ESTUDIOS PRELIMINARES EN LA MARCACION DEL PEPTIDO

DOTA-HER 2/NEU CON 177Lu

López Bularte, A C; Nevares N N; Pérez J H; Zapata A M; Crudo J L.

Div. Radiofarmacia Básica y Aplicada, Centro Atómico Ezeiza, Comisión Nacional de Energía
Atómica, Argentina. Contacto: bularte@cae.cnea.gov.ar

Abstract:
Introduction. HER 2 (human epidermal growth factor receptor type 2) also called
HER2/neu are over expressed in various human cancers including breast and ovarian
cancer. Sinthetic peptides can bind them with high afinity and specificity. These
peptides may be usefull candidates for tumor imaging. The same peptides can be
labelled with beta negative radionuclides such as Luthetium-177 (Lu-177), for potential
use in radionuclide therapy of cancer. The main goal of the present study was to labell
DOTA-HER 2/Neu peptide with locally produce Lu-177 and carry out quality controls
and in vitro assays of the radiolabelled peptide.
Methods. 10-70 μg of peptide were labelled with 1-3.5 mCi of 177LuCl3 (S.A.= 20
Ci/mg) at pH 5 adjusted with sodium acetate. The solution was incubated at 90ºC.
Radiochemical purity (RP) were determined using Reverse Phase-High Performance
Liquid Chromatography (RP-HPLC). Stability in saline and serum were carried out at
37ºC. Binding to serum protein were determined. Internalization assays using BT 474
(HER 2+) cell line were carried out.
Results. RP determined by RP-HPLC was 10,5-99,0%, (Retention Time = 12 min).
Percentage of recovery in the HPLC was quite low (25-65% of the total injected
activity). The peptide solubility in water was low, then previous to radiolabelling
procedure the peptide were dissolved in acetonitrile/ water (1:1) and ethanol/ water (2:1)
with higher labelling yields. The stability in water and human serum were good.
Binding serum protein assay were 34.8% and 28.9 % at 45 min and 48 h respectively.
Preliminar internalization assays with 177Lu-DOTA-HER2 peptide showed no binding
to the BT 474 (HER 2+) and unsuccessful blocking with trastuzumab.
Conclusion. Preliminar results of 177Lu-DOTA-HER2 showed good RP and good
stability in water solution and human serum. It will be neccessary to modify same
parameters during the next internalization assays and to obtain higher S.A. than before.
In- vivo assays will be done if the in-vitro assays were successfull.

Objetivo:

El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados preliminares de la marcación con

Lutecio-177 del péptido DOTA-HER 2 y sus controles in-vitro.

Introducción:

En la Argentina, el total de muertes debidas a tumores (malignos, benignos e inciertos)

durante el trienio 2008-2010, representa un 20% de las defunciones totales. Según el
Ministerio de Salud de la Nación, el cáncer de pulmón es el que ocasiona más muertes
por año, y representa el 16% del total de defunciones por cáncer en ambos sexos. Sólo
el 15% de los pacientes con esta enfermedad sobrevive 5 años (1).
Según los datos estadísticos, el cáncer de mama representa el 9% del total de muertes
por cáncer para toda la población argentina, pero si se restringen los valores a mujeres,
el porcentaje de mortalidad se duplica (21% del total de defunciones por año) (Tabla I).

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Los valores de la Tasa Estandarizada de Mortalidad (TEM), que representa la
mortalidad específica debida a tumores por cada 100.000 habitantes, se muestra en la
Gráfico I. En mujeres, la mortalidad por cáncer de mama tiene una TEM de 17,73 por
cada 100.000 mujeres (2).
Es por ello, que a pesar de los grandes avances en la detección temprana de este tipo de
cáncer, el desarrollo de nuevas terapias para ambos tipos de enfermedad, localizada y
metastásica, continúan siendo objeto de gran interés.

Tratamientos Convencionales para Cáncer de mama:

Una vez establecido el diagnóstico de cáncer de mama, el tratamiento dependerá del
tipo de enfermedad y de las características patológicas particulares, como el grado del
tumor o el nivel de expresión de receptores específicos (1).
El enfoque actual para tratamiento del cáncer es multidisciplinario e involucra la
combinación de distintas modalidades terapéuticas.
Las opciones de tratamiento actuales pueden ser: cirugía, radioterapia, quimioterapia,
terapia hormonal y terapias dirigidas.
Algunos agentes quimioterápicos que han mostrado respuesta en alguno de los estadios
de la enfermedad se muestran en la Tabla II (1).
La terapia hormonal adyuvante beneficia a mujeres con tumores que expresan
receptores de estrógeno, y por muchos años, el Tamoxifeno fue el Gold Standard (3).
Tanto la terapia hormonal como la dirigida dependen de la expresión/sobreexpresión de
receptores específicos. Los receptores estradiol/estrógeno (RE) y progesterona (RP) son
la base de la terapia hormonal así como los receptores HER2 lo son para la terapia
dirigida con el anticuerpo Trastuzumab (Herceptin, Roche). Este anticuerpo
monoclonal humanizado inhibe la proliferación de células cancerosas, induce apoptosis
y reduce la angiogénesis tumoral (1). Ha demostrado su efecto como monoterapia, pero
mayormente se usa como adjuvante para reducir el riesgo de recurrencia (1). Sin
embargo estudios clínicos han demostrado que el 50 % de los pacientes HER2 +
adquieren un fenotipo no respondedor (4). Se han identificado algunos mecanismos de
resistencia, entre ellos la pérdida del dominio extracelular de HER2 (5). También se ha
demostrado mediante ensayos in-vitro, que la hipoxia regularía la sensibilidad al
Trastuzumab de las células tumorales HER2 +, y el factor inducible por hipoxia (HIF-1
a) estaría involucrado en los mecanismos de resistencia al tratamiento (4).

Terapia Radionucleídica de Receptores Peptídicos (PRRT):

La PRRT es una técnica que utiliza una clase importante de radiofármacos para
tratamiento de tumores. Se basa en la marcación de péptidos con un radionucleído
terapéutico a través de un agente quelante bifuncional (BFCA). El hecho de que la dosis
entregada por el radiofármaco es mayor en el tejido tumoral que en el sano se
fundamenta en la sobreexpresión de algunos receptores en las células tumorales y la
alta especificidad de los péptidos por ellos (Figura 1).
La actividad biológica y funcional de los péptidos y los anticuerpos, como el
Trastuzumab, se basa en la alta afinidad y especificidad de estas biomoléculas por
receptores de membrana específicos. Sin embargo, los péptidos poseen algunas ventajas
con respecto a los anticuerpos (6):
- Son mucho más pequeños lo cual los hace mucho más permeables en los tejidos,
excepto la barrera hematoencefálica. Esta distribución diferencial representa
una gran ventaja cuando se busca llegar sólo a tumores en la periferia, ya que el
cerebro suele expresar la mayoría de los receptores blanco.
- Al ser los péptidos compuestos que se encuentran normalmente en los seres
vivos, no suelen tener efectos citotóxicos tan marcados como los

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 quimioterápicos. En general, los efectos colaterales se basan en su actividad
fisiológica intrínseca.
- Usualmente carecen de propiedades antigénicas, debido a su pequeño tamaño.
- Gracias a la tecnología actual disponible, son fáciles de sintetizar y modificar,
incluso con aminoácidos no naturales, aumentando la estabilidad de los análogos
sintéticos frente a las peptidasas.
Entre los posibles blancos bajo estudio para la aplicación de este tipo de terapia se
encuentra el receptor HER 2.

Receptor HER 2:
El receptor HER 2, también conocido como ErbB2 o neu pertenece a la familia ErbB
que consta de cuatro receptores: EGFR (ErbB1), HER 2, ErbB3 y ErbB4, todos
comparten una estructura de tres dominios: uno extracelular de unión al ligando, uno
transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosin quinasa (7).
Tienen un rol fundamental en la homeostasis del tejido normal, pero también
intervienen en el crecimiento y la malignidad de una amplia variedad de tipos tumorales
(8).
Los receptores son inactivos como monómeros, pero la unión del ligando al dominio
extracelular induce la formación de homodímeros y heterodímeros (Figura II). Esto
resulta en la fosforilación (activación) de la tirosin quinasa que consecuentemente
pondrá en marcha una vía de señales compleja e interrelacionada. Estas vías de señales
que se activan están implicadas en el control de muchos procesos celulares como la
apoptosis, migración, crecimiento, adhesión y diferenciación. Las vías claves activadas
por la señalización HER incluyen Ras, la proteína quinasa activada por mitógeno Raf
(MAPK), la quinasa de fosfatidil inositol 3 (PI3k) y las vías Akt.
EGFR, HER-2 y HER-4 tienen actividad quinasa intrínseca mientras que HER-3 carece
de ella. Aunque los receptores comparten una gran homología en los dominios tirosin
quinasa, los dominios extracelulares están mucho menos conservados. Estas diferencias
proporcionan las distintas especificidades a cada receptor para reconocer y unir los
ligandos. Los ligandos pertenecen a la familia EGF de factores de crecimiento: EGF,
TGF-α, EGF-HB, anfirregulina, betacelulina, epirregulina, tomorregulina y la
subfamilia neurregulina.
A diferencia de los otros receptores, HER-2 no se activa por un ligando. Su activación
ocurre mediante homodimerización, en el caso de sobreexpresión de HER 2 o mediante
heterodimerización por activación del ligando de HER-1, HER-3 o HER-4. La
dimerización con HER-2 es la preferida de los otros receptores. Los heterodímeros con
HER-2 son altamente estables mostrando una tasa baja de disociación del ligando
debido a una elevada afinidad por el mismo. Además tienen una potente actividad
señalizadora y son sinérgicos para la transformación celular (9).
Los receptores de esta familia desempeñan un papel importante en el desarrollo de la
mama normal, pero pierden su correcta regulación en las enfermedades premalignas y
malignas de la mama. Cuando los receptores de la familia HER se sobreexpresan o se
mutan, en general se comportan como oncogenes. HER-1 está sobreexpresado en
aproximadamente el 30% de los tumores de mama y se cree que su papel es importante
en los estadios finales del cáncer de mama humano y en el proceso metastásico. HER-2
está sobreexpresado en 25-30% de los cánceres de mama humanos, y se cree implicado
en la iniciación tumoral y progresión temprana del tumor. Se han reportado otros tipos
de tumores que expresan este receptor: se expresa entre el 7-50% en cáncer de pulmón
de células no pequeñas (1), y se sobreexpresa entre el 11-30 % de cáncer epitelial de
ovario (1).

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Lutecio-177:
El Lutecio-177 (177Lu) posee ventajas comparativas con respecto a otros radionucleídos
terapéuticos: es de producción local (RA-3 y Planta de Producción de Radioisótopos,
Centro Atómico Ezeiza) lo cual disminuye su costo notablemente; posee emisiones β-
con energía máxima de 497 Kev (78 %) con un alcance promedio de 2 mm en tejido
blando; sus emisiones γ de 208 Kev (11%) son apropiadas para la adquisición de
imágenes in-vivo y estudios dosimétricos y el período de semidesintegración, 6,7 días,
permite la organización de un sistema adecuado de distribución, pudiendo llegar a
servicios de Medicina Nuclear en lugares alejados (10).
El 177Lu fue producido en el RA-3 (Centro Atómico Ezeiza) por el método directo a
partir de un blanco de Lu2O3 enriquecido al 82% en 176Lu, y se basa en la reacción
nuclear 176Lu(n,γ)177Lu (11).

Materiales y métodos:

Obtención de Lutecio-177:
Brevemente, el blanco de Lu2O3 enriquecido al 82% en 176Lu fue irradiado en el reactor
RA-3 por 4-6 periodos. Luego fue disuelto en HCl (Suprapur, Merck) con un nivel de
impureza en Fe inferior a 2 ppb (12)

Péptido DOTA-HER 2/NEU:

El péptido fue sintetizado y cedido gentilmente por Subhani Okarvi y sus colaboradores.
La síntesis fue en fase sólida basada en la estrategia Fmoc/HBTU, usando un
sintetizador CS036 (CS BIO Co., San Carlos, CA, USA). El péptido consta de 10
aminoácidos unidos al agente quelante DOTA por su extremo N-terminal (Figura III)
(13).

Dilución del péptido DOTA-HER 2/NEU:

Se prepararon dos soluciones del péptido de la siguiente manera:
Solución A: Acetonitrilo: agua (1:1), concentración final 1ug/ul.
Solución B: Etanol: agua (2:1), concentración final 2 ug/ul.

Marcación del péptido DOTA-HER 2/NEU con 177Lu:

Para la marcación se tomaron entre 10-70 μg de péptido DOTA-HER 2/NEU y se
marcaron con 1-3,5 mCi de 177LuCl3 de Ae entre 30-35 Ci/mg de 176Lu al momento de
la marcación.
Las marcaciones se ajustaron a pH 5-5,5 con acetato de amonio 1 M y se incubaron a
90ºC a distintos tiempos entre 0,5 – 2,5 hs.
Las marcaciones fueron realizadas con la solución A y B del péptido para evaluar la
solubilidad del mismo.

Determinación de la Pureza Radioquímica (PR):

El porcentaje de PR se determinó por Cromatografía Líquida de Alta Performance de
Fase Reversa (RP-HPLC, columna Delta-pak C18, Waters) bajo las siguientes
condiciones: solvente A: Agua TFA (trifluoracético); solvente B: Acetonitrilo (ACN);
Gradiente: de 0-1 min. 100% A; de 1-2 min. 90% A; de 2-10 min. 30% A; de 10-15
min. 0 % A; de 15-20 min. 0%A; de 20-23 min, 100% A.

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Ensayo de Estabilidad en solución acuosa:
Una alícuota del radiofármaco (Ae del radiofármaco: 0,04 mCi/ ug de péptido) fue
llevada a una concentración final 273 ug/ml en acetato de amonio 1 M pH 5,5. Se
incubó a 37ºC por 48 hs y se analizó por RP-HPLC.

Ensayo de Estabilidad y Unión a Proteínas del Suero Humano (SH):

La estabilidad en SH y la unión a proteínas del suero se estudiaron incubando 150 uCi
de radiofármaco (Ae del radiofármaco: 0,04 mCi/ ug de péptido) con 100 ul de SH
(concentración final 37 ug/ml), a 37ºC, durante 1h. y 48 hs, por duplicado.
A cada tiempo se tomaron 55 ul de muestra y se precipitaron las proteínas del suero con
1 volumen de solución de etanol: acetonitrilo (1:1). Se centrifugó a 3000 xg por 5 min y
se tomó el sobrenadante (SN). Se realizó un lavado más del pellet con la misma
solución anterior.
Para evaluar la estabilidad en SH, una muestra del SN fue analizada por RP-HPLC.
En el ensayo de unión a proteínas del SH, se midió la actividad de los pellet y los SN.
Se calculó en Porcentaje de unión a proteínas del SH como la actividad retenida en el
pellet con respecto a la actividad total (actividad de pellet y SN).

Ensayo de internalización:
El ensayo se llevó a cabo utilizando la línea celular BT 474 derivadas de un carcinoma
invasivo ductal mamario. Brevemente, se sembraron aproximadamente 1.000.000 de
células por pozo, en placas de 6 pozos, y se dejaron crecer por 48 hs. Se retiró el medio
y se lavaron 2 veces con PBS/ 1% BSA. Tres pozos fueron bloqueados con
Trastuzumab (Herceptin, Roche) una concentración final de 10,5 mg/ml por pozo. El
péptido radiomarcado fue agregado para obtener una concentración final de 4 ng/ml por
pozo. El volumen final por pozo fue de 1,6 ml y se incubó por 1 hs a 37 ºc. Luego se
realizaron 2 lavados con PBS/ 1% BSA, 2 lavados con solución de glicina 1 M, y dos
lavados con NaOH 1 M. Se midió la actividad de cada una de las fracciones en un
contador automático (Packard).

Resultados:

Obtención de Lutecio-177:
Las actividades específicas de 177LuCl3 obtenidas en el RA-03 fueron entre 35-40
Ci/mg de 176Lu al instante final del bombardeo.

Pureza Radioquímica:
Las A.e. de las marcaciones realizadas fueron entre 0,04 y 0,35 mCi/ug de péptido. Las
PR (tiempo de retención, TR= 12,1 min.) variaron de 10,5 a 97 %, siendo la marcación
de A.e. 0,04 mCi/ug de péptido la de mayor porcentaje observado (Gráfico II). Se
observó un bajo porcentaje de recovery, entre 25-65%, posiblemente debido a la baja
solubilidad del péptido. También se probaron distintos solventes para mejorar la
solubilización de DOTA-HER 2, siendo la opción en etanol: agua (2:1) la que mejores
resultados mostró.

Ensayo de Estabilidad en Solución Acuosa:

El porcentaje de PR a las 48 hs post marcación en solución acuosa fue de 99,0 % (TR
12,1 min.).

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Ensayo de Estabilidad y Unión a Proteínas del SH:
El porcentaje de unión a proteínas del SH fue de 34,8% ± 8,4 para 1 h de incubación, y
28,9% ± 4,0 para las 48 hs.
La estabilidad del 177Lu-DOTA-HER2 en SH a 1 h fue muy buena, la PR fue mayor al
98 % (Gráfico III). A 48 hs la estabilidad disminuyó notablemente, observándose la
presencia de otras especies radiomarcadas pero ninguna correspondiente al valor de
tiempo de retención esperado para este análogo (12,1 min.) (Gráfico IV).

Ensayo de internalización:
En las condiciones del ensayo no se observó internalización. Los valores de actividad
medidos estaban cerca de los límites de cuantificación del contador (Tabla III). Por otra
parte, el bloqueo con Trastuzumab no fue exitoso, ya que no se observaron diferencia en
el porcentaje de actividad unida a membrana entre las muestras bloqueadas y no
bloqueadas.

Conclusión:
Se obtuvo una PR del 99 % para la marcación de A.e. 0,04 mCi/ug de péptido, usando
la solución B del péptido (etanol: agua 2:1). El porcentaje de recovery fue bajo,
posiblemente debido la gran hidrofobicidad del péptido DOTA-HER 2.
Se deben optimizar la actividad específica de la marcación, así como también el
gradiente cromatográfico para mejorar el recovery, y la solubilidad del péptido.
La estabilidad en solución acuosa fue muy buena a las 48 hs post marcación (PR 99,0
%). El ensayo de estabilidad en SH, mostró una PR de 98 % luego de 1 h. de
incubación, sin embargo a las 48 hs no se observó el radiopéptido al tiempo de
retención esperado (12,1 min.). Se pudo observar claramente la presencia de al menos
tres especies radiomarcadas.
El ensayo de internalización no es concluyente. Las mediciones de actividad de las
fracciones correspondientes a la actividad retenida en membrana e internalizada en la
célula, estaban muy cerca del límite de cuantificación del equipo. Por otra parte no se
observó diferencias entre las muestras bloqueadas y no bloqueadas con Trastuzumab. Se
debe repetir el ensayo modificando algunos parámetros como, el tiempo de incubación
con el agente bloqueante, la concentración de radiopéptido en el ensayo, el tiempo de
incubación con el radiofármaco y también mejorar la estadística de conteo de las
mediciones.

Agradecimientos:

Al Organismo Internacional de Energía Atómica por financiar parcialmente este trabajo

CRP Research Contract ARG-16671
Al Dr. Gabriel Fiszman, del Instituto de Oncología Ángel Roffo, por donarnos las
células para el ensayo de internalización.
A Dr. Subhani Okarvi y sus colaboradores del Departamento de Ciclotrón y
Radiofármacos, perteneciente al Hospital y Centro de investigación King Faisal, Arabia
Saudita, por cedernos gentilmente el péptido DOTA-HER 2.

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Referencias:

1 Kurzrock R, Markman M. Targeted Cancer Therapy. Ed. Humana Press (2008).

2 Fuente: SIVER/INC- Ministerio de Salud de la Nación, en base a registros de
mortalidad de la DEIS. Argentina, 2013.
3 Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG). Relevance of
breast cancer hormone receptors and other factors to the efficacy of adjuvant
tamoxifen: patient-level meta-analysis of randomised trials. Lancet 2011;
378(9793)771–784. [Abstract]
4 Moverer L, Rodriguez C, Reidel S, Bal de Kier Joffé E, Jasnis MA, Fiszman GL.
Efecto de la hipoxia en los mecanismos de acción y resistencia al Trastuzumab en
células tumorales de mama. XXVIII Jornadas Multiplidicinarias de Oncología,
Instituto de Oncología Angel Roffo, Buenos Aires, Argentina [Poster].
5 Chen FL, et al. Acquired resistance to small molecule ErbB2 tyrosine kinase
inhibitors. Clin Cancer Res. 2008; 14: 6730-6734.
6 Reubi JC. Peptide Receptor as molecular targets for cancer diagnisis and therapy.
Endocrine Raviews 2003;24(4):389-427
7 Wang SC, Hung MC. HER2 overexpression and cancer targeting. Semin Oncol.
2001; 28: 115-124.
8 Wieduwilt MJ, Moasser MM. The epidermal growth factor receptor family:
Biology driving targeted therapeutics. Cell Mol UfSci. 2008; 65 (10):1566-1584.
9 Nahata R, Esteva FJ. HER-2 targeted therapy: lessons learned and future
directions. Clin Cancer Res. 2003; 9: 5.078-5.084.
10 M. R. A Pillai, S. Chakraborty, T. Das, M. Venkatesh, N. Ramamoorthy.
Production logistics of 177Lu for radionuclide therapy. Applied Radiation and
Isotopes 2003; 59:109-118.
11 J. Crudo, N. Nevares. Second research co-ordination meeting of the CRP on
“Development of therapeutic radiopharmaceutical based on 177Lu for radionuclide
therapy” (Research contract ARG-14060). Div. Radiofarmacia, Centro Atómico
Ezeiza, Comisión Nacional de Energía Atómica. Bs. As. Argentina. 2008
12 Crudo J.L., et alExperimental Production of M.S.A. 177Lu from highly enriched
176
Lu. Technetium and other radiometals in chemistry and medicine. Volkert.,
2010 SGE Editoriali Padova, Italy.
13 Okarvi SM, Al-Jammaz I. Research and development of Lutetium-177 based
radiopharmaceuticals for targeted radionuclide therapy of cancer. Report of “2nd.
Research Coordination Meeting on “Development and preclinical evaluation of
therapeutic radiopharmaceuticals based on 177Lu- and 90Y- labelled monoclonal
antibodies and peptides”, Stip, Republic of Macedonia, October 01-05 of 2012.
[Oral Presentation].

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 Gráficos, Tablas y Figuras:

Grafico I: Tasas estandarizadas por edad según población mundial de mortalidad específica por cáncer para los
principales sitios tumorales en hombres y mujeres por cada 100.000 habitantes de Argentina en 2011.
* Cifras corregidas teniendo en cuenta la distribución por grupos etarios de las defunciones por cáncer de útero
cuerpo, cuello y sitio no especificado. Fuente: SIVER/INC– Ministerio de Salud de la Nación, en base a
registros de mortalidad de la DEIS. Argentina, 2013.

Tabla I: Distribución absoluta y relativa de los principales sitios tumorales registrados en la mortalidad por
cáncer de ambos sexos, Argentina trienio 2008-2010. (Fuente SIVER/INC, Ministerio de Salud de la Nación)

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Tabla II: Agentes quimioterápicos para el8 tratamiento
de 12 de cáncer de mama:
 Grado de respuesta:
Antraciclinas
Doxorubicin 10-50 %
Epirubicin 13-48 %
Doxorubicin liposomal 10-50 %
Estabilizadores de microtúbulos
Docetaxel 18-68 %
Paclitaxel 16-62 %
Nab-paclitaxel 33-48 %
Ixabepilone 12-57 %
Otros agentes activos
Capecitabine 10-35 %
Vinorelbine 25-50 %
Gemcitabine 12-37 %
Cisplatin/Carboplatin 9-51 %

Figura I: Vista esquemática del fundamento de la PRRT. El

radiopéptido (P) es inyectado (i.v.) al paciente y se distribuye por todo
el organismo. Se unirá específicamente a las células tumorales que
expresen el receptor específico (R-P). La mayor parte de la actividad
quedará retenida en el tumor, mientras que la actividad remanente se
eliminará por los riñones.

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 Figura II: Esquema de señalización intracelular a partir de la unión de los
factores de crecimiento y posterior formación de homo y heterodímeros.
(Tomado de http://www.biooncology.com/biological-pathways/her-signaling)

DOTA–Asp–Ile–Ile–Ser–Ala–Val–Val–Gly–Ile–Leu–CONH2 DOTA-HER 2

Figura III: Secuencia aminoacidica de peptido DOTA-HER 2.

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 Gráfico II: Resultado del RP-HPLC para 177LU-DOTA-HER2, TR=12,16 min. ; PR=97 %

Detector C
LuHER2 estbSH B 50min 140513 140513 corr1 iny 14ul
0. 16 LUHER2 estbSH i ncub 50min i ny 14ul 140513 corr2 B001 0.16
Retention Time
Area Percent
Area

0. 14 0.14

0. 12 0.12

0. 10 0.10
Volts

Volts
0. 08 0.08
0.067 1.67 13854

0. 06 0.06

0. 04 0.04
12.125 98.33 815949

0. 02 0.02

0. 00 0.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Minutes

Gráfico III: Resultados de RP-HPLC para la estabilidad a 1 hs. en suero humano del radiofármaco 177Lu-DOTA-
HER2 (TR 12,12min.; PR 98 %)

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Gráfico IV: Resultado de RP-HPLC para 177Lu-DOTA-HER2 luego de incubar la muestra en SH por 48 hs. Se
observa la presencia de otras especies radiomarcadas (TR1= 2,64 mon.; TR2= 5,27 min.; TR3= 10,5 min) y no
se observó el radiofármaco al tiempo de retención esperado (12,1 min.).

Línea celular: BT 474 (HER2+) 1hora

Promedio de unión
especifica Desv. estandar
% de unión a células 0,14 0,14
(membrana + internalización)

% de unión a membranas 0,13 0,14

Tabla III: Resultados del ensayo de internalización.

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