Medida del crecimiento

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y
de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas
metodologas.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas
individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los
microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en
el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de
microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas

Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar

colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es
capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias
Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento
es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la
capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para
este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el
crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para
utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinacin de peso hmedo

Determinacin de peso seco
Determinacin de nitrgeno total
Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de
la biomasa.

Recuentos Directos

Recuento microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento
fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras
filtradas en membranas y transparentadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de
acridina).

La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad en el llenado de la

cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se
minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios
mnimos sin fuente de carbono).
Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la
ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos
se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es
brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

Camara de recuento de Petroff-Hausser

Area Volumen Factor

Tipo de cuadro
[cm2] [ml] [1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeo 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento.

Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se
utilizaron para contar un el nmero de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de
cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un
volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml)

Recuento electronico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias,

levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o
miceliares.

Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un

pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica
del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la
resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de
estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin
bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto,
en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo
compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula
es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y
contados.

Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas
producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia
que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen
filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el
pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula
ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente

como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o
qumico.

Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden
volverse complicados si se busca la exactitud.

Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la
separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes
volmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y

contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por
ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio
intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular.
Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el
espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no
inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden
atravesar las paredes bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en
una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso
constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del
orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

Determinacin de cidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la

masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido
nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin.

Determinacin de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa

de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno
que contiene una muestra con relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse
el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin
en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de
Kjeldahl.

Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar

indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un
compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se
determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.

Dispersin de la Luz

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es
reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide
la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un
decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y
al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin.

Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a
resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido
macromolecular).

Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas

de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de
bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad
de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del
microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por
UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son
diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de
microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de
calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar
Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.
 Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco
del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-
mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas
de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores
mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar
suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el
bajo nivel de absorcin.

Absorbancia en funcin del Peso Seco

 Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos

diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo nmero
de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta.

Bibliografa:

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=medida
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-
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