Anlisis inmunoinformtico de una vacuna

basada en eptopos contra la malaria

Integrantes: Pedro Hernndez

Matas Lpez
Profesor: Patricio Oyarzn
Fecha: 04/10/2017
 1. Introduccin
La malaria es una de las enfermedades con mayor incidencia en el mundo,
reconocida por la Organizacin Mundial de la Salud como un problema de salud
pblica que afecta a cerca de 90 pases.1 Se producen anualmente entre 300 y
500 millones de casos clnicos y mueren ms de 1 milln de personas. El 86 % de
la poblacin que muere son nios menores de 5 aos. 2 Esta enfermedad se ha
asociado a condiciones de zonas rurales, pero cuando los pobladores de los
centros urbanos contraan la enfermedad se relacionaba con la movilidad de estos
a los campos. Los continentes ms afectados son frica, Asia y las Amricas
estimando que cada ao la malaria le cuesta a frica 12 billones de dlares del
producto nacional bruto. La enfermedad ha reducido el crecimiento econmico en
1,3% cada ao, y como resultado de esto la prdida de vidas y una menor
productividad. 3
La transmisin es ms intensa en lugares donde los mosquitos tienen una vida
relativamente larga que permite que el parsito tenga tiempo para completar su
desarrollo en el interior de su organismo, y cuando el vector prefiere picar al ser
humano antes que a otros animales. Por ejemplo, la larga vida y la marcada
preferencia por los humanos que presentan las especies que actan como
vectores en frica, en el territorio subsahariano, son la principal causa de que ms
del 90% de los casos de esta enfermedad se registren en ese continente. La
transmisin tambin depende de condiciones climticas que pueden modificar el
nmero y la supervivencia de los mosquitos, como el rgimen de lluvias, la
temperatura y la humedad. En muchos lugares la transmisin es estacional y
alcanza su mxima intensidad durante la estacin lluviosa e inmediatamente
despus.
Se pueden producir epidemias del mosquito del gnero Anopheles cuando el clima
y otras condiciones favorecen sbitamente la transmisin en zonas donde la
poblacin tiene escasa o nula inmunidad, o cuando personas con escasa
inmunidad se desplazan a zonas con transmisin intensa, como ocurre con los
refugiados o los trabajadores migrantes.
La inmunidad humana es otro factor importante, especialmente entre los adultos
residentes en zonas que renen condiciones de transmisin moderada a intensa.
La inmunidad se desarrolla a lo largo de aos de exposicin y, a pesar de que
nunca proporciona una proteccin completa, reduce el riesgo de que la infeccin
cause enfermedad grave.
Es por ello que la mayora de las muertes registradas en frica corresponden a
nios pequeos, mientras que en zonas con menos transmisin y menor
inmunidad se encuentran en riesgo todos los grupos de edad.
La infeccin por malaria se inicia cuando un mosquito del gnero Anopheles
inyecta esporozoitos en la piel, lo que se conoce como transmisin vectorial, las
cuales abandonan el sitio de inyeccin infectando hepatocitos para posteriormente
diferenciarse en la etapa heptica. La superficie de los esporozoitos est
densamente llena de protenas, siendo la protena circunsporozoito (CSP) la ms
prominente 4. La protena CSP es secretada en la etapa de esporozotos del
parsito de la malaria Esta protena tiene una regin repetida, compuesta
principalmente por el eptopo dominante principal de clulas B de NANP y los
extremos amino (N) y carboxilo (C) que contienen varios eptopos de clulas T. 5
Una vacuna contra la malaria que previene la infeccin, reducira la morbilidad,
mortalidad y acelerara los esfuerzos de erradicacin de esta enfermedad. Los
principales enfoques para lograr este objetivo incluyen vacunas de subunidades
que atacan esporozoitos y parsitos en la etapa de la sangre y que bloquea la
transmisin de gametocitos a mosquitos.
La vacuna contra la malaria ms avanzada es la RTS,S / AS01, actualmente en
estudios clnicos fase 3 en pases como Burkina Faso, Ghana, Kenya y
Mozambique,vse dirige a la protena circunsporozoito (CSP) del Plasmodium
falciparum, y que se encarga de reducir moderadamente el riesgo de la malaria
clnica. Esta vacuna posee dos componentes denominados RTS y S, que se
obtuvieron por recombinacin del gen que codifica para la protena CSP, derivada
de una seccin de la regin C-terminal, a travs de la cual se une al extremo
amno del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B. La vacuna fue
preparada para las variante falciparum y vivax, que son los ms letales. La vacuna
reduce en un 50% la mortandad en neonatos de 4 a 13 meses, y en un 30% en
neonatos menores a ese rango, se aplican 4 vacunas a las cuales se les debe,
despus de cierto tiempo, una de refuerzo. Si bien la vacuna no tiene un gran
rango de efectividad, debido a la cantidad de muertes generadas por la patologa,
las autoridades se refieren a mosquirix (RTS,S) como un gran avance, en
comparacin con otras vacunas desarrolladas contra la malaria. 5
 2. Metodologa

2.1 Determinacin de la secuencia proteica

Mediante el servidor del programa nacional de informacin biotecnolgica

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), se busc y se obtuvo la secuencia de aminocidos
de la protena circunsporozotica de la cepa P. falciparum, con cdigo de acceso
P08307en el servidor Uniprot, que debido a ser una protena superficial,
presentara una mayor actividad antignica.

2.2 Anlisis poblacional

Por medio del servidor http://www.allelefrequencies.net/ , se determinaron los

alelos de los genes HLA clase I y clase II de los pases Burkina Faso, Ghana,
Kenya y Mozambique, del sector del subsahariano del continente africano que
presentaban una mayor frecuencia, los cuales adems fueron comparados con los
registrados en literatura.

2.3 Prediccin de eptopos de clulas T putativos

Con base en los genes HLA clase I y clase II con mayor frecuencia se realiz
predicciones de eptopos de clulas T utilizando el mtodo netMHCpan y
netMHCIIpan, programas para MHC I y MHC II respectivamente, disponibles en
los portales http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/ y
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/

2.4 Prediccin de eptopos putativos de clulas B

Se realiz la prediccin de eptopos de clulas B a travs de los programas que se
encuentran en el portal http://www.iedb.org. Se realiz la prediccin de eptopos
lineales a travs del programa Antibody Epitope Prediction, utilizando mtodo de
Chou y Fasman que predice los giros beta, el mtodo de Bepipred que predice la
ubicacin de los eptopos utilizando modelo de markov y el mtodo de
ParkerHydrophilicity. (Kringelum et al., 2012).
 3. Resultados

3.1 Seleccin de secuencias proteicas

La especie Plasmodium falciparum, a las cuales se le atribuyen una mayor

mortalidad, debido a su alta letalidad, la convierte en foco de las principales
investigaciones para el desarrollo de inmunizacin.
Para el anlisis desarrollado en esta investigacin se utilizaron la secuencia de
aminocidos:
>AAA29554.1 circumsporozoite protein [Plasmodium falciparum]
MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQENWYSLKKNSR
SLGENDDGDNDNGNNNNGNNNNGDNGREGKDEDKRDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPGDGNPDPNANPNVD
PNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPN
VDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNAN
PNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANNAVKN
NNNEEPSDKHIEQYLKKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSADKPKDQLDYENDIEKKICKMEKCS
SVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN
 3.2 Anlisis poblacional

Se obtuvo la frecuencia allica de los genes HLA clase I y II Dominantes la que se

describe en la tabla 1.
Tabla 1 Frecuencia allica, especificada por pas, del territorio sub-sahariano

Alelo Pas Frecuencia

A*01:01 Burkina Faso Fulani 0.1330

A*02:01 Burkina Faso Rimaibe 0.1380

A*29:02 Burkina Faso Fulani 0.1020

A*23:01 Burkina Faso Rimaibe 0.1700

B*35:01 Burkina Faso Rimaibe 0.1700

A*02:01 Ghana Ga-Adangbe 0.10687

A*01:01 Ghana Ga-Adangbe 0.02290

A*23:01 Ghana Ga-Adangbe 0.17557

B*35:01 Ghana Ga-Adangbe 0.06489

DRB1*03:01 Ghana Accre Asutuare Akan 0.0420

A*01:01 Kenya Nandi 0.1180

A*02:01 Kenya, Nyanza Province, Luo tribe 0.145000

A*29:02 Kenya, Nyanza Province, Luo tribe 0.050000

A*23:01 Kenya, Nyanza Province, Luo tribe 0.085000

DRB1*03:01 Kenya, Nyanza Province, Luo tribe 0.105000

A*01:01 Mozambique 0.0240

A*02:01 Mozambique 0.1510

A*23:01 Mozambique 0.1120

A*29:02 Mozambique 0.0990

DRB1*01:01 Mozambique 0.0510

DRB1*03:01 Mozambique 0.1810

 3.3 Prediccin de eptopos de clulas T putativos

Se obtuvo prediccin de eptopos de clulas T (citotxicos) y CD4+

(colaboradores) de los cuales se seleccion los que posean menor ranking y se
detallan en las tablas 2 a 9.
Tabla 2 Eptopos putativos para alelo DRB1_04:01

--------------------------------------------------------------------------------------------------
Seq Allele Core Core_Rel 1-log50k(aff) Affinity(nM) %Rank Exp_Bind BindingLevel
--------------------------------------------------------------------------------------------------
419 DRB1_04:01 FNVVNSSIG 0.810 0.632 53.85 1.20 NA <=SB
361 DRB1_04:01 LKKIQNSLS 0.900 0.624 58.52 1.40 NA <=SB
21 DRB1_04:01 YGSSSNTRV 0.800 0.568 106.75 4.00 NA <=WB
0 DRB1_04:01 KLAILSVSS 0.415 0.559 118.61 4.50 NA <=WB
19 DRB1_04:01 YQCYGSSSN 0.435 0.498 228.09 10.00 NA <=WB

Tabla 3 Eptopos putativos para alelo DRB1_0101

-----------------------------------------------------------------------------------------------------
Seq Allele Core Core_Rel 1-log50k(aff) Affinity(nM) %Rank Exp_Bind BindingLevel
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
361 DRB1_01:01 LKKIQNSLS 0.880 0.761 13.34 4.00 NA <=WB
0 DRB1_01:01 LAILSVSSF 0.250 0.752 14.60 5.00 NA <=WB
1 DRB1_01:01 ILSVSSFLF 0.285 0.746 15.62 5.00 NA <=WB
419 DRB1_01:01 FNVVNSSIG 0.780 0.745 15.72 5.50 NA <=WB

Tabla 4 Eptopos putativos para alelo DRB1_0301

--------------------------------------------------------------------------------------------------
Seq Allele Core Core_Rel 1-log50k(aff) Affinity(nM) %Rank Exp_Bind BindingLevel
--------------------------------------------------------------------------------------------------
60 DRB1_03:01 LKKNSRSLG 0.795 0.484 267.12 8.50 NA <=WB
 Tabla 5 Eptopos putativos para alelos HLA-A*02:01

-----------------------------------------------------------------------------------
Pos HLA Icore Identity Score %Rank BindLevel
-----------------------------------------------------------------------------------
364 HLA-A*02:01 YLKKIQNSL AAA29554_1_circ 0.5975240 0.3593 <= SB
431 HLA-A*02:01 GLIMVLSFL AAA29554_1_circ 0.3997290 0.7348 <= WB
6 HLA-A*02:01 AILSVSSFL AAA29554_1_circ 0.2630470 1.1679 <= WB

Tabla 6 Eptopos putativos para alelos HLA-A*01:01

-----------------------------------------------------------------------------------
Pos HLA Icore Identity Score %Rank BindLevel
-----------------------------------------------------------------------------------
356 HLA-A*01:01 PSDKHIEQY AAA29554_1_circ 0.9687060 0.0365 <= SB
15 HLA-A*01:01 FVEALFQEY AAA29554_1_circ 0.9630280 0.0428 <= SB
355 HLA-A*01:01 EPSDKHIEQY AAA29554_1_circ 0.9385480 0.0642 <= SB
354 HLA-A*01:01 EEPSDKHIEQY AAA29554_1_circ 0.8490730 0.1426 <= SB
48 HLA-A*01:01 YNELEMNYY AAA29554_1_circ 0.8186620 0.1634 <= SB
40 HLA-A*01:01 YDNAGTNLY AAA29554_1_circ 0.8011350 0.1750 <= SB
395 HLA-A*01:01 SADKPKDQLDY AAA29554_1_circ 0.7504050 0.2205 <= SB
357 HLA-A*01:01 SDKHIEQY AAA29554_1_circ 0.5609160 0.4132 <= SB

Tabla 7 Eptopos putativos para alelos HLA-A*29:02

-----------------------------------------------------------------------------------
Pos HLA Icore Identity Score %Rank BindLevel
-----------------------------------------------------------------------------------
47 HLA-A*29:02 LYNELEMNY AAA29554_1_circ 0.9372890 0.0239 <= SB
15 HLA-A*29:02 FVEALFQEY AAA29554_1_circ 0.8586640 0.0867 <= SB
18 HLA-A*29:02 ALFQEYQCY AAA29554_1_circ 0.6686980 0.2483 <= SB
39 HLA-A*29:02 NYDNAGTNLY AAA29554_1_circ 0.6538340 0.2591 <= SB
47 HLA-A*29:02 LYNELEMNYY AAA29554_1_circ 0.6535550 0.2593 <= SB
46 HLA-A*29:02 NLYNELEMNY AAA29554_1_circ 0.6224550 0.2810 <= SB
40 HLA-A*29:02 YDNAGTNLY AAA29554_1_circ 0.6141650 0.2868 <= SB
55 HLA-A*29:02 YYGKQENWY AAA29554_1_circ 0.5808990 0.3145 <= SB
14 HLA-A*29:02 LFVEALFQEY AAA29554_1_circ 0.5361340 0.3597 <= SB
12 HLA-A*29:02 SFLFVEALF AAA29554_1_circ 0.4389800 0.4690 <= SB
54 HLA-A*29:02 NYYGKQENWY AAA29554_1_circ 0.4339990 0.4750 <= SB

Tabla 8 Eptopos putativos para alelos HLA-A*23:01

-----------------------------------------------------------------------------------
Pos HLA Icore Identity Score %Rank BindLevel
-----------------------------------------------------------------------------------
12 HLA-A*23:01 SFLFVEALF AAA29554_1_circ 0.9241680 0.0569 <= SB
54 HLA-A*23:01 NYYGKQENW AAA29554_1_circ 0.9064240 0.0736 <= SB
53 HLA-A*23:01 MNYYGKQENW AAA29554_1_circ 0.6595740 0.3260 <= SB
7 HLA-A*23:01 ILSVSSFLF AAA29554_1_circ 0.5570340 0.4618 <= SB
 Tabla 9 Eptopos putativos para alelos HLA-A*35:01

-----------------------------------------------------------------------------------
Pos HLA Icore Identity Score %Rank BindLevel
-----------------------------------------------------------------------------------
15 HLA-B*35:01 FVEALFQEY AAA29554_1_circ 0.6794300 0.2090 <= SB
355 HLA-B*35:01 EPSDKHIEQY AAA29554_1_circ 0.6745990 0.2132 <= SB
5 HLA-B*35:01 LAILSVSSF AAA29554_1_circ 0.6545310 0.2306 <= SB
330 HLA-B*35:01 MPNDPNRNV AAA29554_1_circ 0.4489830 0.4572 <= SB

Los eptopos registrados por los programas, se ven representados segn si

posicin en la secuencia, en la figura 1 (ver anexo).
3.4 Prediccin de eptopos de Clulas B
La prediccin de eptopos de clulas B lineal se observa en la figura 3, las
regiones destacadas son las predicciones que se repiten con los distintos
mtodos: Bepipred (A), el mtodo de Chou y Fasman (B) y el mtodo de parker
Hydrophilicity (C).

Ilustracin 2 Regiones inmunodominantes segn la prediccin de eptopos de clulas T

 4. Discusin
Se registraron una gran variedad de eptopos putativos, obtenidos mediante los
programas netMHCpan y netMHCIIpan, los cuales presentan una tendencia a
ubicarse en las posiciones extremas de la secuencia (aminocidos 4 al 74 y 354 al
439), caracterizando estas zonas como unas con alta capacidad inmunodominante
para linfocitos de T. Mediante lo reportado por Sedegah et. al en el 2013(Tabla
10), se registraron a travs de un ensayo de ELIspot una cantidad de 9 eptopos.
Los cuales presentaron coincidencias (a excepcin del nmero 4) al ser
comparados con los eptopos obtenidos mediante el algoritmo netMHCpan para
MHC clase I y II, a partir de una secuencia de aminocidos desde la variante
falciparum, lo que permite decir que los algoritmos desarrollados por el IEDB para
la determinacin de eptopos, presentan un alto poder deductivo.

Tabla 10 Eptopos determinados por Sedegah et.al 2013

EPITOPOS
1. FLFVEALFQE
2. FVEALFQEY
3. LFVEALFQEY
4. SVFNVVNSSI
5. LIMVLSFLF
6. AILSVSSFLF
7. SVSSFLFVEA
8. SFLFVEALF
9. IMVLSFLFL

Por el contrario, para en anlisis de linfocitos de clulas B, la regin ms

inmunodominante se ubica entre los aminocidos 80 a 320, regin en la que se
concentra una cantidad de 43 repeticiones de la secuencia de aminocidos
NANP (Ver tabla 11), adems de 3 secuencias NANPNVDP, debido a esta
condicin, el reconocimiento de la protena CSP, se facilitara para los linfocitos de
clulas B, concordando con lo registrado por Ockenhouse et al, 2015, quienes al
utilizar esta secuencia para generar inmunizacin, mejoraron en un 69,2% la
capacidad de reconocimiento de la protena CSP.
Tabla 11 Secuencia de AA de P. falciparum, destacando en rojo la secuencia NANP

>AAA29554.1 circumsporozoite protein [Plasmodium falciparum]

MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSSNTRVLNELNYDNAGTNLYNELEMNYYGKQE
NWYSLKKNSRSLGENDDGDNDNGNNNNGNNNNGDNGREGKDEDKRDGNNEDNEKLRKPKH
KKLKQPGDGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNAN
PNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNAN
PNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNAN
PNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANNAVKNNNNEEPSDKH
IEQYLKKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSADKPKDQLDYENDIEKKICKMEKCS
SVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN

Segn la informacin recopilada por Sedegah et. al. (2013) las regiones N-
terminal, comprendida de los aminocidos 1 al 104, y la regin C-terminal, de los
aminocidos 273 a 397 son las zonas que presentan una mayor
inmunodominancia para eptopos de clulas T (ilustracin 3), lo que concuerda
con lo registrado por medio de lo recopilado por los programas NetMHCpan y
NetMHCIIpan (ver anexo 1)

Ilustracin 3 Secuencia de aminocidos de Plamosdium falciparum (A), eptopos para MHC II (B), eptopos para MHC I
(C), grupo de eptopos dominantes (D), eptopos confirmados por Elispot (E)
Bibliografa
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 Anexo

anexo 1 secuencia de amino cido de la protena CSP y epitopos registrados