentuk aglikonnya
antioksidan dengan mencegah dapat dengan mudah ditentukan. 6
peroksidasi lemak dan memiliki Flavonoid dapat diukur
aktivitas sebagai antibakteri karena serapannya menggunakan
mampu berikatan dengan dengan spektrofotometri UV-Vis, untuk
DNA girase bakteri yang berperan menguji dalam spektrofotometri,
dalam replikasi DNA.4 flavonoid dilarutkan dengan
methanol atau etanol terlebih dahulu.
Flavonoid memiliki spectrum khas
pada rentang 230-295 nm (pita II)
dan pada 300-560 nm (pita I). 7
Dalam melakukan analisis
Gambar 2 Struktur Kimia
terhadap suatu senyawa perlu
Quercetin
dilakukan validasi metode analisis
Kuersetin adalah senyawa
terlebih dahulu untuk memastikan
flavonoid golongan aglikon flavonol
bahwa metode tersebut mampu
yang mempunyai aktivitas sebagai
menghasilkan data yang valid dan
antioksidan, antiinflamasi,
sesuai dengan tujuan . Parameter
antiplatelet, antineoplastik, antiviral
validasi metode analisis secara
dan antihistamin. 5
umum adalah :
Aglikon flavonoid merupakan
1. Kekhususan / selektivitas
flavonoid tunggal yang tidak
Parameter ini berkaitan dengan
mengandung gugus gula. Cara
sejauh mana zat lain mengganggu
memperoleh aglikon flavonoid ini
identifikasi atau analisis
dapat dialkukan dengn hidrolisis.
kuantifikasi analit. Ukuran dari
Hidrolisis berfungsi untuk
kemampuan metode untuk
menguraikan flavonoid dalam bentuk
mengidentifikasi atau mengukur
glikosida (flavonoid yang masih
analit. Kehadiran zat lain, baik
terikat dengan gugus gula) menjadi
endogen maupun eksogen, dalam

4
IJPST [] Desember , 2016

sampel matriks di bawah kondisi referensi yang diterima karena

yang dinyatakan metode ini. metode sistematis dan kesalahan
Kekhususan ditentukan dengan laboratorium. Akurasi biasanya
menambahkan bahan-bahan yang dinyatakan sebagai persentase
mungkin dihadapi dalam sampel. 6. Linearitas dan Range
2. Batas deteksi (LOD) Linieritas menggambarkan
Batas deteksi adalah jumlah hubungan yang linier antara
terkecil analit dalam sampel yang konsentrasi dan serapan sehingga
dapat dideteksi yang masih persamaan yang diperoleh dapat
memberikan respon signifikan dipergunakan untuk menghitung
dibandingkan dengan blangko. konsentrasi zat aktif dalam sampel
Batas deteksi merupakan yang diketahui serapannya.
parameter uji bata. Linearitas dan jangkauan kerja
3. Batas Kuantitasi (LOQ) (range) metode yang
Batas kuantitasi merupakan digambarkan sebagai linear ketika
parameter pada analisis renik dan ada berbanding lurus hubungan
diartikan sebagai kuantitas antara respon metode dan
terkecil analit dalam sampel yang konsentrasi analit dalam matriks
masih dapat memenuhi kriteria selama rentang konsentrasi analit
cermat dan seksama. (jangkauan kerja). Jangkauan
4. Presisi kerja yang telah ditetapkan oleh
Presisi adalah ukuran kedekatan tujuan metode dan mungkin
hasil analisis diperoleh dari mencerminkan hanya bagian dari
serangkaian pengukuran ulangan rentang linier penuh. Sebuah
dari ukuran yang sama. Hal ini koefisien korelasi yang tinggi
mencerminkan kesalahan acak (R2) dari 0,99 sering digunakan
yang terjadi dalam sebuah sebagai kriteria linearitas. Namun,
metode. ini tidak cukup untuk
5. Akurasi membuktikan bahwa hubungan
Akurasi adalah ukuran perbedaan linear ada, dan metode dengan
antara harapan hasil tes dan nilai koefisien determinasi kurang dari

5
IJPST [] Desember , 2016

0.99 mungkin masih cocok untuk Stabilitas. Validasi metode harus

tujuan . menunjukkan sejauh mana analit
7. Robustness yang stabil selama prosedur
Ketangguhan metode adalah analisis secara keseluruhan,
derajat ketertiruan hasil uji yang termasuk penyimpanan sebelum
diperoleh dari analisis sampel dan sesudah analisis. Secara
yang sama dalam berbagai kondisi umum, ini dilakukan dengan
uji normal, seperti laboratorium, memban-dingkan standar baru
analisis, instrumen, bahan disiapkan diketahui konsentrasi
pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dengan standar yang sama
dll. dipertahankan untuk periode
Ketangguhan biasanya dinyatakan waktu yang berbeda dan disimpan
sebagai tidak adanya pengaruh dalam berbagai kondisi. 8
perbedaan operasi atau
lingkungan kerja pada hasil uji.
Ketangguhan metode merupakan
ukuran ketertiruan pada kondisi
operasi normal antara lab dan
antar analis.
8. Stabilitas

II. Metode
Alat Bahan

Alat yang digunakan adalah Bahan yang digunakan

beaker glass, corong, labu ukur, adalahAlCl3, Buffer Asetat pH
neraca analitis,mikropipet, pipet 3,8, Ekstrak Sampel, Metanol,
tetes dan spektrofotometer UV- Ultra-pure water
Vis.

6
IJPST [] Desember , 2016

Pembuatan Larutan Preparasi Sampel

AlCl3 2% . Dimasukkan Ditimbang ekstrak pekat

sebanyak 10 gram sebanyak 200 mg. Dimasukkan
aluminium klorida ke ekstrak ke dalam labu alas bulat.
dalam labu ukur 100 mL. Ditambahkan larutan hidrolisis yaitu
Ditambahkan asam asetat heksametilentetramina 1 Ml 0,5%
5% dalam metanol 25 mL (b/v), 20 mL aseton, dan 2 mL HCl
ke dalam labu ukur . 25% (v/v). Dilakukan refluks pada
Dilakukan degassing bahan selama 30 menit. Disaring
selama 5 menit. campuran hasil hidrolisis
Ditambahkan asam asetat menggunakan kapas ke dalam labu
5% dalam metanol ke ukur 100 mL. Dilakukan refluks
dalam labu ukur sampai kembali pada residu degan 20 mL
tanda batas. aseton selama 30 menit. Disaring
Asam setat glasial 5%. hasil refluks ke-dua dan
Dimasukkan asam asetat mencampurkannya ke dalam fultrat
glasial 25 mL ke dalam dalam labu ukur 100 mL.
labu 500 mL . Ditambahkan aseton ke dalam
Ditambahkan metanol ke campuran filtrat sampai volume 100
dalam labu hingga tanda mL kemudian dikocok hingga
batas tercampur sempurna. Diambil
HCl 25%. Diambil HCl sebanyak 20 mL filtrat kemudian
12 N sebanyak 6,79 mL. memasukannya ke dalam corong
Ditambahkan air suling pisah. Ditambahkan akuades
sebanyak 3,9 mL. sebanyak 20 mL. Diekstraksi
Dikocok larutan hingga sebanyak tiga kali masing-masing
diperkirakan merata. dengan 15 mL etil asetat.
Dicampurkan fraksi etil asetat ke
dalam labu ukur 50 mL.

7
IJPST [] Desember , 2016

Ditambahkan etil asetat sampai Akurasi. Disiapkan larutan

volume labu. standar 80%, 100% dan 120% yaitu
11 12 dan 13 ppm. Ke dalam labu 10
Pengukuran kadar Total
ml ditambahkan maisng masing 4 ml
Flavonoid Content (TFC)
larutan sampel, 1ml alcl3 : 0.5 ml
Dipindahkan 10 mL fraksi etil asam asetat glasial serta 1 ml larutan
asetat ke dalam labu ukur 25 mL. standar kuersetindengan 3
Ditambahkan 1 mL larutan AlCl3 konsentrasi ( 11 12 13 ppm).
2%. Ditambahkan larutan asam Dihitung % recoverynya .
asetat glasial 5% (v/v) secukupnya
Presisi. Presisi dilakukan dengan
sampai tepat 25 mL. Disiapkan
larutan blangko dengan konsentrasi sama (100%) sebanyak 6
memindahkan 10 mL etil asetat dan kali replikasi. Dilakukan pengkuran
ditambahkan asam asetat glasial 5% pada larutan standar 13 ppm
(v/v) sampai tepat 25 mL. sebanyak 6 kali pengukuran
menggunakan spektrofotometro uv
Validasi Metode
vis pada panjang gelombang 425 nm.
Linearitas . Diambil larutan stok Dihitung nilai RSD nya
lalu diencerkan pada variasi
Stabilitas. Dilakukan
konsentrasi 11, 12 dan 13 ppm .
pengukuran kadar dengan
Diukur absorbansinya padapanjang
konsentrasi 100% yaitu 13 ppm pada
gelombang425 nm. Dibuatkurva
jam ke 1 2 3 serta 24 jam . Dihitung
kalibrasi kemudian dilihat hasil dari
konentrasi dari masing maisng jam
regresi linier (r2).
tersebut.

8
IJPST [] Desember , 2016

III. Hasil

Preparasi sampel

Tujuan : Hidrolisis glikosida kuersetin

No. Prosedur Hasil

1 Menimbang ekstrak pekat sebanyak 200 mg Didapatkan ekstrak

pekat dengan berat
tersebut

2 Memasukkan ekstrak ke dalam labu alas bulat Didapatkan ekstrak

dalam labu alas bulat

3 Menambahkan larutan hidrolisis yaitu Didapatkan campuran

heksametilentetramina 1 Ml 0,5% (b/v), 20 mL larutan dalam labu
aseton, dan 2 mL HCl 25% (v/v).

4 Melakukan refluks pada bahan selama 30 menit Terjadi pemisahan

komponen

5 Menyaring campuran hasil hidrolisis Hasil hidrolisis tersaring

menggunakan kapas ke dalam labu ukur 100
mL

6 Melakukan refluks kembali pada residu degan Terjadi pemisahan yang

20 mL aseton selama 30 menit lebih spesifik

7 Menyaring hasil refluks ke-dua dan Hasil hidrolisis tersaring

mencampurkannya ke dalam fultrat dalam labu
ukur 100 mL

8 Manambahkan aseton ke dalam campuran Didapatkan larutan yang

filtrat sampai volume 100 mL kemudian homogen
dikocok hingga tercampur sempurna

9 Mengambil sebanyak 20 mL filtrat kemudian Terdapat filtrat dalam

memasukannya ke dalam corong pisah corong pisah

9
IJPST [] Desember , 2016

10 Menambahkan akuades sebanyak 20 mL Didapatkan campuran

akuades dan filtrat

11 Mengekstraksi sebanyak tiga kali maisng- Didapatkan fraksi etil

masing dengan 15 mL etil asetat asetat

12 Mencampurkan fraksi etil asetat ke dalam labu Didapatkan campuran

ukur 50 mL fraksi etil asetat dalam
labu

13 Menambahkan etil asetat sampai volume labu Didapatkan fraksi semi

polar dimana terdapat
kuersetin didalamnya

Pengukuran kadar Total Flavonoid Content (TFC)

Tujuan : Mengukur kadar flavonoid dalam ekstrak sebagai kuersetin

No. Prosedur Hasil

1 Memindahkan 10 mL fraksi etil asetat ke Didapatkan fraksi etil

dalam labu ukur 25 mL asetat dalam labu ukur

2 Menambahkan 1 mL larutan AlCl3 2% Didapatkan campuran

fraksi dengan alumunium
klorida

3 Menambahkan larutan asam asetat glasial 5% Didapatkan campuran

(v/v) secukupnya sampai tepat 25 mL ketiga komponen

4 Menyiapkan larutan blangko dengan Didapatkan blanko tanpa

memindahkan 10 mL etil asetat dan sampel.
ditambahkan asam asetat glasial 5% (v/v)
sampai tepat 25 mL Didapatkan kadar 4.63%

Pembuatan kurva standar

No. Perlakuan Hasil

10
IJPST [] Desember , 2016

1. Ditimbang 10 mg baku standar kuersetin dan Didapatkan larutan stok

dilarutkan dalam 10 ml etanol (1000 ppm) kuersetin 1000 ppm

2. Dipiet 1 ml dan dilarutkan dalam 10 ml Larutan stok diencerkan

metanol (100 ppm).

3. Dibuat beberapa konsentrasu yaitu 11. 12 dan Didiapat pengenceran

13 ppm larutan stok engan
konsentrasi 11 12 13 ppm

4. Masing masing larutan ditambhkan 1 ml Alcl3 Didapatkan larutan stok

10%, 0,5 ml asam asetat dan di add dengan yang terkompleks dengan
etanol sampai 10 ml reagen

5. Didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar Larutan berubah menjadi

warna kuning cerah

6. Dibuat blanko dengan melarutkan 1 ml alcl3 Didapatkan blanko

10%, 0.5 ml asam asetat (pH 3.8) dan di add
dengan etanol sampai 10 ml

7. Diukur absorbansinya padapanjang Didapat absorbansi

gelombang425 nm larutan yaitu :

11 ppm ; 0.5317

12 ppm : 0.7277

13 ppm ; 0.8687

8. Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat hasil Didapatkan persamaan

dari regresi linier (r2) linear yaitu

y; 0.1685x-1.3127

r2: 0.9912

Validasi

Tujuan : Menentukan parameter validasi

11
IJPST [] Desember , 2016

Linearitas

No. Prosedur Hasil

1 Diambil larutan stok lalu diencerkan pada Didapatkan larutan

variasi konsentrasi 11 12 dan 13 ppm pengenceran 11 12 13
ppm

2 Diukur absorbansinya padapanjang Didapat absorbansi

gelombang425 nm larutan yaitu :

11 ppm ; 0.5317

12 ppm : 0.7277

13 pm ; 0.8687
3. Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat Didapatkan persamaan
hasil dari regresi linier (r2) linear yaitu

y; 0.1685x-1.3127

r2: 0.9912

Akurasi

No. Prosedur Hasil

1 Disiapkan larutan standar 80%, 100% dan Larutan kuersetin

120% yaitu 11 12 dan 13 ppm standar dengan
konsentrasi 11 12 13
ppm

2 Ke dalam abu10 ml ditambahkan maisng

masing 4 ml larutan sampel, 1 ml alcl3 :
0.5 ml asam asetat glasial serta 1 ml
larutan standar kuersetin dengan 3
konsentrasi ( 11 12 13 ppm)

3 Dihitung % recoverynya

Presisi

12
IJPST [] Desember , 2016

Presisi dilakukan dengan konsentrasi sama (100%) sebanyak 6 kali

replikasi

No. Prosedur Hasil

1 Dilakukan pengkuran pada larutan standar Didapatkan

13 ppm sebanyak 6 kali pengukuran absrobansinya yaitu :
menggunakan spektrofotometro uv vis
pada panjang gelombang 425 nm 0.5131

0.6272

0.5283

0.649

0.6263

0.658

2 Dihitung nilai RSD nya 3.0266646 %

Stabilitas

No. Prosedur Hasil

1 Dilakukan pengukuran kadar dengan Didapatkan absorbansi

konsentrasi 100% yaitu 13 ppm pada jam jam ke
ke 1 2 3 serta 24 jam

1: 0.7073

2 : 0.6568

3 : 0.5089

4 : 0.4014

13
 IJPST [] Desember , 2016

2 Dihitung konentrasi dari masing maisng Didapatkan konsentrasi

jam tersebut tpada jam tersebut

Linearitas

Konsentrasi A1 A2 A3 Rata-rata

11 0,5389 0,5303 0,5258 0,5317

12 0,7323 0,7293 0,7214 0,7277

13 0,873 0,8648 0,8682 0,8687

Linieritas Kuersetin Baku

1.0000
0.8000 y = 0.1685x - 1.3127
Absorbansi

0.6000 R = 0.9912

0.4000 Series1

0.2000 Linear (Series1)

0.0000
10 11 12 13 14
Konsentrasi

Presisi

Absorbansi
Absorbansi 1 Absorbansi 2 Absorbansi 3 rata2 Konsentrasi (Xi-Xav) (Xi-Xav)^2
0,514 0,5102 0,5152 0,513133333 10,83580613 -0,329541708 0,108597737
0,5275 0,5256 0,5285 0,5272 10,91928783 -0,246060007 0,060545527
0,5274 0,5305 0,527 0,5283 10,92581602 -0,239531817 0,057375491
0,6471 0,6495 0,6504 0,649 11,6421365 0,476788658 0,227327424
0,6288 0,6242 0,626 0,626333333 11,50761622 0,342268381 0,117147645
0,5648 0,5704 0,5688 0,568 11,16142433 -0,003923508 1,53939E-05
Sigma(Xi-
11,16534784 Xav)^2 0,571009218

14
IJPST [] Desember , 2016

SD 0,337937633
%RSD 3,02666462

Akurasi

1. C sampel : 7.855 ppm

2. C spike 15 ppm : 8.09 ppm

3. C standar :

115% 15 ppm : 11.8599

LOD LOQ

Standar Deviasi (SD) = 0,3379376

% RSD = 3,0266646

Slope = 0,1685

(3,3 X SD) (3,3 X 0,3379376 )

LOD = = = 6.618362493
SLOPE 0,1685

(10 X SD) (10 X 0,3379376 )

LOQ = = = 20.05564392
SLOPE 0,1685

Stabilitas

Jam ke- Absorbansi Rata-rata Konsentrasi (ppm)

1 0,7095 0,7071 0,7053 0,7073 8,49780

2 0,6579 0,6548 0,6577 0,6568 8,44730

3 0,5095 0,5084 0,5087 0,5089 8,29937

15
IJPST [] Desember , 2016

24 0,4004 0,4019 0,4019 0,4014 8,19190

Grafik konsentrasi kuersetin terhadap waktu

8.55000
8.50000
8.45000
8.40000
8.35000
8.30000
8.25000
8.20000
8.15000
0 5 10 15 20 25 30

%difference kuersetin 1-2 jam =-0,594 %

%difference kuersetin 1-3 jam = -2.335 %

%difference kuersetin 1-24 jam =-3,6

IV. Pembahasan

Praktikum ini bertujuan dalam ekstrak dilakukan terlebih

menentukan kadar flavonoid total dahulu tahap preparasi sampel.
ekstrak sebagai kuersetin dan penetapan Dihidrolisis ekstrak kental sambiloto
kadar kuersetin dengan menggunakan menggunakan asam yakni campuran
spektro uv-vis. Analisis kuantitatif heksametilentetramina 1 Ml 0,5%
menggunakan spektrofotometri UV- (b/v), 20 mL aseton, dan 2 mL HCl
Visible karena metode ini 25% (v/v). Tujuan dari hidrolisis
menghasilkan sensitifitas yang yaitu dalam tumbuhan flavonoid
tinggi, sehingga dapat digunakan berbentuk glikosida flavonoid
untuk mengetahui kandungan (flavonoid yang masih terikat dengan
kuersetin dalam ekstak. Sebelum gugus gula) Untuk menghitung kadar
dilakukan pengukuran kuersetin flavonoid total maka gugus gula yang

16
IJPST [] Desember , 2016

terikat pada flavonoid harus dengan C-3 atau C-5 gugus hidroksil
dihilangkan dengan cara hidrolisis dari flavon dan flavonol. Selain itu
menggunakan asam atau basa atau AlCl3 juga membentuk kompleks
dengan enzim. Pada saat melakukan asam yang labil dengan gugus orto
hidrolisis dilakukan metode refluks dihidroksil pada cincin A atau B dari
selama 30 menit untuk mempercepat flavonoid sehingga akan mempunyai
terjadinya pemisahan komponen. serapan maksimum.
Hasil refluks disaring untuk
Metode analisis biasanya
mengambil bagian residu (hasil
didasarkan pada literatur yang sudah
hidrolisis).
ada menggunakan instrumen yang
Hasil hidrolisis = aglikon sama atau hampir sama. Oleh karena
flavonol = sifatnya tidak larut dalam itu perlu dilakukan validasi metode
air sehingga digunakan aseton untuk diaawali dengan pembuatan kurva
melarutkannya. Aseton merupakan baku dan linearitas yang diperoleh
pelarut yang baik untuk melarutkan dengan cara membuat seri
flavonoid. Untuk mengambil konsentrasi 11 ppm, 12 ppm dan 13
kandungan kuersetin (semi polar) ppm sehingga diperoleh hasil
dalam aglikon flavonol maka absorbansi pada panjang gelombang
dilakukan proses ECC sebanyak 3 maksimum.
kali (triplo). Pelarut yg digunakan
Kurva baku merupakan kurva
adalah etil asetat (semi polar) dan air
yang diperoleh dengan cara
(polar). Fraksi etil asetat diambil dan
memplotkan nilai absorban dengan
digunakan untuk analisis
konsentrasi larutan standar yang
(mengandung kuersetin). Kemudian
bervariasi menggunakan panjang
fraksi etil 1 mL ditambahkan larutan
gelombang maksimum. Kurva ini
AlCl3 2% dan larutan asam asetat
merupakan hubungan antara
glasial 5% (v/v).Prinsip dari
absorbansi dengan konsentrasi. Bila
pewarnaan metode ini adalah AlCl3
hukum Lambert-beer terpenuhi maka
membentuk kompleks asam yang
kurva kalibrasi berupa garis lurus.
stabil dengan C-4 gugus keto, lalu
Pada pembuatan kurva baku ini

17
IJPST [] Desember , 2016

digunakan persamaan garis yang diperoleh dari hasil pengukuran

diperoleh dari metode kuadrat sehingga persamaan regresi linear
terkecil yaitu y = bx + a. Persamaan adalah y = 0,1685x 1,3127 dari
kurva baku merupakan hubungan persamaan ini akan menghasilkan
antara sumbu x dan sumbu y dimana koefisien korelasi (r). Adapun nilai
sumbu x dinyatakan dengan koefiesn korelasi yang diperoleh
konsentrasi yang diperoleh adalah 0,9912. Hasil penentuan
sedangkan sumbu y merupakan linearitas dari konsentrasi yang telah
absorbansi atau serapan yang dibuat dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Data Absorbansi Larutan Seri Kadar

Konsentrasi Rata-
A1 A2 A3
(ppm) rata

11 0,5389 0,5303 0,5258 0,5317

12 0,7323 0,7293 0,7214 0,7277

13 0,873 0,8648 0,8682 0,8687

Kurva larutan kuersetin dapat dilihat pada gambar 1.

Linieritas Kuersetin Baku

1.0000
0.8000
Absorbansi

y = 0.1685x - 1.3127
0.6000
R = 0.9912
0.4000 Series1
0.2000
Linear (Series1)
0.0000
10 11 12 13 14
Konsentrasi

Gambar 1. Kurva Baku Kuersetin

18
IJPST [] Desember , 2016

Harga koefisien korelasi (r) dalam sampel, yang masih bisa

yang belum mendekati 1 menyatakan dideteksi oleh instrumen. LOQ
hubungan yang belum linier antara (Limit of Quantification) atau
konsentrasi dengan serapan yang disebut pula batas kuantifikasi
dihasilkan karena nilai koefiesn merupakan parameter pada analisis
korelasi yang diperoleh hanya renik dan diartikan sebagai kuantitas
0,9912, dengan kata lain untuk terkecil analit dalam sampel yang
memperoleh koefisien korelasi (r) masih dapat memenuhi kriteria
yang mendekati 1, seharusnya terjadi cermat dan seksama (Riyanto, 2002).
peningkatan nilai absorbansi analit
Batas deteksi dan batas
yang berbanding lurus dengan
kuantifikasi ditentukan dari
peningkatan konsentrasi yang sesuai
persamaan regresi yang didapat dari
dengan kriteria penerimaan koefisien
besarnya nilai standar deviasi (SD)
korelasi yang telah memenuhi
dengan nilai slope yang diperoleh
persyaratan. Kurva kalibrasi harus
dari persamaan regresi pada
linier karena jika kurva kalibrasi
penentuan kurva baku atau linearitas.
sudah tidak linier maka kesalahan
Parameter ini ditentukan untuk
hasil dalam analisa uji
mengetahui jumlah terkecil analit
perbandingannya akan semakin
dalam sampel yang dapat dideteksi
besar.
yang masih memberikan respon
Setelah mendapatkan kurva signifikan. Kedua parameter ini
kalibrasi yang memenuhi pesyaratan, mempunyai nilai yang bergantung
selanjutnya data yang diperoleh dari pada metode dan instrumentasi yang
konsentrasi tiap analit yang digunakan.
memberikan absorbansi berbeda Untuk perhitungan LOD dan
untuk diolah untuk menentukan batas LOQ data blanko tidak menghasilkan
deteksi (LOD) dan batas kuantitas sinyal sehingga SD (standar deviasi)
(LOQ). LOD (Limit of Detection) dari blanko tersebut adalah nol maka
atau disebut pula batas deteksi SD diganti dari data larutan deret
merupakan jumlah analit terendah

19
IJPST [] Desember , 2016

standar dengan menggunakan artinya pada konsentrasi tersebut

rumusan : masih dapat dilakukan pengukuran
Batas deteksi dan batas kuantitas sampel yang memberikan hasil
dihitung dengan rumus sebagai ketelitian suatu alat berdasarkan
berikut : tingkat akurasi individual hasil
(3 X SD) analisis, sedangkan nilai LOQ yang
LOD =
SLOPE
diperoleh yaitu 20,053 ppm artinya
pada konsentrasi tersebut bila
(10 X SD)
LOQ = dilakukan pengukuran masih dapat
SLOPE
memberikan kecermatan analisis.
Pada penelitian ini diperoleh
nilai LOD yaitu 6,016 ppm yang
Tabel 2. Nilai LOD dan LOQ

Standar Deviasi (SD) 0,3379

%RSD 3,0266
Slope 0,1685
LOD (ppm) 6,016
LOQ (ppm) 20,053

Akurasi adalah ukuran Pengujian dilakukan dengan

perbedaan antara harapan hasil tes mem-bandingkan hasil analisis untuk
dan nilai referensi yang diterima sampel pada tiga konsentrasi
karena metode sistematis dan (Biasanya untuk mengendalikan
kesalahan laboratorium atau ukuran sampel yang digunakan untuk
yang menunjukkan derajat kedekatan mengevaluasi presisi dan akurasi).
hasil analis dengan kadar analit yang Recovery tidak harus 100%, namun
sebenarnya. Accuracy dinyatakan tingkat recovery (analit dan standar
sebagai persen perolehan kembali internal) harus konsisten (untuk
(recovery) analit yang ditambahkan. semua kon-sentrasi yang diuji). Pada
pengujian dilakukan hanya pada
konsentrasi 15 ppm. Konsetrasi

20
IJPST [] Desember , 2016

spiked 15 ppm yaitu 80% sedangkan Recovery dari suatu analit

pada konsentrasi baku 15 ppm yaitu adalah respon detector yang
115%. Hal ini dikarenakan diperoleh dari jumlah analit
kurangnya frekuensi pengukuran ditambahkan dan diekstrak dari
terhadap larutan spiked dan baku matriks, dibandingkan dengan respon
dengan titik persentase yang sama. detektor untuk konsentrasi baku dari
Hal lain yang dapat memengaruhi standar. Persen recovery (%R) yang
adalah Kriteria akurasi yang sangat didapat adalah 1.724671404 %.
tergantung pada konsentrasi analit Syarat keberterimaan akurasi adalah
dalam matriks sampel dan 98-102%. Hali ni dapat dikatakan
keseksamaan metode (RSD). bahwa metode validasi akurasi ini
Sehingga hal-hal tersebut tidak akurat yang dapat dilihat dari
menyebabkan hilangnya data pada nilai %R (persen recovery) yang
titik kesamaan tersebut yang sangat jauh dari nilai persyaratan.
berpengaruh terhadap hasil recovery.

Presisi atau keterulangan membuat larutan 13 ppm pada 6 labu

adalah ukuran kedekatan hasil yang dapat dilakukan dengan 2
analisis yang diperoleh dari macam metode yakni dapat
serangkaian pengukuran ulangan dari digunakan 1 konsentrasi dengan 6
ukuran yang sama (Riyanto, kali ulangan atau dengan
2002).Uji presisi yang dilakukan menggunakan 3 konsentrasi 3 kali
dalam penetapan kadar kuersetin ulangan, yang dapat pula dilakukan
dalam ektrak menggunakan secara interday (selama 3 hari)
Spektrofotmetri UV diawali dengan maupun intraday (selama 1 hari).

21
IJPST [] Desember , 2016

Untuk uji presisi yang digunakan Spektrofotometri UV-Visibel

dalam penelitian kali ini adalah uji merupakan metode spektrofotometri
presisi intraday yang menggunakan 1 yang didasarkan pada adanya serapan
konsentrasi dengan 6 kali sinar pada daerah ultraviolet (UV)
pengulangan lalu melakukan dan sinar tampak (Visibel) dari suatu
pengukuran pada setiap labu nya. senyawa. Senyawa dapat dianalisis
Lalu di dapat data absorbansi 0,5131; dengan metode ini jika memiliki
0,5272; 0,5283; 0,648; 0,6263 dan kemampuan menyerap pada daerah
0,658. UV atau daerah tampak. Senyawa
Presisi diukur sebagai yang dapat menyerap intensitas pada
simpangan baku atau simpangan daerah UV disebut dengan kromofor,
baku relatif (koefisien variasi) yang sedangkan untuk melakukan analisis
dapat ditentukan dari hasil AUC senyawa dalam daerah sinar tampak,
masing-masing larutan baku yang senyawa harus memiliki warna.
telah diuji. Hasil perhitungan Prinsip dasar Spektrofotometri UV-
menunjukan bahwa %RSD kuersetin Vis adalah analisis yang didasarkan
dalam ekstrak tersebut adalah 3,0266 pada pengukuran serapan sinar
%. Dalam persyaratan presisi monokromatis oleh suatu laju larutan
menyebutkan bahwa kriteria berwarna pada panjang gelombang
penerimaan %RSD adalah kurang spesifik dengan menggunkana
dari 2% sehingga dapat disimpulkan monokromator prisma atau kisi
bahwa untuk uji presisi kuersetin difraksi dengan detektor fotube.
tidak memenuhi persyaratan.
Untuk menentukan kadar
kuersetin dalam ekstrak sambiloto
Tujuan pada percobaan ini
yaitu fraksi etil asetat 10 mL
yaitu untuk menetapkan kadar
dipindahkan kedalam labu ukur 25
kuersetin secara spektrofotometri
mL untuk mendapatkan fraksi etil
UV-Vis menggunakan sampel
asetat, lalu ditambahkan 1 mL AlCl3
ekstrak samboloto. Kuersetin adalah
dan asam asetat glasial 5 % hingga
salah satu zat aktif kelas flavonoid
tepat 25 mL. Lalu membuat larutan
yang secara biologis amat kuat

22
IJPST [] Desember , 2016

blanko dengan menambah 10 mL etil sebesar 4,63 %. Lalu dihitung kadar

asetat dan asam asetat glasial hingga kuersetin dan didapat hasil sebagai
25 mL dan didapat kadar blanko berikut :

Didapat rata-rata kadar sebesar 2, dengan membandingkan standar baru

7979 %, kadar tersebut didapat disiapkan diketahui konsentrasi
setelah dikali faktor pengenceran dengan standar yang sama
3562 dengan persamaan linier yang dipertahankan untuk periode waktu
didapat y = 0,1685x-1,3127. yang berbeda dan disimpan dalam
Perrsayaratan kadar kuersetin dalam berbagai kondisi. Pada uji stabilitas
sambiloto yaitu 46,3 %, maka dapat quersetin kali ini dilakukan
disimpulkan kadar kuersetin dalam pembuatan larutan dnegan
ekstrak sambilot yang diukurkan konsentrasi 13 ppm pada konsentrasi
kurang dari persyaratan atau tidak 100%, dan dilakukan pengukuran
memenuhi syarat. pada jam ke 1, 2, 3, dan 24 jam.
Hasil yang didapat adalah dari data
Parameter validasi terakhir
tersbeut dapat dikatakan bahwa
yaitu pengujian stabilitas bertujuan
stabilitas kuersetin yang diuji tidak
untuk mengetahui kestabilan dari
stabil yang dapat dimatai dari
suatu analit. Kestabilan ini diamati
perolehan nilai kadar yang menurun
selama prosedur analisis secara
ditiap jamnnya (1, 2, 3, dan 24 jam).
keseluruhan, termasuk pada saat
Degradasi ini dapat saja terjadi
penyimpanan sebelum dan sesudah
karena beberapa faktor diantaranya
analisis. Secara umum, ini dilakukan
suhu penyipanan dan cahaya.

23
IJPST [] Desember , 2016

V. Kesimpulan

Penentuan kuersetin dalam ekstrak

sambiloto dapat dilakukan
DAFTAR PUSTAKA
menggunakan spektrofotometri UV-
Vis. Kadar sampel sambiloto yang 1. Yuliani, S. L Udarno & E.
didapat 2,797 %. Melalui parameter Hayani. 2003. Kadar Tanin
validasi yang telah dilakukan dapat dan Quersetin TigaTipe Daun
disimpulkan bahwa metode ini Jambu Biji (Psidium
memiliki akurasi yang kurang baik Guajava). Buletin Tanaman
dengan %R 1,7246%, presisi sedikit Rempah dan Obat. 14
melebihi dengan nilai rsd 3,026 dan (1):1724.
linieritasnya baik yaitu 0,9912 serta 2. Peshkova, V. M., &
stabilitas dengan nilai %difference Gromova, M. I. (1961).
kuersetin 1-2 jam =-0,594 % , Practical Handbook on
%difference kuersetin 1-3 jam = - Spectrophotometry and
2.335 % , %difference kuersetin 1-24 Colorimetry. Izd-vo MGU,
jam =-3,6 147.
3. Markham, K.R. 1988.
Techniques of Flavonoid

24
IJPST [] Desember , 2016

Identification. London : Hal 4Y7 : 69Y76, ITB.

Academic pr. Bandung.
4. Kawai Y, Nishikawa T, Shiba 7. Neldawati, Ratnawulan, &
Y, Saito S, et al. Macrophage Gusnedi. (2013). Analisis
as a Target of Quercetin Nilai Absorbansi dalam
Glucuronides in Human Penentuan Kadar Flavonoid
Atherosclerotic Arteries. The untuk Berbagai Jenis Daun
Journal of Biological Tanaman Obat. Pillar of
Chemistry. 2008; 283(14): Physics, 76-83.
9424-9434. 8. Riyanto. 2002. Validasi dan
5. Susan, P. 2003. Quercetin verifikasi metode uji. Sleman
Monograph. Pharm D 1-2. : Deepublish.
6. Harborne, J.B., 1996, Metode 9. Gandjar, I.G., dan Rohman,
Fitokimia Penuntun Cara A. 2007. Kimia Farmasi
Modern Menganalisis. Analisis. Yogyakarta :
Tumbuhan, Diterjemahkan Pustaka Pelajar.
oleh Kosasih Padmawinata
dan Imam Sudiro,. Edisi II,

25