5/19/2015

Caracterele şi markerii

caracter –

Biotehnologii proprietate/insuşire/trăsătură/calitate
observabilă dobandită sau moştenită

M k ii genetici
Markerii ti i ca răspuns la determinată
acţiunea genetic
mediului
înconjurător

Caracterele şi markerii Caracterele şi markerii

polimorfism – mai multe forme polimorfism – mai multe forme

Caracterele şi markerii Caracterele şi markerii

caracter –
proprietate/insuşire/trăsătură/calitate
polimorfism – mai multe forme observabilă dobandită sau moştenită

ca răspuns la determinată
d t i tă
acţiunea genetic
mediului
înconjurător

polimorfism – mai multe forme

marker genetic –
morfologic (fenotipic)
biochimic
molecular

1
 5/19/2015

Markerii genetici Markerii (genetici) moleculari

Tipuri Definiţie

Markerii (genetici) moleculari pot fi definiţi în mai multe feluri:

(a) a chromosomal landmark or allele that allows for the tracing of a specific
region of DNA;
morfologici
(b) a specific piece of DNA with a known position on the genome;

(c) a fragment of DNA that is associated with a certain location within the
genome; molecular markers are used in molecular biology and biotechnology to
identify a particular sequence of DNA in a pool of unknown DNA;
biochimici hormoni, enzime (izoenzime/aloenzime), anticorpi
(d) a gene whose phenotypic expression is usually easily discerned, used to
identify an individual, species or a cell that carries it, or as a probe to mark a
nucleus, chromosomes, or locus;

(e) a short DNA sequence, such as a sequence surrounding a single base-pair

moleculari change (single nucleotide polymorphism, SNP), or a long one, like minisatellites;

(f) are regions in the genome that are heritable as simple Mendelian traits, are
easy to document and can be used to quickly detect genetic variation.

Markerii (genetici) moleculari Markerii (genetici) moleculari

Definiţie Aplicaţii

Markerul molecular este reprezentat de un fragment (regiune) din Analiza diversităţii genetice şi înrudirii
molecula de ADN care permite deosebirea/identificarea între sau în cadrul populaţiilor, speciilor
• unui individ (separarea de alţi indivizi sau apartenenţa la un anumit
grup sau categorie)
sau indivizilor
• unui caracter fenotipic (anatomic, morfologic)
• unui caracter biochimic
• unui caracter molecular (alt fragment/regiune de ADN).
analize/studii/discipline comparative
Practic, se poate afirma că markerul molecular este asociat individului/ anatomie, morfologie, embriologie,
caracterului. psiohologie
Fragmentul de ADN poate avea
• mărime (număr de nucleotide)
+
• structură (secvenţă nucleotidică) molecular
• rol genetic (codificator sau ne-)
• localizare la nivelul genomului (poziţie/locus)
foarte variabile.
polimorfismul ADN-ului şi proteinelor
Poziţia markerului la nivelul genomului poate sau nu să fie cunoscută. aplicaţii în filogenie(-genetică),
Metodele de studiu/analiză bazate pe markeri moleculari sunt de
taxonomie, ecologie, genetică,
asemenea foarte variate. ameliorare, medicină

Markerii genetici Markerii genetici

Caracteristici !

• polimorfism – moderat, înalt

Locus
• transmitere – codominantă
• posibilitatea de discriminare precisă a alelelor
Genă
• stabilitate
• repetabilitate şi reproductibilitate Alele (variante)
• transferabilitate
Genotip (combinaţia de alele)
• detectare/observare – uşoară, ieftină, automatizare
• creare/dezvoltare – uşoară, ieftină Fenotip (caracter, combinaţia de...)

• identificarea
• deosebirea
• discriminarea

2
 5/19/2015

Markerii genetici Markerii biochimici

Transmitere

alozime – enzime produse de alele (forme) diferite ale aceleiaşi

Makerilor biochimici şi moleculari le sunt caracteristice
două modele de transmitere:
((1)) dominantă/recesivă
/
(2) codominantă.
În cazul în care structura genetică homozigotă poate fi
deosebită de cea heterozigotă, markerul este
codominant, iar acest tip este cel mai informativ.
+ -
interacţiunea dintre gene şi
mecanismele de formare a
caracterlor
gene
-
izoenzime – enzime produse de gene diferite dar care catalizează
aceeaşi reacţie
în trecut, au reprezentat cea mai utilizată clasă de markeri (cost redus,
simplitate şi expeditivitate dpdv. tehnic, uşor de dezvoltat), dar au fost
surclasaţi de markerii moleculari, care sunt mai informativi (pot evidenţia
un grad mai ridicat de polimorfism şi la nivelul mult mai multor loci) şi mai
stabili (nu sunt influenţaţi de vrstă sau anatomie)
-
se bazează pe mobilitatea electroforetică diferită determinată de mici
diferenţe în secvenţa de aminoacizi
variabilitatea/diversitatea evidenţiată astfel este cea de la nivelul funcţional
al genelor
-
caracteristici: transmitere simplă, exprimare codominantă, penetranţă
completă, lipsa interacţiunilor epistatice şi pleiotropice

Markerii biochimici Markerii biochimici,

allozymes ≡ isozymes

Secvenţierea Markerii moleculari

Markerii moleculari au revoluţionat domeniul analizelor

moleculare genetice, depăşind limitările markerilor biochimici.
-
În prezent, există un mare număr de astfel de sisteme ce
permit evaluarea directă a informaţiei genetice şi la nivelul
întregului genom.
-
Influenţa factorilor de mediu şi stadiului ontogenetic este
neglijabilă.
-
Există două mari grupuri de markeri moleculari:
(1) bazaţi pe hibridarea moleculară (ADN-ADN) (ex. RFLP)
(2) bazaţi pe reacţia PCR – amplificarea fragmentelor de ADN
(ex. RAPD, ISSR, SSR, SCAR, AFLP, SNP, CAPS)
(3) secvenţierea.

3
 5/19/2015

Markerii moleculari Markerii moleculari

Fiecare tip de markeri (moleculari şi genetici) prezintă Amprentare genetică/moleculară

avantaje şi dezavantaje, de aceea, utilitatea şi aplicabilitatea Profil genetic
unui sistem de markeri nu au caracter universal. Genotip(iz)are
- Testare genetică
Alegerea markerilor depinde, în principal, de sopul urmărit.
- DNA profiling
De ex.: DNA fingerprinting
(1) sistemul RFLP este destul de mult utilizat, dar necesită DNA (geno)typing
ADN de foarte bună calitate şi caracterizare moleculară Genetic testing
prealabilă
(2) markerii AFLP au un grad mare de reproductibilitate, dar
prezintă dezavantaje tehnico-materiale
(3) sistemele RAPD şi ISSR sunt preferabile în cazul lipsei
caracterizării moleculare şi a resurselor materiale
(4) markerii SCAR necesită o foarte bună caracterizare
moleculară (i.e. secvenţiere)
(5) CAPS, SSR, SNP etc.

Tipuri de markeri markeri Tipuri de markeri markeri

moleculari – ex. #1 moleculari – ex. #2

Tipuri de markeri markeri Tipuri de markeri markeri

moleculari – ex. #2 moleculari – ex. #3

4
 5/19/2015

Tipuri de markeri markeri Tipuri de markeri markeri

moleculari – ex. #3 moleculari

Tipuri de markeri markeri Markerii genetici

moleculari – ex. #3 Aplicaţii

Variabilitate genetică – genetica populatiilor (+ gen. evoluţionistă +

filogen. moleculară etc.)
-
studiul frecvenţei genelor/alelelor şi a interacţiunilor dintre acestea sub
influenţa principalelor procese evolutive: selecţia naturală, driftul genetic,
mutaţia, fluxul genelor

Selecţia
S l ţi asistată
i t tă de
d markeri
k i (+ ameliorarea
li asitată
it tă de
d markeri)
k i)
-
selecţia indirectă a formelor ce prezintă o caracteristică genetică dorită (şi
implicit un fenotip dorit)

Variabilitatea genetică

Variabilitatea Studiul variabilităţii genetice şi modelelor de diversitate

genetică intra- şi interspecifică şi intra- şi inter

genetică şi modele populaţională ajută la dezvoltarea metodologiilor de

(1) ameliorare (selecţie)
(2) domesticire
de diversitate (3) conservare

genetică intra- şi
Pentru atingerea acestor obiective este necesară
interspecifică şi selectarea (şi utilizarea) unor
markeri genetici (moleculari) corespunzători.

intra- şi
interpopulaţională în funcţie de:
numărul locilor studiaţi
gradul de polimorfism detectabil
costuri (resurse)

5
 5/19/2015

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică evaluabilă cu ajutorul markerilor

este reprezentată de diferenţele de la nivelul moleculei de
ADN, determinate de mutaţii – inserţii, deleţii, duplicări,
inversii. Provocarea constă în alegerea celor mai
potriviţi markeri moleculari, pentru
Mutaţiile pot determina modificări de natură funcţională, identificarea/evidenţierea variaţiei din cadrul
ce determină, la rândul lor, schimbări metabolice sau
fenotipice, sau pot fi neutre.
populaţiilor.

Variantele mutante pot:

(1) avea eficienţă metabolică sporită sau redusă
(2) avea diferite niveluri sau tipare de expresie genică în
diferite stadii fizologice sau de dezvoltare
(3) să îşi piardă complet funcţionalitatea
(4) să capete funcţii noi.

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

6
 5/19/2015

Variabilitatea genetică Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică

Selecţia asistată de
markeri
k i

Selecţia asistată de markeri Selecţia asistată de markeri

Aplicaţiile potenţiale ale markerilor moleculari:

selecţia asistată de markeri – selecţia indivizilor ce
prezintă caracteristici dorite, pe baza analizei
QTL – quantitative trait locus – locus asociat unui caracter
genotipice moleculare; se poate utiliza singură sau în
cantitaitv (!poligenic)
combinaţie cu metode de selecţie clasice;
ameliorarea asistată de markeri – orice aplicaţie a
QTL l reprezintă
QTL-ul i tă o regiune
i cromozomalălă în
î cadrul
d l căreia
ă i
markerilor moleculari în cadrul programelor de
este situată o genă
ameliorare, în vederea eficientizării acestora.
sunt situate mai multe gene
ce influenţează semnificativ (controlează) un caracter
cantitativ. De obicei, regiunile QTL identificate includ mai
Selecţia asistată de markeri poate fi:
multe gene asociate unui caracter cantitaiv, dar nu pe
selecţia indirectă bazată pe markeri QTL
toate.
selecţia directă bazată pe genele codificatoare a
caracterelor de interes.

7
 5/19/2015

Selecţia asistată de markeri Selecţia asistată de markeri

SELECŢIA INDIRECTA BAZATĂ PE MARKERI QTL SELECŢIA INDIRECTA BAZATĂ PE MARKERI QTL
-
Toate formele de selecţie indirectă presupun selecţia unui caracter (i.e. Se încrucişează doi indivizi cu forme extreme ale
markerul) corelat cu o variantă superioară a altui caracter (caracterul ţintă fenotipului de interes. Aceştia sunt caracterizaţi
dpdv. genetic (i.e. structura genetică pentru cei trei
sau de interes). markeri este cunoscută).
-
Principiu: Din generaţia F1, se încrucişează două forme cu
fenoptip intermediar şi structură genetică
populaţii corespunzătoare (i.e. segregante) sunt utilizate pentru identificarea g
heterozigotă.
asocierilor
i il (înlănţuirea/linkage)
(î lă i /li k ) dintre
di markeri
k i moleculari
l l i (de
(d obicei
bi i
necunoscuţi) şi QTL-uri; În generaţia F2 are loc segregarea,
asocierea înseamnă că anumite alele ale locusului ce reprezintă markerul atât fenotipică, cât şi genotipică.
corespund unei frecvenţe ridicate a alelelor QTL favorabile;
practic, corelaţia (asocierea) markerului şi caracterului de interes este
determinată de linkarea markerului cu o regiune cromozomală pe care Fiecare descendent este genotipat
pentru cei trei markeri.
este prezentă şi o genă ce influenţează semnificativ caracterul
ţintă (i.e. QTL) Markerul B-b este codominant.
sunt prezente mai multe gene care influenţează caracterul ţintă
(i.e. QTL).
- Cu ajotorul testelor statistice se identifică o
De obicei, markerii QTL se pot utiliza cu succes doar în cadrul familiilor în asociere între clasele genotipice (markerul B-b) şi
care au fost identificaţi; în cadrul altor familii, s-ar putea ca înlănţuirea formele fenotipului de de interes:
genotipul BB este asociat dimensiunii mari
iniţială (între alele) să nu existe. genotipul Bb este asociat dimensiunii intermediare
- genotipul bb este asociat dimensiunii reduse.
Selecţia asistată de markeri indirectă reprezintă o extindere a selecţiei
indirecte clasice.

Selecţia asistată de markeri Selecţia asistată de markeri

SELECŢIA DIRECTĂ BAZATĂ PE GENELE CODIFICATOARE A
CARACTERELOR DE INTERES
-
Această formă de selecţie asitată de markeri presupune selecţia
directă a alelelor individuale specifice unuia sau mai multor loci
ce influenţează caracterul poligenic. Pentru aceasta, este necesară
cunoaşterea, la nivel molecular, a uneia sau mai multor gene
implicate în controlul caracterului de interes. Practic, markerii
sunt reprezentaţi de polimorfisme (variante) ale genelor ce
controlează direct caracterul poligenic.
- Cel mai important aspect se referă la structura genetică a caracterului de interes.
Pentru a fi eficientă, selecţia moleculară directă trebuie aplicată
mai multor (tuturor) loci ce controlează caracterul poligenic de
interes.
- dificilă.
Toate formele de selecţie asistată de markeri pot fi utilizate
separat sau împreună cu metodele de selecţie clasică.
AVANTAJE ŞI DEZAVANTAJE
-
Selecţia asistată de markei prezintă numeroase beneficii, fie utilizată împreună
cu metodele clasice, fie singură:
(1) posibilitatea reducerii duratei ciclui de ameliorare;
(2) reducerea costurilor legate de testarea populaţiilor de descendenţi;
(3) creşterea intensităţii selecţiei;
(4) creşterea eficienţei de selecţie a caracterelor cu heritabilitate
redusă.
-
Există şi câteva dificultăţi semnificative în utilizarea eficientă a selecţiei asistate
de markeri, care se întâlnesc la orice tip de organisme (i.e. plante agricole şi
horticole, animale, specii forestiere).
Dacă acesta se află într-adevar sub controlul a zeci/sute/mii de loci, fiecare cu
având un mic efect fenotipic, atunci este imposibilă detecţia tuturor locilor, iar
identificarea unor markeri asociaţi poate fi de asemenea imposibilă, sau foarte
Un alt factor ce limitează eficienţa selecţei bazate pe markeri QTL, este
posibilitatea variabilităţii caracterului de interes în funcţie de factorii de mediu
sau de genomul analizat.

Ameliorarea asistată de markeri Selecţia asistată de markeri

Eucalyptus grandis

AMELIORAREA ASISTATĂ DE MARKERI Eucalyptus urophylla

Deşi au fost obţinute realizări importante cu ajutorul

metodelor clasice de ameliorare, selecţia asistată de
markeri oferă potenţialul de sporire a eficienţei acestora. ♀ E. grandis x E. urophylla ♂
Ameliorarea asistată de markeri se referă deci la diferite
aplicaţii ale markerilor moleculari în cadrul programelor F1 E. urograndis
de ameliorare.
ameliorare
-
Astfel, pe lângă procesul de selecţie, markerii moleculari
pot fi utilizaţi şi în alte etape/faze ale acestor programe:
alegerea schemelor de hibridare
testarea (genetică a) descendenţei (genotipare)
management şi controlul calităţii
etc.
-
Se doreşte:
sporirea valorii genetice,
reducerea costurilor,
scurtarea intervalul dintre generaţii şi
eficientizarea controlului calităţii.
distanţă de izolare

8
 5/19/2015

Selecţia asistată de markeri Selecţia asistată de markeri

E. urograndis Analiza ♀ E. grandis
nu toţi descendenţi provin din clona
vârstă 6 ani utilizată în plantaţie
A – circumferinţa trunchiului
Analiza ♂ E. urophylla
n1 – îndeplinesc criteriul A două dintre clonele utilizate ca
n2 – aleşi la întâmplare polenizatori sunt identice
n3 – nu îndeplinesc criteriul A -
nu toţi descendenţi provin din clonele
utilizate în plantaţie
-
Markeri moleculari microsateliţi
ţ n1 – cea mai mare p parte dintre descendenţi
ţ
provin doar din trei clone
-
autopolenizare – lipseşte în n1; proporţie
mică în n2; proporţie mare în n3

validarea sistemului
îmbunătăţirea managementului

distanţă de izolare distanţă de izolare

Selecţia asistată de markeri