MAKALAH MIKROBIOLOGI ANALISIS

‘’METODE CEPAT ANALISIS MIKROBIOLOGI ‘’

DISUSUN OLEH : KELOMPOK 11

RISKY DERMAWATI G 701 15 010

WANA WULANDARI G 701 15 114

MULYANI G 701 15 184

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TADULAKO
PALU
2017

1
 KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat TuhanYang Maha Kuasa dan atas segala
limpahan rahmat, serta hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini yang
berjudul “METODE CEPAT ANALISI MIKROBIOLOGI”.
Kami menyadari sepenuhnya bahwa makalah ini masih banyak kekurangan yang
disebabkan oleh keterbatasan pengetahuan yang dimiliki. Oleh karena itu kritik dan saran
sangat diharapkan dalam penyusunan makalah ini kedepannya.
Akhir kata, penyusun mengucapkan banyak terima kasih dan semoga makalah ini dapat
bermanfaat bagi kita semua.

Palu, 09 OKTOBER 2017

Penuils

2
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR................................................................................................................1

DAFTAR ISI..............................................................................................................................2

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ........................................................................................................3

BAB II PEMBAHASAN

II.1 Uji Mikrobiologi......................................................................................................5

II.2 Metode Uji Mikrobiologi.........................................................................................5

BAB III PENUTUP

III.1 Kesimpulan...........................................................................................................12

3
 BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar belakang

Populasi mikroorganisme di alam sekitar kita sangat besar dan kompleks.
Beratus-ratus spesies berbagai mikroba berada disekitar kita. Mikroorganisme ada
yang menguntungkan dan ada yang merugikan. Mikrorganisme yang merugikan yaitu
mikroorganisme yang dapat menyebabkan infeksi, menghasilkan racun dan merusak
bahan dengan cara menyebabkan pembusukan, menguraikan bahan-bahan.
Terdapatnya mikroorganisme dalam sediaan farmasi, makanan, minuman sebagai
kontaminan, kemungkinan disebabkan oleh cara pengolahan yang tidak bersih dan
sehat, cara pengepakan yang kurang bagus, cara penyimpanan yang tidak baik dan
lain-lain. Sedangkan sumbernya kemungkinan dari udara, tanah, air, peralatan yang
digunakan dalam pengolahan, atau pekerja yang melakukan proses pembuatan.
Makanan, minuman, obat tradisional, sediaan non steril, serta kosmetik
merupakan suatu sediaan yang berasal dari hewan, tumbuhan, mineral, maupun dari
zat-zat kimia sintetik. Pada umumnya sediaan-sediaan tersebut, diproduksi oleh
industri secara besar-besaran dan biasanya memakan waktu yang cukup lama dalam
produksi, penyimpanan, distribusi dan akhirnya sampai ke tangan konsumen. Jadi
kemungkinan dapat terjadi pertumbuhan mikroba di dalamnya.
Di dalam bidang ilmu mikrobiologi ada suatu hal mendasar yang juga perlu
diperhatikan yaitu analisia kuantitatif dan kuantitatif terhadap suatu bahan. Suatu
analisis ini Sangat penting untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang ada pada
suatu sampel tertentu mengandung banyak mikroorganisme atau sebaliknya.

I.2 Tujuan percobaan

Mengetahui berbagai metode cepat dalam analisis mikrobiologi

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Pengertian

Mikrobiologi adalah suatu kajian tentang mikroorganisme. Mikroorganisme itu sangat

kecil, biasanya bersel tunggal, secara individual tidak dapat dilihat dengan mata
telanjang. Mikroorganisme hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Mereka
tersebar luas di alam dan dijumpai pula pada pangan. Beberapa diantaranya, jika terdapat
jumlah yang cukup banyak dapat menyebabkan keracunan makanan. Mikroorganisme
merupakan penyebab utama merosotnya mutu pangan, misalnya kerusakan pangan.
Namun demikian tidak semua mikroorganisme berperanan penting dalam semua bentuk
kehidupan, karena mereka dapat memecah bahan organik kompleks dan mengembalikan
unsur hara ke dalam tanah. Mikroorganisme juga dipergunakan oleh manusia untuk
memproduksi beberapa jenis makanan, misalnya roti dan yogurt

II.1 Uji Mikrobiologi

Uji mikrobiologi merupakan salah satu jenis uji yang penting, karena selain dapat
menduga daya tahan simpan suatu makanan, juga dapat digunakan sebagai indikator
sanitasi makanan atau indikator keamanan makanan. Pengujian mikrobiologi diantaranya
meliputi uji kuantitatif untuk menentukan mutu dan daya tahan suatu makanan dan uji
kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya,

II.2.1 Metode Uji Kualitatif

Metode analisis yang responsnya berupa jumlah dari analit, baik yang
diukur secara langsung (misalnya : enumerasi mikroba) maupun secara
tidak langsung (misalnya : nilai absorbans, intensitas warna, impedansi,
dan lain-lain) terhadap sejumlah sampe

5
A. Metode MPN
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang
menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair
spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang
ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri
tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji
dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Contoh : data yang
didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari
pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu
dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g (Gallup, 2008).
Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk
contoh berbentuk padat. Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui
berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri
dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji
penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis
merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri
koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode
perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa
setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang
merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang
terdapat pada sampel (Plummer, 1987).
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat
tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan
jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif
“kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang
dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin
“sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang
dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin
“jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik
adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”.
Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas
sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh
karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif

6
(ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada
sampel sebelum diencerkan (Gallup, 2008).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan
jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming
unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai
perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100
mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen
sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan
nilai MPN tertinggi (Lim, 1998).
Menurut Plummer (1987), ada beberapa cara yang dapat digunakan
untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi
atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu:
a. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number)
b. Perhitungan massa sel secara langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (turbidimetri)
c. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
1. Analisis komponen sel
2. Analisis produk katabolisme
3. Analisis konsumsi nutrient

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba

di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk
contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari
contoh tersebut. Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi,
dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif
yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati
timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung

7
Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik
pembentuk gas (Fardiaz, 1993).

Untuk metode MPN (most probable number) digunakan medium cair

dalam wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan
jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada
mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau terbentuknya gelembung
gas pada dasar tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini digunakan
bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari
hasil perubahan tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN, dan untuk
jumlah bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008).

Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan

pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah
koliform dalam sampel yang diuji. Uji positif akan menghasilkan angka
indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah
koliform dalam sampel (Pakadang, S, 2010).

Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri

patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda
bahwa adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi
indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif
dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan mendeteksi koliform adalah
jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik
lain. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator
adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air,
makanan, susu dan produk-produk susu. Pada saat perhitungan koloni, apabila
jumlah koloni yang di temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan,
maka suatu sampel bisa di katakan murni (Umbreit, 1960).

Beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif,

sehingga diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya
coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan
kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat
fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk
batang, gram negatif, tidak-berspora. Bakteri coliform adalah golongan bakteri

8
 intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform
adalah bakteri indicator keberadaan bakteri patogenik lainnya. Lebih tepatnya,
sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri indicator adanya pencemaran
bakteri pathogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran
dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan
bakteri pathogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat dan
sederhana daripada mndeteksi bakteri patogenik lain (Lim, 1998).

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli

adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering
disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih cepat jika
dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga yang
merupakan tahap pertama uji E.coli (Penn, 1991).

Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi

kualitas air minum. Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli,
Enterrobacter aerogenes, dan Citrobacter fruendi. Keberadaan bakteri di
dalam air minum itu menunjukkan tingkat sanitasi rendah. Keberadaan bakteri
ini juga menunjukkan adanya bakteri pathogen lain misalnya, Shigella, yang
menyebabkan diare hingga muntaber (Lim, 1998).

B. Metode TPC
Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC)
adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar,
sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang
dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop. Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk
menentukan jumlah mikroorganisme.Dengan metode ini, kita dapat
menghitung sel yang masih hidup, menentukan jenis mikroba yang tumbuh
dalam media tersebut serta dapat mengisolasi dan mengidentifikasi jenis
koloni mikroba tersebut.
Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus
dikuasai.Sebelum mikroorganisme ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu
dilakukan pengenceran sampel menggunakan larutan fisiologis.Tujuan dari
pengenceran sampel yaitu mengurangi jumlah kandungan mikroba dalam

9
sampel sehingga nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah mikroorganisme
secara spesifik sehingga didapatkan perhitungan yang tepat.Pengenceran
memudahkan dalam perhitungan koloni (Fardiaz, 1993). Menurut Waluyo
(2005), tahapan pengenceran dimulai dari membuat larutan sampel sebanyak
10 ml (campuran 1 ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis). Dari larutan
tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan kedalam 9 ml larutan fisiologis
sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1
ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis
sehingga didapatkan pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai
pengenceran yang kita harapkan.Secara keseluruhan, tahap pengenceran
dijelaskan dalam gambar berikut ini.

Gambar 1. Teknik pengenceran Sampel

10
 Setelah dilakukan pengenceran, kemudian dilakukan penanaman pada
media lempeng agar.Setelah diinkubasi, jumlah koloni masing-masing cawan
diamati dan dihitung.Koloni merupakan sekumpulan mikroorganisme yang
memiliki kesamaan sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya.
Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan
medium adalah sebagai berikut:

 Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa satu titik, namun
ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium.
 Bentuk. Ada koloni yang bulat dan memanjang. Ada yang tepinya rata
dan tidak rata.
 Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata dengan permukaan medium,
ada pula yang timbul diatas permukaan medium.
 Halus kasarnya pemukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada
yang permukaannya kasar dan tidak rata.
 Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat da nada
yang permukaannya suram.
 Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
 Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lender, ada yang keras dan
kering.

Selanjutnya perhitungan dilakukan terhadap cawan petri dengan jumlah koloni

bakteri antara 30-300.Perhitungan Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah
koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer. Keuntungan dari
metode TPC adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan.
Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat
dalam contoh.Adapun kelemahan dari metode ini adalah:

 Memungkinkan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba,
seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.
 Memungkinkan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang
sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh
karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen
selama masa inkubasi.
11
 Memungkinkan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di
seluruh permukaan media,sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini
akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.
 Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi
mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30
koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik,
namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena
terjadi persaingan diantara koloni.
 Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi
yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

Uji Total Plate Countmenggunakan media padat dengan hasil akhir berupa
koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung. Sebelum diuji di media
padat, sampel terlebih dahulu harus diencerkan. Pengenceran sampel
dilakukan terhadap sediaan yang akan didentifikasi kemudian ditanam pada
media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar
dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.Perhitungan
dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300.Total
Plate Count dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan
dikalikan faktor pengencer.
Teknik pengenceran sampel dilakukan pada metode cawantuang (pour
plate). Pada metode tuang, sejumlah sampel dari hasil pengenceran sebanyak 1
ml dimasukkan kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan media yang telah
disterilkan sebanyak 15-20 ml. Kemudian cawan petri digoyang agar media
dan sampel tercampur rata dan biarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan
sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan media yang kaya oksigen, tetapi
ada pula yang tumbuh didalam media yang tidak begitu banyak mengandung
oksigen. Secara keseluruhan tahap dalam metode cawan tuang (pour plate) ini
dijelaskan pada gambar berikut.

12
Sementara pada metode lainnya yaitu metode goresan, proses penanaman
bakteri hanya dilakukan di permukaan bakteri saja.Teknik ini menguntungkan
jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-
keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan metode ini adalah
bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh, karena goresan hanya dilakukan di
permukaan media saja.

Gambar 3. Pertumbuhan bakteri pada metode Spread plate dan Pour plate
Pada gambar diatas dapat anda lihat bahwa pada metode goresan atau spread
plate, bakteri hanya tumbuh pada permkaan media yang digores saja,
sementara pada metode cawan tuang atau pour plate, bakteri tumbuh tidak
hanya di permukaan media saja tetapi diseluruh bagian media.
Dalam melakukan teknik goresan harus memperhatikan beberapa hal berikut
ini, antara lain:

1. Gunakan jarum ose yang telah dingin untuk menggores permukaan

lempengan media. Jarum ose yang masih panas akan mematikan
mikroorganisme sehingga tidak terlihat adanya pertumbuhan
mikroorganisme di bekas goresan.

13
2. Sewaktu menggores, jarum ose dibiarkan meluncur diatas permukaan
lempengan. Media agar yang luka akan mengganggu pertumbuhan
mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.
3. Jarum ose harus dipijarkan kembali setelah menggores suatu daerah, hal
ini dengan tujuan mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata
jarum ose dan mencegah kontaminasi pada penggoresan berikutnya.
4. Menggunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan supaya
terhindar dari kontaminasi.
5. Membalikkan lempengan media agar untuk mencegah air kondensasi
jatuh diatas pemukaan media.

Ada beberapa teknik penggesekan, yaitu

1. Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar
cawan petri.

 Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.

 Panaskan mata jarum ose dan biarkan dingin kembali.
 Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan penggoresan pada
daerah II
 Ulangi prosedur diatas untuk melakukan penggoresan untuk daerah III

2. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan

agar dibagi menjadi 4

14
 3. Goresan Radian

 Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.

 Pijarkan mata jarum ose dan dinginkan kembali
 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus diatas goresan
sebelumnya

4. Goresan Sinambung

 Ambil satu mata ose suspense dan goreskan setengah permukaan

lempengan agar
 Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang
sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.

C. Metode Petroff Hausser

Penghitungan mikroorganisme secara langsung dapat dilakukan secara

mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang
15
sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hausser Chamber atau
Haemocytometer (Buckle, 1987). Cara penggunaan Petroff Hausser yakni
sampel disuntikkan pada daerah cekung (parit) kotak Petroff Hausser,
kemudian ditutup cover glass, dan diamati di bawah mikroskop. Hasil
pengamatan dari metode Petroff Hausser ini adalah adanya mikroorganisme
yang menyebar dalam kotak-kotak Petroff Hausser tetapi jumlah
mikroorganisme tersebut tidak banyak. Mikroorganisme yang terlihat di bawah
mikroskop ini berbentuk kokus dan tidak berkoloni.

Dalam metode Petroff-Hausser, hitungan mikroskopik dilakukan dengan

pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1
mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0.04 mm2, dan setiap kotak
besar terdiri dari 16 kotak kecil. Tinggi contoh yang terletak di antara gelas
objek dengan gelas penutup adalah 0.02 mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak
besar dihitung, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam satu kotak besar
(Fardiaz, 1992). Sesuai dengan perhitungan pada literatur, kotak Petroff
Hausser terdiri dari 25 kotak sedang yang masing-masing kotak sedang berisi
16 kotak kecil. Luas kotak kecil yaitu 0,0025 mm2 dan tingginya yaitu 0,1 mm
sehingga satu kotak kecil memiliki volume 0,00025 mm3. Setelah satu kotak
kecil diketahui volumenya, kotak sedang dapat dihitung dengan volume kotak
kecil dikalikan 16 karena dalam satu kotak sedang terdapat 16 kotak kecil
sehingga volume satu kotak sedang yaitu 0,004 mm3 atau 4 x 10-6 cm3. Jumlah
cairan yang terdapat antara cover glass dan alat ini mempunyai volume
tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga
tertentu (Buckle, 1987).

Mikroorganisme pada setiap kotak sedang berbeda-beda karena

penyebarannya yang tidak merata. Mikroorganisme yang dihitung terdapat
pada kotak pojok kiri atas, pojok kanan atas, pojok kiri bawah, tengah, dan
pojok kanan bawah. Faktor yang berpengaruh dalam jumlah mikroorganisme
antara lain jumlah mikroorganisme tersebut terdiri dari sel-sel hidup dan sel-
sel mati karena tidak dapat dibedakan jika menggunakan metode Petroff
Hausser. Faktor-faktor yang berpengaruh berasal dari kelemahan-kelemahan
metode Petroff Hausser sendiri.

16
 Menurut Fardiaz (1996), hitungan mikroskopik merupakan metode yang
cepat dan murah, tetapi mempunyai beberapa kelemahan sebagai berikut:

1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup. Oleh
karena itu, keduanya akan terhitung.
2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop,
sehingga kadang-kadang tidak terhitung.
3. Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup
tinggi, misalnya untuk bakteri minimal 106 sel/ml. Hal ini disebabkan
dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel
yang dapat dihitung.
4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan
pangan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal
ini akan mengganggu dalam perhitungan sel.

II.2.2 Metode Uji Kuantitatif

Metode analisis yang responsnya berupa presence atau absence (ada atau
tidak ada) yang dideteksi baik secara langsung maupun tidak langsung
terhadap jumlah sampel
A. Uji Katalase
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri
yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat
memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk
pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai
enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang
termasuk katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus,
dan Clostridium.
Uji ini dilakukan dengan langk ah :
1. Mengambil kultur sampel dengan ose secara aseptis dari agar miring
dengan meijarkan ose dan mendinginkannya.
2. Biakan digoreskan pada petridish agar sel rata dan tidak bertumpuk.
3. Kultur mikroba kemudian ditetesi 1-2 tetes H2O2 3% agar aktivitas
katalase pada mikroba dapat diketahui.

17
 4. Petridish ditutup kembali agar tidak ada kontaminasi dan
memaksimalkan mikroba untuk merombak H2O2.
5. Amati ada tidaknya gelembung-gelembung kecil. Jika terdapat
gelembung maka dalam petridish tersebut merupakan bakteri katalase positif,
sebaliknya jika tidak ada gelembung termasuk bakteri katalase negatif.

Keberadaan H2O2 pertama kali dideteksi pada kultur Pneumococcus,

sebuah organismeyang tidak memproduksi katalase dan sedikit sensitif
terhadap peroksida. Organisme yang tidak memproduksi katalase dilindungi
oleh penanaman dengan jaringan hewan atau tumbuhan atau organisme lain
yang mempunyai kemampuan memproduksi enzim. Katalase diproduksi oleh
beberapa bakteri. Beberapa bakteri diantaranya memproduksi katalase lebih
banyak daripada yang lain. Ini ditunjukkan dengan jumlah yang banyak pada
bakteri aerob. Sedangkan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob obligat
karena mereka tidak memerlukan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob
obligat karena mereka tidak memerlukan enzim tersebut.

Bakteri katalase positif seperti S. Aureus bisa menghasilkan gelembung-

gelembung oksigen karena adanya pemecahan H2O2 (hidrogen peroksida) oleh
enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Komponen H2O2 ini
merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, misalnya S. aureus,
dimana hasil respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri
karena bersifat toksik bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini
harus dipecah agar tidak bersifat toksik lagi.

Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal

ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif,
misalnya, L.casei sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase
negatif tidak memiliki enzim katalase yang menguraikan H2O2.

Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan respirasi,

bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2. Bakteri
yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka
segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang
dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan memecah H2O2 menjadi
H2O dan O2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase

18
 tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan
yang telah dilakukan.

B. Kit diagnostik
Kit diagnostik dapat digunakan untuk mendeteksi adanya mikroorganisme
patogen secara sederhana, mudah, teliti. Misalnya untuk mendeteksi adanya
E.Coli, Salmonella, dan Staphylococcus.
Uji Enterobacteriaceae dan gram negatif lainnya
Untuk menguji bakteri yang tergolong Enterobacteriaceae dan gram
negatif lainnya dapat digunakan sistem UniScept API 20E. Sistem ini
menggunakan 23 macam uji biokimia untuk mendeteksi koloni yang diisolasi
dari contoh, dimana isolat yang diuji harus murni sehingga dapat terhindar dari
kesalahan. Substrat kering yang mengandung pereaksi untung berbagai uji
biokimia masing-masing masing ditempatkan dicawan mini yang diatur
berderet dan ditempelkan pada kertas karton. Penambahan bakteri yang akan
diuji akan menyebabkan rekonstitusi subsrat tersebut. Reaksi biokimia yang
terjadi dapat terlihat setelah 18-24 jam dengan melihat indikatorpada tabung,
kemudian dicocokan pada label yang tersedia untuk mengidentifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi E.Coli dapat digunakan RIM (Rapid Identification
Method) yang memerlukan waktu satu jam. Dalam metode ini swab yang telah
dijenuhkan dengan masing-masing pereaksi diinokulasi dengan isolat
mikroorganisme yang diambil dari medium padat, kemudian swab
ditempatkan kedalam tabung yang berisi bufer dan diinkubasi selama 30
menit. Aktifitas enzim dapat dilihat dari reaksi yang terjadi didalam tabung
tersebut.
Sistem minitek TM digunakan untuk membedakan Enterobacteriaceae
dari organisme lainnya yang hampir sama dalam waktu 24 jam. Sistem ini
menggunakan lepengan kertas (paper disk) yang telah djenuhkan dengan
berbagai substrat dengan berbagai uji biokimia. Setelah ditetesi dengan
suspensi bakteri, diinkubasi dan ditambahkan pereaksi tertentu, diamati
perubahan warna yang menunjukkan reaksi biokimia, dan disesuaikan dengan
standar tabel.

19
C. Analisis Fotometrik terhadap perubahan biokimia
Auto Micromic System merupakan suatu sistem otomatis berdasarkan uji
biokimia yang dimonitor dengan melewatkan sinar melalui contoh. Dapat
diidentifikasi berbagai jenis mikroorganisme berbdasarkan sistem komputer,
termasuk bakteri gram negatif basili, bakteri gram positif koki, khamir, bakteri
aerobik, bakteri pathogen, dsb.

D. Metode MUG (4-metibumbeliferil-beta-D-Glukoronida)

MUG (4-metibumbeliferil-beta-D-Glukoronida) adalah suatu komponen
yang dapat dihidrolisa oleh enzim glukoronidase yang diproduksi oleh galur
yang tergolong E.Coli, Shalmonella, dan Shigella menghasilkan produk yang
bersifat fluorogenik. Jika pereaksi MUG ditambahkan kedalam medium agar
yang sesuai dan diinkubasi, adanya E.coli dapat dideteksi sebagai fluorenses
dibawah sinar UV gelombang tinggi dalam waktu 4-24 jam.

E. Metode elektroforesis
Metode ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi organisme yang
terdapat di dalam makanan elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan
protein pada gel menjadi pita-pita polipeptid, menggunakan muatan listrik.
Masing-masing spesies mikroorganisme mengandung berbagai polypeptide
dengan macam dan jumlah yang berbeda. Dengan menggunakan metode ini
dapat diketahui pola peptide suatu bakteri, dan jika dicocokan dengan standar
yang ada dapat diketahui spesies bakteri tersebut.

F. Metode filtrasi membrane

Metode ini banyak digunakan untuk mendeteksi adanya mikroorganisme
tertentu di dalam makanan, misalnya mendeteksi adanya salmonella,
Salmonella merupakan salah satu bakteri pathogen yang berbahaya, dan tidak
boleh ada dalam makanan. Maka dari itu jika ada indikasi makanan terdapat
bakteri salmonella dilakukan metode filtrasi membrane yang teruji sebagai
salah satu metode yang sangat sensitive terhadap ada atau tidaknya bakteri
salmonella pada suatu makanan.

G. Metode radioimunoasai (RIA)

20
 Metode ini banyak digunakan dalam mendeteksi toksin mikroorganisme di
dalam makanan, misalnya mikotoksin, toksin botulinum, enterotoksin-
stapilokokus, dan enterotoksin-perfringens. Prinsip metode ini adalah
penetapan suatu toksin mikroorganisme berdasarkan atas reaksi kompetisi
antara sejumlah toksin yang diberi label redioaktif dengan jenis toksin yang
sama, di dalam contoh, terhadap sejumlah antibody standar.

H. Metode hibridisasi DNA

Metode ini digunakan untuk mendeteksi bakteri dalam makanan secara
tepat dan teliti. Dalam asai hibridisasi menggunakan prob DNA, yaitu DNA
ulir tunggal yang telah di labeli dengan radioaktif, dimana pola urut-urutan
base nya tepat komplementari dengan DNA organisme yang akan diuji. Jika
dicampur dengan contoh yang mengandung DNA target dari mikroorganisme
yang diuji, DNA prob akan melakukan hibridisasi, membentuk ulir ganda yang
berlabel,yang kemudian dapat dideteksi dan diukur.

21
 BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan
1. Prinsip utama metode iMPN adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam
dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang
tetapi tidak selalu”.
2. Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah
menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar, sehingga
mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop

III.2 Saran

Diharapkan dalam pembuatan makalah selanjutnya agar lebih memperbanyak atau

mencantumkan lebih banyak lagi metode dalam metode cepat analisi mikrobiologi.

22
 DAFTAR PUSTAKA

Buckle,K .A., R.A Edwards,G.H. Fleet,dan M.Woottoon, 1985, Ilmu Pangan, UI-Press,
Jakarta.

Dwidjoseputro, D.1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.

Fardiaz, S., 1996, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Radja Grafindo Persada, Jakarta.

Gobel, Risco B. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Universitas Hasanuddin,

Makassar.

Kawuri, R., Y. Ramona dan I. B. G. Darmayasa, 2007, Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Farmasi, Jurusan Biologi F. MIPA UNUD, Bukit Jimbaran.

Lim, D, 1998, Microbiology 2nd edition, United States of America, McGraw Hill.

Pakadang, S., 2010., “Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi”, Jurusan Farmasi
Politeknik Kesehatan Depkes Makassar, Makassar.

Penn, C. 1991. Handling Laboratory Microorganism. Open University, Milton Keynes.

Plummer, D. T., 1987, An Introduction to Practical Biochemistry, Tata Mc-Graw Hill

Publishing Company LTD, Bombay- New Delhi.

23
Suriawiria, U., 1985, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia. Jakarta.

Umbreit, W.W, 1960, Aplied Microbiology, Academic Press, London.

http://www.pintarbiologi.com/2016/02/pemeriksaan-kualitas-air-dan-makanan-metode-
tpc.html

24