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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
NATAL – RN
2012
-2-
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABORATÓRIO MULTIDISCIPLINAR DE PESQUISA
NATAL – RN
2012
-3-
COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO
___________________________________________________
Profª. Drª. Maria das Graças Almeida
Presidente-UFRN
___________________________________________________
Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel
Examinador Interno-UFRN
____________________________________________________
Profº Drº Ullysses Paulino Alburquerque
Examinador Externo-UFRPE
NATAL – RN
2012
-4-
AGRADECIMENTOS
À Deus, por possibilitar a existência e sempre nos dar a força para superar
desafios.
Ao Prof. Dr. Jorge A. López pela orientação, incentivo e visão ampla, além da
amizade e ajuda durante todo o árduo trabalho para a elaboração desta
dissertação. Sempre com a idéia de que “nenhum mestre sabe o suficiente,
que nunca poderá ser aluno novamente.”
Às Profª Drª. Alessandra Silva Guedes e Profa. Drª. Sibele Oliveira Tozetto,
pela oportunidade de realizar minha primeira iniciação cientifica, mostrando-me
que experimentar e descobrir são possíveis.
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para este trabalho, meus
sinceros agradecimentos.
Winston Churchill
-6-
RESUMO
Spondias sp. (Anacardiaceae), popularmente conhecida como cajá-umbu, é
uma planta endêmica do Nordeste do Brasil, onde as suas folhas são
largamente usadas na medicina popular no tratamento de processos
inflamatórios, enquanto os seus frutos possuem grande potencial agro-
industrial. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades hepatoprotetora,
antioxidante, antibacteriana, antinociceptiva, antiinflamatória, além da
toxicidade aguda e 28 doses repetidas, usando um extrato metanólico (EMS),
uma fração rica em flavonóides (FRF) e um precipitado obtidos de folhas de de
Spondias sp. A atividade antioxidante dos mesmos foi avaliada para determinar
a capacidade de sequestro do radical livre DPPH, enquanto que MES e e FRF
foram utilizados para avaliar a capacidade hepatoprotetora em lesões induzidas
por tetracloreto de carbono (CCl4). Sete grupos (n=5) de ratas Wistar foram
usados como se segue: grupo de controle, grupo intoxicado com CCl4- tratado
com EMS (500 mg/kg) durante 7 dias, três grupo intoxicado com CCl4 tratados
com o FRF (25, 50 e 75 mg/kg) durante 7 dias e o grupo intoxicado com CCl4
tratado com Legalon® (silimarina, fitoterápico de referência). EMS e FRF
apresentaram ação protetora contra o dano hepático induzido por CCl4, ao ser
observada a redução significativa da atividade enzimática de marcadores
séricos (alanina transaminase e aspartato transaminase). Além disto, a redução
da peroxidação lipídica, o aumento do conteúdo de glutationa e da atividade
enzimática do sistema de defesa de antioxidante (SOD, CAT, GPx),
comparáveis aos valores normais, indicaram a capacidade de MES e FRF de
restaurar o desequilíbrio oxidativo induzido por CCl4. A análise histological
confirmou a hepatoproteção, em comparação às modificações degenerativas
no grupo tratado com CCl4. Este efeito hepatoprotetor foi análogo ao mostrado
pelo Legalon®. A alta capacidade de antioxidante in vitro do extrato (93.16
±1.00 %) foi similar à obtida com Carduus marianus e BHT (padrões de
referência), fato este que explica os resultados obtidos in vivo. Nenhuma
atividade antibacteriana foi detectada, porém, EMS e FRF promoveram o efeito
antinociceptivo induzido na segunda fase da injeção intraplantar de formalina,
evidenciando a ação antiinflamatória; confirmado pelo modelo de peritonite
induzida por carragenina. A avaliação da alodinia mecânica (CFA a 80%)
demonstrou o envolvimento da composição química de Spondias sp. na
atividade anti-inflamatória em relação aos processos agudos. A exposição
aguda e dose repetida durante 28 dias não produziram mudanças significativas
nos parâmetros que avaliaram a toxicidade. Os resultados experimentais,
revelaram que extratos de folhas de Spondias sp. possuem um potencial
promissor na área farmacêutica e face à sua atoxicidade apresentam eficiência
e segurança.
Palavras-chave: Spondias sp., fitoquímica, atividade farmacológica, toxicidade,
ratos e camundongos.
-7-
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIATURAS
1O2 Oxigênio singlet
ALP Fosfatase Alcalina
ALT Alanina transaminase
AST Aspartato transaminase
BHT Butil Hidroxitolueno
BT Bilirrubina Total
CAT Catalase
CCl3- Tricloreto de Carbono
CCl4 Tetracloreto de carbono
CFA Adjuvante completo de Freud
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
DTNB 5,5‟ditiobis, 2-nitrobenzóico
ERN Espécies Reativas do Nitrogênio
ERO Espécies Reativas do Oxigênio
FRF Fração Rica em Flavonóide (Flavonoid rich-fraction)
H2O2 Peróxido de hidrogênio
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa Redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
LH Ácidos Graxos Poliinsaturado
L• Radical lipídico
LOO• Radical Peroxil
LOOH Radical hidroperóxido
LO• Radical Alcooxil
MDA Malondialdeído
O2 Oxigênio Molecular
O2•¯ Radical Anion Superóxido
•OH Radical hidroxil
RSC Radical Scavenging Capacity
-9-
LISTA DE FIGURAS
Figura pág.
01 Detalhes da exsicata de Spondias sp. depositada no 21
Herbário da Faculdade de Tecnologia e Ciências –
Departamento de Biologia – Campus Salvador.
02 Cajá-umbu (Spondias sp.) Linn. (EMBRAPA) A. detalhes 22
dos frutos maduros, e B. galhos de cajá-umbuzeiro.
03 Peroxidação Lipídica (Adaptado LOUREIRO et al., 2002). 26
04 Detoxificação enzimática realizada pela CAT e GPx 28
LISTA DE TABELAS
Tabela pág.
01 Espécies do gênero Spondias distribuídas no Brasil 20
02 Bioatividade atribuídas a espécies da família anacardiácea 22
03 Esquema do gradiente de eluição estabelecido para 45
separação dos compostos fenólicos.
04 Deslocamentos Quimicos (ppm) de RMN-13C e RMN-1H do 65
composto isolado, padrão rutina e lituratura.
05 Ensaios de validação segundo a RE nº 899 72
06 Capacidade sequestradora de 50% dos radicais livres, em 75
µg/mL, dos padrões e dos extratos aquoso, etanolico e
EMS, e frações.
07 Parâmetros bioquímicos de avaliação de lesão e função 78
hepática nos animais dos diferentes grupos experimentais
08 Atividade das enzimas SOD e GPx em homogenato de 86
fígado dos animais dos diferentes grupos experimentais.
09 Determinação da atividade antibacteriana do extrato bruto e 87
das frações contra as cepas testadas.
10 Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos animais 100
controle e tratados com dose única de EMS 2000 mg/kg e
28 doses de 500 mg/kg de EMS.
- 13 -
SUMÁRIO
Pág.
1. Introdução 17
2. Revisão de literatura 20
2.1 Levantamento botânico 20
2.2 Atividades Farmacológicas 22
2.3 Estresse oxidativo 23
2.3.1 Espécies reativas de oxigênio 23
2.3.2 Peroxidação Lípidica 25
2.3.3 Sistema de defesa antioxidante 26
2.3.4 Antioxidantes Naturais 29
2.4 Atividade antibacteriana 31
2.5 Inflamação 32
2.6 Dor 33
2.7 Composição Química 34
2.7.1 Flavonóides 34
2.8 Avaliação toxicológica 36
3. Objetivo 38
3.1 Objetivo Geral 38
3.2 Objetivos Específicos 38
4 Metodologia 41
4.1 Material Vegetal 41
4.2 Otimização do processo extrativo 42
4.3 Obtenção do Extrato Metanólico, das frações e isolado de 42
folhas Spondias sp.
4.4 Caracterização da Composição Química dos Extratos e 44
isolado
4.4.1 Determinação de polifenólicos 44
4.4.2 Espectrofotometria UV 44
4.4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 44
4.4.4 Ressonância Magnética Nuclear 13C e 1H 45
4.4.5 Desenvolvimento e validação de método analítico por 45
CLAE-DAD
- 14 -
INTRODUÇÃO
- 17 -
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica
diversidade étnica e cultural detém um valioso conhecimento tradicional quanto
ao uso de plantas medicinais, e, consequentemente, o potencial necessário
para o desenvolvimento de pesquisas que resultem em tecnologias e
terapêuticas apropriadas (BRASIL, 2005).
1
Medicamento Sintético: produto farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado por síntese
artificial, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnósticos. É uma forma
farmacêutica terminada que contém o fármaco, geralmente, em associação com adjuvantes
farmacotécnicos (BRASIL, 2004).
- 18 -
Dessa forma, os estudos sobre a medicina popular vêm despertando cada vez
mais a atenção científica na identificação e na caracterização química de novos
princípios ativos, visando elucidar a ação farmacológica e efeitos tóxicos
dessas substâncias (GURIB-FAKIM, 2006).
REVISÃO DA LITERATURA
- 20 -
2 REVISÃO DA LITERATURA
O termo radical livre utilizado para designar qualquer átomo ou molécula cuja
estrutura atômica apresenta um ou mais elétrons desemparelhados no seu
orbital mais externo, sendo por isso instável e com grande capacidade de
reatividade. Outras espécies químicas podem-se formar a partir dos radicais
livres, que embora, não tenham elétrons desemparelhados, possuem similar
instabilidade estrutural dos radicais livres. (RIBEIRO et al., 2008).
do radical O2•¯ com H2O2, via reação de Haber-Weiss, forma o radical •OH
(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; VASCONCELOS, 2007).
Assim, o estresse oxidativo não pode ser definido apenas pelo desequilíbrio
entre parâmetros pró-oxidantes e antioxidantes. Atualmente, conceituado como
uma perturbação da sinalização e do controle redox, levando-se em
consideração o sistema redox GSSG/GSH, tioredoxina e cisteina/cistina
(JONES, 2006).
HO CH3
H CH3 H CH3
CH3
CH3 O
CH3
CH3
2.5 Inflamação
A resposta inflamatória é um mecanismo que provoca alterações do sistema
vascular, componentes líquidos e celulares, visando destruir, diluir ou isolar o
agente lesivo, sendo assim uma reação de defesa e de reparação do dano
tecidual (GILMAN, 1996; RANG; DALLE; RITTER, 1997).
Grande parte das atividades dos flavonóides descrita em artigos contempla sua
ação no sangue e em células endoteliais, o qual vem de encontro com as
principais áreas de pesquisa, concentradas na inflamação e no câncer. Embora
os flavonóides sejam estudados há mais de 50 anos, o mecanismo celular
envolvido em sua ação biológica não está completamente elucidado
(BENAVENTE-GARCÍA; CASTILLO, 2008).
2.6 Dor
(STORY et al., 2003) e ativado por temperaturas menores que 17°C (CALIXTO
et al., 2005; PATAPOUTIAN, TATE, WOOLF, 2009). Esses receptores também
podem ser ativados por substâncias pungentes, tais como alicina, D9-
tetraidrocanabinol (THC), formalina, substâncias presentes nos óleos de
mostarda (isotiocianato de alila) e canela (cinamaldeído), e moléculas irritantes
presentes no meio ambiente (BANDELL et al., 2004; JORDT et al., 2004).
2.7.1 FLAVONÓIDES
5'
6' 4'
8 B
9 O 3'
7 2
A C 2'
6 3
10
5 4
O
Figura 6. Estrutura base dos flavonóides (TIWARI, 2001).
OBJETIVO
- 40 -
3 OBJETIVO
METODOLOGIA
- 43 -
4 METODOLOGIA
4.4.2 ESPECTROFOTOMETRIA UV
13
4.4.4 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR C E 1H
4.6.1 ANIMAIS
Com exceção do grupo 1, os animais dos outros grupos receberam uma dose
única de CCl4 (2mL/kg i.p), diluído em veículo (óleo de milho, 50%, v/v). Após
24 h de indução de dano hepático com CCl4, foi iniciada a administração oral
do extrato (EMS), fração rica em flavonóide (FRF) e do Legalon® (controle
antioxidante). Os animais foram sacrificados 24 h após o término da
administração do extrato (BRITO, 2009).
- 50 -
Para a avaliação por este modelo, os animais foram pré-tratados com veículo
(Controle: salina, 0,1 ml/10 g) ou EMS (30-1000 mg/kg) e FRF (3-100 mg/kg)
por via oral, e após 30 min foi intraplantarmente injetado um volume de 20 μL
de formalina a 2,5% na superfície ventral da pata direita do animal. A resposta
nociceptiva (lambida e/ou mordida da pata) foi observada em um período de
tempo de 0-5 min (fase neurogênica) e de 15-30 min (fase inflamatória) após a
injeção da formalina.
A dose da toxicidade aguda foi de 2000 mg/kg, administrada por gavage a seis
ratos de ambos os sexos pela manhã; ocorrendo óbitos abaixo de 50% de até o
14º dia, outros seis animais seriam tratados com dose maior. Se o número de
óbitos fosse superior a 50%, doses sequenciais menores seriam utilizadas até
obter a DL50. A dose selecionada para avaliação da toxicidade 28 doses
repetidas foi 500 mg/kg. Sendo os animais observados por 28 dias (OECD,
1996; ANVISA, 2004) O peso, o consumo de água e de ração, além das
alterações comportamentais foram observados e registrados diariamente. Os
parâmetros hematológicos analisados foram hemoglobina, hematócrito,
contagem total e diferencial de leucócitos, plaquetas. Como marcadores da
função hepática foram avaliados as enzimas ALT, AST, γ-GT e a fosfatase
alcalina. A creatinina, uréia, proteínas totais, albumina foram determinadas
para a avaliação renal. Colesterol total, triglicérides, e a glicemia foram também
analisados. Os animais foram eutanasiados ao término do período
- 58 -
RESULTADOS E DISCUSSÃO
- 60 -
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O bioma Caatinga é um complexo vegetacional com características peculiares
e variações fisionômicas dos seus componentes herbários (RATTER et al.,
1992), e apesar de sua elevada biodiversidade, pouco tem sido feito em termos
de valorizar sua conservação. A caatinga brasileira é considerada um dos 25
ecossistemas do planeta, e muitas destas plantas encontradas nesse
ecossistema são utilizados na medicina natural.
Após a maceração das folhas de Spondias sp. em metanol por 3 dias, para
obtenção do extrato bruto, foi rotaevaporado, após seco foram fracionado por
solventes de polaridade crescente, obtendo-se as frações hexânica,
cloroformica, acetato de etila e precipitado (Fração rica em Flavonoides). A
Fração rica em Flavonoides (FRF), foi fracionada em coluna de Sephadex
LH20, isolando o composto majoritário, um sólido amorfo de coloração
amarelada, com ponto de fusão de 181ºC (170-187ºC) e entalpia de -110ºC,
por calorimetria diferecial exploratória. O sresultados obtidos estão de acordo
com o mostrado na inclução de rutina em complexo sacarídeos (SRI et al.,
2007) (Figura 10).
A presença de AlCl3 forma complexos estáveis com compostos que têm grupos
hidroxila em C-3 ou C-5, e complexos menos estáveis (lábeis) com grupos
ortodiidroxila. O complexo formado com os grupos ortodiidroxila decompõe-se
rapidamente, mas a complexação com o grupamento cetona na posição 4 e o
grupo 5-hidroxila formam um complexo estável na presença do ácido HCl. Com
adição de HCl ocorre um deslocamento hipsocrômico da banda I (30-40nm)
devido à decomposição do complexo com o grupo ortodiidroxila, verificando-se
assim a presença deste grupo no anel B. Ainda com HCl na presença de AlCl3
é possível verificar a presença dos grupos 3 e/ou 5-hidroxila. Espectros de
substâncias com esses grupamentos apresentam a banda I com deslocamento
batocrômico em relação ao espectro com MeOH; para 3,5-hidroxiflavonas esse
deslocamento é em torno de 50-60nm, para 5-hidroxiflavonas com a posição 3
substituída é de 35-55nm, e já para 3- hidroxiflavonas em torno de 60nm.
Figura 11. Espectros de UV, varredura de 200 – 500 nm, do composto isolado
(A), composto isolado + AlCl3 (B), composto isolado + AlCl3 + HCl (C), rutina
padrão (D), rutina padrão + AlCl3 (E) e rutina padrão + AlCl3 + HCl (F).
- 65 -
composto isolado foi baseada por comparação com os espectros obtidos com o
padrão de rutina e espectros da literatura e foi definido como rutosideo (uma
unidade de glicose, outra de ramnose) (Tabela 04). O experimento DEPT
revelou a presença de apenas um CH2 68.57 ppm, característico de glicosídeo.
Figura 13. Varredura espectral em 2D e 1D dos padrões (1) Acido Galico, (2)
Ácido Clorogênico, (3) Catequina, (4) Galato de -(-) epigalocatequina, (5)
Rutina, (6) Hiperina, (7) Quercetina, (8) Apigenina e (9) Canferol.
- 68 -
Figura 16. Análise de pureza de pico dos nove compostos. Área verde: pura;
área amarela: parcialmente pura e vermelha: impura. Sendo: (1) Acido Galico,
(2) Ácido Clorogênico, (3) catequina, (4) Galato de -(-) epigalocatequina, (5)
Rutina, (6) Hiperina, (7) Quercetina, (8) Apigenina e (9) Canferol.
- 71 -
Através da análise por CLAE com DAD, foi possível verificar que a pureza de
pico e o índice de similaridade dos picos referentes aos marcadores no extrato
foram satisfatórios, quando comparados aos compostos puros. Esses dados
confirmam a ausência de impurezas ou interferentes que poderiam estar
coeluindo com as substâncias de interesse, assegurando que o método
proposto é adequado para a análise dos nove compostos fenólicos em extratos
de Spondias sp.
Ácido Gálico 1.71 1.5-50 9.2054 0.9945 0.260 0.520 3.96 98.62
Ácido
6.62 1.5-50 9.7922 0.9973 0.345 1.150 3.26 100.03
Clorogênico
Galato de -(-)
8.18 1.5-50 8.7029 0.9989 0.834 2.780 3.76 98.76
Epigalocat.
80 ***
60
SRAT (µmol/L)
***
40
20
0
S
F.
F
F
l4
e
.
eg
ol
FR
FR
EM
C
FR
tr
+L
C
on
kg
kg
kg
kg
l4
g/
g/
C
g/
g/
C
5m
5m
m
0m
00
+2
+7
+5
+5
l4
l4
l4
l4
C
C
C
C
C
C
C
O tratamento com EMS e FRF de animais pré tratados com CCl4 foi
satisfatório ao inibir a produção de ERO, com a consequente e significativa
diminuição da peroxidação lipídica. Estes resultados são coerente com o
- 80 -
Os animais intoxicados com CCl4 e tratados com EMS e FRF mostraram uma
recuperação em relação ao conteúdo da GSH hepática. A diferença
significativa deste biomarcador foi evidenciado nos animais tratados com EMS
e FRF, sendo também observado no grupo de animais injuriados tratados com
o Legalon®. A comparação foi feita em relação aos grupos controle (tratado
com CCl4 e sem nenhum tratamento, sendo observado valores elevados, de
GSH, como mostrado na Figura 19.
- 81 -
10
### ### ###
8
GSH (mmol/L)
4
***
2
g.
e
F.
F
l4
ol
FR
FR
C
EM
Le
FR
C
tr
l4 +
on
kg
kg
kg
kg
C
C
g/
g/
g/
g/
C
m
0m
m
25
75
50
50
l4 +
l4 +
l+
l4 +
C
C
C
C
C
C
C
C
Figura 19. Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre o conteúdo de GSH em
homogenato de fígado de animais pré tratados com CCl4.
Valores expressos em média ± desvio padrão, n=5/grupo. *** Diferença estatistica comparado
###
ao controle, p<0,05 Diferença estatistica comparado ao CCl4+Leg., p<0,05
Os resultados obtidos com EMS e FRF no modelo de injúria induzida por CCl 4
são condizentes com os que preconizam a utlização de polifenóis no combate
ao estresse oxidativo, face ao seqüestro de radicais livres (BRITO, 2009).
O estrese oxidativo está envolvido em diversas desordens fisiológicas (e.g.
como processos inflamatórios e ulcerogênicos). Portanto, agentes
antioxidantes, como vitamina E (SODERGREN et al., 2001), Gingko biloba
(OZENIRLER et al., 1997) e extrato de Camélia sinensis (FADHEL & AMRAM,
- 82 -
400
***
*** ***
CAT (U mol/min.L)
300
**
200
100
***
0
l4
e
F.
F
S
eg
ol
FR
FR
EM
C
FR
tr
+L
C
on
kg
kg
kg
kg
l4
C
g/
g/
C
g/
g/
C
5m
5m
m
m
00
0
+2
+7
+5
+5
l4
l4
l4
l4
C
C
C
C
C
C
C
Figura 20. Efeito do tratamento com EMS e FRF sobre a atividade catalásica
em homogenato de fígado de animais intoxicados com CCl 4. Valores expressos
em média ± desvio padrão, n=5/grupo. *** Observa-se diferença estatistica em
comparação ao controle, p<0,05
Figura 21. Efeito do EMS e FRF sobre a nocicepção induzida por formalina
2,5% em camundongos. A nocicepção foi avaliada na primeira fase(0-5 min,
painel A e C) e na segunda fase (15-30 min, painel B e D).
Os resultados estão expressos como médias ± desvio padrão (n=6). A comparação entre os
grupos foi realizada através da variência (ANOVA) seguida do teste de Newman-Keuls.
Diferente do grupo controle para ** p<0,01 e ***p<0,001.
O tratamento por via oral dos animais com EMS (300 mg/kg) e com FRF (3-10
mg/kg) reduziu a migração de leucócitos totais com uma inibição de 31,75 ±
2,7% e 68,67 ±3,8% (Figura 23A), enquanto a migração de neutrófilos foi
reduzida em 87,8 ± 2,7 % e 72 ± 3,7 %, respectivamente (Figura 23B).
Figura 23. Efeito do EMS e FRF sobre a migração de leucócitos totais (painel
A), e neutrofilos (painel B) induzida pela carragenina (750 ug/cavidade) por 4 h.
A comparação entre grupos (n=6) foi realizada através da análise da variância (ANOVA)
seguida do teste de Newman-Keuls. Diferente do grupo salina para *** p< 0,001. Diferente do
# ## ###
grupo carragenina para p<0.05, p<0,01 e p<0,001.
A administração da FRF (30 mg/kg, v.o.) não inibiu a nocicepção induzida por
capsaicina (5,2 nmol/pata), não havendo envolvimento de receptores TRPA1
na possivel atividade antiinflamatória (Figura 25) ou induzida por cinamaldeído
(Figura 26).
Figura 25. Efeito da FRF sobre a nocicepção induzida por capsaicina (5,2
nmol/pata) em camundongos.
Resultados estão expressos como médias ± desvio padrão (n=6). A comparação entre os
grupos foi realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman-
Keuls.
o qual é condizente com estudos realizados com Ixora coccinea Linn., rica em
rutina (BAGILA & KURIAN, 2012).
Figura 27. Efeito do tratamento com EMS (300 mg/kg) e FRF (30mg/kg) sobre
a alodinia mecânica induzida pela injeção intraplantar de CFA em
camundongos. B representa o limiar dos animais nates de receberem o CFA.
Inj. representa o limiar dos animais após 24h da injecção intraplantar do CFA.
Resultados estão expressos como médias ± desvio padrão (n=6). A comparação entre os
grupos foi realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman-
Keuls. Diferente do grupo veiculo para *** p< 0,001.
- 93 -
CONCLUSÃO
- 98 -
7. Conclusão
Com base nos resultados experimentais in vitro e in vivo, pode-se concluir que:
4. O EMS e a FRF por via oral foi capaz de reverter o dano hepático induzido
com CCl4 em ratos Wistar tratados durate sete dias, ao se observar a
diminuição de parâmetros bioquímicos da função hepática (AST, ALT, BT);
REFERÊNCIAS
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Anexo 01
- 114 -
- 115 -
- 116 -
- 117 -
Anexo 02
- 118 -
Gabriel Araujo-Silvaa, Naira J.N. Britoa, José B.M. Macedoa, Sibele de O. Tozettob,
Alessandra S. Guedesc, Jorge A. Lópezd2, Maria das Graças Almeidaa
a
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, 59012-57 Natal, RN, Brazil
b
Departamento de Patologia Humana, Escola Bahiana de Medicina, Salvador, BA,
Brazil
c
Faculdade de Tecnologia e Ciências, Salvador, BA, Brazil
d
Curso de Biotecnologia, CCBS, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba -
PR, Brazil
Abstract
The study was undertaken to evaluate the effects of a methanolic leaf extract of
Spondias sp. (MLES) on CCl4-induced hepatotoxicity in rats. Twenty female Wistar rats
were divided into four groups. Group 1 served as normal control. Group 2, 3 and 4 rats
were induced hepatotoxicity by CCl4 administering a single dose. Group 2 was the
toxicant control. Group 3 received MLES (500mg/kg body weight, p.o.) while group 4
was treated with reference drug Legalon (50mg/kg bodyweight, p.o.) by oral
administration once daily for 7 days. At the end of the experiment, animals were
sacrificed and blood were collected for assaying biochemical parameters. The livers
were excised for evaluating peroxidation products and histopahology. The results
showed that MLES significantly (p<0.05) lowered alanine aminotransferase (ALT),
aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase, total bilirubin (tBIL), reduced
the content of the peroxidation products malondialdehyde (TBARS) and elevated the
glutathione content (GSH) and the superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase
(GPx) and catalase (CAT) activities, compared to CCl4-treated group. Histopathological
results were also in accordance with the biochemical findings. Therefore, the results of
this study suggest that the MLES protective role might be correlated with its antioxidant
and free radical scavenger effects.
Keywords: Spondias sp.; methanolic extract; Carbon tetrachloride; Hepatoprotective;
antioxidant
Corresponding author. Tel./Fax +55 84 3342 9807
E-mail addresses: mgalmeida@diginet.com (M.G. Almeida)
- 119 -
Introduction
Excessive generation and accumulation of free radicals and reactive oxygen species
(ROS) have been implicated in a multitude of disease states, including inflammation
and some hepatopathies (Halliwell, 2006). Normally, ROS are efficiently neutralised by
a cell potent armoury without any untoward effect. However, hampering the balance
between ROS production and antioxidant defenses lead to the onset of oxidative stress,
which seek stability through electron pairing with biological macromolecules (proteins,
lipids and DNA) in healthy human cells and cause protein and DNA damage along with
lipid peroxidation (Valko et al. 2007). These changes contribute to numerous
manifestations (e.g. cancer, atherosclerosis, cardiovascular diseases, ageing and
inflammatory diseases) (Halliwell, 2006), that have been proven to be associated with
redox imbalance and oxidative stress (Jones 2006). All cells protect themselves against
oxidative damage by enzymes such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) or
compounds (e.g. glutathione (GSH), ascorbic acid, tocopherol (Zadák et al. 2007).
Therefore, compounds that exhibit antioxidant properties, scavenging of free radicals
and inhibition of lipid peroxidation are expected to show protective activity (Handa et
al. 1986; Wu et al. 2001; Dhanasekaran et al. 2009.).
Spondias sp (family Anacardiaceae) is a typical fructiferous tree, widely ditributed in
Northeastern Brazil, commonly known as “cajá-umbu” (Lira Júnior et al. 2005). This
species is still in domestication process, possibly the product of natural crossing
between Spondias mombim L. and S. tuberosa Arr. Cam. (Almeida et al. 2007). Besides
the industrial importance (jelly, juice) (Silva Junior et al. 2004), some pharmaceutical
properties have been reported for this plants. Their leaves as infusion are commonly
used in folk medicine to produce a wide variety of remedies against ulcers and
inflammatory processes (Teixeira and Melo 2006).
Therefore, the aims of this study were to evaluate the antioxidant potential and free
radical scavenging activity of a methanol extract of Spondias sp. leaves, employing an
in vitro assay and also investigated the protective effect of this extract against liver
injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in a murine experimental model.
Histological analysis of liver tissues was also carried out.
- 120 -
AST, ALT, ALP and tBIL kits were supplied by Biosystems (Spain). Legalon was
obtained from Nycomed (Brazil). All the other chemicals used were of analytical grade.
Spondias sp. leaves, collected from Itaberaba, BA, Brazil, were identified and
authenticated by Dr. Maria das Graças Ferreira (Department of Botany, Bahia Company
for Agro-Livestock Development (EBDA), Salvador, BA, Brazil). A voucher specimen
(Herbarium Nr. 2897/12.09) was deposited at the Herbarium of the Faculty of
Technology and Sciences (FTC, Salvador, BA, Brazil). Collected leaves were shade-
dried at 40°C and powdered by an expeller. Leaf powder (350 g) was soaked in 3L of
methanol for extraction for seven days with periodical shaking. After filtration, the
solvent was condensed using a rotary evaporator at 40°C, giving a yield residue of
39.5±2.7 g. The crude extract (MSE) was stored at -20ºC for subsequent experiments.
Total phenolics in leaf Spondias sp. extract were determined using Folin-Ciocalteu
reagent, based on procedure described by Georgé et al. (2005), and the results were
expressed as mg of gallic acid equivalents per g of extract. The determination of radical
scavenger activity of the extract was performed by the DPPH test (Brand-Williams et al.
1995), using Carduus marianus extract and BHT as positive controls. The results
expressed in % RSC.
Twenty adult female Wistar rats (160 – 210 g) were used. Animals were bred in the
Central Animal House (CCS, Federal University of Rio Grande do Norte) at 223ºC in
12 h light/dark cycles with standard diet and water ad libitum. The experiments were
performed in accordance with the guidelines provided by the Brazilian College of
Animal Experimentation (COBEA) and Institutional Animals Ethics Committee
(protocol 100312/09).
Animals were divided into four groups (n = 5). Group 1 served as normal control and
received vehicle corn oil. Group 2, 3 and 4 were induced liver toxicity by CCl4
administration by a single dose of CCl4 (2.5 ml/kg CCl4, diluted in corn oil). Groups 2
served as toxicant control, while groups 3 and 4 received MSEL and Legalon®
(antioxidant control) at doses of 500 mg/kg and 50 mg/kg, respectively, for seven days.
Administration was done orally using the intragastrictubes .Animals were humanly
sacrificed 24 h after the last treatment by cervical dislocation, anesthesied with
Tiopental (40 mg/kg b.w.). Blood was collected and serum was separated to analyze the
- 121 -
biochemical parameters, while livers were dissected out for analysis and
histopathological analysis.
Serum level of ALT, AST, tBIL were estimated according to the manufacturer‟s kit
instructions (Biosystems, Spain). Catalase was determined as described by Beutler
(1975). GSH was determined by the method of Beutler et al. (1963), while the levels of
TBARS were estimated as describe by Ohkawa et al. (1979) was determined in liver
homogenate. For histopathological examination livers sections were fixed in 10%
buffered formalin, processed, and embedded in paraffin, cut into 5 - 6 µm thick sections
and stained with haematoxylin-eosin (H&E), using a standard protocol and then
analyzed by light microscope.
Acute toxicity study was performed according to Organisation for Economic Co-
operation and Development guidelines No. 423 (OECD, 1996). Wistar rats of either sex
were divided into six groups with six animals each. MESL was administered orally as a
single dose to rat at different dose levels of 250, 500, 1 000, 1 500 and 2 000 mg/kg
b.w. Animals were observed periodically for the symptoms of toxicity and death within
24 h and then daily for 14 days.
Reverse-phase HPLC analysis were performed by a method development and
validation, on the VARIAN ProStar HPLC system (Walnut Creek, USA), consisting of
HPLC pump, ProStar 240 quaternary gradient unit, 335 PDA UV/Vis detector. In order
of chromatographic separation, we accomplished on a Phenomenex C18 reverse phase
column (Phenomenex, 4.6 X 100 mm, 2.6 µm) at room temperature and monitored at
280 nm. The gradient solvent system consisted of 0.1% formic acid in water (solvent A)
and acetonitrile (solvent B) according the table 01, with a flow rate of 1.3 ml/min. For
preparation of stock solutions, extracts and nine phenolic compounds were dissolved in
MeOH at concentrations of 5 mg/mL, and 1 mg/mL, respectively. After filtration
through a syringe filter (0.22 µm, Allcrom), 9 µl of each sample was injected. The
retention times, linear ranges, linear coefficients, correlation coefficients and UV
spectrums were showed in table 02. The relative quantity of phenolic compounds in the
extract was calculated from each equation, considering the spectrum similarity, and the
results were expressed in mg of equivalent standard/ g of the extract.
The experimental results were expressed as meanSD. Analysis of variance was
(ANOVA) used for statistical analysis by and post-hos test of Tukey-Kramer, using the
Graph PAD Software version 4.0. p <0.05 implied significance.
- 122 -
The methanolic crude extract from Spondias sp. leaves produces no mortality at 2 000
mg/kg. Therefore, one-quarter of the maximum no mortality dose of extract, it were
selected as therapeutic dose (500 mg/kg) in this study.
In the present study, it was evaluated the methanolic crude extract from Spondias sp.
leaves which was tested against the CCl4 induced hepatotoxicity.
Fig. 1 shows the percentage of radical scavenger activity of the extract. It was found
that the reduction of DPPH occurred in a concentration-dependent manner, as observed
with the decrease in the absorbance of DPPH. This result was in accordance with the
concentration of phenolic compounds determined in the extract (12.08±1.20 mg
EAG/100 mg of extract).
The hepatoprotective efficacy of the MSEL against CCl4-induced liver injury was
evaluated in a murine model. The administration of a single dose of CCl4 resulted in a
significant increase of the serum levels of AST, ALT, ALP and tBIL (p<0.05) due to
liver injury. In treated animals with MSEL (group 3) and Legalon (group 4), there was
a significant (p<0.05) decrease in these serum hepatic marker levels (Table 1).
The activities of CAT, SOD,GPx and the GSH content were significantly reduced in the
CCl4-intoxicated group (p<0.05) when compared to normal control animals. In the
group 3 which received CCl4 with MSE and in rats treated with Legalon (group 4), it
was observed a significant (p<0.05) increase in the levels of CAT and GPx activities, as
well as in the GSH content, which were near to normal (Group 1) (Table 2).
The administration of CCl4 in rats increased the TBARS level in the liver when
compared to normal control animals (p<0.05). However, the TBARS content was
significantly reduced by the oral administration of the MSEL or Legalon (p<0.05),
when compared with animals from group 2 (Fig.2).
In the histopathological analysis of group 1 (Fig. 3a), animals showed normal
architecture of liver. In rats treated with CCl4 alone, the liver normal architecture was
completely lost with the appearance of vacuolated hepatocytes and degenerated nuclei.
Vacuolization, fatty changes and necrosis of hepatocytes were severe in the
centrilobular region and these changes were also observed in areas other than the
centrilobular regions (Fig. 3b). The livers of rats treated with MSEL (Fig. 3c) or
Legalon (Fig. 3d), group 3 and 4, respectively, showed a significant recovery from
CCl4-induced liver damage as evident from normal hepatocytes with well defined
- 123 -
nuclei, almost comparable to those of the control group. Vacuolization and fatty
degeneration were remarkably prevented by the treatment with extract and Legalon.
The HPLC method applied to separation of major number of compounds in the
Spondias sp. extract, were efficient to identification of the majors compounds and
groups in MSEL. In fact, were observed twelve major compounds (Figure 1A), and the
group were identified by comparison between their and external standards (Figure 1B)
UV spectrums and retention times, which just the compounds 4, 5 and 6 no possible
identified the group. The compound 1(RT=1.43) was identified as simple phenolic by
shown the RT and UV spectrum similar to Gallic acid, and compound 2 (RT= 1.73)
was identified and quantified as 0.69±0.0012 µg Gallic acid/mg of MSEL. The
compound 3 (RT=6.63) was quantified as 1.34 ±0.0065 µg de Chlorogenic acid /mg de
MSEL. The compounds 7, 8 and 9 (RT=9.23, 10.05 and 12.65) corresponding at
glycosylated flavonoids, and the compound 7 was identified and quantified as 21.63 ±
0.0039 µg of rutin/mg de MSEL. Flavonoids aglicon, compounds 10(15.99), 11(18.92)
and 12(19.30), were found, and the compound 10 corresponding at 2.14 ± 0.02 µg of
quercetin/mg MSEL. The compound 11 were quantified as 4.44 ± 0.0046 µg of
kaempferol/mg de MSEL.
The results indicate that the methanolic crude extract from Spondias sp. leaves was
found to be rich in phenolics and flavonoids, a flavonol-3-O-glycosilate (compound 7)
with near retention time and similar UV spectrum of rutin, and were identified gallic
acid, chlorogenic acid, quercetin and kaempferol.
Acknowledgements
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Table 1. Scheme of the elution gradient established for the separation of phenolic
compounds
Linear
Retention time
Compound range a R2 UV (nm)
(min)
(mg/mL)
Gallic acid 1.71 1.5-50 9.2054 0.9945 271
(-)-Epigallocatechin
8.18 1.5-50 8.7029 0.9989 275
gallate