BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA

Biotecnologia é uma área multi- e interdisciplinar que pode ser definida como a aplicação industrial das
ciências Biológicas e da Engenharia e sua aplicação a organismos, células e moléculas biológicas
(componentes biológicos) para obtenção de produtos e serviços de valor acrescentado.

Crescimento
Preparação do Operação
das Células
meio de usando células Recuperação Armazenamento
Imobilização Produto Purificação
Crescimento e ou enzimas (Concentração) do Produto
(Celular ou
Esterilização imobilizadas
Enzimática)

A biotecnologia assenta na crescente compreensão dos mecanismos que mantêm os organismos vivos e
que lhes permite o fenómeno da reprodução. A área da Biotecnologia Moderna é relativamente recente,
tendo aparecido nos últimos 20-25 anos, contudo a Biotecnologia Tradicional remota aos primórdios da
Humanidade.

BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL
O Homem tem aproveitado e adaptado organismos vivos nas Biotecnologias tradicionais, que incluem a
preparação de bebidas fermentadas, silagem, lacticínios e também a agricultura. Em relação à Indústria
Farmacêutica, destaca-se a produção de antibióticos, nomeadamente de Penicilina na 2ªGuerra Mundial,
com uma produção em larga escala. Caracterizada por biofármacos de baixo peso molecular.

BIOTECNOLOGIA MODERNA
Está sempre associada à produção de fármacos, sendo a maior parte resultante de Tecnologias de DNA.
Na Biotecnologia Moderna, fala-se obrigatoriamente na Biotecnologia das Proteínas em que há recurso a
técnicas de DNA Recombinante, que visam a manipulação desse mesmo DNA (Indução de um
determinado microrganismo para produzir em excesso determinada proteína, ou produzi-la de forma
modificada). Atualmente são manipuladas pequenas regiões do genoma de um organismo,
posteriormente introduzidas no interior de outro organismo, sem qualquer relação filogenética: é
ultrapassada a barreira natural das espécies  Transgénicos

O primeiro biofármaco de alto peso molecular foi produzido em 1982, utilizando Tecnologia de DNA
Recombinante, tratando-se da Insulina.
Com a evolução da ciência foi possível a sequenciação genómica,
possibilitando assim a identificação de novos alvos terapêuticos e obtenção
de novos fármacos.
Os microrganismos usados na produção de antibióticos foram desenvolvidos
através da mutação e seleção de estripes anteriormente, menos produtivas
e eficazes.
No entanto, o desenvolvimento da produção de proteínas recombinantes requer uma investigação
dispendiosa que eleva os custos dos biofármacos (os custos de produção não são necessariamente
elevados).
 A Biotecnologia Farmacêutica tem assim, como objetivo geral, a promoção da aquisição e aplicação de
conhecimentos sobre a produção de medicamentos por via biotecnológica. Desta forma, evidencia o
importante papel destes medicamentos, das fontes de obtenção, da produção propriamente dita e a
dispensa pelo farmacêutico.

Aplicações e áreas de mercado da Biotecnologia: Farmácia/Medicina (Biotecnologia encarnada),

Agroalimentar (Biotecnologia Verde), Biorremediação (Biotecnologia Cinzenta), Marinha (Biotecnologia
azul), Produção de Polímeros e de Químicos (Biotecnologia Branca).
Bioprocessos originam processos industriais mais limpos, com grande potencial para encontrar soluções
ambientais, reduzindo consumo energético.

Farmacêuticas (Biotecnologia Vermelha)

o Farmacogenómica Diagnóstico
o Produção de medicamentos o Testes de gravidez
o Terapia génica o Testes de vírus
o Vectores (vírus, lipossomas) o Testes de propensão de doenças
o Ac para identificação de várias proteínas
Fatores a considerar:
Diferentes fases de aprovação, entidades reguladoras (FDA/EMEA), incidência de doença, opinião
pública

Agro-alimentar (Biotecnologia Green)

o Fornecimento de maior produção
o Obtenção de um produto com características melhor
adaptadas ao fim a que se destina
o Plantas resistentes a doenças
o Condições adversas de cultura
o Fitofármacos
o Plantas resistentes a doenças e insectos
o Plantas resistentes a herbicidas
o Esterilidade
o Novas características morfológicas e fisiológicas
o Cores de plantas ornamentais
o Sabores e aromas

Aplicações industriais (Biotecnologia branca)

o Vitaminas o Enzimas novas a partir de organismos extremófilos

o Novos materiais para próteses o Novas fibras
o Novos corantes

CARACTERÍSTICAS DO MERCADO EM BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA

o Ciclos Longos
Um medicamento demora em média 10anos para chegar
ao mercado, patentes levam tempo a ser concedidas.
o Investimentos avultados
Para colocar um medicamento no mercado são gastos
cerca de 800milhões de Euros
o Retorno apreciável
Risco/retorno, 2/3 dos medicamentos no mercado não
geram receitas para pagar o I&D efetuado
o Muito Sustentado pela Industria Farmacêutica
10% das vendas de medicamentos já são de produtos com
origem biotecnológica
BIOFÁRMACOS

Todo o fármaco obtido por via biotecnológica que inclua a engenharia genética, em parte ou na totalidade
da sua obtenção. Fármacos cujo desenvolvimento envolve sempre a manipulação genética (RNA e DNA),
efetuada por tecnologia de DNA recombinante (as proteínas recombinantes são biofármacos). A insulina
foi o 1ºbiofármaco produzido a nível mundial.
o Menos tóxicos e com melhores índices de
o Mais puros, menos efeitos laterais metabolização (atuam de modo semelhante às
o Mais eficazes, atuando em baixas doses moléculas fisiológicas)
o Mais específicos, atuando numa só célula ou órgão o Mais baratos, com maior rendimento, menor mão-
de-obra, apesar de investigação muito mais cara

FÁRMACOS OBTIDOS POR VIA BIOTECNOLÓGICA

Neste grupo estão incluídos os biofármacos, mas também aqueles que são obtidos por biotecnologia
tradicional, ou seja, não são proteínas recombinantes. Nestes últimos, os microrganismos podem ser
manipulados geneticamente (ex: AB, esteroides, enzimas propriamente ditas).
BIOTECNOLOGIA DE PROTEÍNAS
Está relacionada com o isolamento, produção e comercialização de proteínas específicas de plantas,
animais e fontes microbianas e/ou subsequente utilização destas proteínas de modo a encontrar um
objeto pré-definido.
Está associada a:
 Tecnologia de DNA recombinante
 Tecnologia de Fermentação

As proteínas para fins terapêuticos são normalmente produzidas em pequenas quantidades, estando
sujeitas a processos de separação e purificação rigorosos, que asseguram elevados graus de pureza.
 FERMENTAÇÃO

A fermentação consiste num tipo de catabolismo que se processa em anaerobiose (referente à

respiração anaeróbia), em que ocorre a degradação da glucose.

Glucose  etanol + ácido láctico

Contudo, em Biotecnologia tem um sentido mais lato, sendo definido como o processo levado a cabo
por células vivas, ocorrendo sempre que temos crescimento, não apenas em anaerobiose. No final
obtemos produtos de fermentação como álcoois, ácidos, AB, enzimas…

BIOTRANSFORMAÇÃO

Reação em que o substrato é convertido no produto por ação de um catalisador biológico.

Processo em que a ação de enzimas sobre substratos orgânicos leva a cabo transformações químicas,
estejam as enzimas.
 Dentro de células vivas, de células em estado latente, de células mortas
 Isoladas

BIORREATORES
o Reatores para biotransformação
Onde ocorrem reações executadas por enzimas, purificadas ou não. Ocorrem reações
enzimáticas com células que não estão em crescimento. Só executam determinada reação
enzimática.

o Reatores enzimáticos
Biorreactores onde há a produção de enzimas

o Fermentadores
Recipientes usados no crescimento de células

Classificação dos bioreactores quanto ao modo de funcionamento:

EM CONTÍNUO
No ínicio coloca-se uma determinada quantidade de meio, contendo alguns nutrientes e substratos. Contudo, durante o processo
vai havendo entrada de nutrientes com a saída em simultâneo de meio contendo produtos, células e nutrientes não convertidos.
Tem grandes vantagens, mas não é muito usado pois a entrada contínua de meio é muito suscetível a sofrer contaminações.

EM DESCONTÍNUO (“BATCH”)
Quando se inicia o processo nestes biorreactores, são colocados logo de início todos os nutrientes e substratos necessários ao
processo. Não há entrada nem saída de meio no biorreactor. É comum a nível farmacêutico industrial.
Um biorreactor em descontínuo pode também funcionar em contínuo.

EM SEMI-DESCONTÍNUO (“FED-BATCH”)
Situação intermédia entre o biorreactor contínuo e descontínuo. Neste caso não há sempre entrada e saída de meio. No início
colocam-se os nutrientes e apenas ao fim de alguns intervalos de tempo são adicionados nutrientes.
É o mais usado na indústria farmacêutica.
 MODO DESCONTÍNUO MODO SEMI-CONTÍNUO MODO CONTÍNUO
1) Elevada conversão de 1) Produtividades Volumétricas elevadas
1) Produtividade volumétrica superior
nutrientes e produtos (a fase de latência de crescimento é
2) Elevada conversão de nutrientes e
minimizada)
produtos
2) Facilidade de execução e 2) A taxa específica de crescimento é
3) Possibilidade de operar abaixo das []
controlo mantida constante ao longo do tempo
inibitórias
Vantagens 3) A adição constante de substrato
4) O metabolismo pode ser manipulado
3) Aprovado pela FDA para a permite trabalhar abaixo da []
por controlo da concentração de
produção de proteínas inibitória
nutrientes
recombinantes 4) O metabolismo pode ser manipulado
5) Elevada concentração final de
por controlo da [] de nutrientes
produto.
4) Volume Constante
1) Inibição pelo produto 1) Utilização incompleta de nutrientes
1) [S] inicial tem que ser inferior 2) Taxa de diluição máxima tem que ser
2) Maior duração da cultura pode
às concentrações inibitórias inferior a μmax, p evitar “wash-out”
conduzir a uma maior degradação do
Desvantagens 3) Não são utilizados sistemas que
produto
2) Impossibilidade de necessitam de indução
3) Não aprovado para produção de
manutenção da [S] 4) Risco de contaminação
proteínas recombinantes
MONOGRAFIA: PRODUTOS DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE

Produzidos em microrganismos ou células modificados – Célula

Hospedeiro, através da expressão de um gene inserido por via de um plasmídeo ou vetor: Vetor e
tradução proteica

Adequabilidade do sistema vetor – célula hospedeira

Gene: origem, identificação, sequência nucleotídica e isolamento

Construção génica: etapas de construção, sequência nucleotídica e mapa de restrição, regiões

de controlo do vetor, junções ligadas sequenciadas, identificação de sequências de expressão.

Sistema vetor: células hospedeiras: mecanismo de transferência do vetor, número de cópias e

estabilidade do vetor incorporado

Validação de Sistema de Banco Celular:

Master cell bank (MCB): pool homogénea de células originais transformadas = sistema vetor-célula
hospedeiro

Working cell bank (WCB): suspensão homogénea de células derivadas do MCB numa mesma passagem,
dividida em alíquotas para produção em sistemas de cultura contínua ou em passagem fixa.

Validação do processo de fabrico:

Extração e Purificação: capacidade de remoção de contaminantes provenientes das células (DNA, HCP,
proteínas) ou do meio de cultura (agentes adventícios).

Validação: capacidade de exclusão de agentes adventícios, de remoção do vetor, das células, meio de
cultura, contaminantes de processo, rendimento de produção definido, estabilidade.

Substância ativa: identidade, pureza, potência e estabilidade, análise química, física, imunoquímica e
biológica

Consistência de fabrico: controlo de processo e de produto

Controlo do banco celular de produção (MCB e WCB) e avaliação da contaminação viral, bacteriana,
fúngica ou por micoplasmas.

Caracterização da construção genética

Sistema de expressão:

o Vetor de expressão com vetor de expressão com o gene recombinante

o Origem do material genético de partida, genes de resistência antibióticos, promotores,
enhancers inseridos no vetor
o Construção/produção de proteínas de fusão
o Sequência nucleotídica dos genes e regiões de flanking, zonas de restrição/pontos de inserção
o Mapa do plasmídeo/construção génica
o Outras proteínas sintetizadas a partir de plasmídeo/construção génica

Transferência para a célula hospedeira: MCB e WCB

o Nº de passagens do banco celular – marcadores de fenótipo e genótipo
o Nº de cópias do vetor de expressão
o Inserções, deleções, pontos de integração
o % de retenção do sistema de expressão extracromossomal

Caracterização dos substratos celulares para produção

o Derivação e caracterização dos substratos celulares usados na produção de produtos
biológicos/de biotecnologia

Derivação e caracterização do substrato celular

Substrato celular = banco de células transformadas para produção

Célula parental humana/animal = tecido, órgão, etnia/espécie-estirpe, zona geográfica, idade, sexo,
saúde, patogénicos
Células microbianas= espécies, estirpe, genótipo, fenótipo, patogenicidade, toxicidade, células
parentais: isolamento, manipulação, seleção, dentificação/características, taxa de duplicação

Produção e manutenção de substrato celular: MCB e WCB

Método: fusão, transfecção, seleção, clonagem, amplificação genética, adaptação

Banco celular: idade de duplicação, nº de passagens
Identidade: espécie por isoenzimas, polimorfismo genómico; micróbio por crescimento seletivo pureza,
estabilidade
Tumorigenicidade só produtos pouco purificados

Estabilidade da expressão durante toda a fermentação

Análise transversal ao longo do processo de fermentação:
Caracterização genótipica e fenotípica do sistema vetor + células hospedeiras no início, no fim ou
mesmo algumas gerações depois, em vários lotes de produção.
o Mapa de restrição
o Sequenciação do gene de interesse por PCR
o Sequenciação do mRNA por RT-PCR
o Sítio de integração- hibridação in situ
o Nº de cópias integradas
Contaminantes
Contaminantes não virais:
o BSE, bactérias, micoplasma,fungos
o Certificação de matérias primas

Contaminantes virais :
o Materiais de origem biológica / tecidos ou linhagens celulares animais / materiais de origem
humana.
o Avaliação de cargas virais nas etapas de fabrico
o Avaliação de cargas virais do granel não processado
o Análise da inativação ou remoção viral pelo processo de fabrico
o Estudos em scale-down devidamente qualificados como representativos.

Produto final
Enquadrados no critério dos testes respetivos:
o Caracterização físico-química: heterogeneidade qualitativa /quantitativa
o Consistência de fabrico - libertação de lote
o Caracterização da actividade biológica in vivo ou in vitro: potência, libertação de lote
o Caracterização imunoquímica: identidade, homogeneidade, pureza, massa, libertação de lote
o Pureza: heterogeneidade / substâncias aparentadas, actividade específica
o Impurezas de processo: substrato celular (proteína, DNA do hospedeiro) / cultura celular
(antibióticos, soro, vírus) / processo (reagentes, ligandos)
o Impurezas de produto: degradação / agregação

Caracterização biológica

Bioensaio: mede a actividade do produto para produzir um efeito biológico determinado

Potência: mede a actividade biológica através de bioensaio quantitativo relacionado com um atributo
do produto relevante para o seu desempenho

Ensaios in vivo em animais (resposta biológica)

Ensaios em células cultivadas (resposta fisiológica, bioquímica)
Ensaios bioquímicos (reações enzimática, interferência imunológica)
Ensaios de afinidade (ligação a recetores específicos)
Expressos em unidade de atividade por comparação co padrões específicos

o Determina a actividade do produto

o Assegura qualidade e consistência de fabrico
o Apoia a análise de dados clínicos
o Denuncia falhas na produção
o Define especificação para libertação de lote
o Permite definir estabilidade da substância e / ou do produto
o Indispensável em comparabilidade

Comparabilidade / “Estudos de equivalência”

Caracterização físico-química
Iso-tipos, subclasse, microheterogeneidade, peso molecular, estrutura primária, secundária, glicosilação,
integridade

Caracterização biológica
Imunoreatividade e reação cruzada
 PROCESSO DE FABRICO DE FÁRMACOS POR BIOTECNOLOGIA

SEQUÊNCIA DAS OPERAÇÕES ENVOLVIDAS NUM PROCESSO INDUSTRIAL UTILIZADO A

BIOTECNOLOGIA

Preparação Imobilização Operação utilizando

Seleção do Crescimento Recuperação Armazenam
de Meio de Celular/Enzi células/ Enzimas Produto Purificação
biocatalizador das Células Imobilizadas (Concentação) ento
Crescimento ma

I. Seleção do biocatalizador

Os biocatalizadores permitem executar uma reação ou passos reacionais difíceis de executar por
métodos químicos. A biocatálise surge como uma alternativa à via química tradicional.

Natureza Forma Estado Fisiológico

Intracelulares Solúvel, Solúvel em H2O
Enzimas Suspensão,
Extracelulares Insolúvel em H2O
Tipos de Imobilizada
Biocatalizadores Não
Microbiana
Suspensão, metabolizadora
Células
Vegetal Imobilizada
Metabolizadora
Animal
Organelos

Aplicação dos biocatalisadores na indústria com sucesso:

o Substrato barato e facilmente disponível no mercado (fornecimento constante)
o Biocatalisador com elevada atividade e substrato concentrado, tamanho do reator
o Obtenção do máximo de conversão de substrato em produto
o Purificação e isolamento dos produtos facilmente se estes estão numa fase diferente do(s)
substrato(s)
o Facilidade de manutenção da esterilidade no reator (produtos antimicrobianos)
 Na seleção do biocatalisador é importante ter em atenção o processo global e não uma operação em
particular.
“The Product is the Process”
Assim, a sua escolha depende de alguns critérios:

1. Natureza da reação que se pretende que ocorra

Se esta se vai processar em meio aquoso ou numa
mistura de meio aquoso e meio orgânico
2. Necessidade ou não de recurso a cofatores
3. Escala à qual a biotransformação vai ocorrer
4. Avaliação da atividade catalítica
5. Avaliação da estabilidade do biocatalisador
6. Avaliação da estereoespecificidade
7. Avaliação da viscosidade da fase aquosa
8. Avaliação do processo de separação e recuperação
do produto
9. Custos
10. Patogenicidade
11. Características fisiológicas, taxa de crescimento,
fontes de carbono e energia

12. Características da proteína codificada

Processamento proteolítico, glicosilação, massa molecular
13. Características do gene a clonar
Frequência dos codões utilizados

14. Caso sejam processos que utilizem enzimas extracelulares nunca se pode recorrer a processos de
fermentação contendo os microrganismos inteiros
15. O biocatalisador tem que ser uma célula inteira viável pela necessidade de uma atividade particular

A biocatálise é uma alternativa relativamente aos processos químicos, isto porque os processos biológicos
apresentam inúmeras vantagens relativamente aos processos químicos, nomeadamente:

o Grande área específica, o que permite uma elevada taxa metabólica

o As reações decorrem a temperatura biológica e em soluções aquosas
o Gama de condições ambentais é vasta
o Os m.o. têm grande variedade de reções metabólicas, que permitem a sua adaptação a variadas
fontes de nutrição
o Os m.o. são suscetíveis de manipulação genética

Critérios de seleção de um biocatalisador:

1. Natureza da reação
2. Necessidade de cofatores
3. Escala a que a biotransformação
4. Para enzimas excretadas pelos microrganismos (amílases, protéases e lipases) não é possível a utilização de
microrganismos inteiros
5. O biocatalisador tem que ser uma célula inteira viável pela necessidade de uma atividade partículas (enzima
ligada à membrana, sistema de regeneração do cofator, utilização de um sistema multienzimático)
 Enzimas

As enzimas podem atuar como biocatalizadores. Podem ser enzimas intracelulares ou extracelulares,
podendo ainda ser usadas na forma solúvel ou insolúvel.

Enzimas Intracelulares: Permanecem no interior da célula quando são produzidas.

Para obtê-las numa forma purificada, é necessário provocar a lise da célula e
efetuar um processo de purificação subsequente.

Enzimas extracelulares: amílase, protéase, lípase

Estas enzimas vão sendo libertadas para o meio à medida que o organismo
cresce, sendo posteriormente purificadas desse meio. Neste caso não é possível
recorrer a células não metabolizadoras como alternativa.

Enzimas na Forma Solúvel: não são reutilizáveis, pois o processo de remoção da mesma do meio onde se
solubilizou é extremamente caro.

Enzimas na forma insolúvel: a enzima não se solubiliza no meio reacional, ficando em suspensão.
Isto permite a sua reutilização.

Objetivo da imobilização de uma célula ou enzima é convertê-la numa forma sólida tal que possa ser
recuperada ou retirada no reator. Um dos objetivos da imobilização de células inteiras é a substituição da
imobilização de enzimas intracelulares.

Vantagens:
o Grande especificidade reacional o Regio e enantioselectivos
o Elevadas velocidades catalíticas em condições o Altamente eficientes (elevadas produtividades)
relativamente suaves o Necessidades energéticas e custos de capital baixo
(temperatura ambiente, pressão atmosférica, o A sua especificidade minimiza a formação de
soluções neutras) produtos laterais não desejados

Células

Microrganismos são organismos unicelulares, ou pluricelulares, pouco diferenciados. As células podem

ser de origem microbiana, animal ou vegetal, contudo as células microbianas são preferidas. Quando
temos uma célula inteira, o objetivo é que funcione como enzima, ou seja, essa célula não vai estar em
crescimento. No interior destas células existem vários sistemas enzimáticos. Contudo, apenas estará ativo
aquele sistema correspondente ao substrato existente no meio reacional. Todos os outros sistemas vão
estar inativos pois não contêm os seus substratos no meio.

Células metabolizadoras: também designadas células viáveis ou em crescimento. Possuem todos os seus
sistemas viáveis a crescer. É o caso da produção de metabolitos 1ários e 2ários,
que ocorrem no fermentador.

Células não metabolizadoras: também designadas células não viáveis ou células em não crescimento.
Possuem apenas um ou outro sistema enzimático ativo, sendo que esse sistema
enzimático terá que ser intracelular. Este processo é complexo.
 Vantagens:

o Facilitam a cultura no fermentador

o Têm maior relação área/volume, permitindo uma rápida absorção de nutrientes e uma elevada
velocidade de metabolismo, gerando processos mais económicos
o Muito versáteis
(capacidade de converter compostos muito diversos e produção de grande variedade de
metabolitos finais)

Por vezes não é possível utilizar microrganismos e temos de recorrer a células eucariotas, apesar das
desvantagens que estas apresentam.
As células animais são eucariotas e portanto mais complexas, têm forma muito variada (30μm), não
apresentam parede celular rígida, o que constitui uma desvantagem, visto que as torna mais sensíveis às
condições do meio, no entanto sofrem modificações pós-traducionais como glicosilação.
Células de mamífero, células de inseto (são mais resistentes, de manipulação mais fácil e de crescimento
rápido).
O desenvolvimento de células animais, em geral, depende da superfície de adesão, mas algumas crescem
em suspensão.
Exemplo de células animais que crescem em suspensão:
• Células sanguíneas, Células de hibridomas (fusão de linfócitos B produtores de anticorpos com
células tumorais)
Como a maior parte das células e das superfícies de adesão estão carregadas negativamente, são
necessárias glicoproteínas (por exemplo fibronectina, gelatina) e/ou catiões divalentes (Ca 2+, Mg2+) que
promovam adesão célula suporte.

Organismo Vantagens Desvantagens

Sistema bem conhecido
Muitos vetores Não faz modificação pós-tradução
Controlo de expressão fácil Endotoxinas
Bactéria Genoma simples Proteína inclusa requer solubilização
Bom rendimento (g/L) Actividade biológica e imunogenicidade diferente da
Grande Escala nativa
Proteína inclusa ou excretada
Sem endotoxinas
Faz modificação pós-tradução
Glicosilação diferente
Genoma pequeno
Levedura Controlo da expressão difícil
Baixo custo
Proteína no citoplasma requer lise celular
Bom rendimento (0,1g/L)
Grande escala
Cultura difícil e cara
Modificações pós-tradução naturais
Crescimento lento
Células Muitos vetores
Genoma grande e recombinante instável
Mamífero Produção de quimeras
Baixo rendimento (0,01g/L)
Glicosilação idêntica
Maior risco viral
Glicosilação diferente
Crescimento rápido
Sistema de fermentação particular
Células Inseto Modificação pós-tradução
Produção cara
Bom rendimento (0,1g/L)
Ainda pouco conhecido
Taxa de crescimento variável
Modificação pós-tradução Rendimento fraco
Células Vegetais
Risco viral improvável Glicosilação diferente, imunogénica
Produção de metabolitos ativos, protéases
 Um dos processos chave num processo biotecnológico é a seleção dos microrganismos a usar. Para que
estes possam ser utilizados à escala industrial devem obedecer a determinados requisitos,
nomeadamente ausência de patogenicidade, não produtores de produtos tóxicos, crescimento e
metabolismo elevados e de preferência, fontes de carbono e energia pouco dispendiosas.
Outra vertente importante do processo biotecnológico é o desenvolvimento de biorreactores em larga
escala, de forma a minimizar os parâmetros que limitam a produtividade (ex.: oxigenação, difusão de
nutrientes, etc).
Os microrganismos mais usados são:
o Leveduras: Saccaromyces carvisiae
o Bactérias: E.coli
São considerados microrganismos seguros (“Generally Regarded As Safe” ou GRAS). Ultimamente têm
sido utilizadas células que apresentam maior rendimento na síntese de proteínas heterólogas, como é o
caso da Pichia pastoris (Levedura), que comparada com S.cerevisae possui menos problemas de baixa
glicosilação.

A qualidade, a funcionalidade, a
velocidade de produção e rendimento
da proteína são os fatores mais
importantes a considerar quando se
escolhe a sistema de expressão
heteróloga para produção de proteínas
recombinantes.

Os produtos produzidos por estes microrganismos podem ser de 2 tipos:

o Metabolitos primários
São metabolitos necessários ao crescimento exponencial das células. São produzidos
durante a fase de crescimento, ou fase exponencial. Estes incluem biomassa celular,
álcool, aminoácidos, ácidos orgânicos, polissacáridos, vitaminas e também enzimas.

o Metabolitos secundários
Não são necessários ao crescimento das células. São apenas libertados para o meio depois
do microrganismos ter atingido a fase estacionária do crescimento. Exemplos destes
metabolitos incluem AB, alcaloides e aminoácidos.
As variáveis de processo mais frequentemente monitorizadas em linha:

• Concentração Celular
• Temperatura
• pH
• Oxigénio dissolvido
• Concentração de componentes na fase gasosa

Um conhecimento detalhado da fisiologia, metabolismo, viabilidade e morfologia das células permite uma
melhor otimização de todo o processo.
Variáveis fundamentais do processo como concentração de biomassa, de substrato e de produto são
determinadas através de análises a amostras do meio de fermentação.

Biomassa
A concentração de biomassa é um parâmetro chave numa cultura celular (microbiana, animal ou vegetal).
A definição da concentração de biomassa pode significar o número ou massa de células viáveis ou a
totalidade da massa celular ou de massa seca.
A concentração de biomassa numa cultura celular pode ser avaliada, através de amostras do caldo por
um processo off-line. No entanto o custo e duração das análises limita a frequência das medições, sendo
os resultados desfasados no tempo em relação à amostragem.
Por outro lado, à própria amostragem está sempre associado um risco de contaminação da cultura.

II. Preparação do Meio de Crescimento

Métodos de quantificar o crescimento microbiano:

1. Determinação do número de colónia

o Contagem do número de colónias
o Contador de colónias (Coulter)
o Nefelometria

2. Determinação do número de células

o Contagem direta ao microscópio, com recurso a câmaras de contagem (e.g. câmara de
Neubauer)
o Contadores eletrónicos como o contador de Coulter
o Citómetro de fluxo

3. Determinação da massa celular

a. Métodos diretos
o Peso seco (Biomassa)
Para executar esta medição é necessário ter um filtro adequado. Retira-se uma
amostra do fermentador, que é filtrada com um filtro previamente seco em
estufa e tarado. Coloca-se novamente o filtrado na estufa e determinamos a
diferença de massa, que vai corresponder ao peso seco das células filtradas.
Posteriormente faz-se uma curva de calibração que relaciona o peso seco com
DO. Este método é mais usado para bactérias e leveduras.
o Turbimetria
A determinação do peso seco justifica-se quando se pretende determinar as
produtividades e rendimento em biomassa obtida em condições fisiológicas definidas.
 b. Métodos Indiretos
o Componentes Celulares (N, DNA, proteína)
o Fornecimento de oxigénio
o Formação de produto
o Determinação de calor
o Viscosidade
o Medida de ATP

Para quantificar o crescimento celular, podemos fazer medições in situ ou em linha que devem
obedecer a requisitos gerais:

 Fiabilidade
Com especial destaque para a estabilidade a longo termo e manutenção da esterilidade

 Calibração
A resposta deve ser linear com a variação da concentração de biomassa, isto é desde baixo
valores após inoculação até valores muito elevados no final da fermentação, e devem permitir
a calibração em linha

 Sensibilidade e interferências
Não devem existir interferências de sólidos não biológicos, de células não viáveis, e da luz do
meio e devem ser pouco sensíveis a alterações nas condições operacionais (agitação,
arejamento, concentração de oxigénio dissolvido, pH e temperatura) e na composição do meio
de crescimento

 Desenho
Com especial ênfase para a possibilidade de esterilização e limpeza no local de ação do sensor e
posicionamento numa zona do birreator de mistura total.

 Sinal elétrico estável

O sinal elétrico deve ser estável e o desenho deve permitir a utilização em diferentes aplicações
(e.g. cultura de bactérias, de leveduras, de fungos, de células animais e vegetais)

As medições in situ são efetuadas por sensores, mais sofisticados, para análise da luz, transmitida in situ,
diretamente no fermentador:

• Díodos emissores de luz de alta intensidade – LED

• Lâmpadas de Tungsténio
Colocadas num sensor esterilizável e fechadas num fotodíodo
O meio a analisar circula entre a fonte da luz e o detetor
• Sensor turbidimétrico
Designação comercial Aquasant
O turbidímetro é usado num circuito ligado ao fermentador
• Espectroscopia de infravermelho próximo (NIR)
Utilizada no desenvolvimento de sensores, in situ, com aplicação na monitorização de biomassa
em fermentações microbianas e na cultura de células animais
• Fluorossensores
Particular interesse, em processos biológicos não só para determinação de biomassa mas
também para caracterização de reatores biológicos, monitorização e controlo de processos
(e.g. estado metabólico das células)
 • Métodos acústicos – ultrassons
Através da diferença entra a velocidade do som na suspensão celular e não solução livre de
células

A escolha do método de determinação do crescimento da biomassa é uma decisão crucial.

Fatores que influenciam essa escolha:
o Propriedades da biomassa
o Propriedades do meio de cultura
o Precisão
o Sensibilidade
o Velocidade nas medidas

Sensibilidade

4. Determinação dos metabolitos produzidos

Técnicas Analíticas:
HPLC, UV, IF, GC, RMN, eletroforese

Métodos da Farmacopeia:
 Cromatografia
A cromatografia aplica-se à análise de aminoácidos, determinação do M, estrutura quaternária,
mapa peptídico e pureza. Esta cromatografia pode ser de vários tipos:
Troca iónica, exclusão molecular, adsorção, fase reversa, bioafinidade

 Eletroforese
Determinação da massa molecular
Estrutura quaternária

 Espectrometria de massa
Determinação massa molecular
Pureza
Mapa peptídico
Informação sequência/estrutura primária
Estrutura quaternária
Deste modo, diversos que analisam variáveis mensuráveis em tempo real, em particular sensores para
determinação in situ e em linha da concentração de biomassa e análise dos componentes celulares, apesar
do seu desenvolvimento e aplicação estar no início o seu potencial é claro.

O conhecimento da concentração de biomassa por definição é necessário para a determinação de

rendimentos, atividades metabólicas, balanços mássicos, produtividades.
Muitas vezes é usada como critério de avaliação de diferentes modos de cultura, e.g. em termos de taxa
de crescimento e concentração celular máxima ou final.
Acresce que a biomassa pode ser usada como uma variável de processo no estabelecimento de estratégias
de controlo em cultura semi-contínua ou em cultura contínua e a sua medição fornece informações sobre
o estado fisiológico das células, sendo essencial no controlo de qualidade do produto.

CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA

O meio adicionado permite crescimento dos microrganismos que os utilizam em reações bioquímicas
intracelulares. Estas reações permitem a formação de biomassa (células, proteínas, DNA, RNA, lípidos,
açúcares), macromoléculas extracelulares e ainda metabolitos primários e secundários.

Nutrientes de um meio de fermentação

Glucose, Futose, Sacarose
Melaços, Amido, Óleos Vegetais, Bagaço
Hidratos de Carbono Hexoses, Pentoses,
Células Animais Dissacáridos,
Polissacáridos, Alcoóis
Sais de Amónio, Nitratos ou Ureia (ação
tamponante)
Aminoácidos, Péptidos, Purinas, Pirimidinas
Azoto Glutamina, Alanina,
Serina, Glicina, Prolina,
Células Animais
Ácido Aspartico
(aminoácidos)
Fósforo (P), Potássio (K), Magnésio (Mg), Enxofre
(S)
O P é muitas vezes fornecido como
Macro-Elementos
hidrogenofosfato, H2PO4-
Importante na manutenção do balanço iónico
através da membrana e estabilizador do RNA
Fe, B, Si, Ni, Mn, Zn, Cu, Co, Na, Cl
Micro-elementos Importantes como efetores de enzimas e
coenzimas, presentes em meios complexos
Vitaminas, Aminoácidos, Ácidos gordos
Fatores de Crescimento
insaturados, Esteróides
A fonte de Carbono é consumida para os seguintes fins:
o Síntese de material celular
o Fornecimento de energia para a síntese de material celular
o Síntese de produtos bioquímicos extracelulares
o Fornecimento de energia para a síntese de produtos bioquímicos extracelulares
o Fornecimento de energia para a manutenção celular

Numa fermentação, o substrato limitante é utilizado para fins de:

Produção de biomassa, Formação de Produção, Manutenção

• Meios Complexos
A fórmula química dos nutrientes não é conhecida. Muitas vezes, estes meios apresentam um aspeto sujo,
pois os nutrientes não se encontram totalmente solubilizados. Como vantagem permitem um aumento
rápido de biomassa.

• Meios Semi-Definidos
Meios com alguns nutrientes de fórmula química é conhecida, enquanto a de outros é desconhecida.
Normalmente contêm um hidrolisado proteico em vez de aminoácidos puros. Sofrem adição de glicerol a
40% e são armazenados a -70ºC.
Para conservação de culturas ou para reativação de microrganismos.

• Meios quimicamente definidos

Conhece-se a composição química exata, sendo possível escrever a fórmula química dos nutrientes
constituintes. Quando se passa para escalas superiores (nível piloto e industrial), estes meios são
substituídos por meios complexos.

Devem satisfazer as necessidades elementares:

 À formação de biomassa
 À produção de metabolitos
 Ao fornecimento de energia

Determinação da massa de nutrientes utiliza-se normalmente um balanço de mássico elementar

Meios definidos: os cálculos são diretos, as quantidades de carbono, azoto e fósforo calculam-se
diretamente a partir da fórmula química dos nutrientes e da biomassa.
DESCRIÇÃO QUÍMICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Permite escrever a fórmula química da fração orgânica da biomassa. Quando se pretende formular o
meio, é necessário ter esta fórmula em consideração. É então possível fazer a descrição química do
crescimento bacteriano (M).

Estes índices variam consoante seja uma bactéria, levedura

ou célula animal.

A composição da fonte de carbono é em princípio conhecida

Composição das células determinada por análise

elementar (ou então com recurso à fórmula)

Resulta 4 equações e seis incógnitas

d/a = quociente respiratório

(RQ razão entre o CO2 produzido consumido e o O2 consumido)
Obtido por resultados experimentais, uma vez conhecido, permite resolver o sistema de equações
 III. Crescimento Celular

CINÉTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO DESCONTÍNUO

A cultura em modo descontínuo permite uma elevada conversão de nutrientes em produto, assim como
facilidade na execução e no controlo, no entanto, a concentração inicial de substrato tem de ser inferior
aos níveis inibitórios originando uma impossibilidade de manipulação da concentração de substratos.

Quando temos microrganismos em condições controladas, pode representar-se a concentração de

biomassa ou densidade ótica em função do tempo, que apresenta 6 fases distintas:

1. Fase de latência – adaptação ao meio/ inóculo

2. Fase de aceleração
3. Fase Exponencial
4. Fase de Retardamento
5. Fase Estacionária
6. Fase de Declínio

Fase de Latência
Fase de adaptação ao meio pelo microrganismo
Corresponde à adaptação do microrganismo às novas condições do meio, reorganizando os seus
constituintes para o novo ambiente.
A fase de latência deve ser curta, pois consomem-se nutrientes sem haver crescimento. Para minimizar
esta fase usa-se um inóculo.
A preparação de uma população de microrganismo a partir de uma cultura armazenada, para um
estado “útil” de inoculação e um estado produtivo final é designados de desenvolvimento do
inóculo. O inóculo é essencial a qualquer processo de fermentação (minimiza o tempo de
fermentação).
Inóculo permite que o microrganismo esteja em condições de crescimento semelhantes às
utilizadas no fermentador, conduzindo a uma adaptação mais rápida. O volume de inóculo varia
entre 5-10%.
a. Minimização da perda de viabilidade do microrganismo durante a recuperação a partir
do estado de conservação
b. Obtenção de uma cópia genotipicamente idêntica à população armazenada
c. Desenvolvimento da cultura para um estado fisiológico adequado à população
d. Diminuição da fase de latência e do tempo de fermentação

Fase de aceleração
Fase muito rápida, por vezes difícil de detetar. Sabe-se que há o início da divisão celular, a uma velocidade
de crescimento cada vez maior. Fase que não se encontra bem descrita matemática nem biologicamente.

Fase Exponencial
Corresponde a um crescimento da população microbiana como função exponencial do tempo.
O crescimento mantêm-se a uma velocidade máxima até que a falta de um ou vários nutrientes e/ou a
acumulação de produtos inibitórios originem a diminuição e a paragem do crescimento.
X = X0 eμt
Fase de Retardamento
Desaceleração por diminuição brusca da concentração de substrato limitante.
Isto ocorre devido à elevada concentração de biomassa que rapidamente utiliza o substrato
remanescente e/ou à acumulação de inibidores.
A população microbiana ainda está a aumentar, mas a taxa específica de crescimento tende a diminuir.
As células podem sofrer alterações metabólicas e fisiológicas.

Fase Estacionária
Ocorre consumo total do substrato limitante, acumulação de produtos inibitórios ou alteração do
ambiente físico-químico. O número de células viáveis diminui e ocorre formação de metabolitos
secundários. Fase patamar.

Fase de Declínio
Fase em que a concentração de biomassa diminui como resultado, do metabolismo de manutenção pu
por autólise.
As células não mantêm as suas atividades fisiológicas e, à medida que a viabilidade diminui, pode ocorrer
autólise com a libertação para o meio de produtos intracelulares.

VARIAÇÕES NA CURVA DE CRESCIMENTO EM DESCONTÍNUO (“BATCH”)

1. Crescimento diáuxico
Ocorre num meio contendo mais do que uma fonte de carbono e energia, sendo que estas são
usadas uma de cada vez. Vão aparecer duas fases de crescimento, correspondendo às 2 fontes
de carbono.
Utilização sequencial de substrato
(Exemplo: E.coli a crescer num meio contendo glucose (1) e a glucose é consumida em primeiro
lugar)

2. Existência de um período curto de divisão exponencial com  superior à do período seguinte

Existe uma 1ªfase exponencial muito curta e só depois se observa um curto crescimento mais
prolongado. Ocorre em microrganismo que são modificados.

3. Cinética de Crescimento em meios complexos

Nestes meios há várias fontes de carbono

presentes, que geram uma sucessão de fases
exponenciais em que uma fase apresenta sempre
uma  inferior à da fase anterior.

4. Cinética de Crescimento Linear

É uma situação muito frequente em crescimento contínuo, raro em

crescimento descontínuo. O crescimento é linear, isto é, não há fase
de crescimento exponencial.
Sob determinadas condições:
Meios definidos:
Contendo uma única fonte de carbono e energia, a taxa específica de crescimento durante a fase
exponencial apresenta um valor constante
Se o meio ambiente e a constituição da biomassa não se alterarem pode aplicar-se a equação
exponencial.

CRESCIMENTO EXPONENCIAL
Velocidade volumétrica
Dá a variação da concentração de células na unidade de tempo. Dá-nos a massa de células que se forma
por unidade de volume e por unidade de tempo. Para passar de velocidade volumétrica a velocidade
específica de crescimento (ou taxa específica de crescimento) basta dividir pelo número de células.

Taxa específica de crescimento de acordo com uma cinética de 1ªordem

Este parâmetro tem o mesmo valor independentemente do método usado para avaliar o crescimento,
desde que seja equilibrada. Esta equação só se aplica à fase exponencial.

RELAÇÃO ENTRE O CRESCIMENTO BACTERIANO E A CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

RELAÇÃO DE MONOD

À medida que a concentração de nutrientes [S] aumenta, a taxa específica de crescimento (μ) também
aumenta.

(1) Para baixas concentrações de nutrientes ou substrato, a taxa específica de crescimento é

diretamente proporcional à concentração (n=1).
(2) Continuando a aumentar a [S] limitante, verifica-se a existência de uma zona de transição
(0<n<1).
(3) A partir deste ponto, observa-se que por mais que se aumente a [S], não há aumento da taxa
específica de crescimento, ou seja, μ mantêm-se constante (n=0). Se aumentássemos muito [S],
haveria inclusivamente redução de μ por um efeito de inibição.
Baixa S] limitantes  1ºOrdem
Elevada S] limitante  Ordem 0 (n=0)

A partir deste gráfico, é possível determinar uma constante de substrato KS que representa a S] que
origina uma taxa específica que é metade da taxa específica máxima. Para baixas S], a relação entre a
taxa específica e a S] é uma relação linear.

KS S] Elevada afinidade do microrganismo para o substrato (ex: glucose e E.coli)
KS  S] Baixa afinidade do microrganismo para o substrato (ex:lactose e E.coli)
Na fase exponencial:

Si >> KS a concentração de substrato não é limitante

Logo,

No fim da fase exponencial a população bacteriana aumenta muito e x >>

S] = KS

Daí que a transição da fase exponencial para a fase estacionária seja

muito rápida

Na fase estacionária

S] << KS

 Proporcional à concentração de substrato limitante

(constante de substrato)

rX = velocidade ou taxa volumétrica de formação de biomassa

Formação de biomassa por unidade de tempo (g/L/h)

rS = velocidade ou taxa volumétrica de consumo de substrato

O sinal negativo revela um consumo

RP = velocidade ou taxa volumétrica de formação de biomassa

ou de um metabolito, também designada produtividade
volumétrica (g/L/h ou M.L-3 T-1)
Define a velocidade de formação de produto por unidade de
volume de fermentador. Esta depende da concentração celular
e é importante nos processos de fermentação industrial.

QP = produtividade específica (/h)

Representa a eficácia da célula na síntese do produto ou sua utilização, permitindo comparar resultados
entre processos de fermentação e determinar o mais eficaz. Independente da concentração celular.
O modelo Monod é usado para o consumo de substrato, sendo um modelo geral que se aplica a grande
número de casos. Contudo, existem também modelos para prever a formação de produtos, mas não são
tão gerais como o de Monod.

MODELOS “NÃO-ESTRUTURADOS”

Modelos mais simples, utilizados na descrição do crescimento microbiano. Consideram a população

homogénea, quer do ponto de vista metabólico como estrutural. A quantificação do crescimento de uma
população celular, realizada só em termos do número ou massa das células.

Limitações: Aplica-se unicamente a culturas microbianas em condições de crescimento equilibrado

Crescimento “equilibrado”
No período de tempo de uma cultura durante o qual as propriedades das células se mantêm constantes:
Fase exponencial na cultura em modo descontínuo
Em estado estacionário na cultura contínua

Não descrevem situações dinâmicas, nomeadamente a transição de uma fase de crescimento a velocidade
elevada para uma fase de crescimento lento, situação de crescimento escalonado ou fase de crescimento
entre duas situações de estado estacionário.
Modelos não estruturados de Crescimento

Modelos não estruturados de morte celular

No biorreator, durante o processo de crescimento, as células morrem naturalmente a uma taxa
volumétrica rd:

Kd – taxa especifica de morte Kg células mortas (Kg células vivas)-1/h]

X – concentração de células viáveis

Nalguns casos a lise celular segue a morte celular

Os componentes libertados podem servir de nutrientes ou até ser inibitórios
A morte e a lise celular podem ou não ser desprezados num processo de modelação do bioreator
MODELOS “ESTRUTURADOS”
Os componentes celulares são subdivididos em compartimentos
Modelos estruturados mais simples, a célula encontra-se dividida em dois compartimentos. Mais
detalhados pode ser superior a 20
Exemplo:
Um sintético, contendo DNA
Outro envolvendo componentes estruturais e genéticos (contém as proteínas e o DNA)
Na cultura de leveduras há diferenças no metabolismo entre célula-mãe e filha. Nas bactérias e fungos
filamentosos há diferença no metabolismo entre as várias células que formam o filamento.

A validação dos modelos estruturados metabólicos requer a medição de concentrações ou de atividades

de componentes intracelulares.
A validação dos modelos estruturados morfológicos necessita uma criteriosa análise de imagem.

CULTURA EM MODO DESCONTÍNUO

Consumo de substrato
Construção de um modelo de um sistema reacional de consumo de substrato

Manutenção Celular
Manutenção dos gradientes de concentração (e.g. protões e do potencial elétrico através da membrana)
Turn-over de macromoléculas, umas são muito estáveis na célula, outras (enzimas, constituintes da
parede celular, mRNA) são degradados e continuamente sintetizadas no interior da célula
Motilidade celular

O coeficiente de manutenção varia com os fatores ambientais, com o estado fisiológico das células

Fatores de Rendimento

Biomassa/ Substrato
Na formação de uma quantidade de biomassa X é consumida uma quantidade S de substrato
Variação da concentração de substrato consumido num intervalo de tempo. O nutriente consumido é
considerado o limitante.
 Rendimento em produto:

Corresponde ao parâmetro α, tendo por base a biomassa formada. Este rendimento é

muito usado no caso de metabolitos primários

Este rendimento em produto é um rendimento geral, sendo portanto calculado para metabolitos
primários, como para secundários, uma vez que existe uma variação na concentração de substrato. Pode
calcular-se em relação ao nutriente limitante, ou a outro nutriente presente no meio de fermentação.

Modelos para a formação de Produto

 Modelo de Lueduking e Piret (1959)

(mais abrangente, muito útil pois abarca todas as situações reais)

α. dx/dt = formação de produto associado ao crescimento

(Característico dos metabolitos primários)
β .x = formação de produto não associado ao crescimento
(Característico dos metabolitos secundários)

dP/dt = massa de produto por unidade de volume e unidade de tempo

α = Constante (adimensional)
β = Constante (inverso de t)
x = concentração celular

α=0
A formação do produto está totalmente dissociada do crescimento
(Formação de metabolitos secundários)
A equação reduz-se a: dP/dt = β .x

β=0
A formação do produto está associada ao crescimento
(Formação de metabolitos primários)
A equação reduz-se então a: dP/dt = α .dx/dt

α=β
Cinética mista: a formação do produto não começa logo no início da fase exponencial, mas decorre
durante o crescimento (formação de metabolitos intermédios)
O modelo de Luedeking e Piret além de ser descrito na forma de taxas ou velocidades volumétricas,
também pode ser definido na forma de Taxas específicas.

(1) Metabolito primário (β=0)

Observa-se que a formação de produto vai estando associada ao crescimento, atingindo um
valor máximo. O patamar corresponde à fase exponencial, em que =max
(2) Metabolito intermédio
A formação do produto pode estar mais desviada para a esquerda ou para a direita. É bem
claro que a formação do produto pode começar no início da fase exponencial, ou pode começar
mais para o fim.
(3) Metabolito secundário (α=0)
Quando o crescimento celular termina (corresponde à fase estacionária), inicia-se a formação
do metabolito secundário.
CINÉTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO CONTÍNUO

Cultura Contínua
Monod alterou o processo em descontínuo (“Batch”) para que este se convertesse em contínuo em
1949. Para isso, proporcionou adição contínua de meio e saída de meio contendo produtos.

Componentes essenciais numa cultura em contínuo:

o Volume constante de meio
o Fornecimento constante de meio
o Meio esterilizado
o Controlo da temperatura, pH, arejamento e agitação

A cultura contínua permite produtividades volumétricas elevadas e devido à adição contínua de substrato,
permite operar abaixo das concentrações inibitórias. O metabolismo pode ser manipulado por controlo
da concentração de nutrientes, permitindo controlar a formação de metabolitos inibitórios.
No entanto possui como desvantagens:
Utilização incompleta de nutriente
Taxa de diluição máxima inferior a max para evitar o “wash-out”
Não se utiliza em sistemas que necessitam indução

Existem 3 tipos de sistemas de cultura que permitem o crescimento em contínuo:

1. Biostato
A velocidade de crescimento é mantida constante por controlo da concentração de CO2 libertado
para o meio de fermentação. É pouco usado pois é muito caro e sensível

2. Turbidostato
A turbidimetria (DO) é mantida constante através do controlo do caudal do meio, de modo a que
seja mantida dentro de certos limites. A velocidade de crescimento é mantida contraente através
do controlo de pH. É um sistema pouco utilizado.

3. Quimiostato
A velocidade de crescimento é controlada pelo meio químico envolvente, através de um
substrato limitante. O sistema mais usado.
 Em meio contínuo como o volume é constante, a taxa de diluição vai depender
fundamentalmente do caudal.
O tempo médio de residência traduz o tempo que o meio permanece no fermentador.

Balanço de massa celular:

Num quimiostato simples x0 = 0 , pois o meio de alimentação é estéril

 >> α logo,

No estado estacionário:
dx/dt = 0 logo,  = D

Consoante o inóculo é
mais ou menos
concentrado, obtém-se
gráficos diferentes

Balanço de massa de nutrientes

Geralmente,

m.x << (.x)/ Y

(qP.x) / YP / S muito 

No estado estacionário:

dS/dt = 0 logo,  = D

x = Y (S0 - S)

O rendimento celular é independente do

crescimento e da taxa de diluição
Balanço de massa aos produtos

No estado estacionário:
dP/dt = 0 logo,  = D
P = YP/S (S0 - S)
K=0
Quando o metabolito produzido não está a ser utilizado pela célula, podendo ser
desprezado

Quando Monod relacionou o crescimento celular com a cultura, fez uma relação também para o modo
contínuo. Considerando um estado estacionário.

Dc = taxa de diluição crítica

Representa a taxa de diluição máxima à qual o quimiostato pode funcionar sem que haja wash-out

Monod verificou que aumentando a taxa de diluição, a

concentração de biomassa mantém-se constante. Contudo,
mesmo trabalhando a taxas de diluição elevadas, a
concentração de células acaba por não ser mais elevada. Põe-
se então a questão:
Justifica-se trabalhar a caudais elevados?

P = D.x
Monod concluiu que é vantajoso trabalhar com caudais
elevados, pois a produtividade também é maior.

Produtividade (g/L.h)
Quanto maior a taxa de diluição (D) e a concentração de substrato,
maior é a produtividade, contudo existe um limite para este aumento
(Dc), pois quando se trabalha com taxas de diluição muito elevadas,
pode ocorrer wash-out.
A produtividade é um parâmetro que pode ser comparável para o
modo contínuo e o descontínuo. Esta comparação é feita através de G:
G = Produtividade max. em contínuo no quimiostato
Produtividade max. em descontínuo
P é maior em modo contínuo do que em modo descontínuo

KS baixo indica elevada afinidade para o nutriente

KS elevado indica baixa afinidade para o nutriente
Quando se atinge DC, tanto a concentração de biomassa como a concentração de produto caem para 0,
em resultado do fenómeno de wash-out, contido, a concentração de nutriente aumenta muito pois não
é consumido. Deve portanto trabalhar-se a uma taxa de diluição ótima, DOPT (um aumento de D pode
permitir um ligeiro aumento de biomassa, para casos em que o microrganismos tem baixa afinidade para
o substrato, KS ).

Num processo de fermentação é necessário um compromisso com:

 Conversão (%)
Se todo o nutriente for utilizado para a formação de biomassa, o rendimento aproxima-se muito
do grau de conversão. Relacionando estes dois parâmetros, pode saber-se se o substrato que é
usado para a biomassa, para produto e para outro processo metabólico.
 Custos
 Produtividade
Os casos de formação de produto dissociada de crescimento
e cinética de crescimento mista, são situações pouco comuns
numa cultura em contínuo.
CINÉTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO SEMI-CONTÍNUO (“FED-BATCH”)

A cultura em modo semi-contínuo oferece a possibilidade de operar abaixo de concentrações inibitórias,

com uma elevada conversão de nutriente em produto. O metabolismo pode ser manipulado por controlo
da concentração de nutrientes, permitindo controlar a formação de metabolitos inibitórios. A
produtividade volumétrica elevada assim como a concentração final do produto.
Possui como desvantagens a inibição pelo produto, e maior duração da cultura pode consumir a uma
maior degradação do produto.
EFEITO DOS FATORES AMBIENTAIS NO CRESCIMENTO CELULAR

O ambiente exerce um efeito determinante sobre o microrganismo ou a célula, tanto numa cultura em
modo contínuo, como em modo descontínuo e semi-descontínuo. Geralmente a influência dos fatores
ambientais é estudada em descontínuo.

1. Temperatura

Todos os microrganismos apresentam Temperatura

ótima de crescimento, fora das quais a morte celular
se sobrepõe ao crescimento celular.

A taxa específica de crescimento está relacionada com

a energia de ativação do crescimento e da morte
celular (Ea).

Quando Ea= 60-90 Kcal/mol ocorre um predomínio da morte celular, sendo necessário alterar a
temperatura

a. Psicrófilos
Têm T ótima de crescimento na ordem dos 10-15ºC
b. Mesófilos
Têm T ótima de crescimento na ordem dos 30-40ºC
c. Termófilos
Têm T ótima de crescimento na ordem dos 55-60ºC
d. Hipertermófilos
Têm T ótimo de crescimento na ordem dos 85-90ºC

A temperatura ótima de produção de metabolitos pode não corresponder à temperatura ótima de

crescimento. O mesmo não acontece para metabolitos primários, já que estes são produzidos e libertados
à medida que o microrganismo cresce.

Inicialmente há um ligeiro aumento do declive, até se atingir uma temperatura correspondente ao

rendimento máximo. Este aumento de energia é necessário para quebrar as ligações entre o carbono,
havendo então o arranque metabólico com utilização desta fonte

Exemplo: Produção de proteínas recombinantes

Estirpes de E.coli para produzir proteínas
recombinantes, geralmente se a cultura for realizada
à temperatura ótima de crescimento da bactéria, as
proteínas produzidas acumula-se rapidamente em
aglomerados denominados corpos de inclusão, nos
quais possuem frequentemente uma conformação
não ativa.
Um modo de evitar a formação de corpos de inclusão é reduzir a temperatura de cultura no momento em
que se faz a indução da produção da proteína recombinante.

Esta redução de temperatura provoca um abrandar dos processos metabólicos e permite que a proteína
seja produzida a uma velocidade inferior e seja armazenada na célula sem ser em corpos de inclusão, logo
na forma ativa.

Outros sistemas de expressão de proteínas fazem uso da própria temperatura para induzir a produção da
proteína recombinante de interesse.

2. pH

A escolha do pH tem em atenção a redução do risco de contaminação. Para

metabolitos primários, o pH ótimo de crescimento é igual ao pH de produção do
metabolito. No caso de metabolitos secundários, pode haver necessidade de ajustar o
pH após ter sido atingida a fase estacionária de crescimento, de forma a permitir que
haja formação de mais metabolito.

Por vezes, utilizam-se fontes de azoto capazes de induzirem alterações do pH do meio, como é o caso de
NH4+, que induz a descida do pH e NO3-, que induz o seu aumento. É ainda de salientar que alguns
microrganismos produzem diferentes metabolitos, consoante o pH do meio, por exemplo, os Aspergillus
niger a pH baixo produz ácido cítrico, mas a pHs mais elevados produz ácido glucorónico e na zona neutra
produz ácido oxálico.

Existem processos biológicos em que a variação de pH é usada para controlo do processo de produção,
por exemplo, na produção de penicilina, a velocidade de adição da fonte de carbono e de azoto pode ser
controlada pela medição do pH, a fonte de azoto é metabolizada a catiões básico e a fonte de carbono a
dióxido de carbono e ácido orgânicos, o balanço entre estes dois nutrientes fornece uma base para o
controlo de pH.

O controlo automático do pH e a medição dos volumes e das concentrações das soluções das soluções de
ácido e de base utilizadas para manter o pH pré-definido permitem realizar uma estimativa em tempo
real da evolução da concentração de ácido acético durante uma fermentação.

Importante, não só para as fermentações de E.coli durante as quais se produz ácido acético em situações
de limitação de oxigénio ou de excesso de glucose, mas também para fermentações de produção de
proteínas recombinantes com S.cerevisiae, uma vez que se verifica que os períodos de produção/consumo
de ácido acético estão relacionados com períodos de ativações de vias metabólicas biossintéticas.
3. Efeito de elevadas concentrações de nutriente

O aumento da concentração de nutrientes induz um aumento do crescimento. O crescimento

aumenta assim proporcionalmente à concentração de nutrientes, mas apenas até certo ponto. A
partir daqui, ocorre saturação dos recetores e transportadores desses nutrientes, passando o
substrato a funcionar como inibidor do crescimento – inibição anti-competitiva
Consequentemente verifica-se um declínio da curva de crescimento.

Estes efeitos podem ser visualizados através da

linearilização da equação de Monod:
1/ = Ks /max . 1/S + 1/ max

Quando há inibição o gráfico torna outra forma, o que constitui uma desvantagem nos processos de
fermentação.
Outros nutrientes podem atuar como inibidores de crescimento celular, por exemplo, tolueno,
formaldeído, metanol e compostos fenólicos.
Quando existem nutriente que, apesar de serem essenciais ao crescimento têm uma ação inibitória,
pode usar-se como alternativa o crescimento contínuo, tendo esse nutriente concentrações
inferiores às que provocam inibição.
 Existem ainda outros tipos de inibição do crescimento:
o Inibição competitiva
Não há alteração de VMAX. A presença de um inibidor, ou de elevadas concentrações de
substrato provocam o aumento de KM

o Inibição não competitiva

Há alteração de VMAX. A presença de um inibidor ou de elevadas concentrações de substrato
não altera KM

o Inibição anti-competitiva
Há alteração de KM e VMAX Considera-se que quando há inibição pelo substrato, o
mecanismo mais frequente é o anti-competitivo.

4. Efeito dos nutrientes insolúveis ou pouco solúveis em meio aquoso

O crescimento celular pode também ser limitado pela solubilidade ou velocidade de difusão dos
nutrientes no meio.
Agregados microbianos, células encapsuladas, nutrientes sólidos, nutrientes líquidos pouco solúveis ou
praticamente insolúveis em meio aquoso]
O oxigénio é um gás pouco solúvel e a sua solubilidade é tanto menor quanto maior for a temperatura do
meio de crescimento. O oxigénio tem que passar da fase gasosa para a fase líquida e depois, desta para o
microrganismo. A passagem da fase gasosa para a fase líquida é descrita através de uma equação de
transferência de massa:

Sabendo que a utilização do oxigénio pela célula segue uma cinética de saturação (cinética de Monod), o
crescimento em condições limitantes de oxigénio é função linear do oxigénio consumido pela célula. Os
problemas de transferência de oxigénio resultantes da sua baixa solubilidade podem ser minimizados
através de um bom arejamento, com uma agitação adequada.
 IV. IMOBILIZAÇÃO CELULAR / ENZIMÁTICA

IMOBILIZAÇÃO DE BIOCATALIZADORES
Operação que tem por finalidade o seu confinamento a uma região bem definida do espaço, com retenção
das suas atividades catalíticas, podendo ser repetida e continuamente utilizados.
Principais vantagens:

o Possibilidade de uso em reatores contínuos

o Melhor controlo da reação
o Produto mais puro
o Uso repetitivo da mesma operação
o Por vezes melhor atividade e estabilidade

O custo adicional da imobilização de uma enzima ou célula só se justifica se a estabilidade operacional for
adequada.

Redução dos problemas de difusão

Redução das limitações de transferências de massa

Enzimas
• Enzimas modificadas de forma a ficarem insolúveis
• Enzimas solúveis usadas em reatores dotados de membranas de ultrafiltração
• Enzimas cuja mobilidade foi restringida por ligação a outra macromolécula

Células
• Células ligadas a superfícies sólidas
• Células aprisionadas
• Células em suspensão livres em reatores equipados com membranas semipermeáveis
• Células floculadas

Grupos funcionais da enzima envolvidos na imobilização

• Amina
• Carboxilo
• Imidazol (histidina)
• Sulfidrilo (Cisteína)

Condições de imobilização
• Suaves
• Bem controladas
• Evitar reações a altas temperaturas
• Evitar meios ácidos ou alcalinos
• Evitar solventes orgânicos
• Elevadas concentrações de sais
 IMOBILIZAÇÃO
Constantes cinéticas aparentes:
V(max)ap
Km (ap)
(VMAX/Km)ap
A cinética de um biocatalisador surge complicada em relação à forma livre

Vantagens do uso de biocatalisadores imobilizados:

1. Retenção do biocatalisador no biorreator
a) Possibilidade de reutilização
b) Produto mais puro
c) Possibilidade de taxas de diluição elevadas sem “wash-out”
2. Elevadas concentrações de biocatalisador
a) Aumento da produtividade volumétrica
b) Rápida conversão de substratos instáveis
c) Minimização de reações paralelas
3. Controlo do microambiente do biocatalisador
a) Manipulação da atividade e especificidade do biocatalisador
b) Estabilização da atividade do biocatalisador
c) Proteção de biocatalisadores sensíveis à agitação
4. Separação do biocatalisador do produto facilitada
a) Controlo preciso do tempo da biorreação
b) Minimização de transformação do produto

Limitações:

Aumento dos custos na produção do biocatalisador

Necessidades acrescidas de material
equipamento
Necessidade de reatores com configurações
específicas
Perda de atividade durante a imobilização
Relacionadas com o biocatalisador
a) Exposição a pH e temperaturas extremas
b) Exposição a reagentes tóxicos
c) Exposição a agitação elevadas
Relacionadas com o microambiente
a) Exclusão de substratos macromoleculares
b) Local não acessível
c) Limitações à transferência de massa
Perda de atividade durante a operação do bioreator
Perda biocatalisador
a) Erosão da matriz ou solubilização
b) Saída de pequenas partículas na corrente de
saída
c) Crescimento no interior da matriz
d) Alteração no tamanho de poros
”Envenamento” da matriz
a) Inibidores no micro-ambiente
b) Retenção de sólidos em suspensão
c) Crescimento de espécies contaminantes
Empiricismo
a) Necessidade para caso específico da otimização
de vários parâmetros
b) Dificuldades no processo de modelação e
controlo
 Suporte de imobilização deve:
o Estável em solução
o Não se deve deteriorar nas condições
operacionais de composição e pH do meio
o Mecanicamente robusto
o Não sofrer compactação em operações
contínuas (reatores de teito fixo)

CLASSIFICAÇÃO DOS SUPORTES DE IMOBILIZAÇÃO

1. Composição

Suportes orgânicos
Mais adequados à imobilização porque contém grupos funcionais utilizáveis em ligação com a enzima
Polímeros Naturais
Polissacáridos (Carragéneo, alginato, celulose, amido, dextrano, quitina, agar)
Proteínas (colagénio, seda)
Materiais carboníferos

Polímeros Sintéticos
Polistireno, Poliacrilados, Polímeros de anidrido maleico, Polipeptídeos, Polímeros de vinil e aril, poliamidas

Suportes Inorgânicos
Preferíveis industrialmente pela sua maior resistência mecânica e microbiana apesar da sua ligação à enzima ser mais
difícil.
Minerais
Gesso, bentonite, pedra-pomes

Materiais fabricados
Vidro de poro controlado, metais, vidro não poros

2. Morfologia
a) Porosos
b) Não Porosos
Em função dos parâmetros do suporte, área superficial e diâmetro de poros

Tamanho de partícula
Fator crucial que contribui para determinação:
• Da extensão das limitações à transferência de massa e difusão interna na atividade enzimática
• Queda de pressão nas colunas de leito fixo
• Velocidade de fluidização nos reatores de leito fluidizado
• Potência de agitação necessária a suspender as partículas nos reatores agitados
• Estabilidade
Suportes porosos

Poros pequenos
Retêm o biocatalisador mas apresentam
problemas à difusão substrato/produto o que
implica redução da produtividade global do
processo

Poros largos
Facilitam a difusão substrato/produtos, mas
facilitam a saída do biocatalisador
Contido a maior parte dos materiais de suporte e métodos
de imobilização descritos na literatura não são adequados
para a escala industrial devido aos custos e à natureza dos
materiais utilizados.

EFEITO DA IMOBILIZAÇÃO NAS PROPRIEDADES CINÉTICAS

Os principais efeitos modificadores das propriedades catalíticas das enzimas, durante ou após a imobilização são:

a) Efeitos conformacionais
b) Efeitos estereoquímicos
c) Efeitos microambientais
d) Efeitos difusionais

a) Efeitos conformacionais
Devidos a modificações químicas da proteína enzimática durante a imobilização
Quando afetam os resíduos dos aminoácidos que formam o local ativo ou quando são importantes na manutenção da
estrutura terciária da enzima, podem ter sérios efeitos na atividade enzimática.

b) Efeitos Estereoquímicos

Ocorrem quando as moléculas enzimáticas são imobilizadas numa posição tal que o local ativo está relativamente
inacessível às moléculas de substrato.

c) Efeitos microambientais

Devido à enzima agir num ambiente diferente do encontrado na solução (existem interações electrostáticas entre o
suporte e o substrato).

Substâncias hidrofilicas vão ser seletivamente ligadas à superfície e poros do suporte hidrofílico.
Substratos hidrofóbicos vão ser repelidos dos suportes hidrofilicos mas seletivamente ligados aos suportes hidrofóbicos.

Substratos carregados positivamente e protões vão ser atraídos ara suportes carregados, negativamente, originando
uma grande concentração de substrato à superfície e baixo pH no interior do suporte.
Efeitos de partição deste tipo podem dar origem a valores de K M e ótimos de pH para a enzima imobilizada diferentes
dos da enzima livre.
As diferenças das concentrações de equilíbrio dos compostos solúveis carregados podem ser descritos pelo coeficiente
de partição, P
P = CI / C0
CI = concentração do composto no microambiente
C0= concentração do composto no macroambiente
 d) Limitações difusionais

O substrato tem que se difundir-se para a enzima ou célula imobilizada antes de a reação ter lugar.
 Limitações difusionais externas
Devidas à velocidade limitada de difusão do substrato na película de filme de fluído que envolve a partícula de
suporte.

Estas limitações difusionais externas podem ser minoradas aumentando:

o O grau de agitação em reatores agitados
o Velocidade de fluxo em reatores tubulares
o Usando um substrato mais concentrado e menos viscoso

A velocidade de transferência de massa externa do substrato, Vdif da solução até à superfície enzimática é dada pela
equação:

 Limitações à difusão interna

Quando uma enzima ou célula é imobilizada numa matriz porosa existem, para além de efeitos de transferência
de massa externa,
• Resistência à difusão interna do substrato,
Devido às moléculas deste terem de se difundir através dos poros para chegar ao catalisador
• Resistências à difusão do produto,
Que tem de se difundir para a solução

A difusão se solutos através de 3 regiões (meio, fluido à volta da esfera, interior da partícula) é governada pela
Lei de Fick:
O coeficiente de difusão está relacionado com o tamanho e formas moleculares. A adsorção de moléculas na parede da
matriz pode complicar o processo de difusão.
A transferência de massa interna processa-se em paralelo com a reação enzimática, obtendo-se:
o Uma diminuição de velocidade de reação com a diminuição da concentração do substrato ao longo
dos poros
A velocidade global da reação dependerá do gradiente de concentração do substrato

CLASSIFICAÇÃO DOS VÁRIOS MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO, BASEADA NA NATUREZA DO SUPORTE

CLASSIFICAÇÃO DOS VÁRIOS MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO, BASEADA NA COMBINAÇÃO DA NATUREZA DO

SUPORTE COM O TIPO DE INTERAÇÃO RESPONSÁVEL PELA IMOBILIZAÇÃO
Adsorção Física

Baseia-se na ligação do biocatalisador (célula, enzima) na superfície do suporte, por forças de van der Waals

Em ambientes naturais, solo, rios, certas partes do corpo humano (boca, pele) as células microbianas existem adsorção
às superfícies. Sabe-se desde longa data que uma superfície em contacto com uma suspensão microbiana com o tempo
se vai tornar biologicamente ativa devido à adesão do microrganismo.

A adsorção de biocatalisadores (células ou enzimas) está dependente das características do meio.

O fenómeno de adsorção ou adesão baseia-se em interações electroestáticas – forças de Van der Waals, ligação de
hidrogénio – entre a superfície do biocatalisador e o suporte de material.

Principais vantagens:

o Não provocar alterações conformacionais na molécula enzimática ou destruição do centro ativo

o Manutenção da viabilidade e atividades celulares
o Possibilidade de regeneração da preparação celular, por adsorção das células inativas

Principais desvantagens:

o Possibilidade de desadsorção do biocatalisador

o Ligação ao suporte fraca
o Concentração de biocatalisador relativamente baixa por unidade de volume de reator quando
comparada com outros métodos

Métodos de ligação iónica

Baseia-se na ligação iónica da proteína enzimática ao suporte contendo resíduos de troca-iónica (normalmente
associa-se com a adsorção física)

Principais vantagens:

o Método suave
o Não provoca alterações conformacionais do local ativo
o Em muitos casos as atividade enzimáticas obtidas são elevadas
Outro fator que influencia a ligação e está estritamente dependente das propriedades do microrganismo é a
composição da parede celular.

As células de levedura por exemplo, estão carregadas negativamente, logo é preferível um suporte carregado
positivamente.

Principais desvantagens:

o Desadsorção
o Alteração do pH

Método de ligação covalente

Baseia-se na ligação da enzima (grupo amina, carboxílico, tiol, imidazólico as proteinas) a um suporte ativado.

Classificação consoante o tipo de ligação:

o Diazo
o Peptídica
o Alquilação

Reações mais utilizadas:

Diazotação
Formação de ligações peptídicas
Alquilação e arilação
Formação de bases de Schiff
Reação de UGI
Reação de amidinação
Reação troca de tiol – dissulfureto
Interações mercúrio-enzima
Ligação induzida por radiação 

É um dos métodos mais utilizados para imobilização de enzimas, devido à obtenção de preparações enzimáticas com
elevada estabilidade operacional.
Não é muito utilizado para células devido à toxicidade dos agentes de ligação utilizados, do que resulta algumas vezes
perda da viabilidade e da atividade celular.

Principais vantagens:
o Obtenção de um sistema livre de limitações difusionais
o Ligação forte e estável durante longos períodos de tempo

Principais desvantagens:
o Método pouco suave
o Alterações da conformação e do centro ativo, o que implica diminuição/perda de atividade ou alterações da
especificidade do substrato.
Método de ligação covalente + adsorvente
Suporte a utilizar:

Orgânicos (celulose, carboximetilcelulose, hidrazida de agarose)

Inorgânicos (vidro, sílica ou cerâmica)

Método de ligação Quelação (ligação metálica)

Ligação metálica entre a enzima ou célula e um suporte
Vantagens:
Facilidade separação
Biosensores

Método de imobilização por reticulação (“Cross-linking method”)

Baseia-se na formação de ligações químicas, como no método de ligação covalente, por ação de agentes bi- ou
multifuncionais, que levam à formação de agregados tridimensionais insolúveis em água.

Principais agentes de reticulação:

Glutaraldeído (base de Schiff)
Diisocianato de tolueno (ligação peptídica)
Bis diazobenzidina (ligação diazo)
Ácido tânico

Principais vantagens:
Obtenção de enzimas imobilizadas praticamente puras,
devido à natureza do reagente

Limitações:
Dificuldade em controlar as reações e a necessidade de
grandes concentrações de enzima e às propriedades
mecânicas devido à natureza gelatinosa do agregado.

A insolubilização das proteínas está dependente do balanço de vários fatores nomeadamente:

o Concentração e natureza da enzima
o Concentração do reagente de reticulação
o Força iónica da solução
o Temperatura
o Tempo de reação

A concentração ótima de proteína é 50-200mg/ml

A razão glutaldeido/proteína é aproximadamente 10% (p/p).

Devido a estas propriedades mecânicas de natureza gelatinosa dos agregados enzimáticos e celulares, este método
deve ser utilizado em conjugação com suportes de materiais inertes para aumentar a força mecânica do sistema
especialmente quando se pretende a sua utilização em reatores mecanicamente agitados.

Principais desvantagens:
Método severo: pode levar à perda de atividade devido à participação do centro ativo na reticulação
Ligação irreversível entre o grupo amina da enzima e o glutaraldeido e resistente a extremos de pH e
temperatura.
A reticulação das células pode obter-se por um processo físico ou químico.

O método de reticulação químico baseia-se na formação de ligações covalentes entre as células por agentes bi- ou
multifuncionais, tais como aldeídos ou aminas.
A toxicidade destes agentes para a células limita a sua aplicabilidade.
A ligação da célula microbiana com o glutaraldeído envolve a reação entre o agente bifuncional e o resíduo do
aminogrupo livre do mucopeptido microbiano.

A reticulação física das células, por floculação, apresenta alto potencial de aplicação na imobilização das células
(viáveis ou não) pois na tecnologia industrial este processo origina latas concentrações celulares por unidade de
volume de reator.
Agentes de floculação usados na formação de agregados celulares:
o Polielectrólitos catiónicos (poliaminas, polietilenoiminas, poliacrilamidas, polielectrólitos aniónicos)
o Compostos metálicos (óxidos, hidróxidos, sulfatos e fosfatos de magnésio)

Método de oclusão (“entrapment method”)

Baseia-se na oclusão das células ou enzimas em matrizes (polímeros ou membranas) suficientemente eficazes de
modo a impedir a sua libertação para a solução, permitindo a difusão de substratos e produtos.

É o método mais utilizado para imobilização de células (mortas, em estado latente ou em crescimento)

Para retenção da viabilidade celular são preferidos métodos não químicos, especialmente ao utilizar materiais não
tóxicos (k-carragéneos, alginato…)

Principais vantagens:

o Aparentemente não existe ligação entre o biocatalisador e o suporte

o Elevada retenção da atividade enzimática
o Não há destruição da atividade biológica, comparada com os métodos químicos

Principais desvantagens:
o Limitação a substratos e produtos de baixo peso molecular

O material resultante deve possuir porosidade suficiente para o transporte do substrato e saída do produto,
permanecendo as células no seu interior.
Método de oclusão em géis
Envolve a oclusão do biocatalisador nos espaços intersticiais do gel insolúvel.
O biocatalisador pode ser aprisionado tanto por:
o Polimerização
o Formação de ligação iónica
o Precipitação
Matrizes mais utilizadas no método de oclusão:

1. Polímeros orgânicos
Naturais
Polisacárideos (alginatos, carragéneos, agar e agarose, quitina e quitosano, pectinas, celulose, gelano)
Proteinas (colagénio, gelatina, albumina)

Sintéticos
Nylon, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliamidas, polipéptidos, polímeros de vinilo e alilo, álcool vinílico,
silicone, poliuretano, resinas epóxi

Oclusão por precipitação

Os géis podem ser formados por precipitação de polímeros naturais o u sintéticos, por alteração de alguns
parâmentros da solução, tais como temperatura, salinidade, pH ou solvente.

Matrizes mais utilizadas: colagénio, gelatina, agar, K-carragéneo, agarose

K-carragéneo – polissacárido extraído das algas vermelhas e utilizado como aditivo alimentar não tóxico
O gel forma-se por contacto da solução de K-carrageneo contendo o biocatalizador com iões metálicos como o
potássio.
No caso do agar a gelificação é obtida por arrefecimento. O gel pode ser granulado em partículas de tamanho
desejado.

Desvantagens do k-carragéneo:

o Dissolução do gel quando o ião indutor do gel não está presente na mistura reacional, o que resulta na
libertação das células.
o Por outro lado, o reagente indutor do gel pode ser inibidor da atividade enzimática desejada

Pode ser útil para investigação das características das células depois da imobilização, por exemplo, viabilidade celular
ou estudos de adsorção na matriz tanto de substratos como de produtos.
Principais vantagens:

o Não toxicidade do gel

o Barato
o Suave
o Praticamente não afetar nem a atividade metabólica, nem enzimática das células e enzimáticas
o Possibilidade de fazer várias formas com o suporte, dependendo da aplicação particular

Oclusão por polimerização

Foi um dos primeiros polímeros, gel de poliacrilamida a ser utilizado na imobilização das células. A preparação do gel
baseia-se na polimerização dos radicais livres de poliacrilamida em solução aquosa. Devido à sua solubilidade em água
têm que ser insolubilizados por reticulação com compostos bifuncionais, normalmente N,N- metilenobisacrilamina
(BIS). BIS - agente de reticulação
Principais desvantagens:

o Toxicidade do monómero de acrilamida e do agente de reticulação (BIS) do que resulta uma diminuição da
atividade enzimática e da viabilidade celular

Oclusão por formação de ligações iónicas

É um dos métodos mais comuns na imobilização de células inteiras. É um processo muito versátil, não tóxico e
preferido para células vivas e células muito sensíveis como células vegetais e protoplastos.

Matrizes mais utilizadas: alginato de cálcio, carboximetilcelulose, chitosano, alginato de alumínio

O processo de imobilização inclui a preparação da solução de alginato, por exemplo, por adição de biomassa e
dispersão da mistura numa solução de iões, o que resulta na formação de esferas com microporos que retêm o
biocatalisador.

Principais vantagens:
o Método simples
o Suave
o Rápidos

Principais desvantagens:
O fato de a utilização de esferas de alginato de cálcio num meio contendo agentes queladores do cálcio, como
fosfatos e alguns catiões Mg2+ ou K+ resultar na dissociação do gel.

Bioencapsulação sol-gel

A bioencapsulação consiste na incorporação de um agente biológico

como parte integrante de uma estrutura polimérica.
A imobilização de RNA, DNA, anticorpos, enzimas, células em matrizes
covalentes com óxidos metálicos, silicatos ou organosilicatos, com
porosidade definida e gerados por reação de polimerização à
temperatura ambiente, compõem os chamados bioencapsulados sol-gel.
Hidrólise parcial dos percursores (salicatos de alquilo ou alcoxisilanos) do que resulta um oligómero, que se pode ser
transesterificado com glicerol – porosidade- com vista ao aumento da biocompatibilidade.

O oligómero é totalmente hidrolisado formando-se uma dispersão coloidal (sol) à qual é adicionada uma solução
tamponizado contendo biocatalisador, dando inicio ao processo de policondensação, donde resulta a formação de
uma fase distinta – o hidrogel ou xerogel contendo o biocatalisador.

A matriz é depois envelhecida e liofilizada resultando nano ou micromatrizes com dimensões na gama 2nm a 2m,
diâmetros de poro de 0,5 a 20nm e áreas superficiais a 1000m2g-1

Principais vantagens:

o Estabilidade mecânica e química

o Eficiente retenção do biocatalisador
o Estabilidade operacional e
armazenamento elevadas

Principais desvantagens:

o Possível ação desnaturante resultante

da bioencapsulação
o Possível colapso dos poros durante a
formação do gel

Aplicações:

o Biossensores (detenção de ácidos orgânicos, álcoois, aldeídos, glucose)

o Reações de síntese
o Esterificação, oxidação, hidrolise
o Produção de proteínas recombinantes

Alternativa à bioencapsulação sol-gel consiste na incorporação de enzimas numa matriz polimérica

Resinas epóxi, poliuretanos, plásticos polivinílicos ou silicone
Obtidas por reações de condensação

Oclusão em gel utilizadas principalmente, em processos com células inteiras:

Produção de aminoácidos, ácidos orgânicos, esteroides

Microencapsulação

Imobilização em membranas lipídicas (encapsulação)

Obtenção das microcápsulas por emulsificação/polimerização interfacial e por complexação de polielectrólitos

Aplicações:
o Retenção de moléculas como a glucose (180Da)
o Macromoléculas de IgG (1,6x104 Da)
o Células de E.coli encapsuladas para metabolização de ureia em ratos com insuficiência renal
 o Microencapsulação de células de mamíferos para produção de anticorpos monoclonais permitiu a redução de
escala de 100x , relativamente à cultura de células em suspensão convencionais, resultando num produto
mais puro.
o Produção de dopamina, interferões e imunoglobulinas

Micelas Invertidas
Uma solução tampão, contendo o biocatalisador é dispersa e emulsionada numa fase orgânica composta por agentes
de superfície, aditivos e um hidrocarboneto (solvente) para formação de membranas líquidas com o biocatalisador
imobilizado.

Agregados esféricos de moléculas de tensioativo, a camada externa é constituída pelas camadas hidrofobas das
moléculas de tensioativo e o interior pelos grupos polares das moléculas.
Formação espontânea quando se dissolve um tensioativo num solvente orgânico apolar.
O tamanho depende da razão molar da água e do agente de superfície, pode ser alterados pela presença de proteínas
grandes. Enzima solubilizada no interior de uma micela está protegida do contacto direto com o solvente orgânico.

Vantagem: Natureza não química e reversibilidade

Desvantagens:

o Possível libertação do biocatalisador

o Difusão de substratos e produtos através da membrana está dependente da sua solubilidade
o Separação do produto surge normalmente dificultada pela presença do agente de superfície

Aplicações:

Conversão de esteroides, glicéridos, ácidos e álcoois de cadeia longa

Método de imobilização de biocatalizadores livres

Retenção das enzimas ou células no seu estado livre continuamente por longos períodos de tempo, em reatores
providos de membranas de filtração.

Vantagens:
Método que não envolve nenhuma modificação da enzima ou do microrganismo imobilizado, nem do seu
microambiente, não se registando alterações das suas propriedades cinéticas ou retenção da atividade catalítica.

Desvantagens:
Possibilidade de adsorção do substrato (macromoléculas) Às membranas e possível redução da velocidade de reação,
devido à resistência à difusão através da membrana.

Escolha do método de imobilização