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Curso terico-prtico
Apresentao do curso
18 Terica Estrutura de cidos nucleicos e Replicao do DNA
A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
GRUPO FOSFATO
BASE NITROGENADA
PENTOSE
Estrutura dos cidos nucleicos
DNA ou ADN: cido DesoxirriboNucleico
Polmeros de desoxinucleotdeos
FORTE FRACA
ligaes fosfodister pontes de H
(mesma fita) (entre as fitas)
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA
5 3
3 5
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA
5 3
3 5
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA
5 3
3 5
Replicao do DNA
A replicao do DNA ocorre de forma semiconservativa
Replicao do DNA
Polimerizao unidirecional: sentido 5 3
PCR
Fundamentos da Tcnica
Fundamentos da PCR
Estrutura dos cidos nucleicos
Replicao do DNA
Conceito da tcnica de PCR
Fundamentos da tcnica de PCR
Aplicaes da PCR
Como visualizar e interpretar os resultados
Quais as variaes da tcnica de PCR
Como preparar reaes de PCR
PCR na prtica!
Fundamentos da PCR
A Reao em Cadeia da Polimerase
PCR
Reao enzimtica baseada na Replicao
Fundamentos da PCR
TEMPERATURA
Fundamentos da PCR
Os iniciadores de PCR
A Enzima DNA polimerase no se liga em fita simples
Iniciadores ou oligonucleotdeos (=PRIMERS)
Utilizao de pares de inciadores (um complementar para cada fita)
Iniciador Senso (Forward): se liga na fita 3-5
Iniciador Antissenso (Reverse): se liga na fita 5-3
Fundamentos da PCR
tubulina actina miosina
25C
95C
60C
72C
Fundamentos da PCR
Reao Cclica
Desnaturao
Vrias vezes...
Extenso
Hibridizao
Fundamentos da PCR
Fundamentos da PCR
at bilhes de cpias!
Fundamentos da PCR
10 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Nmero de ciclos
Fundamentos da PCR
Componentes de uma reao de PCR:
Amostra de DNA
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Iniciadores (S e AS)
Enzima DNA Polimerase
Tampo da enzima
Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)
Fundamentos da PCR
Mg2+
TAMPO
Fundamentos da PCR
As principais etapas:
DNA Polimerase
(termoestvel)
Fundamentos da PCR
T C
95
72
60
Tempo
Fases da PCR: ciclos
Termocicladores
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
Rate of PCR 2n
1.8E+09
1.6E+09
1.4E+09
1.2E+09
DNA copy number
1.0E+09
8.0E+08
6.0E+08
4.0E+08
1 2 4 8
2.0E+08
0.0E+00
0 5 10 15 20
PCR cycle
25 30 35
Nmero de molculas de DNA
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
109
108
107
Plat
Cpias
106
105
104 Cpias do DNA: 1.073.741.824
Cpias do alvo: 1.073.741.764
103
102
10
1 3 5 10 15 20 25 30
Ciclos
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
Plat
Linear Sem amplificao
Baixa eficincia
Log [DNA]
Exponencial
Alta eficincia
N de Ciclos
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
Identificao de espcies
Iniciadores para cada espcie
Amplificao de genes especficos
(Ausncia nas outras espcies)
Diagnstico molecular
Iniciadores especficos
Presena/ausncia do gene
(positivo ou negativo para o teste)
Aplicaes da tcnica de PCR
Medicina forense
Identificao humana
Marcadores humanos especficos
(necessidade de controles)
Teste de paternidade
Identificao humana
Marcadores humanos especficos
(teste em todos os envolvidos)
Aplicaes da tcnica de PCR
As diferentes aplicaes da tcnica de PCR:
Transcrio Reversa
mRNA
cDNA
Variaes da PCR: RT-PCR
Aumento da fluorescncia
Variaes da PCR: qPCR
Ciclos
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