c

Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina, Escuela de Medicina
Depto. De Ciencias Básicas y Morfología
Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N° 3 - 4
CINÉTICA ENZIMÁTICA

Integrantes: Susana Córdova

Dafne Del Mauro
Alessio Espinoza
Valentina Fuentes
Carrera: Medicina
Sección: I
Fecha de realización: 12 y 19 de mayo, 2010
Fecha de entrega: 2 de junio, 2010
Docentes encargados: BQ Mirna Munoz, M.Sc.
Dr. Reginald Del Pozo, Ph.D.
c

c
Introducción de sustrato y la concentración de enzima afectan y
determinan la velocidad enzimática.
Es fundamental que el organismo catalice
reacciones de manera eficaz y selectiva, las Aplicar y entender la ecuación de Michaels y
multiples reacciones bioquímicas que ocurren en el Menten y la de Dobles Reciprocos para la
cuerpo requieren de un tiempo de realización determinación experimental de Vmax y Km.
óptimo, de lo contrario, si transcurren de manera
muy lenta no son eficaces. La velocidad de Manejar conceptos químicos de absorvancia y
reacción es, entonces, de gran importancia y esta espectofotometria, que nos permitirán deducir la
determinada por catalizadores biológicos como son concentración de producto.
las enzimas.
Darse cuenta de la importancia de llevar a cabo de
manera correcta el método experimental,
Las enzimas son en su mayoría proteínas que
entendiendo que cualquier error durante el
catalizan una reacción disminuyendo su energía de procedimiento será fundamental en los resultados.
activación, están en el centro de todos los procesos
biológicos, actuando en la degradación de
moléculas de nutrientes, conservación y transporte
de energía y síntesis de macromoléculas. Catalizan
una reacción disminuyendo su energía de
activación y aumentando 1 millon de veces más la
velocidad de reacción.

En condiciones óptimas de temperatura y pH, se

unen de manera especifica a su sutrato y son estas
interacciones no covalentes las que liberan energía
libre que dan estabilidad y disminuyen la energía de
activación haciendo más favorable y rápida la
reacción.

La velocidad de reacción (micromoles de producto

formado por unidad de tiempo) es directamente
proporcional a la concentración de sustrato si esta
es muy pequeña, luego se vuelve constante
cuando la concentración de sustrato es saturante.
alcanzando Vmax. Cuando la concentración de
sustrato es saturante, la concentración de enzima
también influye en la velocidad de reacción,
haciéndose Vmax si están todos los sitios activos
ocupados.

Conforme a lo anterior, analizaremos la hidrólisis

del bifosfoglicerato de sodio catalizado por la
enzima fostatasa alcalina, y el comportamiento que
se aprecia al variar la concentración de sustrato y
de enzima y como influyen estas variantes en la
formación de producto y velocidad de reacción.

Objetivos:

Comprender la cinética enzimática de la reacción

del bifosfoglicerato catalizado por fosfatasa alcalina,
entendiendo que variables como la concentración
Resultados

1. Resultados práctico N° 3: Curva de progreso

de una reacción enzimática.

-2
a) Cálculo de los ȝmoles de fosfato (PO4H )
liberado en los distintos tiempos de incubación,
utilizando la lectura del estándar.

1° Se calcula la absorbancia promedio del

estándar:

ܵ‫ ͳ݀ݐ‬൅ ܵ‫ʹ݀ݐ‬ Ͳǡ͵͵Ͷ ൅ Ͳǡ͵͸͹

Abs ‫= ݔ‬ ൌ ൌ Ͳǡ͵ͷͲ
ʹ ʹ
-2
Como la concentración de producto (PO4H )
liberado es proporcional a la absobancia obtenida:
஺௕௦௦௧ௗ௫ ஺௕௦௧௨௕௢ೣ c
ሾ௦௧ௗሿ
ൌ ሾ௧௨௕௢ೣ ሿ
ï
  
  
 
 
   

        

 


  
 ï 
     
‫ݔ݀ݐݏݏܾܣ‬ Ͳǡ͵ͷͲ  
 
   

ൌ ൌ Ͳǡ͵ͷͲ
ሾ‫݀ݐݏ‬ሿ ͳߤ݉‫݈݋‬Ȁ݈݉ c

࡭࢈࢙࢚࢛࢈࢕࢞
Luego }›
 ൌ
૙ǡ૜૞૙

¨ǡଶ଼ସ
Ej.: [tubo3]= ൌ 0,811ߤ݉‫݈݋‬Ȁ݈݉
¨ǡଷହ¨

De esta forma se calcularon los ȝmoles totales

-2
PO4H para cada uno de los tubos.

b) Cálculo de ȝmoles de fosfato en 5 min para

cada tubo.
Se obtienen mediante la siguiente fórmula:

m
 
m





 m







Ej.: Para el tubo 4 c

     
          
ߤ݉‫ݏ݈݁݋‬ହ௠௜௡ ൌ ͳǡʹͷͶߤ݉‫ ݏ݈݁݋‬െ Ͳǡͺͳͳߤ݉‫ݏ݈݁݋‬  
 
      
ൌ ૙ǡ ૝૝૜ࣆ࢓࢕࢒ࢋ࢙Ȁ૞࢓࢏࢔        
      

c
 c c

cï
 —c
En los tubos con diferencia de 10 min el valor
obtenido se divide por 2.

Las concentraciones y valores de absorbancia

obtenidos se resumen en la siguiente tabla:
 c
ï
       
       

    
  
  
 


c
           
   

   !   "       

   #
     $   #  
   
 c
c c c

cï
 

2. Resultados práctico N°4: Efecto de la

concentración de sustrato y de enzima en la
velocidad de reacción.

a)Efecto de la concentración de ȕ-glicerofosfato

de sodio (sustrato) sobre la velocidad de la
reacción catalizada por la fosfatasa alcalina.

Se calcularon los ȝmoles de fosfato utilizando la

lectura promedio del estándar de fosfato y c
aplicando la formula:   %          
 
  

!    

࡭࢈࢙࢚࢛࢈࢕࢞    
 &' 

   
ࣆ࢓࢕࢒ࢋ࢙ࡼࡻ૝ ࡴି૛ ࢚࢛࢈࢕࢞ ൌ    
    ! 
 

(!
ഥ
࡭࢈࢙࢙࢚ࢊ࢞
  
!  
   #  
 
 
 )     
 
Absorbancia promedio estándar= 0,3855 * + '*

c c c

cï
 c

Los valores obtenidos corresponden a la velocidad Matemáticamente la curva de velocidad v/s

inicial de la reacción para cada concentración de concentración de sustrato se puede expresar según
sustrato, ya que se expresa en ȝmoles de fosfato ௏೘žೣ ൈሾௌሿ
liberado por 10 minutos de incubación. la ecuación de Michaelis-MentenãcC௜ ൌ c
௄ ାሾௌሿ ೘

Los resultados de absorbancia y velocidad inicial

para cada tubo se resumen en la siguiente tabla:
cMediante el ˜

 se puede obtener el valor
aproximado de Km y Vmáx: 0,9 mM y 2,8
ȝmoles/10min respectivamente.

Como se dijo anteriormente este es un cálculo

aproximado en donde no hay mucha precisión
debido a que se obtiene directamente de la gráfica.

Para obtener los valores exactos de Km y Vmáx se

utiliza la ecuación de ³dobles recíprocos´ de
Lineweaver-Burk, donde la ecuación general
W ௄ W W
quedaría así:c ൌ ೘ ൈ ൅ c
௏೔ ௏೘žೣ ௌ ௏೘žೣ
 ࡭࢈࢙࢚࢛࢈࢕࢞
ࣆ࢓࢕࢒ࢋ࢙ࡼࡻ૝ ࡴି૛ ࢚࢛࢈࢕࢞ ൌ 
ഥ
࡭࢈࢙࢙࢚ࢊ࢞

Los resultados de resumen en la siguiente tabla:

c
ï
 %    

 
 
 
 
 
! 
 ,  

    
#    
    
   #  
-
 . !
#    
 
 


     
  

$  
 
 ï
 c

Según los datos obtenidos en el práctico (ï  )

nos resultó la siguiente ecuación de la recta:

y=0,3859x + 0,2593

En consecuencia Vmáx será:

³
c ൌ0,2593
࢓ž࢞

³
Vmáx= ൌ3,856ȝmoles PO4H-2/10 min
૙ǡ૛૞ૢ૜

El Km lo podemos calcular mediante la pendiente

de la recta: c
  ,           
࢓  #  !         
 
ൌ 0,3859 
     
   
     
࢓ž࢞

  $      
    

 

 
!       

      
࢓ ൌ 0,3859 x ࢓ž࢞  
     # !  
 




!
 (!

 %/0!

࢓ ൌ 0,3859 x 3,856 = 1,488 ȝmoles

b) Efecto de la concentración de la fosfatasa

alcalina sobre la velocidad de hidrólisis de ȕ-
glicerofosfato de sodio.

Se calcularon los ¹ 
c c 
c 


 c

c

c

cc  c 
c
c c
cc
 

ccc

cc

c
c
—c
Conclusión y discusión:
Debemos señalar que con cada actividad realizada
durante el trabajo práctico logramos cumplir los
objetivos propuestos, rigiéndonos y guiándonos a
través de los procedimientos establecidos,
utilizando estándares y blanco para cálculos de
resultados obtenidos. Este informe se basó de 2
prácticos correspondientes al 3 y 4, en los cuales
utilizamos los mismos materiales, pero su
metodología fue distinta, pues la intención era
comprobar la variación en la velocidad de una
reacción química enfrentada a enzimas después
de un cierto tiempo y los factores influyentes en la
velocidad de reacción para la obtención de
producto. Es así como en ambos casos preparamos
una incubación que contenía tampón de glicina (pH
9.4), sustrato B-glicerofosfato, agua destilada, a
temperatura de 37º C constante y la solución de la
enzima que se vertía posteriormente a una pre-
incubación con molibdato (ácido) con el fin de
detener la reacción a distintos tiempos y medir la
variación de producto liberado, en este caso fosfato
libre, utilizando espectrofotómetro para su medición
y de esta manera, en el caso del práctico
3,observar la variación en la velocidad de reacción
respecto del tiempo en que actúa. Fue así como
utilizamos estándares de fosfato para calcular la
cantidad de producto respecto del valor de
absorbancia obtenido que, logramos concluir
observando el gráfico 1, por medio de la línea de
tendencia trazada la cual justifica que los puntos no
se encuentre todos dentro de la línea curva de
representación, que a medida que transcurre el
tiempo la reacción química va progresando y la
cantidad de producto generada cada vez aumenta
más,llegando a un punto en que alcanza su
equilibrio, en donde su concentración no aumenta
más debido a que el producto proviene del sustrato
de la reacción, y éste último va disminuyendo.
Además podemos deducir respecto del
gráficoproducto en función del tiempoque existe
una relación directamente proporcional durante el
tiempo en que el sustrato es saturante, y que la
curva comienza a aplanarse transcurrido un tiempo
alcanzando de esta manera el equilibrio(1).Sin
embargo, debemos mencionar que durante el
desarrollo ocurrieron variaciones menores respecto
de la toma enla cantidad de material requerida
materiales como en el caso de los estándares
debido a que a pesar de utilizar instrumentos de
precisión, no siempre fueron obtenidas con la
precisión justa con la que debiesen haberse
obtenido.Respecto del grafico 2 donde analizamos
la velocidad de la reacción respecto del tiempo
transcurrido se puede concluir que la velocidad no
varía durante el tiempo en que el sustrato es
saturante, puesto que la velocidad inicial
corresponde al número de moles de producto
formado por unidad de tiempo, medidos antes de
que se haya formado suficiente producto para
permitir que ocurra la reacción contraria (2),
pero decae continuamente cuando la concentración
de sustrato es menor, hasta finalmente hacerse
cero, llegando al equilibrio de la reacción (3).
En elpráctico 4, utilizando los mismos materiales
que la actividad anterior a través de otros
procedimientos pero utilizando estándares y blanco
de igual forma para obtener los resultados de
análisis, esta vez para observar cómo influye la
concentración de sustrato y la concentración de
enzima en la velocidad de una reacción enzimática,
para lo cual en el primer caso el resto de factores
debe mantenerse constante, ya sea el pH, la
concentración de enzima, concentración de
activadores, entre otros para poder observar de
esta manera, el fenómeno ocurrido cuando
analizamos la velocidad de una reacción en función
de la cantidad de sustrato. A partir del grafico 3,
podemos deducir mediante los valores obtenidos
que a concentraciones de sustrato relativamente
bajas, la velocidad inicial aumenta casi linealmente
con el incremento de concentración de sustrato, a
medida que está concentración va aumentando los
sitios activos de las enzimas se van ocupando, en
el momento en que la mitad de los sitios activos se
ven ocupados, la velocidad corresponde a la mitad
de la velocidad máxima y podemos definir Km,
como la concentración de sustrato a la cual al
velocidad de la reacción se hace la mitad de su
valor máximo, a medida que esta concentración
aumenta comienzan a saturarse, no quedando
enzima libre para reaccionar por lo que un aumento
en la concentración de sustrato ya no influye , esto
se refleja en la zona aplanada que se produce una
vez alacanzadala velocidad máxima de reacción(4).
En el caso del gráfico 4, utilizando la gráfica de
dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk, utilizando
los mismos valores del gráfico anterior, fue posible
determinar de manera más precisa los valores de
Km y Vmáx empleando valores recíprocos de c
velocidad inicial y concentración de sustrato.
c
Enla última actividad correspondiente al análisis de
la concentración de enzima respecto a la velocidad
de reacción, y a partir del gráfico 5, se deduce que
cuando la concentración de sustrato es saturante,
la totalidad de la enzima se encuentra como
complejo enzima-sustrato, en estos casos la
velocidad de la reacción (Vmáx) es directamente
proporcional a la concentración de enzima
observándose un gráfico lineal, siempre y cuando
se mantengan las condiciones constantes para que
ocurra, ya sea conservando el pH, temperatura,
entre otras( 5).

Podemos concluir de esta manera que las enzimas

son proteínas complejas que producen un cambio
químico específico en otras sustancias, sin que
exista un cambio en ellas mismas, sino más bien
reduciendo la energía de activación acelerando la
reacción y de esta manera obtener sustancias
simples útiles a partir de complejas. Las enzimas,
por tanto, son esenciales para todas las funciones
corporales y se encuentran en la boca (saliva), el
estómago (jugo gástrico), los intestinos (jugo
pancreático, jugo y mucosa intestinal), la sangre y
en cada órgano y célula del cuerpo.(6)

Bibliografía

(1),(3),(5) Muñoz. M, Del Pozo. R, Guía de

Trabajos Prácticos, Carrera de Medicina 2010,
Universidad Católica de la Santísima
Concepción,Facultad de Medicina, Departamento
de Bioquímica.

(2),(4)Nelson, D; Cox, M. Lehninger Principios de

Bioquímica, Tercera Edición,Ediciones Omega,
2000, Barcelona, España.

(6)http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency
/article/002353.htm