La inseminación tardía de vacas no obesas mejora las tasas de embarazo cuando se usa el

semen clasificado por sexo en la inseminación artificial programada de las vacas de carne
amamantada

INTRODUCCIÓN

La concepción del semen clasificado por sexo se maximiza actualmente cuando las vacas son
inseminadas después de un estro observado (Seidel, 2007). La cría de citas sin detección de celos
no se recomienda actualmente con el semen sexsort (Seidel, 2011). En la industria de la carne,
sin embargo, el uso generalizado del semen ordenado por sexo probablemente requerirá el
desarrollo de sincronización de estro y protocolos de inseminación artificial de tiempo fijo (FTAI)
que optimicen específicamente para el uso del semen clasificado por sexo.

El semen clasificado por sexo presenta desafíos únicos para su uso en FTAI tanto en términos de
cantidad y calidad de células espermáticas. Debido a las ineficiencias en el proceso de
clasificación celular citométrica de flujo, solo aproximadamente el 20% de las células
espermáticas de un eyaculado dado se pueden clasificar para el contenido deseado del
cromosoma sexual (Seidel y Garner, 2002). En consecuencia, se colocan menos células de
esperma en una dosis de AI de semen ordenado por sexo (típicamente 2 × 106 células por dosis
en comparación con 20 × 106 células por dosis en el semen convencional). Se ha demostrado
que un número menor de células espermáticas por dosis tiene un impacto negativo sobre la
fertilidad (Den Daas et al., 1998; DeJarnette et al., 2008). El semen sexsorted también se
caracteriza por la disminución de la calidad del esperma. Hollinshead et al. (2003) encontraron
que el proceso de clasificación por sexo induce una mayor proporción de espermatozoides
capacitados. Este y otros factores estresantes del proceso de clasificación celular pueden limitar
la vida útil de las células espermáticas que se han clasificado por sexo. Por lo tanto, la
inseminación más cercana al momento de la ovulación generalmente es ventajosa.

Los datos preliminares recopilados por nuestro laboratorio sugieren que las tasas de embarazo
FTAI cuando se usa semen ordenado por sexo son particularmente bajas entre las vacas que no
expresan estro antes del IATF, tal vez porque la fertilidad de los espermatozoides y el momento
de la ovulación no están alineados de manera óptima. Por lo tanto, el objetivo de este estudio
fue desarrollar una estrategia que optimizara el uso de semen ordenado por sexo en un
protocolo FTAI modificado que maneja con mayor precisión a las hembras basándose en la
expresión del estro antes del FTAI.

Materiales y métodos

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de
Animales de la Universidad de Missouri.

Animales

Estrus se sincronizó usando el protocolo 7-d CO-Synch + de liberación controlada de droga

interna (CIDR) para vacas cruzadas de carne de vaca lactante (n = 656) en 5 lugares durante 3
días. Las vacas recibieron GnRH (100 μg, im; Cystorelin; Merial, Athens, GA) y un inserto CIDR
Eazi-Breed (1,38 g de progesterona; Zoetis, Madison, NJ) en d 0. En d7, PGF2α (25 mg, im;
Lutalyse; Zoetis) se administró coincidiendo con la eliminación de insertos CIDR. A todas las
vacas se les administró GnRH (100 μg, i.m.) en d 10 a las 66 h después de la eliminación de la
inserción de CIDR.
Se aplicaron agentes de detección de estro (Estrotect; Rockway Inc., Spring Valley, WI) en la
eliminación de PGF2α y CIDR en d7, y se registró la expresión de estro en la administración de
GnRH en d 10. Se consideró que las vacas habían expresado estro si el> 50% de el revestimiento
de fricción se eliminó del Estrotect. Las vacas fueron asignadas dentro del grupo de edad por
BCS (escala de 1 a 9: 1 = demacrado y 9 = obeso; Richards et al., 1986) a 1 de 3 tratamientos: 1)
FTAI (concurrente con GnRH, 66 h después de la extracción de inserción de CIDR) con semen
convencional independientemente de la expresión del estro (n = 218), 2) FTAI con semen
ordenado por sexo independientemente de la expresión del estro (n = 217) o 3) FTAI con semen
ordenado por sexo para vacas que expresaron estro y IA 20 h diferida después de la GnRH final
(Fig. 1) para las vacas que no expresan el estro (n = 221). Se registraron los tiempos de
administración de PGF2α, administración de GnRH e IA para cada vaca. Toda la IA fue realizada
por un único semen convencional y por sexo. El semen se obtuvo de un toro comercial, y las
pajas de semen se envasaron a las tasas de dosis estándar de la industria para el semen
convencional y clasificado por sexo (25 × 106 y 2.1 × 106 células de esperma por paja,
respectivamente). Doce a 14 días después de la inseminación artificial, las vacas estuvieron
expuestas a toros fértiles durante el resto de la temporada de reproducción.

Diagnosis del Embarazo

La tasa de preñez a AI se determinó mediante ultrasonografía transrectal (Aloka 500V equipado

con un transductor lineal de 5,0 MHz; Aloka, Wallingford, CT) 60 días después de la FTAI.

Análisis estadístico

Las tasas de expresión del estro antes de FTAI se analizaron mediante ANOVA utilizando el
modelo estadístico con la ubicación, el tratamiento y la interacción de la ubicación y el
tratamiento (PROC GLIMMIX, SAS Inst. Inc., Cary, NC). Además, las tasas de embarazo FTAI se
analizaron mediante ANOVA utilizando el modelo estadístico con expresión de estro antes de la
interacción FTAI, ubicación, tratamiento y ubicación × tratamiento (PROC GLIMMIX, SAS Inst.
Inc.).

RESULTADOS En la Tabla 1 se muestran el número de vacas, la edad media, el promedio de BCS

y la respuesta del estro para cada tratamiento. Las tasas de embarazo a FTAI basadas en la
respuesta, tratamiento y ubicación del estro se muestran en la Tabla 2. El intervalo de PGF2α a
GnRH ( media ± SE) fue de 66.4 ± 0.8 h para los 3 tratamientos.

Para las vacas no obesas que recibieron inseminación diferida en el Tratamiento 3, el intervalo
entre GnRH e inseminación (media ± SE) fue 20.4 ± 1.0 h.

Se encontró un efecto de ubicación significativo para la respuesta del estro (P = 0,0081), ya que
las tasas de respuesta del estro antes de la GnRH variaron según las ubicaciones. Sin embargo,
no se encontraron efectos de tratamiento significativos (P = 0.9057) o interacción de ubicación
× tratamiento en relación con la respuesta del estro (P = 0.5579).

No se encontraron efectos significativos de la ubicación (P = 0.6017) o la interacción ubicación ×

tratamiento (P = 0.0938) en relación con la tasa de embarazo FTAI. Al combinar ubicaciones
(Tabla 3), se encontró una interacción de tratamiento × expresión del estro (P <0.0001). Las
vacas que expresaron estro antes de FTAI alcanzaron mayores tasas de embarazo FTAI (P
<0.0001) que las vacas que no expresaron estro cuando las vacas fueron inseminadas con semen
convencional (Tratamiento 1; 77 versus 37%, respectivamente) o con semen ordenado
sexualmente concurrente con GnRH administración (Tratamiento 2; 51 versus 3%,
respectivamente). Sin embargo, las tasas de embarazo al semen ordenado por sexo no difirieron
significativamente (P = 0.36) entre vacas con celo y sin estro cuando las vacas no obesas fueron
inseminadas 20 h después de la administración de GnRH (Tratamiento 3; 42 versus 36%,
respectivamente).

Se alcanzaron tasas más altas de embarazo FTAI (P <0,0001) con semen convencional
(Tratamiento 1; 77%) que con semen ordenado por sexo (Tratamientos 2 y 3; 51 y 42%,
respectivamente) entre las vacas que expresaron estro.

Sin embargo, entre las vacas que no expresaron estro, la inseminación diferida con semen
ordenado por sexo produjo tasas de embarazo con FTAI más altas (P <0,0001) que con el semen
sexado en el tiempo estándar (Tratamientos 2 y 3; 3 versus 36%, respectivamente). Además,
entre las vacas que no expresaron estro, las tasas de embarazo FTAI al usar semen ordenado por
sexo en el momento diferido (36%) fueron comparables (P = 0,9) a las alcanzadas con el semen
convencional en el tiempo estándar (Tratamiento 1; 37% )

DISCUSIÓN

En FTAI, hay fundamentalmente 2 grupos de mujeres: las que han expresado estro antes del
IATF y las que no han expresado el estro. Las hembras que expresan celo ovulan en respuesta a
un aumento endógeno de LH que ocurre coincidiendo con la aparición del estro. Para estas
mujeres, la ovulación ocurre aproximadamente 28 h después del inicio del estro (Walker et al.,
1996). Por el contrario, las hembras que no han expresado estro en el momento del FTAI son
inducidas a ovular en respuesta a la administración de GnRH en la inseminación, con la ovulación
aproximadamente 28 h más tarde (Pursley et al., 1995; Vasconcelos et al., 1999). . Existen, por
lo tanto, 2 distribuciones diferentes de tiempos de ovulación en un protocolo FTAI, con hembras
del estro que presumiblemente ovulan más temprano en relación con FTAI que las hembras no
desnudas.

En base a los resultados de estudios previos con semen sexado (Mallory et al., 2013; Nash et al.,
2012a), planteamos la hipótesis de que gran parte de la disminución de las tasas de embarazo
FTAI a semen ordenado por sexo se puede atribuir a la reducción de las tasas de embarazo de
las vacas que no pudo expresar el estro antes del FTAI. Los estudios que examinaron la relación
entre el momento de la inseminación y el comienzo del celo en el ganado han llevado al
concepto de que el tiempo óptimo de inseminación es un compromiso. La inseminación
demasiado temprana en relación con la ovulación puede resultar en una vida espermática
inadecuada que conduce a una menor tasa de fertilización pero mayor calidad embrionaria,
mientras que la inseminación demasiado tardía puede resultar en una selección reducida de
espermatozoides o un oocito envejecido que conduzca a una mayor tasa de fertilización pero a
una menor calidad embrionaria (Dransfield et al. ., 1998, Dalton et al., 2001; Saacke et al., 2000).
Sin embargo, el momento óptimo de inseminación cuando se usa semen convencional
probablemente no sea el momento óptimo cuando se usa el semen clasificado por sexo, ya que
el proceso de clasificación celular citométrica de flujo puede dañar los espermatozoides de
manera que limiten la longevidad de los espermatozoides en el tracto femenino. Nuestra
hipótesis es que la inseminación a la administración de GnRH puede ser demasiado temprana
para las hembras no desnudas, cuya ovulación inducida ocurrirá aproximadamente 28 h después
de la administración de GnRH. Estos datos respaldan esa hipótesis, ya que el retraso en la
inseminación de hembras no desnudas hasta las 20 h después de la GnRH mejoró drásticamente
las tasas de embarazo con FTAI hasta el semen clasificado por sexo.
Además, estos datos sugieren que la inseminación retrasada de vacas no obesas usando semen
ordenado por sexo puede producir tasas de embarazo comparables a la inseminación usando
semen convencional en el momento estándar. Nash et al. (2012a) propusieron una estrategia
para limitar el uso del semen clasificado sexualmente a las vacas en celo en un protocolo FTAI,
con el uso de semen convencional para vacas no obesas para lograr tasas de embarazo
aceptables. Como ejemplo, una respuesta típica del estro antes del IATF puede ser de alrededor
del 50% entre las vacas de carne vacuna, lo que significa que dicha estrategia limitaría el uso del
semen ordenado por sexo a aproximadamente la mitad del rebaño. Los datos actuales, sin
embargo, sugieren que hay una oportunidad para el uso ampliado de semen ordenado por sexo
en un protocolo FTAI, ya que se lograron tasas de embarazo similares con la inseminación
diferida del semen clasificado por sexo como con el semen convencional y sin demora.

Además de alinear mejor la vida útil de los espermatozoides capacitados y viables con el
momento de la ovulación, la inseminación tardía de las vacas no obesas también puede permitir
el establecimiento de un entorno materno más favorable para el embarazo. Las vacas que
expresan estro antes del FTAI tienen tasas de embarazo más altas que las vacas que no expresan
el estro antes del FTAI después de la administración del protocolo CO-Synch (Perry et al., 2005;
Busch et al., 2008). Además, Busch et al. (2008) informaron que las vacas que exhibían estro
antes de la FTAI tenían concentraciones séricas de estradiol mayores durante los 2 días previos
a la inseminación que las vacas no obesas que fueron inducidas a ovular con GnRH. La iniciación
del estro en el ganado va precedida de un aumento de las concentraciones séricas de estradiol
(Allrich, 1994), y el estradiol preovulatorio coordina varios procesos fisiológicos que contribuyen
al establecimiento y mantenimiento del embarazo, incluidos los efectos sobre las células
foliculares, el ovocito, el transporte de gametos, y preparación del ambiente uterino (Pohler et
al., 2012).

Las concentraciones más bajas de estradiol entre las vacas no obesas también pueden afectar
las tasas de embarazo al afectar el transporte de esperma en el tracto reproductivo femenino.
Perry et al. (2008a, b) sugirieron que las concentraciones preovulatorias de estradiol durante el
estro de pie pueden modular el pH uterino para afectar el transporte de esperma. Aunque la
administración de GnRH no induce estro, es posible que retrasar la inseminación de vacas no
obesas permita el desarrollo de un ambiente uterino y oviductal más favorable, dadas las 20
horas adicionales de exposición a altos niveles preovulatorios de estradiol antes de la
inseminación.

Nuestros datos difieren un poco de los de Sá Filho et al. (2012), que informaron que las tasas de
embarazo después de FTAI para el semen ordenado por sexo no fueron significativamente
menores que las tasas de embarazo al semen convencional entre las vacas que no habían
exhibido estro en el tiempo estándar de FTAI.

Sin embargo, ese estudio (Sá Filho et al., 2012) involucró vacas Bos indicus en lugar de vacas Bos
taurus como en nuestro estudio.

Además, en el estudio de Sá Filho et al. (2012), el estro se sincronizó utilizando un protocolo que
contiene cipionato de estradiol (ECP) y benzoato de estradiol (EB) en lugar del protocolo 7-d CO-
Synch + CIDR utilizado en nuestro estudio. Jinks et al. (2013) demostraron que la administración
de PAE a vacas posparto 24 h antes de que GnRH indujera la ovulación de un pequeño folículo
dominante y FTAI resultó en un aumento en las tasas de embarazo en comparación con las vacas
que no recibieron ECP. La administración de ECP o EB después de la eliminación del dispositivo
de progestina en el estudio de Sá Filho et al. (2012) probablemente proporcione un entorno de
estradiol mejorado y pueda aliviar potencialmente parte de la reducción en las tasas de
embarazo con FTAI cuando se usa el semen clasificado por sexo en vacas no obesas. Por lo tanto,
no está claro si hay una oportunidad para mejorar las tasas de embarazo de FTAI a través de la
inseminación retrasada de vacas no frías cuando se usan protocolos que contienen ECP y EB
entre las vacas Bos indicus.

En conclusión, estos resultados indican que se pueden lograr mayores tasas de embarazo FTAI
para el semen ordenado por sexo al retrasar la inseminación de vacas no adultas. El uso de un
auxiliar de detección de estro puede ser útil para los productores al clasificar a las hembras que
expresaron estro o que no pudieron expresar el estro antes del FTAI. Las hembras clasificadas
como que tenían estros expresados podrían ser inseminadas a la hora estándar, y las hembras
clasificadas como que no tenían estros expresados podrían recibir GnRH seguido de
inseminación 20 h más tarde. Esta estrategia ofrece a los productores la oportunidad de alcanzar
tasas de embarazo AI aceptables para el semen clasificado por sexo sin la necesidad de detectar
visualmente el estro e inseminar durante varios días como en un sistema de detección de estro.

Estudios previos utilizando semen ordenado por sexo han evaluado retrasar el tiempo de IA (por
ejemplo, un intervalo prolongado desde PGF2α a IA para todo el grupo sincronizado) con éxito
moderado (Schenk et al., 2009; Sales et al., 2011). Sin embargo, hasta donde sabemos, este
experimento es el primero en administrar diferencialmente a las hembras basado en la
expresión del estro antes del IATF, en un intento de optimizar el momento de la inseminación
para ambas clases de hembras.

Se necesitan más estudios para evaluar el efecto de la inseminación retrasada de vacas y

vaquillas no frías cuando se usa semen convencional en lugar de sexado.

Aunque no en el mismo grado que cuando se usa el semen clasificado por sexo, las tasas de
embarazo FTAI al semen convencional fueron significativamente menores para las mujeres que
no expresaron estro antes de FTAI en datos publicados anteriormente por nuestro laboratorio
(Busch et al., 2008; Nash et al. ., 2012b; Martin, 2012). Análisis retrospectivos adicionales de
estos datos sugieren que puede haber diferencias considerables entre los toros en las tasas de
embarazo de las hembras que no pudieron expresar el estro antes del IATF. Esto plantea
preguntas sobre si los toros que no funcionan tan bien en los protocolos de FTAI pueden ser
identificados o pueden ver una mejor fertilidad cuando se administran mujeres de forma
diferente en función de la expresión del estro.

Los experimentos futuros deberían evaluar una estrategia similar de inseminación retrasada de
hembras no desnudas como un medio potencial para mejorar o agregar consistencia a las tasas
de embarazo de IATF en una variedad de contextos.