3.6.

METODE ANALISA

3.6.1. Analisis Kadar Air (Metode Oven, AOAC, 2012)

Siapkan alat dan bahan. Panaskan cawan porselin dalam oven, pada suhu

102 – 105 0C selama 12 jam. Kemudian dinginkan cawan yang telah dipanaskan

dalam desikator selama 30 menit. Timbang cawan yang didinginkan. Kemudian

timbang sampel sebanyak 1 – 2 gram. Masukan sampel yang telah ditimbang

kedalam cawan yang telah selesai ditimbang. Selanjutnya keringkan sampel dalam

oven pada suhu 105 0C sampai berat konstan. Kemdian sampel dikeluarkan dan

didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Timbang sampel.

Perhitungan:

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 − 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

Kadar Air (%) = x 100 %
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

3.6.2. Analisis Kadar Abu (AOAC, 2012)

Cawan abu dipanaskan dalam oven dengan suhu 105 0C. Dinginkan cawan

pengabuan dalam desikator selama 30 menit dan timbang berat cawan abu kosong.

Kedalam cawan abu, masukan sekitar 2 gram sampel, selanjutnya abukan tungku

pengabuan sampai suhu sekitar 650 0C dan biarkan pada suhu ini selama 1 jam.

Setelah suhu tungku pengabuan turun sekitar 200 0C, dinginkan cawan abu porselin

dalam desikator selama 30 menit dan timbang beratnya.

Perhitungan:

berat abu ( g )
Kadar Abu (%) = x 100 %
berat sampel ( g )

3.6.3. Analisis Protein (AOAC, 1999, SNI 01-2891-1992).

A. Pereaksi

36
 1. Campuran selenium

2. Campurkan 2,5 g serbuk SeO2, 100 g K2SO4, dan 20 g CuSO4.5H2O

3. atau campuran selenium (Selenium Mixture) siap pakai khusus untuk

penentuan N (dari Merck)

4. Indikator campuran

5. Siapkan larutan bromocresol green 0,1% dan larutan merah metil 0,1%

dalam alkohol 95% secara terpisah. Campur 10 mL bromocresol green

dengan 2 mL merah metil.

6. Larutan asam borat, H3BO3 2% b/v.

7. Larutan 10 g H3BO3 dalam 500 mL air suling. Setelah dingin, pindahkan

ke dalam botol tertutup gelas. Campur 500 mL asam borat dengan 5 mL

indikator.

8. Larutan asam klorida, HCl 0,01 N (sebelum dipakai harus

distandardisasi)

9. Larutan natrium hidroksida NaOH 30% b/v.

10. Larutkan 150 g NaOH ke dalam 350 mL air, simpan dalam botol bertutup

karet.

B. Prinsip Kerja

1. Timbang seksama 0,51 g cuplikan, masukkan ke dalam labu Kjeldahl 100

mL.

2. Tambahkan 2 g campuran selen dan 25 mL H2SO4 pekat.

3. Panaskan diatas pemanas listrik atau pembakar bunsen sampai mendidih

dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan (sekitar 2 jam).

37
 4. Biarkan dingin, kemudian encerkan dan masukkan ke dalam labu ukur

100 mL, tepatkan sampai tanda tera.

5. Masukkan 5 mL larutan ke dalam alat penyuling, tambahkan 5 mL NaOH

30%, segera tutup labu destilasinya.

6. Sulingkan selama lebih kurang 10 menit, sebagai penampung gunakan

10 mL larutan asam borat 2% (perhatian: selama proses penyulingan,

ujung pipa kondensor harus selalu tercelup dalam larutan borat).

7. Bilas ujung pipa dengan air suling.

8. Titar dengan larutan HCl 0,01 N dan Kerjakan penetapan blanko.

C. Perhitungan

(V1 – V2) x N x 0,014 x f.k x fp

Kadar Protein = -------------------------------------------- x 100%

Dimana :
Wcontoh = bobot cuplikan (g)
V1 = Volume HCl 0,01 N yang dipergunakan pada penitaran contoh (mL)
V2 = Volume HCl 0,01 N yang dipergunakan pada penitaran blanko
NHCl = normalitas HCl
fk = faktor konversi untuk protein dari makanan secara umum = 6,25; susu
dan hasil olahannya = 6,38; mentega dan kacang = 5,46.
fp = faktor pengenceran.

3.6.4. Analisa Lemak (AOAC, 2012)

1. Pereaksi

Heksana atau pelarut lemak lainnya.

38
2. Prinsip Kerja

a) Prepasi Sampel

Sampel dibebaskan airnya dulu dengan metode seperti pada penentuan

kadar air.

b) Analisis Sampel

- Timbang seksama 1 – 2 g contoh langsung (atau contoh yang sudah

dihilangkan airnya), masukkan ke dalam selongsong kertas yang

dialasi dengan kapas.

- Sumbat selongsong kertas berisi contoh tersebut dengan kapas,

keringkan dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80oC selama lebih

kurang satu jam, kemudian masukkan ke dalam alat soxhlet yang

telah dihubungkan dengan labu lemak berisi batu didih yang telah

dikeringkan dan telah diketahui bobotnya.

- Ekstraksi sampel dilakukan dengan heksana atau pelarut lemak

lainnya selama lebih kurang 6 jam.

- Sulingkan heksana dan keringkan ekstrak lemak dalam oven

pengering pada suhu 105 oC

- Dinginkan dan timbang

- Ulangi pengeringan ini hingga tercapai bobot tetap

W2 - W1
Kadar Lemak (% dry basis)  x 100%
W
100 - K.a
Kadar Lemak (% wet basis)  x Kadar Lemak (%dry basis)
100

Dimana:

39
 W = Bobot contoh, dalam gram

W1 = Bobot labu sebelum ekstraksi, dalam gram

W2 = Bobot labu sesudah ekstraksi, dalam gram

K.a = Kadar air (%)

3.6.5. Perhitungan Karbohidrat by Difference (Winarno, 2003)

Kandungan karbohidrat diketahui melalui perhitungan sebagai berikut:

% Karbohidrat = 100 % - % ( protein + lemak + abu + air )

3.6.6. Analisa Asam Amino (AOAC, 1999)

1. Preparasi Sampel
a) Tentukan kadar protein dari sampel dengan metode Kjeldahl

b) Masukkan sampel yang mengandung 3 mg protein kedalam ampul,

tambahkan 1 mL HCl 6 N

c) Bekukan campuran tersebut dalam es kering-aseton. Gunakan “Freeze

dryer” yang dihubungkan dengan pompa vakum, untuk mengeringbekukan

sampel.

d) Keluarkan udara yang ada dalam sampel yang telah dibekukan dengan cara

: Keluarkan ampul dari dalam es kering-aseton. Pada saat campuran

mencair, udara yang terlarut dalam sampel akan keluar. Jika gelembung

udara terlalu banyak, atau keluar terlalu cepat, masukkan kembali ampul ke

dalam es kering-aseton, dan divakum kembali. Cara ini diulangi sampai

40
 udara yang ada dalam sampel keluar seluruhnya. Jika masih ada gelembung

udara, tambahkan 1 atau 2 tetes n-oktil alkohol sebagai anti bubbling.

e) Ampul divakum kembali selama 20 menit, kemudian tutup bagian tengah

tabung dengan cara memanaskannya di atas api.

f) Masukkan ampul yang telah ditutup ke dalam oven pada suhu 110ºC selama

24 jam.

g) Dinginkan sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar. Pindahkan

isinya ke dalam labu evaporator 50 mL, bilas ampul dengan 2 mL HCl 0,01

N dan masukkan cairan bilasan ke dalam labu evaporator, ulangi 2-3 kali.

h) Keringkan sampel dengan menggunakan “freeze dryer” dalam keadaan

vakum, untuk mengubah sistein menjadi sistin tambahkan 10 – 20 mL air

ke dalam sampel dan keringkan dengan freeze dryer, ulangi 2 – 3 kali.

i) Tambahkan 5 mL HCl 0,01 N ke dalam sampel yang telah dikeringkan,

larutan sampel ini siap untuk dianalisis

2. Pembuatan pereaksi OPA

1) Larutan stok pereaksi OPA

OPA : 50 mg

Metanol : 4 mL

Merkaptoetanol : 0,025 mL

Brij-30 30% : 0,050 mL

Buffer borat 1M, pH = 10,4 : 1 mL

Larutkan 50 mg OPA dalam 4 mL metanol dan tambahkan merkaptoetanol.

Kocok hati-hati campuran tersebut, tambahkan larutan brij-30 30% dan

41
 buffer borat. Simpan larutan dalam botol berwarna gelap pada suhu 4ºC dan

akan stabil selama 2 minggu.

Pereaksi derivatisasi dibuat dengan cara mencampurkan satu bagian larutan

stok dengan dua bagian larutan buffer Kalium Borat pH 10,4 dan harus

dibuat segar setiap hari.

2. Fase Mobil

Bufer A : Na-Asetat (pH 6,5) 0,025 M

Na-EDTA 0,05 %
Metanol 9,00 %
THF 1,00 %
Buffer A terdiri dari komposisi di atas yang dilarutkan dalam 1 liter air HP.
Buffer ini harus disaring dengan kertas milipore 0,45 µm dan akan stabil
selama 5 hari pada suhu kamar bila disimpan dalam botol berwarna gelap
yang diisi dengan gas He atau Nitrogen.

Buffer B : terdiri dari metanol 95 % dan air HP. Lakukan penyaringan

dengan kertas milipore 0,45 mikron. Larutan ini akan stabil dalam waktu tak
terbatas.
3. Kondisi Alat
1). Atur kondisi HPLC sebagai berikut:
Kolom : Ultra techspere
Laju aliran fase mobil : 1 mL/menit
Detektor : Fluoresensi
Fase mobil : Buffer A dan Buffer B dengan gradien
sebagai berikut:

Waktu Laju aliran fase mobil % Buffer B

(menit) (mL/menit)
0 1 0
1 1 0
2 1 15

42
 5 1 15
13 1 42
15 1 42
20 1 70
22 1 100
26 1 100
28 1 0
38 1 0

2). Buatlah grafik hubungan antara waktu (menit) sebagai absis dengan %
B sebagai ordinat.

4. Analisis asam amino

a) Larutkan sampel yang telah dihidrolisis (B-9) dalam 5 mL HCl 0,01N

kemudian saring dengan kertas milipore.

b) Tambahkan Buffer Kalium Borat pH 10,4 dengan perbandingan 1 : 1.

c) Ke dalam vial kosong yang bersih masukkan 10 µl sampel dan

tambahkan 25 µl pereaksi OPA, biarkan selama 1 menit agar derivatisasi

berlangsung sempurna.

d) Injeksikan ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µl kemudian tunggu

sampai pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan

sekitar 25 menit.

Catatan: Tahap 3 dan 4 dapat dilakukan dengan alat penyampel

otomatis (auto sampler)

5. Perhitungan

Konsentrasi asam amino dinyatakan dalam μmol AA dalam sampel:

luas puncak sampel

= x konsentrasi standar
luas puncak standar

luas puncak sampel μmol

= x 0,5 x 5 ml
luas puncak standar ml

43
 Persen asam amino dalam sampel adalah:

μmol AA x Mr AA
= x 100 %
μg sampel

AA Asp Glu Ser His Gly Thr Arg Ala Tyr Met Val Phe Ileu Leu Lys

Mr 133.1 147.1 105.09 155.16 75.07 119.12 174.2 89.09 181.19 149.21 117.15 165.19 131.17 131.17 146.19

3.6.7. Analisa Asam Lemak ( AOAC, 2012)

Prinsip Kerjanya :

A. Preparasi Sampel (Hidrolisis & Esterifikasi)

a) Timbang 20 – 30 mg contoh lemak atau minyak dalam tabung bertutup

teflon

Tambahkan 1 mL NaOH 0,5 N dalam metanol dan panaskan dalam

penangas air selama 20 menit.

b) Selanjutnya tambahkan 2 mL BF3 16 % dan 5 mg/mL standar internal,

panaskan lagi selama 20 menit

c) Dinginkan, kemudian tambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL heksana,

kocok dengan baik

d) Pindahkan lapisan heksana dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung

yang berisi 0,1 g Na2SO4 anhidrat, biarkan 15 menit

e) Pisahkan fasa cair selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas

B. Analisis Komponen Asam Lemak, sebagai FAME

1). Atur kondisi alat sebagai berikut
Kolom : Cyanopropil methyl sil (capilary column)

Dimensi kolom : p = 60 m, Ø dalam = 0.25 mm, 025 m

Film Tickness

44
 Laju alir N2 : 20 mL/menit

Laju alir H2 : 30 mL/menit

Laju alir udara : 200 – 250 mL/menit

Suhu injektor : 200ºC

Suhu detektor : 230ºC

Suhu kolom : Program temperatur

- kolom temperatur : awal 190oC diam 15 menit

Akhir 230 oC diam 20 menit

Rate 10oC/ menit

Ratio :1:8

Inject Volum : 1 L

Linier Velocity : 20 cm/sec

2) Injeksikan pelarut sebanyak 1 µl ke dalam kolom. Bila aliran gas

pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan

nampak dalam waktu kurang dari 1 menit

3) Setelah pena kembali ke nol (baseline) injeksikan 5 µl campuran

standar FAME. Bila semua puncak sudah keluar, injeksikan 5 µl

contoh yang telah dipreparasi (A)

4) Ukur waktu retensi dan puncak masing-masing komponen. Jika

rekorder dilengkapi dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak

langsung diperoleh dari integrator

45
 5) Bandingkan waktu retensinya dengan standar untuk mendapatkan

informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh

6) Untuk metode internal standar, jumLah dari masing-masing komponen

dalam sampel dapat dihitung dengan cara sebagai berikut :

Ax . R. Cs
Cx =
As

Dimana:
Cx = Konsentrasi komponen x
Cs = Konsentrasi standar internal
Ax = Luas puncak komponen x
As = Luas puncak standar internal
R = Respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap
Standar

Untuk metode eksternal standar, lakukan preparasi yang sama, hanya contoh

dan standar dilakukan secara terpisah, tidak ada penambahan larutan standar

kedalam contoh. JumLah kandungan komponen dalam contoh dihitung

sebagai berikut :

Ax contoh
x C Standar x V x 100 %
As 100
=
gram contoh

C. Cara Penentuan R
Buat suatu campuran X (murni) dan S dengan jumLah Wx dan Ws yang

diketahui dan dibuat kromatogramnya. Dalam hal ini,

Wx = Ax . Rx; dan

Ws = As .Rs

46
 Dari hubungan ini, maka R dapat dihitung sebagai

𝑅𝑥 𝑊𝑥 . 𝐴𝑠
R= =
𝑅𝑠 𝑊𝑠 . 𝐴𝑥

3.7. ANALISA KUALITAS PROTEIN DAN ASAM LEMAK

1. Prediksi Protein Efisiensi Ratio (P-PER).

Diperkirakan rasio efisiensi protein (P-PER) dari sampel segar dihitung dari

komposisi asam amino berdasarkan persamaan yang dikembangkan oleh Alsmeyer

et al. (1974) dalam Adeyeye (2009) dengan persamaan :

P–PER = -0,468 + 0,454 (Leusin) – 0,105 (Tirosin).

2. Analisa Kualitas Lemak

Kualitas lemak dapat diindikasikan dengan antara lain: Indeks Artherogenik

(AI) dan Indeks Trombogenik (TI) yang dikalkulasikan berdasarkan persamaan

berikut (Ulbricht and Southgate, 1991 dalam Talahigue et al., 2013 ):

[C12: 0 + (4 x C14: 0) + C16: 0]

AI =
[n6 PUFA + n3 PUFA + ΣMUFA]

[C14: 0 + C16: 0 + C18: 0]

TI =
[(0,5 x ΣMUFAs) + 0,5 x PUFA n6) + (3 x PUFA n − 3) + PUFAn3/PUFAn6]

Rasio Hipokolesterolemik dan Hiperkolesterolemik dapat diperoleh berdasarkan

persamaan berikut:

(C18: 1 + C18: 2 + C18: 3 + C20: 3 + C20: 4 + C20: 5 + C22: 4 + C22: 6)

h/H =
(C14: 0 + C16: 0)

47
 Selain itu, Polien Indeks (PI), yang mana merupakan indikator baik untuk

determinasi oksidasi lipid (Sahari et al., 2009 ; Nazemroaya et al., 2009 dalam

Telahigue et al., 2013) dapat dihitung dengan berdasarkan rumus sebagai berikut:

DHA
PI = EPA +
C16: 0

48