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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

"CUANTIFICACIÓN
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS"

INTEGRANTES : Francis González


Lawrence Lackey
PROFESORA : Alejandra Saavedra
AYUDANTE : Catalina Rodríguez
FECHA EXPERIENCIA : 23 de Octubre del 2017
FECHA DE ENTREGA : 6 de Noviembre del 2017
1.- INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La estructura de los aminoácidos consta de un grupo amino, un carboxilo y grupo R unidos


a un mismo átomo de carbono. El grupo R hace caracteriza a cada aminoácido, algunos de
estos poseen un grupo aromático el cual es capaz de absorber luz ultravioleta a una longitud
de onda de 280[nm], propiedad que es aprovechada para la cuantificación de proteínas. Una
forma de medir esta absorción y poder determinar concentración de proteínas es utilizando
un espectrofotómetro, el cual emite luz a una longitud de onda determinada que atravesará
por una cubeta de paso óptico donde se encuentra la muestra de cierta concentración, la que
absorberá parte de esta luz disminuyendo su intensidad y midiéndose por un detector en el
otro extremo. De este modo, la absorbancia está relacionada con el espesor de la cubeta(l),
el coeficiente de absorción molar (𝜀) y la concentración de la solución (c) mediante la Ley
de Lambert-Beer como indica Nelson y Cox (1) que permitirá cuantificar las especies.

𝐴=𝜀∙𝑐∙𝑙

Otra forma de determinación de concentración de proteínas es mediante el ensayo de


Biuret, el cual consiste en la reacción entre los enlaces peptídicos de polipéptidos y sulfato
de cobre en un medio alcalino formándose un complejo color violeta, donde la intensidad
del color es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes. El máximo de
absorciónde luz UV se encuentra a 540[nm] como señala Pihlasalo(2).

En la siguiente experiencia se busca conocer los fundamentos teóricos y prácticos de la


espectrofotometría y también determinar las concentraciones de aminoácidos y proteínas en
solución.

2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.1 Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Se prepararon 8 muestras en tubos Eppendorf de 2[mL] con las siguientes soluciones:

Tabla 2.1: Volumen en [mL]de reactivos que se agregó a cada tubo.


Tubo
Reactivo 1 2 3 4 5 6 7 8
NaCl 0,9% p/v 1,0 0,9 0,75 0,5 0,25 - - -
𝑚𝑔
SAB5 [ ] - 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 - -
𝑚𝐿
Muestra problema - - - - - - 1,0 1,0
Reactivo de Biuret 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Para esto, los tubos fueron colocados sobre una gradilla y mediante una micropipeta de
1000[µL] se agregaron los compuestos en las proporciones indicadas en la tabla 2.1. La
seroalbúmina bovina (SAB) se agregó de forma lenta y sin agitar para evitar la formación
de espuma.

1
La muestra problema del tubo 7 correspondió a saliva de la estudiante Francis González y
la del tubo 8 a saliva del estudiante Lawrence Lackey. Estas fueron depositadas sobre un
tubo Eppendorf y posteriormente extraídas con la micropipeta.

Ya habiendo añadido todos los reactivos a los tubos, se mezclaron las soluciones
suavemente para luego ser llevados a baño termorregulado de agua a 50[°C] por 5 minutos.
Pasado este tiempo se agregaron 200[µL], utilizando micropipetas del mismo volumen, de
cada muestra y con duplicado a una placa de plástico de 96 pocillos que posteriormente se
llevó al Tecan (modelo infinite M200 pro) para leer la absorbancia de las muestras a
540[nm] de longitud de onda.

2.2 Reconocimiento y cuantificación de aminoácido y proteínas por absorbancia a


280[nm].

En esta sección de la experiencia la profesora del laboratorio entregó la absorción a


280[nm] de glicina, SAB y de la misma solución de cloruro de sodio utilizadaen la
experiencia anterior.

3.- RESULTADOS

3.1 Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Las absorciones a 540[nm] de las 8 muestras en ambas corridas experimentales en el equipo


Tecan fueron las siguientes:

Tabla 3.1: Absorción a 540[nm] de las distintas muestras.


Muestras
1 2 3 4 5 6 7 8
Absorción 0,0791 0,1174 0,1733 0,2609 0,3549 0,4507 0,9302 0,5073
Absorción 0,0792 0,1221 0,1784 0,2706 0,3703 0,4366 0,5812 0,5040

Las concentraciones de proteína (SAB) utilizadas en la tabla 2.1 son recalculadas para el
nuevo volumen en dilución de 2[mL] de la solución final ,los cuales se indican en la tabla
3.2 y fueron graficados respecto a la absorbancia correspondiente en la figura 3.1.

Tabla 3.2. Concentración de proteínas en dilución para las muestras de calibración.

Tubo
Reactivo 1 2 3 4 5 6
SAB [mg/mL] 0,000 0,250 0,625 1,250 1,875 2,500

2
Figura 3.1: Curva de calibración de proteínas para una longitud de onda de 540[nm].

0,5
0,45
0,4
Absorbancia 0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentración proteína[mg/mL]

Tabla 3.3:Ecuación lineal, coeficiente de correlación y rango de validez de la regresión.

Regresión 𝐴 = 0,1464 ∙ 𝐶 + 0,0826


Coeficiente de correlación (R2) 0,9993
Rango de validez [0-2,5]

Con la regresión y las absorciones se calcularon las concentraciones de proteínas en cada


una de las muestras para cada corrida experimental, incluyendo las muestras problema.

Tabla 3.4: Concentración de proteínas en cada muestra.


Muestras
1 2 3 4 5 6 7 8
𝒎𝒈
Concentración[ 𝒎𝑳 ] 0,000 0,2377 0,6195 1,2179 1,8600 2,5143 5,7896 2,9010
𝒎𝒈
Concentración[ 𝒎𝑳 ] 0,000 0,2698 0,6544 1,2842 1,9652 2,4180 3,4057 2,8784

3.2 Reconocimiento y cuantificación de aminoácido y proteínas por absorbancia a


280[nm].

Con la absorbancia a 280[nm] determinada experimentalmente en el espectrofotómetro,


identificación del blanco y los datos bibliográficos de peso molecular y coeficiente de
extinción molar se determinó la concentración de SAB de las muestras.

Tabla 3.3: Absorción a 280[nm] y concentración de SAB.


𝒎𝒈
Reactivo Absorción Concentración 𝒎𝑳
NaCl 0,9% p/v 0,098 0,000
𝑚𝑔
SAB 5 [ 𝑚𝐿 ] 0,800 1,062
Glicina 0,101 0,000

3
4.- DISCUSIÓN

4.1 Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Cualitativamente las muestras cumplen la ley de Lambert-Beer, ya que el aumento de


absorbancia ocurre de forma lineal respecto al incremento de la concentración de proteína
(SAB) tanto en la primera corrida experimental como en su duplicado, gráficamente se
observa en la figura 3.1. Cuantitativamente las diferencias entre las corridas experimentales
son menores y pueden explicarse por la sensibilidad del equipo y homogenización del
sistema. La regresión lineal que ajusta al promedio de las absorbancias entre ambas corridas
experimentales y la concentración de proteína ajustada a la dilución presentó un coeficiente
de correlación de 0,9993 con errores menores al 2%respecto de las concentraciones
teóricas, lo que corrobora estadísticamente la hipótesis anterior.

Mediante la curva de calibración se cuantificaron las concentraciones de proteínas en las


muestras problemas, determinándose que para la muestra 1 y 2 las concentraciones fueron
5,7896 y 2,9010 [mg/mL] en la primera corrida experimental y 3,4057 y 2,8784 [mg/mL]
en la segunda, tal como se indica en la figura 3.4. de resultados. Del análisis del duplicado
se corroboraron los resultados de la muestra 8, puesto que la diferencia entre sus
absorbancias es de 0,77%, no así en la 7, ya que hubo una diferencia del 41,16% entre las
absorbancias para la misma muestra. Esto se puede explicar producto de la falta de
homogenización de la saliva para este caso, ya que es un fluido altamente viscoso y
propenso a formar espuma, por lo que su agitación fue cuidadosa como se indicó en el
procedimiento experimental.

Los valores clínicos de la concentración de proteínas salivales totales en adultos con edad
promedio de 25 años se encuentran entre 3,2±1,7[mg/mL] según Castro, Guzmán y
Giacaman (1). A partir de esto la muestra 8 se ajusta al rango de concentración y etario,
mientras que la muestra 7 cumpliendo el rango etario sólo se ajusta la concentración en la
segunda corrida experimental.

4.2 Reconocimiento y cuantificación de aminoácido y proteínas por absorbancia a


280[nm].

El espectro de absorción de las proteínas se encuentra a los 280[nm] producto de la


presencia de aminoácidos con grupos aromáticos. Tanto el cloruro de sodio como la glicina
no presentan estos grupos en su estructura lo que les impide absorber radiación UV en un
rango cercano a esta longitud de onda. La diferencia entre las mediciones de estos
compuestos se explica por la incertidumbre del propia del equipo, la cual es al menos
±0,001 por ser un equipo digital.

Por otra parte, la concentración de SAB por absorbancia a 280[nm] fue de 1,065[mg/mL]
que corresponde a un 78,76% de error respecto a la concentración indicada en la solución

4
.Un posible motivo es que la ley de Lamber-Beer se cumple hasta un cierto rango de
concentraciones, posterior a un punto límite la tendencia deja de ser lineal y no cumple la
ley. También es factible de que la muestra presentara errores en la determinación de la
absorbancia, como la celda óptica sucia lo que reduciría la absorbancia. Esta clase de
errores no pueden ser descartados al no tener un duplicado de la misma medición.

5.- CONCLUSIONES

Se conoció y aplicó la Ley de Lambert-Beer que permitió la construcción de una curva de


calibración con la que se determinó la concentración de distintas soluciones, mediante el
ensayo de Biuret, con seroalbúmina de Bovino (SAB) con errores menores al 2% y la
concentración de proteínas en la saliva de humano. Los valores de concentraciones de la
saliva determinadas a partir de este método se encontraron dentro de los valores clínicos
esperados.

Por otra parte, no se logró cuantificar satisfactoriamente SAB mediante su absorción a


280[nm], puesto que el error obtenido por este método fue de 78,76%.

6.- REFERENCIAS

[1]Nelson D. L. & Cox M. M. (2009). Lehninger Principios de Bioquímica. Cuchillo C. M.


(ed), Aminoácidos, péptidos y proteínas (5a ed., pp:71,76). España, Barcelona: Ediciones
Omega.

[2]Pihlasalo S. (2011). Quantification of proteins and cells. (pp:30) Finlandia, Annales


Universitatis Turkuensis. Disponible en:
http://www.doria.fi/bitstream/handle/10024/67470/AnnalesD952Pihlasalo.pdf Visitado el 5
de Noviembre del 2017.

[3] Castro RJ, Guzmán G &Giacaman RA. (2012). Comparación de la concentración total
de proteínas salivales de adultos y adultos mayores. (pp: 25). Revista clínica de
periodoncia, implantología y rehabilitación oral. Disponible en:
http://www.scielo.cl/pdf/piro/v5n1/art05.pdf Visitado el 4 de Noviembre del 2017.

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