Professional Documents
Culture Documents
TRANSGNICOS.
Ingeniera gentica: conjunto de mtodos para es traer dan de una clula, manipularlo in vitro
e introducirlo y expresarlo en otra clula, generalmente de una especie diferente.
Desarrollo de cepas
-Incrementar la produccion: regulacin, permeabilidad, resistencia.
- Propiedades fermentativas mejoradas: sin pigmentos, necesidades reducidas de oxgeno, menor
produccin de espuma, capacidad de crecer en sustratos baratos, etc...
- Productos finales nicos: en metabolitos secundarios.
Retrotranscripcin:
Usamos una enzima sobre el RNAm que esta en el citoplasma y ya ha sido modificado, ya
hemos eliminado la secuencias no codificantes; este primer transcrito ya es completo, una
vez que sale del nucleo solo tenemos la secuencia modificada, flanqueado por el promotr y
el terminador; al obtener este RNAmaduro solo tengo el
material genetico que codifica; solo nos interesa la
secuencia a traducir, que ya es universal para procariotas
y eucariotas.
PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(PCR) es una tcnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la clula de duplicar el
ADN.
Promotores inducibles, solo se expresa durante un tiempo por el inductor. Existen en todos los
seres vivos (ej el del gen lactosa), el que se usa con mas frecuencia es el 35s, que es de un virus
mosaico de la coliflor
Ej: Se aisl el gen CRYIA y CRY9 del Bacillus thuringiensis que produce una proteina que es
toxina contra larvas de insectos (especialmente lepidopteros).
Se aislaron genes de resistencia a dos herbicidas, glifosato y glufosinato, producidos por bacetrias
del suelo (agrobacterium, Ochrobactrum...).
Una vez que tenan ambos genes se busco el promotor. El promotor 35S que induce la expresin
gnica en todas las clulas todo el tiempo (al ser constitutivo), se uni a los de B.thuringiensis, se
demostr que una protena aloctona poda provocar alergias; luego se cambio al promotor de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa, es muy potente (ya q es la enzima mayoritaria d la fotosntesis),
adems es una enzima fotosinttica y solo se expresa en los tejidos que realizan la fotosntesis, la
hoja (donde actan los larvas de los insectos); los herbicidas eran de absorcin folial, por tanto
tambin nos interesa.
Los terminadores, hay que usar las secuencias que responden mejor, las q son especificas del
tejido donde quiero expresar el gen, aqu no hay tanta variedad, asique se elige la especifica y ya
est.
Gen marcador: se puede usar una protena fluorescente (inconveniente, me ayuda a detectar
pero no a seleccionar), asique se usa como gen marcador un gen de resistencia, as se cultivan
las clulas en una placa petri con el antibitico que confiere resistencia este gen arcador, siembro
los transformantes y las que no tienen el gen marcador morirn y me quedare con los que me
interesa; ya no se usa para no crear ms resistencias.
2.- ELECCIN DEL VECTOR
En la naturaleza no hay un vector de clonacin que tenga las caractersticas que necesitamos, por
ello lo creamos. Permite que entre el ADN en la clula y que el ADN que se ha construido se
mantenga estable y que se reproduzca de manera sincrnica con el material celular.
Si no existiera el vector, al dividirse de forma no sincrnica solo una clula Heredar el fragmento
de DNA introducido y al avanzar las generaciones, en la 4 ya estar tan diluido que lo he perdido.
Por ello el vector es autoreplicativo (replicn) as se replica a la vez que la clula y se hereda igual
que todos los genes que estn en el interior del cromosoma; todas las generaciones llevan su
material gentico y el introducido por el vector.
Los plsmidos actan como replicones, y no existen plsmidos naturales que nos sirvan como
vectores, luego se construyeron los vectores, cogiendo fragmentos de distintas partes de
plsmidos o de transposones para montar uno con las caractersticas interesantes, el primero
construido fue el pBR322, sus caractersticas:
- Tiene un origen de replicacin y tiene que ver con la clula que se quiere replicar (en este
caso es en E.coli que es con lo que se trabaja en ese momento), si quisiera que sirviera
para otro tipo de clulas cambiaria el origen de replicacin.
- Usaron dos fragmentos de DNA de otro plsmido para marcarle dos genes de resistencia
a AB (en aquel momento se usaba esto como marcador)
-Se necesitaba que dentro del gen de resistencia existiera secuencias especficas de corte
para endonucleasas de restriccin, para que al cortar con las endonucleasas se introduce
ah el DNA interesado y se deja de producir ese ab
SELECCION DE VECTOR:
Sea el mtodo que sea, nosotros conseguimos introducir en la clula el ADN fabricado en el
laboratorio, obteniendo as una clula recombinante.
Otro mtodo, complejo y que ha ido cayendo en desuso, basado en la transduccin (transporte de
genes de una clula a otra).
Voy a utilizar el virin como un sistema de transporte e inyeccin de ADN. Esto se consigue
teniendo virus efectivos (dos o tres tipos), que ninguno
de ellos sean capaces de formar una partcula viral
completa porque le faltan protenas necesarias, pero que
la suma de todos ellos formen la suma de las protenas
necesarias. Las protenas una vez completas se
autoensamblan y adems introducen dentro de la cabeza
ese material gentico, obteniendo as pseudoviriones.
Normalmente se usa e.coli como recombinantes; a partir de aqu hay tres vas fundamentales
1- Que la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto del gen de forma activa,
esto ocurre con la insulina porque es una molcula sencilla. Entonces solo hay que propagar las
clulas a nivel industrial y purificar el producto
2- S lo que nos interesa obtener es un ser vivo transgnico diferente a una bacteria (planta),
entonces a partir de la bacteria que contiene el gen que nos interesa hay que disear un sistema
que nos permita transferir el gen, esto se realiza usando la capacidad q tiene una bacteria
patgena de plantas (agrobacterium thurifaciens?) que inyecta un bloque de ADN para q la planta
forme un tumor que contenga las sustancias que le interesan para vivir; nosotros cambiamos los
genes de la bacteria por los nuestros e infecto a la planta; obtenemos plantas transgnicas
(resistentes a sequias, que se rieguen con agua de mar...)
3- La bacteria no tiene capacidad de modificar la protena como lo hacen las clulas humanas, ya
que tiene que estar glicosilada; hago lo mismo que con las plantas pero con clulas humanas,
obtengo cultivos de tejido donde introduzco el gen, se produce la sntesis de la protena y su
glicosilacion, obtenemos una protena humana activa; obtenemos muchas protenas de uso
teraputico, que en clulas de bacterias no funcionaran bien.
6.- PROPAGACIN DE LA CLULA (Produccin industrial)
ADN de la clula donadora, vamos a recombinar ese vector e introducir dentro de una clula
(bacteria e.coli) y vamos a detectar nuestros recombinantes. Que podemos hacer a partir de aqu
BIOTECNOLOGA.
Hay tres vas fundamentales: la propia bacteria sea capaz de producir y exportar el producto de
ese gen de forma activa, esto es lo que ocurre con la insulina, lo nico que tenemos que hacer es
propagar las clulas de forma industrial.
A veces esto no es posible, motivos: lo que me interesa es tener un ser vivo diferente de una
bacteria si no un transgnicos (plantas); entonces a partir de esa bacteria tengo que idear un
sistema que me permita transferirlo a una planta, esto se hace mediante una bacteria patogena de
plantas (muy bien conocida, agrobacterium thurifsciens), esta es capaz de inyectar un bloque de
ADN que infecta a la planta y produce un tumor que contiene las sustancias que a ella le interesan
para vivir. Nosotros cambiamos los genes de las bacterias por los nuestros a la planta.
Otra opcin la bacteria no tiene capacidad para modificar una PT de la misma forma que lo hace
las clulas y para que la protena se activa tiene que ser glicosilada. Tengo que tener cultivo de
tejidos en los que introduzco ese gen en lo que se va a producir la sntesis de esa PT y por
supuesto la glicosilacion, esto sirve para la obtencin de una gran cantidad de PT de uso
teraputico.
Cultivo en masa para la produccin del beneficio industrial que me interesa tener. Para ver la
tecnologa de la fermentacin.
- FASES DE PROCESO FERMENTATIVO.
Un proceso fermentativo es un esquema de procesos que nos permitan un cultivo a gran escala
de los MO de utilizacin industrial. El primero de ellos es propio fermentador, es un recipiente que
nos permite desarrollar el microorganismo; tiene que cubrir los requisitos esenciales, tenemos que
garantizar que estn los nutrientes en contacto con las clulas, necesitamos aadir un sistema de
generacin, aadir precursores desde fuera a lo largo del proceso, controlar el pH y de
temperatura.
Para llevar a cabo el proceso de fermentacin necesitamos:
- Clulas que hemos obtenido y que nos interesan, estas clulas tienen que seguir unos
protocolos para que no cambien, a partir de una alcuota pequea de estas tenemos que generar
un inoculo que tenga la cantidad exacta de clulas y con una calidad contrastada
- Cuando ya est las clulas dentro del medio, cambia sobre una semana el desarrollo-proceso
de fermentacin.
Cuando preparo esto, obtengo un caldo de fermentacin, con dos elementos, las clulas y el
sobrenadante de cultivo. Lo primero q hay q hacer es la separacin de estos dos elementos, para
ello hay diferentes metodologas. Un vez separado, hay q tener en cuanta q nos interesa,
obtenemos las clulas. Lo habitual es q no nos interese toda la clula sino una molcula concreta,
entonces hay q discernir donde est esta molcula, en el sobrenadante o en las clulas. Si son las
clulas lo primero q hay q hacer es romper la biomasa (hay diferentes mtodos, cuando los
enzimas intracelulares son labiles-termolabiles, no puedo usar tcnicas que den calor como
sonicacion o cavitacin). Con la clula rota vuelvo a separar sobrenadante del resto.
Si nos interesa el sobrenadante tengo q purificar directamente, aqu es donde est la dificultad de
los medios con subproductos de la industria alimentaria, usamos tratamientos como extraccin
con disolventes, tamizado irregular...