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Irradiación de frutillas con UV-C: efecto sobre

la síntesis de proteínas, degradación de la pared
celular y mecanismos de...
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Marina Pombo Pedro M. Civello

National University of La Plata National University of La Plata
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Gustavo Adolfo Martínez

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wavelengths on plant metabolism View project
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Tesis para optar por el título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología de la
Universidad Nacional de General San Martín
Irradiación de frutillas con UV-C: efecto sobre la

síntesis de proteínas, degradación de la pared
celular y mecanismos de defensa
Marina A. Pombo
Director: Dr. Pedro Marcos Civello

Co-director: Dr. Gustavo Adolfo Martínez
Laboratorio de Bioquímica y Fisiología de la

Maduración y Senescencia (UB-4)
IIB-INTECH (Chascomús)
2009
Los resultados mostrados en la presente Tesis, han sido publicados en las
siguientes revistas internacionales con referato y actas de congresos:
A. Revistas internacionales con referato:
“UV-C irradiation delays strawberry fruit softening and modifies the expression of
genes involved in cell wall degradation”. Marina A. Pombo; Marcela M. Dotto;
Gustavo A. Martínez; Pedro M. Civello. Postharvest Biology and Technology 51
(2009) 141-148.
“Effect of UV-C treatment on defense gene expression and activity in strawberry

fruit”. Marina A. Pombo; Hernán G. Rosli; Gustavo A. Martínez; Pedro M. Civello.
Manuscrito en preparación.
“Cloning of FaPAL1 gene from strawberry fruit and characterization of its

expression and enzymatic activity in two cultivars with different anthocyanin
accumulation”. Marina A. Pombo; Gustavo A. Martínez; Pedro M. Civello.
Manuscrito en preparación.
B. Actas de congresos y reuniones científicas con referato:
“Influence of UV-C irradiation on expansin and pectin-methylesterase gene

expression in strawberry fruit”
Pombo, Marina; Dotto, Marcela; Martínez, Gustavo and Civello, Pedro.
XLI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología
Molecular (SAIB).
Diciembre de 2005. Pinamar, Buenos Aires, Argentina.
“Efecto del tratamiento UV-C sobre el ablandamiento y la expresión de

enzimas de degradación de pared durante la postcosecha de frutilla”.
Marina A. Pombo, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello.
XXVI Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV).
Octubre de 2006. Chascomús, Buenos Aires, Argentina.
“La expresión de genes involucrados en la degradación de la pared celular en

frutilla aumenta durante las primeras horas posteriores al corte del fruto”.
Dotto, Marcela C.; Pombo, Marina A.; Martínez, Gustavo A. y Civello, Pedro M.
IV Jornadas de Biología y Tecnología de Postcosecha y I Jornadas de Postcosecha
del Cono Sur.Julio de 2007.
Ciudad de Buenos Aires, Argentina.
“Induction of Phenylalanine ammonia lyase in strawberry fruit by UV-C treatment”.

Pombo, Marina A.; Martínez, Gustavo A. y Civello Pedro M.
XLIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Bioquímica y Biología Molecular
(SAIB).
Noviembre de 2007. Mar del Plata, Argentina.
“Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

defensa en frutilla”.
Pombo, Marina A.; Rosli, Hernán G.; Martínez, Gustavo A.; Civello, Pedro M.
XIII Reunión Latinoamericana XXVII Reunión Argentina de Fisiología Vegetal.
Septiembre de 2008. Rosario, Buenos Aires, Argentina.
“Expression of phenylalanine ammonia lyase during ripening of different

strawberry cultivars” .
Pombo MA, Martínez GA, Civello PM.
XLIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y
Biología Molecular (SAIB).
Noviembre de 2008. Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina.
“UV-C treatment on strawberry fruit: effect on gene expresion in different tissues”.

Hernán G. Rosli, Marina A. Pombo, P. Marcos Civello and Kevin M. Folta.
XX Annual PMCB Workshop.
Mayo de 2009. Crystal River, Florida, EEUU.
“Infuencia de la irradiación con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

defensa en frutilla (Fragaria x ananassa, Duch)”.
Marina A. Pombo; Hernán G. Rosli; Gustavo A. Martínez y Pedro M. Civello.
V Jornadas Argentinas de Biología y Tecnología Postcosecha.
Octubre de 2009. San Pedro, Buenos Aires, Argentina.
“FaPAL expression in fruit tissue of strawberry cultivars with contrasting

anthocyanin accumulation”.
Pombo, Marina A.; Martínez, Gustavo A. y Civello, Pedro M.
XLV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y
Biología Molecular (SAIB).
Noviembre de 2009. San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.
INDICE
INDICE
A. Introducción general .................................................................................................1
1. Generalidades de los frutos .............................................................................................. 2

1.1. Origen e importancia biológica ...................................................................................... 2
1.2. Desarrollo ....................................................................................................................... 2
1.3. Maduración..................................................................................................................... 4
2. La Frutilla………………………………………………………………………………………………………………….6
2.1. Clasificación biológica e historia ..................................................................................... 6
2.2. Morfología de la planta .................................................................................................. 7
2.3. El fruto y su maduración ................................................................................................. 9
2.4. Cultivo y productividad................................................................................................. 11
3. Tratamientos postcosecha de los frutos ........................................................................ 13
3.1. Tratamientos físicos...................................................................................................... 14
3.1.1. Refrigeración ............................................................................................................. 14
3.1.2. Atmósferas modificadas y controladas ..................................................................... 15
3.1.3. Aplicaciones de ozono ............................................................................................... 16
3.1.4. Tratamientos térmicos de alta temperatura ............................................................. 17
4. Irradiación con UV-C ....................................................................................................... 18
4.1. Propiedades de la radiación UV ................................................................................... 29
4.2. Efecto sobre el mantenimiento y la mejora de la calidad en los frutos....................... 21
4.2.1. Influencia sobre procesos asociados a la maduración y senescencia de frutos ....... 21
4.2.1.1. Firmeza ................................................................................................................... 21
4.2.1.2. Color y pigmentos................................................................................................... 22
4.2.1.3. Producción de etileno............................................................................................. 22
4.2.1.4. Respiración ............................................................................................................. 23
4.2.1.5. Sabor y aroma......................................................................................................... 23
4.2.1.6. Compuestos antioxidantes ..................................................................................... 24
4.2.2. Control del decaimiento postcosecha ....................................................................... 25
4.3. Aspectos moleculares y celulares de los tratamientos con UV-C ................................ 26
B. Objetivos ................................................................................................................. 29
C. Capítulo I Efecto del tratamiento con UV-C sobre la degradación de la pared celular
del fruto .................................................................................................................. 31
1. Introducción .................................................................................................................... 32
1.1. Composición de la pared celular .................................................................................. 32
1.1.1. Celulosa ..................................................................................................................... 33
1.1.2. Hemicelulosas ............................................................................................................ 34
1.1.3. Pectinas...................................................................................................................... 35
1.1.4. Proteínas estructurales.............................................................................................. 36
1.2. Estructura de la pared celular ...................................................................................... 37
1.3. Proteínas que modifican la pared celular..................................................................... 37
1.3.1. Poligalacturonasas (PGs) ........................................................................................... 38
1.3.2. Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2) .................................................................................. 39
1.3.3. Pectinmetilesterasas (PMEs, EC 3.1.1.11) ................................................................. 40
INDICE
1.3.4. Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207) ............................................ 40

1.3.5. Expansinas (EXPs) ...................................................................................................... 41
1.3.6. Endo-1,4-β-D glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4) .......................................................... 42
1.3.7. β-D-galactosidasas (β-gals, EC 3.2.1.23) .................................................................... 43
1.3.8. α-L-arabinofuranosidasas (α-L-aras, EC 3.2.1.55) ..................................................... 44
1.3.9. β-D-xilosidasas (β-xils, EC 3.2.1.37) ........................................................................... 45
1.3.10. Endo-β-1,4-D-xilanasas (Xasas, EC 3.2.1.8) ............................................................. 46
2. Resultados ....................................................................................................................... 47
2.1. Comparación de la firmeza en frutos controles y tratados con UV-C .......................... 47
2.2. Expresión de genes de degradación de la pared celular y efecto del tratamiento con
UV-C ................................................................................................................................ 48
2.2.1. Expansinas ................................................................................................................. 48
2.2.2. Expresión de FaCel1 y actividad endo-1,4-β-D-glucanasa ........................................ 50
2.2.2. Expresión de FaPE1 y actividad pectinmetilesterasa (PME) ..................................... 52
2.2.4. Expresión de FaPG1 y actividad poligalacturonasa ................................................... 54
3. Discusión.......................................................................................................................... 57
D. Capítulo II Efecto del tratamiento con UV-C sobre la defensa contra

patógenos………………………………………………………………………………………………………………63
1. Introducción .................................................................................................................... 64
1.1. La podredumbre negra causada por Botrytis cinerea .................................................. 64
1.2. Mecanismos de defensa de las plantas ........................................................................ 68
1.2.1. La vía fenilpropanoide y fenilalanina amonio liasa (PAL) .......................................... 68
1.2.2. Polifenol oxidasa (PPO).............................................................................................. 69
1.2.3. Peroxidasas ................................................................................................................ 70
1.2.4. Proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) .......................................................... 71
1.2.4.1. Quitinasas (EC 3.2.1.14).......................................................................................... 72
1.2.4.2. β-1,3 glucanasas (EC 3.2.1.39) ................................................................................ 73
1.2.4.3. Proteínas semejantes a osmotinas (Osmotin-like proteins) .................................. 74
2. Resultados ....................................................................................................................... 75
2.1. Inoculación de frutos con Botrytis cinerea ................................................................... 75
2.2. Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión de genes relacionados a la
defensa............................................................................................................................ 76
2.2.1. Fenilalanina amonio liasa (PAL) y proteína semejante a osmotina (OLP)................. 76
2.2.2. Quitinasas .................................................................................................................. 78
2.2.3. β-1,3 glucanasa .......................................................................................................... 79
2.2.4. Polifenoloxidasa (PPO) .............................................................................................. 81
2.2.5. Peroxidasas ................................................................................................................ 82
3. Discusión.......................................................................................................................... 84
E. Capítulo III Caracterización de fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con

diferente acumulación de antocianinas………………………………………………………………..88
1. Introducción .................................................................................................................... 89
1.1. Las antocianinas............................................................................................................ 89
1.2. Síntesis de antocianinas a través de la vía fenilpropanoide......................................... 90
2. Resultados ....................................................................................................................... 94
INDICE
2.1. Clonado y caracterización del ADNc completo correspondiente a una PAL de frutilla 94
2.2. Expresión de FaPAL1 en diferentes tejidos de frutilla ................................................. 97
2.3. Fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con diferentes acumulación de
antocianinas .................................................................................................................... 97
2.3.1. Acumulación de pigmentos (antocianinas) en Camarosa y Toyonoka ..................... 97
2.3.2. Expresión de FaPAL1 durante la maduración de Camarosa y Toyonoka .................. 99
2.3.3. Actividad PAL durante la maduración de ambas variedades .................................. 101
2.4. Fenilalanina amonio liasa en variedades de frutilla con acumulación diferencial de
pigmentos de distintos tejidos del fruto ...................................................................... 102
2.4.1. Acumulación de antocianinas en los tejidos externos e internos de frutos de las
variedades Camarosa y Toyonoka ................................................................................ 102
2.4.2. Expresión de FaPAL1 en tejidos externos e internos de las variedades Toyonoka y
Camarosa ...................................................................................................................... 104
2.4.3. Actividad PAL en tejidos externos e internos de las variedades Camarosa y
Toyonoka....................................................................................................................... 105
3. Discusión........................................................................................................................ 107
F. Consideraciones finales .......................................................................................... 112
G. Materiales y Métodos ........................................................................................... 115
1. Material Vegetal ........................................................................................................... 116

2. Tratamiento con UV-C .................................................................................................. 116
3. Determinación de la firmeza ........................................................................................ 117
4. Inoculación de frutos con Botrytis cinerea ................................................................... 117
5. Extracción de ARN total ................................................................................................ 118
6. Electroforesis de ARN en geles de agarosa-formaldehído y transferencia a
membranas................................................................................................................... 118
7. Northern blot................................................................................................................. 119
7.1. Prehibridización de las membranas ........................................................................... 119
7.2. Preparación de sondas ............................................................................................... 119
7.2.1. Genes que codifican proteínas de degradación de la pared celular ....................... 121
7.2.2. Genes relacionados a mecanismos de defensa ....................................................... 121
7.3 Marcado radiactivo de las sondas ............................................................................... 121
7.4. Hibridación de las membranas ................................................................................... 122
7.5. Hibridación de las membranas con sonda para ARNr 18S ......................................... 122
8. Transcripción reversa (RT) ............................................................................................ 122
9. Análisis de expresión por RT-PCR semicuantitativa .................................................... 123
9.1. Expresión de FaPE1 .................................................................................................... 123
10. Visualización de ADN en geles de agarosa ................................................................ 125
11. Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa ............................ 125
12. Ligación de productos de PCR..................................................................................... 125
13. Preparación de células competentes ......................................................................... 125
14. Transformación de células competentes ................................................................... 126
15. Extracción de ADN plasmídico .................................................................................... 126
16. Análisis de plásmidos por restricción ......................................................................... 127
17. Obtención de ADNc completo de PAL ........................................................................ 127
17.1. Búsqueda en una biblioteca de ADNc ...................................................................... 127
INDICE
17.2. Reacciónes de 5’RACE............................................................................................... 128

18. Actividades enzimáticas ............................................................................................. 128
18.1. Enzimas de degradación de la pared celular ............................................................ 128
18.1.1. Endo-β-1,4-glucanasa ............................................................................................ 128
18.1.2. Poligalacturonasa .................................................................................................. 129
18.1.3. Pectinmetilesterasa ............................................................................................... 129
18.2. Enzimas relacionadas a mecanismos de defensa ..................................................... 130
18.2.1. Fenilalanina amonio liasa (PAL) ............................................................................. 130
18.2.2. Quitinasa................................................................................................................ 130
18.2.3. β-1,3 glucanasa ...................................................................................................... 131
18.2.4. Polifenoloxidasa (PPO) .......................................................................................... 131
18.2.5. Peroxidasa ............................................................................................................. 131
APÉNDICE ........................................................................................................................... 132
H. Bibliografía ........................................................................................................... 133

INTRODUCCIÓN GENERAL
Introducción general
1. Generalidades de los frutos

1.1. Origen e importancia biológica
Una vez producida la fecundación de los óvulos, y al mismo tiempo en que éstos
se transforman en semillas, se desarrolla el fruto. En sentido estricto el fruto es el ovario
maduro conteniendo las semillas (Valla 1995). El carpelo, u órgano reproductor femenino
que encierra los óvulos, es una de las mayores innovaciones evolutivas de las plantas que
poseen flores. En las gimnospermas, el grupo más antiguo de plantas vivientes que
producen semillas, los óvulos generalmente se encuentran como estructuras desnudas
que se desarrollan en las axilas de ciertos órganos derivados de las hojas. En cambio, en
las plantas más recientes que poseen flores o angiospermas, los óvulos están encerrados
y protegidos por órganos reproductivos femeninos especializados llamados carpelos.
Además de su función protectora de los óvulos, los carpelos les confieren
numerosas ventajas a las plantas. Por un lado, los tejidos superiores de los carpelos que
forman el estigma, están adaptados para una eficiente captura del polen. En algunos
casos, también proveen un mecanismo selectivo sobre el polen, previniendo la
polinización entre especies diferentes o la autopolinización, favoreciendo de este modo la
polinización cruzada. Una vez capturado el polen, el mismo es guiado a través de los
tejidos del carpelo hasta los óvulos no fertilizados. Después de la fertilización, el tejido
carpelar sufre diferentes cambios en su desarrollo que lo transforman en un fruto, el cual
protege el desarrollo de las semillas y posteriormente contribuye a la dispersión de las
mismas por diversos mecanismos dependiendo de la especie.
Todas estas razones hacen de los carpelos una de las principales características
que llevaron al gran éxito evolutivo de las angiospermas, las cuales se diversificaron a
partir de un ancestro común hace aproximadamente 160 millones de años, hasta formar
un grupo de cerca de 300.000 especies vivientes en la actualidad (Scutt y col. 2006).
1.2. Desarrollo
La relación ontogenética entre los frutos y las hojas es evidente, ya que en las
flores, el ovario indiferenciado está formado por células parenquimáticas, hacecillos
vasculares y dos capas de células epidérmicas, una interna y otra externa. Durante el
2
desarrollo del fruto, las paredes del ovario formarán el pericarpio, el cual está compuesto
por tres diferentes capas: el endocarpo (desarrollado a partir de la epidermis superior del
carpelo), el mesocarpo (formado a partir del mesófilo) y el exocarpo (desarrollado a partir
de la epidermis inferior). De esta manera, el carpelo puede ser visto como una hoja
modificada que se pliega formando una estructura tubular que encierra los óvulos.
Tomando como principal ejemplo y modelo de estudio al tomate (Solanum
lycopersicum), el desarrollo temprano de la mayoría de los frutos puede ser dividido en
tres fases (Figura 1) (Gillaspy y col. 1993). La primera de ellas comienza después de la
apertura floral (antesis) e involucra la fertilización, el desarrollo del ovario y la
preparación para desencadenar la futura división celular y desarrollo del fruto, etapas que
en conjunto se denominan de establecimiento del fruto (“fruit set”). La presencia de
óvulos fertilizados generalmente inicia el desarrollo del ovario para convertirse en fruto.
Figura 1: Fases del desarrollo del fruto de tomate Adaptado de

Gillaspy y col. (1993).
En la segunda fase, el crecimiento del fruto se debe principalmente a la división

celular. En esta etapa, las células son pequeñas, comprimidas y ricas en sustancias
citoplasmáticas con pequeñas vacuolas. La proliferación y diferenciación celular que se da
en los tejidos del fruto están temporalmente coordinadas con el desarrollo temprano de
la semilla y del embrión.
Después del período de división celular, el tamaño del fruto aumenta
principalmente por un incremento en el volumen celular (fase III). La expansión celular
generalmente incrementa el tamaño del fruto 100 veces o más. Durante esta etapa del
desarrollo se produce también la maduración del embrión. Esta última fase lleva a la
inducción de la dormancia de la semilla, que se caracteriza por la acumulación de
3
productos de almacenamiento, la supresión de la germinación precoz, y la adquisición de

la tolerancia a la desecación y a la pérdida de agua. Cabe destacar que diferentes tipos de
frutos muestran variaciones a este programa general de desarrollo.
Como mencionamos anteriormente, desde el punto de vista anatómico el fruto es
el ovario maduro, pero en algunos casos el fruto se desarrolla a partir de componentes
extracarpelares como el cálix, receptáculo, brácteas o el tubo floral (base fusionada de los
órganos florales). Ejemplos de estos frutos son: frutillas, ananás, moras, manzanas y
peras.
1.3. Maduración
La maduración podría definirse en términos generales como la suma de cambios
bioquímicos y fisiológicos que ocurren al final del desarrollo de los frutos,
transformándolos en órganos atractivos para el consumo por parte de organismos que
ayudan en la liberación y dispersión de las semillas (Giovannoni 2001). Estos cambios,
aunque son variables entre las especies, generalmente incluyen modificaciones del color
a través de alteraciones en el contenido de clorofila, carotenoides y/o acumulación de
flavonoides; modificación en la textura por medio de cambios en la turgencia celular y la
estructura y metabolismo de la pared celular; modificación de azúcares, ácidos y volátiles,
que afectan la calidad nutricional, el sabor y el aroma; y aumento de la susceptibilidad a
patógenos oportunistas (comúnmente asociada a la pérdida de integridad de la pared
celular) (Giovannoni 2004).
Los frutos maduros pueden clasificarse en secos o carnosos, según la consistencia
final del pericarpio. En el caso de los frutos carnosos, éstos maduran de acuerdo a la
definición anteriormente desarrollada; en cambio, los frutos secos maduran a través de
un proceso más parecido al que ocurre durante la senescencia de las hojas. Los frutos
secos se clasifican en dehiscentes o indehiscentes dependiendo de si se abren o se
mantienen cerrados durante la etapa final de liberación de las semillas (Valla 1995).
Aunque los frutos secos se encuentran en una gran variedad de especies de plantas, los
estudios de desarrollo y maduración se han focalizado principalmente en los frutos
carnosos, debido fundamentalmente a su importancia en la dieta humana.
4
VM R RM
Figura 2: Cambios que ocurren durante el desarrollo y maduración de

un fruto climatérico (tomate). Las diferentes curvas muestran los
cambios relativos en la división celular, expansión celular, respiración,
síntesis de etileno, ablandamiento y acumulación de carotenoides. a,
antesis; VM, verde maduro; R, rojizo; RM, rojo maduro; dpa, días
post-antesis. Adaptado de Giovannoni (2004)).
Existen dos grupos principales en la clasificación de la maduración de los frutos

carnosos: climatéricos y no-climatéricos. Los frutos climatéricos, por ejemplo tomate,
zapallo, palta, banana, durazno, ciruela y manzana, sufren un incremento en la
respiración y biosíntesis de etileno durante la maduración, particularmente al inicio de la
misma (Figura 2) (Lelièvre y col. 1997). En cambio, los frutos no-climatéricos, como
frutilla, uva y los cítricos, no presentan un aumento marcado en la respiración ni en la
producción de etileno al inicio de la maduración. Poco se conoce de las diferencias a nivel
molecular que separan a los frutos climatéricos de los no-climatéricos. Además, es
interesante destacar que variedades pertenecientes a una misma especie (ej.: diferentes
cultivares de melón) (Perin y col. 2002) o especies estrechamente relacionadas (ej.: melón
y sandía) pueden incluir formas de maduración climatéricas y no climatéricas.
En los últimos años se ha develado que algunos de los genes que controlan el
desarrollo y la maduración del fruto están íntimamente relacionados a factores
reguladores involucrados en la modulación del desarrollo de órganos florales (Seymour y
col. 2008). Los más estudiados hasta el momento han sido los genes MADS box de
Arabidopsis y de tomate. La existencia de genes MADS box que regulan la maduración,
tanto en tomate como en frutilla, sugeriría la existencia de mecanismos reguladores
5
compartidos tempranamente entre ambas especies, climatéricas y no-climatéricas

(Vrebalov y col. 2002). Sin embargo, hasta el momento no se conoce el rol de de estos
factores de transcripción en frutos no-climatéricos, como es el caso de frutilla.
2. La frutilla
2.1. Clasificación biológica e historia
Las frutillas pertenecen al género Fragaria, el cual se encuentra dentro de la
familia Rosacea. Esta familia abarca más de 100 géneros y más de 3000 especies de
plantas económicamente importantes, incluidos muchos árboles con frutos (manzana,
durazno, cereza), frutales herbáceos (frutilla, zarzamora), plantas ornamentales (rosa,
Crataegus), y otros cultivos utilizados para la producción de madera (cerezo) (Shulaev y
col. 2008).
La familia Rosacea fue dividida tradicionalmente en cuatro subfamilias de acuerdo
al tipo de fruto presente: Rosoideae (Rosa, Fragaria, Potentilla y Rubus), donde el fruto es
un aquenio; Prunoideae (Prunus), con la drupa como fruto; Spiraeoideae (Spiraea), donde
el fruto puede ser un folículo o una cápsula; y Maloideae (Malus, Pyrus y Cotoneaster),
con el pomo como fruto. Actualmente, y después de análisis filogenéticos combinados
con análisis de secuencias, se divide a la familia sólo en tres subfamilias: Dryadoiseae,
Rosoideae y Spiraeoideae, poniéndose menos énfasis en el tipo de fruto producido
(Shulaev y col. 2008).
En cuanto al género Fragaria, el mismo contiene 23 especies que varían en los
niveles de ploidía. Se pueden encontrar especies que son diploides, triploides,
octaploides, hexaploides, tetraploides y decaploides (Folta y Davis 2006). La especie de
frutilla cultivada hoy en día (Fragaria x ananassa) es octaploide (2n = 8x = 56
cromosomas), y es un descendiente directo de dos especies naturales, también
octaploides, nativas de América: F. chiloensis y F. virginiana. Fragaria chiloensis es una
especie trioica (en una misma población hay una mezcla de igual cantidad de plantas
femeninas, masculinas y hermafroditas), de la cual solo las plantas femeninas fueron
tomadas de Chile e introducidas en Europa en el año 1714 por el capitán francés Amedeé
Francois Frezier, a su regreso a Francia después de cumplir una misión de espionaje de las
fortificaciones españolas en Chile. Dicho explorador llevó consigo cinco plantas femeninas
desde Penco, donde era cultivada por los aborígenes mucho antes de la llegada de los
6
españoles. La introducción de esta planta intentaba contribuir a la obtención de frutos de

mayor tamaño, los cuales eran desconocidos por los agricultores europeos de esa época.
Sin embargo, las plantas no produjeron ningún fruto debido su unisexualidad. El polen
parental en el linaje inicial de F. x ananassa provino de F. virginiana. El lugar y el
momento en que se originó la cruza fueron documentados por Duchesne. Este nuevo
híbrido producía frutos grandes, dulces y sabrosos a partir de los cuales se hicieron
cultivos extensivos y selección, dando origen a las variedades modernas de frutilla (Folta y
Davis 2006).
2.2. Morfología de la planta

La planta de frutilla es herbácea, perenne y tiene forma de roseta. El tallo, llamado
corona, posee entrenudos muy cortos y nudos en donde se insertan las hojas y las yemas
axilares. Las hojas son pinnadas, formadas por tres folíolos (trifoliada) y un largo pecíolo
de 10 a 20 cm de longitud que termina en el nudo del tallo. En la axila de las hojas se
forman yemas que, dependiendo de las horas de luz y de la temperatura, darán origen a
estolones o inflorescencias. Los estolones son tallos modificados rastreros que sirven para
la propagación vegetativa de la planta. Los mismos están formados por dos entrenudos y
una yema terminal que al desarrollarse forma una nueva planta. El sistema radicular se
compone de raíces primarias y secundarias de aspecto fibroso que surgen de la corona
próxima a la superficie del suelo (Figura 3).
7
Figura 3: Morfología de la planta de frutilla (Fragaria x ananassa,

Duch). Adaptado de Strand (1994)).
Las flores se reúnen en racimos de color blanco, con 9 a 12 flores por

inflorescencia. Pueden existir plantas con flores femeninas o masculinas, pero por lo
general son todas hermafroditas. Cada una de ellas consta de un cáliz, compuesto
normalmente de 6 sépalos; una corola compuesta de 6 pétalos; numerosos estambres
insertos en la base del receptáculo, y sobre él los pistilos dispuestos en espiral (Figura 4).
8
Figura 4: Morfología de la flor de frutilla (Fragaria

x ananassa, Duch). Adaptado de Strand (1994).
2.3. El fruto y su maduración

Desde el punto de vista botánico, la frutilla es un falso fruto, del tipo de los frutos
agregados, denominado conocarpo, que se origina a partir de los tejidos del receptáculo
floral (parte carnosa y comestible del fruto), en la superficie del cual se encuentran los
verdaderos frutos o aquenios (Valla 1995). Los aquenios se encuentran embebidos en la
superficie del receptáculo globoso, de forma espiralada, y cada uno de ellos posee una
sola semilla (uniseminados). Se conectan al interior del receptáculo a través de haces
vasculares que le permiten el intercambio de diversas sustancias, incluidas hormonas y
distintos nutrientes. El aquenio maduro está formado por un pericarpio duro y
relativamente grueso, una fina testa, una capa simple de endosperma, y un pequeño
embrión. La formación del embrión se completa a los 10 días post-antesis (Perkins-Veazie
1995).
El receptáculo está compuesto por una región medular que forma el cilindro
central, una corteza de células parenquimatosas y una o dos capas exteriores de células
epidérmicas (Perkins-Veazie 1995).
Al comienzo del desarrollo los frutos son de color verde debido a la presencia de
clorofilas; durante el transcurso de la maduración se produce la degradación de estos
pigmentos, simultáneamente con una gran acumulación de antocianinas. En frutilla, a
diferencia de tomate, existe una superposición entre el desarrollo y la maduración debido
a que el crecimiento del fruto continúa aún cuando la degradación de clorofilas está muy
avanzada y ya ha comenzado la síntesis de antocianinas. De esta manera, basándose en
9
el tamaño y el color superficial, los frutos pueden ser clasificados en: verdes (pequeños o
grandes), blancos y, de acuerdo al porcentaje de color rojo superficial, en 25, 50, 75 y
100% rojo. Una vez que toda la superficie se torna roja el fruto sigue acumulando
antocianinas y alcanza un estadio de sobremadurez (Figura 5).
VP VG BL 25%R 50%R 75%R 100%R SM
Figura 5: Clasificación en los diferentes estadios de madurez de

frutilla. VP, verde pequeño; VG, verde grande; BL, blanco; 25 a 100%R,
25 a 100% de superficie roja, respectivamente; SM, sobremaduro.
La frutilla es clasificada desde el punto de vista fisiológico como un fruto no-

climatérico, ya que es capaz de madurar sin que se observe un incremento marcado de la
respiración y en ausencia de un aumento en la producción de etileno. Esta hormona
gaseosa se produce en muy baja cantidad a lo largo del desarrollo del fruto (Knee y col.
1977) y su rol en la maduración ha sido motivo de controversias. Mientras que algunos
autores descartan que el etileno intervenga en la regulación de la maduración de frutilla
(Given y col. 1988a), otros investigadores han propuesto que esta hormona ejerce un
efecto en la maduración de estos frutos (El-Kazzaz y col. 1983; Jiang y col. 2001; Trainotti
y col. 2005; Mukkun y Singh 2009). En cambio, se le ha atribuido a las auxinas gran
importancia en la regulación del desarrollo y la maduración de estos frutos. A medida que
los aquenios maduran, se produce la síntesis de auxinas que luego son translocadas de
forma basipétala, a través del floema, hacia el pedúnculo (Perkins-Veazie 1995). Durante
los estadios tempranos del desarrollo (frutos verdes), las auxinas sintetizadas por los
aquenios promueven el crecimiento y expansión del fruto (Nitsch 1950). Posteriormente,
la concentración de auxinas libres en el receptáculo disminuye, y se ha propuesto que
este descenso es el principal factor que estimula la maduración del fruto. En ensayos en
los cuales se retiraron los aquenios de una de las mitades de un fruto en estadio verde, se
observó una aceleración de la maduración (evidenciada por un aumento en la cantidad de
10
antocianinas, aumento en la actividad fenilalanina amonio liasa (PAL), disminución de la

firmeza y del contenido de clorofilas) en la mitad deaquenada respecto de la otra mitad
intacta utilizada como control (Given y col. 1988a). Aparentemente, esta acción
coordinada entre los aquenios y el receptáculo sería parte de un mecanismo que
permitiría asegurar que la maduración del aquenio sea previa a la del receptáculo. Esta
teoría estaría avalada por el hecho de que la declinación en los niveles de auxinas inicia la
maduración induciendo la síntesis de varios ARN mensajeros asociados a este proceso
(Manning 1994).
2.4. Cultivo y Productividad

La frutilla pertenece a un grupo denominado “frutos blandos” o berries, junto con
frambuesas, grosellas, moras, arándanos, etc. (Green 1971). Este grupo está formado por
frutos de distintas especies que comparten características comunes, tales como su
pequeño tamaño, textura delicada, coloración intensa y una vida útil postcosecha breve.
Los frutos frescos son muy apreciados por los consumidores, sin embargo una parte
importante de la producción es destinada al procesamiento para la obtención de jaleas,
dulces, yogures, salsas, etc. Dentro de este grupo de frutos blandos, las frutillas son las de
mayor importancia económica a nivel mundial.
Al analizar los datos obtenidos por la FAO (FAOSTAT, 2009) con respecto a la
producción mundial de frutillas, se puede observar un incremento continuo en los últimos
treinta años (1978-2007) (Figura 6). De acuerdo a esta organización, Estados Unidos es el
primer país productor de frutilla con 1.133.703 Tn correspondientes al año 2007 (Tabla I).
Esto representa el 30% de la producción mundial para ese período de tiempo. Su cultivo
se ha extendido también ampliamente en Europa, abarcando países como España,
Polonia, Alemania, Reino Unido, Italia, Francia, Países Bajos, Ucrania y Bélgica. En el caso
de Asia, los principales representantes son Turquía, Rusia y Corea.
El principal país productor de frutilla de América del Sur es México, el cual se
encuentra séptimo en la lista de los veinte mayores productores del mundo, mientras que
Chile y Colombia figuran en las posiciones 18 y 20 de esta lista, respectivamente (Tabla I).
11
Tabla I: Principales productores mundiales de frutilla. Datos

obtenidos de FAOSTAT correspondientes al año 2007.
PAÍSES PRODUCCIÓN EN Tn
1 Estados Unidos 1.133.703
2 España 263.900
3 Turquía 250.316
4 Fed. Rusia 230.400
5 Rep. Corea 203.227
6 Japón 193.000
7 México 176.396
8 Polonia 174.578
9 Alemania 158.658
10 Egipto 104.000
11 Marruecos 100.000
12 Reino Unido 87.200
13 Italia 57.670
14 Francia 46.900
15 Países Bajos 43.000
16 Belarús 41.800
17 Ucrania 40.700
18 Chile 40.000
19 Bélgica 40.000
20 Colombia 39.996
4500
4000
Producción mundial
3500
(miles de Tn)
3000
2500
2000
1500
1980 1985 1990 1995 2000 2005
Año
Figura 6: Producción mundial de frutillas en los últimos 20 años. Datos

obtenidos de FAOSTAT, 2009.
12
En la Argentina se produjeron 8.850 Tn de frutilla en el año 2007 (FAOSTAT, 2009).

Las principales regiones productoras son Coronda, en la provincia de Santa Fe con una
superficie cultivada de aproximadamente 450 hectáreas; y Lules y Tafí del Valle en
Tucumán, las cuales poseen características agroclimáticas ideales para la producción de
frutilla en invierno. El resto de la producción se distribuye en Salta, Jujuy, Misiones,
Corrientes y Buenos Aires.
Algo interesante para analizar son los datos disponibles de lo que la FAO
denomina “desperdicios”, definidos como las cantidades de producto que se pierden
entre el momento en que se registra la producción y su llegada al hogar, es decir, durante
el almacenamiento y el transporte. Según estos registros, se perderían entre un 0,5 y un
48% de la producción de frutilla en el período postcosecha. Esto representa pérdidas
económicas de entre 8 y 105 millones de dólares anuales. En la Argentina, estas pérdidas
corresponden a un 7% de la producción anual. Existen numerosas variables que influyen
en el aumento o disminución de este índice, como por ejemplo el porcentaje de frutos
que se exportan o que se destinan al mercado interno, la cantidad de producción
comercializada como fruta fresca o procesada, y las técnicas de manejo y conservación
del fruto una vez cosechado. Este último factor es de crucial importancia para disminuir
las pérdidas postcosecha, y de ahí el interés por diseñar estrategias y tratamientos
adecuados que permitan una mejor y mayor conservación de los frutos hasta el momento
de su consumo.
3. Tratamientos postcosecha de los frutos

Los frutos carnosos son productos altamente perecederos una vez que han sido
cosechados. Existen varias causas que provocan estas pérdidas en el periodo postcosecha
de un fruto, incluyendo factores pre-cosecha, variedad, técnicas inadecuadas de
recolección, mal manipuleo, almacenamiento con otros productos incompatibles,
incremento en la concentración de etileno durante el almacenamiento, senescencia,
infecciones causadas por bacterias y hongos, etc.
Históricamente, estas pérdidas, sobre todo aquellas causadas por patógenos,
trataron de subsanarse con la utilización de productos químicos sintéticos, tales como
insecticidas y fungicidas. Estos métodos son los más populares entre los productores
debido fundamentalmente a su bajo costo relativo y fácil aplicación. A pesar de estas
13
ventajas, se conocen numerosos efectos nocivos de estos compuestos sobre la salud

humana debido a que son potenciales agentes carcinogénicos, teratogénicos y tóxicos,
además de ser posibles contaminantes del medio ambiente. Asimismo, su uso excesivo
genera gran acumulación de residuos y favorece la proliferación de cepas resistentes.
En los últimos años ha surgido un nuevo concepto de calidad, dado que los
consumidores no solo valoran a los productos por sus características de sabor, aroma y
aspecto visual, sino que también buscan alimentos libres de toxinas e inocuos para la
salud, a la vez que demandan, cada vez más, frutos producidos mediante una agricultura
sustentable y de bajo impacto sobre el medio ambiente (González-León y Valenzuela
Quintanar 2007).
Como opción de los tratamientos con agentes químicos, surge una amplia
variedad de tecnologías saludables para los consumidores y amigables con el medio
ambiente englobadas bajo el nombre de tratamientos físicos.
3.1. Tratamientos físicos

Entre los llamados “tratamientos físicos” que se utilizan para prolongar la vida
postcosecha de los frutos y vegetales se encuentran la refrigeración, las aplicaciones de
ozono, las atmósferas modificadas y controladas, los tratamientos térmicos de alta
temperatura y la irradiación con UV-C.
3.1.1. Refrigeración
La refrigeración es una tecnología ampliamente utilizada para el almacenamiento
y transporte de los productos vegetales; la misma permite retrasar la pérdida de calidad
de los alimentos perecederos debido a que disminuye la actividad biológica del producto.
Además, las bajas temperaturas provocan un lento crecimiento y dispersión de los
microorganismos patógenos (Kader y col. 2002).
Durante el almacenamiento, los frutos deben mantenerse dentro de un estrecho
rango de temperatura de ± 1 °C de la temperatura deseada para el almacenaje; por
debajo de este rango óptimo algunos productos, especialmente aquellos provenientes de
climas tropicales, pueden sufrir daño por frío, y por encima se acorta la vida en bandeja
del producto. Por otro lado, un rápido enfriamiento de los frutos y un almacenamiento
14
con pocas fluctuaciones en la temperatura son esenciales para una buena preservación
de los mismos.
El enfriamiento inicial de los productos a temperaturas cercanas a las óptimas
para el almacenamiento se puede realizar utilizando diferentes métodos, entre los cuales
se incluye: cámaras de enfriado, enfriamiento por aire forzado, hidro-enfriamiento,
empaquetamiento con hielo, y enfriamiento al vacío. Si bien algunos productos pueden
ser enfriados utilizando varios de estos métodos, la mayoría responde mejor solamente a
uno o dos de los mencionados anteriormente.
3.1.2. Atmósferas modificadas y controladas

Tanto las atmósferas modificadas como las controladas involucran usualmente la
utilización de una atmósfera con una concentración reducida de oxígeno y/o
concentración elevada de dióxido de carbono. Ambas atmósferas difieren en su
constitución de la del aire normal, pero la diferencia entre ambas tecnologías reside en
que la composición de las atmósferas controladas es estrictamente regulada y permanece
prácticamente constante durante el tiempo de almacenamiento, mientras que en el caso
de las atmósferas modificadas esta composición puede variar durante dicho período.
Estas tecnologías son ampliamente usadas para el almacenamiento, transporte y
embalaje de varios tipos de alimentos, siendo muy variables los parámetros óptimos
utilizados para cada tipo de producto. La atmósfera empleada dependerá de: el propósito
de uso, la edad fisiológica del producto, la temperatura, la duración del tratamiento, y la
relación costo-beneficio.
El uso de atmósferas modificadas y controladas proporciona distintos beneficios
para la conservación de productos frutihortícolas, incluyendo: retardo de los procesos
metabólicos como maduración y senescencia; retardo en la pérdida de componentes
nutricionales; control del decaimiento; control de insectos; disminución de algunos
desordenes fisiológicos, como el desarrollo de daño por frío (Yahia 2007). Por otro lado,
muchos factores deben ser considerados cuando se evalúa la potencial aplicación de
atmósferas modificadas o controladas, entre los cuales se pueden citar la calidad y el
valor del producto, razón de uso, disponibilidad de tratamientos alternativos,
competencia con otras regiones productoras, tipo de mercado (local, distante, de
exportación), y el tipo de tecnologías pre y post-cosecha disponibles en la región. Un fruto
15
cuya conservación depende fundamentalmente del uso de atmósferas controladas es la

manzana. Algunas de las razones que justifican su uso se deben a que tiene un valor
elevado, se produce en grandes cantidades y se caracteriza por tener respiración
climatérica y larga vida postcosecha. De hecho, la primera cámara de almacenamiento
con atmósfera controlada fue construida para manzanas en Inglaterra en el año 1929
(Yahia 2007). En menor medida, esta tecnología también se utiliza para la conservación de
peras y kiwis.
Aunque las atmósferas controladas permiten una conservación prolongada y un
control preciso de la composición de gases, su implementación es costosa y requieren
continuo monitoreo e instrumentación adecuada. Alternativamente, con el desarrollo de
diferentes tipos de membranas para envoltorios se puede acceder a la producción de
atmósferas modificadas como una mejor opción para la prolongación de la vida
postcosecha, inclusive utilizando embalaje al vacío (Rai y Paul 2007). En todos los casos,
es necesario evitar grandes fluctuaciones en la temperatura, para no incrementar la
respiración que a su vez trae aparejados otros efectos no deseados como la
fermentación, el desarrollo de patógenos y la condensación de agua en el producto
(Brecht y col. 2003).
En conclusión, tanto las atmósferas modificadas como las controladas pueden ser
usadas para complementar a la refrigeración durante el almacenamiento, el
empaquetado y el transporte de diversos productos. Además, esta combinación de bajas
concentraciones de oxígeno y altas concentraciones de dióxido de carbono con bajas
temperaturas tienen un efecto positivo sobre el control del decaimiento de los frutos y
vegetales (Yahia 2007).
3.1.3. Aplicaciones de Ozono

El ozono (O3) es un gas que se genera naturalmente en la atmósfera cuando la
molécula de oxígeno (O2) se rompe formando radicales libres de oxígeno por acción de la
radiación ultravioleta (UV). Esta molécula es un fuerte agente oxidante con una potente
actividad antimicrobiana, y por lo tanto posee numerosas aplicaciones potenciales en
industrias relacionadas con la agricultura y la producción de alimentos. El ozono destruye
a los microorganismos a través de una progresiva oxidación de sus componentes celulares
vitales, previniendo el crecimiento de los mismos y de esta manera extendiendo la vida
16
en bandeja de muchos frutos y vegetales (Artés y col. 2009). Principalmente, dos

mecanismos de acción del ozono sobre los microorganismos han sido identificados. El
primero consiste en la oxidación de los grupos sulfidrilos y amino ácidos que forman parte
de enzimas, proteínas y péptidos. El segundo, es la oxidación de ácidos grasos poli-
insaturados a peróxidos, lo cual provoca el desmantelamiento de las membranas
celulares y la consecuente disrupción celular con liberación de su contenido (Guzel-
Seydim y col. 2004).
La aplicación de este agente puede efectuarse de dos formas diferentes, como gas
o disuelto en agua. Frecuentemente, la utilización de ozono en agua se describe como
una alternativa al uso de hipoclorito de sodio o de calcio desde el punto de vista de la
desinfección, aunque la ventaja más significativa del ozono es que éste se descompone
rápidamente a oxígeno sin dejar residuos en el producto tratado (Palou y col. 2007). Por
otro lado, debido a su naturaleza altamente reactiva y oxidante, las aplicaciones de ozono
también pueden causar modificaciones fisiológicas en los productos y por lo tanto afectar
la calidad de los mismos. Dependiendo de su tolerancia, de la dosis de ozono, del tiempo
de exposición y de las condiciones ambientales durante la exposición, este gas puede o no
ser perjudicial (Palou y col. 2007). Además, como todo agente oxidante, si existen
exposiciones a altas concentraciones por un determinado tiempo, es potencialmente
perjudicial para la salud del personal que lo manipula.
3.1.4. Tratamientos térmicos de alta temperatura

Los tratamientos térmicos resultan de interés como alternativa o complemento de
los tratamientos químicos tradicionales durante la postcosecha y han sido utilizados por
más de un siglo para controlar patógenos (Grondeau y Samson 1994). La aplicación de los
mismos puede realizarse utilizando agua caliente, vapor o aire caliente (Fallik 2007).
Los tratamientos con agua caliente se utilizaron inicialmente para el control de
insectos, pero luego su uso se extendió al control de hongos patógenos. Existen dos
maneras comerciales de aplicación de estos tratamientos: inmersión en agua caliente y
tratamientos con rociadores. En este último caso se emplean máquinas que rocian agua
caliente y que pueden adicionarse a las líneas tradicionales de clasificación y
acondicionamiento de frutos (Fallik 2004). Generalmente, la duración del tratamiento es
17
muy breve (unos pocos segundos o minutos), dado que el agua líquida posee una
capacidad de transferencia térmica mayor que el aire.
Los tratamientos con vapor consisten en colocar los frutos en contacto con aire
saturado con vapor de agua a temperaturas entre 40 y 50 °C, con el fin de eliminar
huevos y larvas de insectos. La transferencia de calor es aún más elevada que cuando se
utiliza agua caliente, ya que se produce principalmente por la condensación de vapor de
agua sobre la superficie fría del fruto. Después del tratamiento, el producto es enfriado
inmediatamente (Fallik 2007).
En el caso de la utilización de aire caliente, se colocan los frutos en cámaras de
calentamiento con o sin aire forzado. El proceso de calentamiento con aire es más lento
que en el caso de los tratamientos con agua o con vapor, lo que conlleva a la realización
de tratamientos más extensos. En términos generales, para estos tratamientos se utilizan
mayores temperaturas y tiempos de exposición más prolongados, sin embargo, estos
parámetros deben ser ajustados de acuerdo al tamaño y tipo de producto a tratar (Fallik
2007).
En general, los tratamientos térmicos de alta temperatura producen varios efectos
benéficos en los productos, por lo que pueden utilizarse para: el control de insectos; la
reducción del ataque de patógenos; la disminución de alteraciones fisiológicas, como por
ejemplo el daño por frío, las escaldaduras superficiales y el pardeamiento superficial; y
para retrasar los procesos de maduración y senescencia. Todos estos efectos mejoran la
calidad de los productos tratados y extienden su vida postcosecha a través de un proceso
inocuo para el producto, la salud y el medio ambiente.
4. Irradiación con UV-C

Los tratamientos con UV-C consisten en exponer los productos hortícolas por
cierto período de tiempo bajo un banco de lámparas de UV, con un máximo de emisión a
254 nm. Aunque la luz UV a altas dosis es perjudicial para los seres vivos, a bajas dosis
genera diversos efectos benéficos, como por ejemplo inducción de resistencia a
enfermedades, retraso de la maduración y mejora de atributos que le aportan una mayor
calidad a los productos (Charles y Arul 2007). Este fenómeno biológico se denomina
“hormesis” y, en otras palabras, se refiere a la utilización de un agente que normalmente
18
es perjudicial para los seres vivos, pero que en bajas dosis permite obtener un efecto
benéfico (Shama y Alderson 2005; Charles y Arul 2007).
4.1. Propiedades de la radiación UV

La radiación UV tiene una mayor energía que la luz visible y es considerada no
ionizante, aunque bajo condiciones específicas puede ionizar determinado tipo de
moléculas, como por ejemplo la molécula de agua (Kovács y Keresztes 2002). Este tipo de
radiación ocupa el rango de longitudes de onda entre los rayos X (200 nm) y la luz visible
(400 nm) (Bintsis y col. 2000), y puede subdividirse en tres regiones: UV-C (200 a 280 nm),
UV-B (280 a 300 nm) y UV-A (320 a 400 nm) (Figura 7).
UV-C UV-B UV-A

100-280 nm 280-320 nm 320-400 nm
Energía
Figura 7: Espectro electromagnético con sus correspondientes

longitudes de onda y frecuencias. Se muestran también, las diferentes
regiones dentro del UV.
El efecto germicida de la radiación con UV-C es conocido desde hace mucho

tiempo. Principalmente se ha utilizado esta radiación para el tratamiento de
enfermedades, para la esterilización de materiales de uso en medicina y en diferentes
industrias donde la contaminación microbiológica es un problema (Guerrero-Beltrán y
Barbosa-Cánovas 2004).
Las lámparas típicamente usadas para la desinfección con UV-C consisten en tubos
de cuarzo que contienen un gas inerte en su interior, como Argón, y pequeñas cantidades
19
de Mercurio. Las fuentes de radiación usadas pueden ser clasificadas en lámparas de baja
y media presión de descarga de Mercurio.
Es importante tener en cuenta que el grado de destrucción o inactivación de los
microorganismos es altamente dependiente de la dosis de UV-C utilizada. La misma se
expresa en el Sistema Internacional (SI) de unidades en Joules por metro cuadrado (J m-2),
mientras que la irradiancia o intensidad de la radiación UV se expresa en Watts por metro
cuadrado (W m-2).
En la práctica se ha utilizado una gran variedad de tratamientos en frutos y
vegetales, pero en la mayoría de los casos las dosis usadas abarcan un rango desde los 0,2
hasta los 20 KJ m-2. La distancia entre el producto y las lámparas también es variable (10-
40 cm) y la dosis de radiación se mide generalmente con un radiómetro (Civello y col.
2007). En la mayoría de los estudios realizados, los productos son rotados manualmente
para asegurarse que todas la superficies hayan sido expuestas a la radiación; sin embargo
(Stevens y col. 2005) indujeron una igual o levemente mejor resistencia al decaimiento
postcosecha de manzana, durazno y mandarina irradiando solo el extremo del pedicelo
del fruto. En todos los casos, la dosis necesaria debe ser optimizada para cada tipo de
fruto o vegetal y también para cada nueva variedad utilizada. Algunos estudios indican
que la dosis requerida cambia con el estado de madurez del fruto y con la estación del
año en la cual fueron cosechados, y que los resultados finales pueden ser afectados por la
temperatura utilizada para el almacenamiento después del tratamiento (Droby y col.
1993).
Cabe destacar que los tratamientos con UV-C poseen varias ventajas para su
utilización en la postcosecha. Entre ellas se encuentra la practicidad, ya que son
tratamientos simples, limpios, se realizan a bajas temperaturas y sin humectación del
producto, requieren menos espacio que otros métodos, poco mantenimiento y tienen un
bajo costo. Estas características, sumado a que podrían ser incorporados fácilmente a una
línea de procesamiento, que requieren una baja inversión para su implementación y que
no existen, en general, restricciones legales para su aplicación, los convierten en una
atractiva opción como tratamiento postcosecha (Civello y col. 2007).
20
4.2. Efecto sobre el mantenimiento y la mejora de la calidad en los frutos

Los frutos son productos altamente perecederos, especialmente una vez que han
sido cosechados. Existen varios factores que afectan al mantenimiento de la calidad de los
frutos durante su almacenamiento, distribución y comercialización. Los tratamientos con
UV-C han demostrado su capacidad para modificar varios de estos aspectos en diferentes
tipos de frutos, extendiendo su vida postcosecha y reduciendo las pérdidas, y también
manteniendo, e inclusive en algunos casos mejorando, su calidad. Estos factores podrían
ser agrupados en dos grupos principales que se encuentran estrechamente relacionados
entre sí, como son aquellos procesos asociados a la maduración y a la senescencia y, por
otro lado, al decaimiento provocado por diversos patógenos que atacan a los frutos.
4.2.1. Influencia sobre procesos asociados a la maduración y senescencia de

frutos
Durante la maduración, los frutos se tornan más atractivos a través de cambios en
su color, sabor, aroma y textura, pero por otro lado estas modificaciones conducen a la
senescencia de los mismos y los tornan más susceptibles a las enfermedades
postcosecha, ambos efectos no deseados por los consumidores y productores. Los
tratamientos con UV-C han demostrado su utilidad para controlar distintos procesos
asociados con la maduración (Maharaj y col. 1999; Stevens y col. 1998). Como se
mencionó anteriormente, los resultados obtenidos varían de acuerdo al tipo de fruto, al
estado de maduración, a la estación del año en la que se realizó la cosecha y a la dosis
aplicada.
4.2.1.1. Firmeza
La firmeza es un atributo muy importante en la postcosecha de los frutos. El
excesivo ablandamiento es uno de los principales factores determinantes de la pérdida de
calidad, dado que los productos más firmes soportan mejor el manipuleo y el transporte y
son menos propensos al desarrollo de hongos y podredumbres. La irradiación con UV-C
retrasó la tasa de ablandamiento de varios frutos carnosos. Se observaron mayores
valores de firmeza en frutillas a las que se le aplicaron 0,25, 1 y 4,1 KJ m -2 de radiación
UV-C (Baka y col. 1999; Pan y col. 2004). Similares resultados se observaron en varios
trabajos realizados en tomate (Maharaj y col. 1999; Barka y col. 2000; Stevens y col.
21
2004). La pérdida de firmeza fue también retrasada en durazno (Gonzalez-Aguilar y col.

2004), boysenberry (Vicente y col. 2004) y pimiento (Vicente y col. 2005b).
4.2.1.2. Color y pigmentos

El color de los frutos puede ser un factor decisivo en su aceptación o rechazo por
los consumidores. Durante la maduración de los frutos su color cambia debido a la
pérdida de clorofilas y a la síntesis de otros pigmentos como los carotenoides y las
antocianinas. Se han observado modificaciones en estos pigmentos en aquellos productos
tratados con UV-C. Varios autores han descripto un retraso en el desarrollo del color en
tomates irradiados (Liu y col. 1993; Maharaj y col. 1999). Además, pimientos tratados con
una dosis de 7 KJ m-2 presentaron un menor contenido de carotenoides y color superficial
(Vicente y col. 2005b). En el caso de las antocianinas, se reportaron diversos efectos del
tratamiento. En frutilla, Baka y col. (1999) observaron un gradual aumento en la
acumulación de estos pigmentos en los frutos irradiados con dosis de 0,25 y 1 KJ m-2,
hacia el final del almacenamiento. Sin embargo, frutillas tratadas con 4,1 KJ m -2 de UV-C
mostraron un menor enrojecimiento de su superficie y una menor acumulación de
antocianinas que sus controles respectivos (Pan y col. 2004).
4.2.1.3. Producción de etileno

Los resultados descriptos con respecto al efecto del UV-C sobre la producción de
etileno son variables y a veces contradictorios. Se han reportado tanto incrementos como
descensos en su producción en diferentes frutos, y en algunos casos en el mismo fruto
pero bajo diferentes condiciones de tratamiento. En el caso de frutilla, la irradiación de
los frutos con distintas dosis conduce a un aumento de la producción de etileno, el cual
fue proporcional a la dosis aplicada y se puso de manifiesto en las primeras horas post-
tratamiento (Nigro y col. 2000). En un fruto diferente, como el durazno, la producción de
etileno también fue estimulada en todos los tratamientos aplicados, aunque otros
parámetros relacionados a la maduración como el ablandamiento y la respiración fueron
reducidos con respecto al control (Gonzalez-Aguilar y col. 2004). Sin embargo, Stevens y
col. (1998) encontraron, en el mismo fruto, un descenso en la producción de etileno en
las primeras horas de almacenaje. En tomate, la irradiación con UV-C provocó una
disminución y un retraso en el pico de etileno climatérico (Maharaj y col. 1999), mientras
22
que en rodajas de zapallo no se observaron diferencias en los niveles de etileno con el

tratamiento (Erkan y col. 2001). Estos resultados tan heterogéneos podrían deberse a las
diferencias en las dosis utilizadas y en la sensibilidad de los distintos productos (tipo de
frutos, cultivares) a la irradiación con UV-C.
4.2.1.4. Respiración
El efecto de la radiación con UV-C sobre la tasa respiratoria es diferente en
distintos frutos analizados. Cuando se trataron tomates con dosis de UV-C que retrasaron
la maduración y la senescencia, se produjo también una reducción en la tasa respiratoria
de los frutos (Maharaj y col. 1999). Frutillas a las que se les aplicaron dosis de 0,25 y 1 KJ
m-2 de UV-C presentaron una menor producción de CO2 con respecto al control durante el
almacenamiento a 4 y 13 °C (Baka y col. 1999). Esta disminución también fue observada
en pimientos tratados y almacenados a 0 °C (Vicente y col. 2005b). Se ha propuesto que la
mayoría de los resultados reportados hasta el momento responderían a alguno de los
siguientes patrones dependientes de la dosis aplicada: a) a bajas dosis, la respiración es
levemente o no es afectada por el tratamiento; b) incrementos en la dosis causarían un
aumento temporal de la respiración durante el tratamiento o pocas horas después del
mismo, seguido de una posterior reducción de la tasa respiratoria; c) un mayor
incremento en la exposición podría provocar un aumento sostenido de la respiración
debido al daño de los tejidos (Civello y col. 2007).
4.2.1.5. Sabor y aroma

El sabor de los frutos se encuentra directamente asociado al contenido total de
azúcares libres y de los ácidos orgánicos presentes. El efecto del tratamiento con UV-C
sobre estos atributos fue estudiado en varios productos. En el caso de frutilla, se
obtuvieron diferentes respuestas de acuerdo con la variedad y la dosis utilizada. Baka y
col. (1999) trataron frutos de la variedad Kent con dosis de 0,25 y 1 KJ m -2, y observaron
un incremento más pronunciado en el contenido de azúcares libres y una menor
reducción en la acidez titulable. En cambio, la aplicación de una dosis de 4,1 KJ m -2 a
frutos de la variedad Seascape no provocó cambios en el contenido de azúcares libres ni
en la acidez (Pan y col. 2004). La irradiación con UV-C de boysenberry, otro fruto blando,
provocó un retraso en la pérdida de azúcares libres y en la disminución de la acidez
23
durante las 24 h posteriores al tratamiento (Vicente y col. 2004). En el caso de mangos, si

bien el tratamiento preservó la calidad del fruto durante su almacenamiento, no se
observaron diferencias en el contenido de azúcares y ácidos orgánicos con respecto al
control (González-Aguilar y col. 2001). De la misma manera, la irradiación con UV-C no
produjo cambios en el contenido de azúcares y acido málico en rodajas de zucchinis
(Erkan y col. 2001). En general, en la mayoría de los trabajos realizados se concluye que el
tratamiento con UV-C tiene un efecto leve o nulo sobre el contenido de ácidos y azúcares.
Además, el cambio observado es generalmente una leve disminución del contenido de
azúcares y ácidos que ocurre normalmente durante la maduración o el almacenamiento
postcosecha, lo cual sugiere que el tratamiento con UV-C provocaría un retraso general
de la maduración y la senescencia del fruto.
En cuanto al aroma, existen escasos trabajos que analicen la influencia del
tratamiento con UV-C sobre el mismo. La irradiación con UV-C produjo modificaciones en
los compuestos volátiles de melones frescos cortados. La concentración de la mayoría de
los ésteres alifáticos se redujo en un 60% respecto de las cantidades comúnmente
encontradas en este tipo de frutos procesados. Por otro lado, los frutos tratados
presentaron una mayor producción de otros volátiles, como por ejemplo β-ionona,
geranil acetona y terpinil acetato (Lamikanra y col. 2002).
4.2.1.6. Compuestos antioxidantes

La irradiación con UV-C es una tecnología que puede ser utilizada para aumentar
las propiedades benéficas de los frutos, debido a la capacidad que posee este tratamiento
físico de activar distintas vías metabólicas involucradas en la síntesis y acumulación de
metabolitos secundarios, algunos de los cuales están bien caracterizados por su impacto
positivo sobre diversos aspectos de la salud humana. De por sí, los frutos son una de las
mayores fuentes de antioxidantes, incluyendo compuestos fenólicos, acido ascórbico y
carotenoides.
La vía fenilpropanoide puede ser estimulada por la irradiación con UV-C; un
ejemplo es el aumento de la concentración de resveratrol, un compuesto fenólico no-
flavonoide, al doble y al triple en uvas irradiadas con UV-B y UV-C, respectivamente
(Cantos y col. 2000). Inclusive, se observó que el vino obtenido a partir de uvas tratadas
con UV-C estaba enriquecido en resveratrol y piceatanol (Cantos y col. 2003). En frutilla,
24
la irradiación con UV-C puede causar un aumento de la capacidad antioxidante de los

frutos y de la actividad de enzimas que participan en la respuesta antioxidante (Erkan y
col. 2008). La cantidad de fenoles y flavonoides totales aumentó en mangos irradiados
con dosis de 2,46 y 4,93 KJ m-2 (Gonzalez-Aguilar y col. 2007). Resultados similares fueron
obtenidos en arándano, donde la capacidad antioxidante fue significativamente más
elevada en los frutos tratados con respecto a los controles, y esto estuvo acompañado de
un aumento en los niveles de diferentes flavonoides (Wang y col. 2009; Perkins-Veazie y
col. 2008). También en boysenberry, los frutos tratados con UV-C mantuvieron una mayor
capacidad antioxidante total que los controles (Vicente y col. 2004).
Con respecto al ácido ascórbico, los frutos y los vegetales proveen más del 90% de
la vitamina C en la dieta humana (Lee y Kader 2000). Existen pocos estudios en los que se
analiza el efecto que tienen los tratamientos con UV-C sobre el contenido de esta
vitamina. En uno de ellos, realizado en zucchinis, se encontró que la enzima ascorbato
oxidasa, participante del catabolismo del ácido ascórbico, fue inactivada después de la
exposición del fruto a radiación UV-C durante 8,5 min (Maccarrone y col. 1993). Además,
tomates tratados con UV-C y almacenados a 13 °C, mostraron una mayor acumulación de
ácido ascórbico en el pericarpio con respecto a los frutos no irradiados (Jagadeesh y col.
2009).
4.2.2. Control del decaimiento postcosecha

Gran parte de los trabajos sobre tratamientos con UV-C están relacionados a su
efecto sobre los organismos patógenos. En estos trabajos se estudió el efecto de la
exposición a UV-C tanto en microorganismos aislados como en aquellos que se
encontraban sobre la superficie de frutos y vegetales. En el caso de estos últimos, los
ensayos se realizaron sobre su microflora natural o inoculando artificialmente con un
patógeno determinado.
El modo de acción del UV-C sobre los microorganismos incluye un efecto directo y
uno indirecto a través de la modificación del metabolismo de los tejidos irradiados
(Shama y Alderson 2005). El efecto directo es debido a la absorción de la radiación por los
microorganismos que se encuentran en la superficie del producto, asociado a diferentes
niveles de daño en sus ácidos nucleicos, membranas, etc. En cambio, el efecto indirecto
se debe a un conjunto de modificaciones provocadas en el metabolismo del fruto o
25
vegetal irradiado que conducen a una mayor resistencia de los mismos contra diversos
patógenos (Civello y col. 2007).
Un efectivo control del decaimiento se observó en diferentes frutos irradiados con
UV-C, entre los cuales se puede mencionar a: tomate (Liu y col. 1993; Stevens y col.
2004); mango (González-Aguilar y col. 2001); arándano (Perkins-Veazie y col. 2008);
durazno (Stevens y col. 1998); frutilla (Pan y col. 2004; Baka y col. 1999; Nigro y col. 2000;
Marquenie y col. 2002); uva (Nigro y col. 1998; Romanazzi y col. 2006); pimiento (Vicente
y col. 2005b), pomelo (Droby y col. 1993; D'hallewin y col. 2000), mandarina (Kinay y col.
2005) y manzana (Capdeville y col. 2002). En todos estos trabajos también se analizó el
comportamiento de diversas especies patógenas incluyendo: Alternaria alternata (Liu y
col. 1993); Botrytis cinerea (Liu y col. 1993; Pan y col. 2004; Baka y col. 1999; Nigro y col.
2000; Marquenie y col. 2002; Marquenie y col. 2003; Nigro y col. 1998; Romanazzi y col.
2006)); Rhizopus stolonifer (Liu y col. 1993; Stevens y col. 2004); Colletotrichum acutatum
(Perkins-Veazie y col. 2008); Monilinia fructicola (Stevens y col. 1998; Marquenie y col.
2002); Penicilliun digitatum (Droby y col. 1993; Kinay y col. 2005); Penicillium italicum
(Kinay y col. 2005) y Penicillium expansum (Capdeville y col. 2002). Es importante destacar
que una de las ventajas de la irradiación con UV-C es la posibilidad de poder combinarlo
con otros tratamientos para obtener mejores resultados (Romanazzi y col. 2006;
Marquenie y col. 2003; Marquenie y col. 2003; Pan y col. 2004). De este modo, se han
reportado tratamientos de UV-C combinados con quitosano (Romanazzi y col. 2006), luz
blanca pulsada (Marquenie y col. 2003; Marquenie y col. 2003) y tratamientos térmicos
(Pan y col. 2004).
4.3. Aspectos moleculares y celulares de los tratamientos con UV-C

A pesar de la existencia de numerosos estudios en los que se describen los efectos
del UV-C sobre diferentes atributos de los frutos y la capacidad de prolongar la vida
postcosecha, son contados los reportes en los que se analizan los aspectos celulares y
moleculares de este tratamiento físico.
Como se mencionó anteriormente, frutos de diversas especies irradiados con UV-C
permanecieron más firmes que sus respectivos controles. El ablandamiento que ocurre
normalmente durante la maduración de un fruto ha sido correlacionado con una
progresiva solubilización y depolimerización de la pared celular (Brummell y Harpster
26
2001). Por otro lado, la degradación de la pared celular facilita el acceso de los
organismos patógenos hacia los tejidos del fruto, lo cual incrementa la susceptibilidad de
los mismos a la infección (Cantu y col. 2008). Algunos trabajos han demostrado que existe
una relación entre el retraso en el ablandamiento de los frutos tratados con UV-C y una
menor actividad de enzimas que degradan la pared celular durante la maduración. Tanto
Stevens y col. (2004) como Barka y col. (2000) hallaron una menor actividad
poligalacturonasa durante el almacenamiento en tomates que habían sido previamente
irradiados con dosis de 3,6 y 3,7 KJ m-2, respectivamente. En este último caso, también se
vio afectada la actividad de otras enzimas de degradación de pared celular, tales como
pectinmetilesterasa, celulasa, β-galactosidasa y xilanasa (Barka y col. 2000).
Con respecto al aumento observado en la capacidad antioxidante cuando los
frutos son irradiados con UV-C, Erkan y col. (2008) reportaron un aumento de al menos
siete enzimas con actividad antioxidante después del tratamiento.
Existen varios mecanismos de defensa que son estimulados por el UV-C, entre los
cuales se encuentra la acumulación de diferentes tipos de fitoalexinas, compuestos de
bajo peso molecular que poseen actividad antibacteriana y antifúngica. En tomate se
encontró que la irradiación previa con UV-C provoca un aumento temprano de la
fitoalexina risquitina, lo que mejoraría las defensas del fruto frente a la eventual invasión
de un patógeno como Botrytis cinerea (Charles y col. 2007d). También es conocida la
estimulación de la vía fenilpropanoide por la radiación UV-C, hecho demostrado por la
activación de fenilalanina amonio liasa (PAL), enzima clave de esta vía. La actividad PAL se
incrementó en distintos frutos irradiados, como uva (Droby y col. 1993), frutilla (Nigro y
col. 2000) y durazno (El Ghaouth y col. 2003).
Por otro lado, se reportó la acumulación de varias proteínas relacionadas a la
patogénesis o proteínas PR en diversos frutos después de la irradiación. Muchas de estas
proteínas son enzimas que degradan la pared celular del patógeno. El Ghaouth y col.
(2003) encontraron un aumento en la actividad PAL, quitinasa y β-1,3 glucanasa en
duraznos tratados con UV-C, acompañado en cada caso de un incremento en los niveles
de transcriptos de los genes correspondientes. En pomelo, el UV-C indujo la acumulación
de una quitinasa de 25 kD pero no afectó ninguna de las β-1,3 glucanasas analizadas
(Porat y col. 1999). Un resultado diferente se encontró en naranjas, donde la expresión de
un gen que codifica para una β-1,3 glucanasa aumentó en respuesta al UV-C (Porat y col.
27
2002). En un trabajo reciente, se observó que el tratamiento con UV-C incrementó la

expresión de quitinasas y β-1,3 glucanasas constitutivas de tomate e indujo la síntesis de
al menos 5 nuevas proteínas PR (Charles y col. 2009).
Hasta el momento, los mecanismos moleculares que llevan a una mayor o menor
expresión y/o actividad de determinadas proteínas por la irradiación con UV-C no han
sido determinados. Existen trabajos que indican que la irradiación de embriones de maíz
con UV-C disminuye la síntesis de proteínas in-vitro (Murphy y col. 1973; Murphy y col.
1974). Posteriormente, se encontró una disminución en la síntesis de nuevas proteínas en
plantas de maíz, como consecuencia del entrecruzamiento entre proteínas ribosomales y
ARN provocado por el tratamiento con radiación UV-B (Casati y Walbot 2004). Asimismo,
plantas tolerantes al UV-B exhibieron una mayor acetilación de histonas H3 y H4 después
de la irradiación, que correlacionó con un incremento en la abundancia de transcriptos
pertenecientes a proteínas o enzimas que participan en la biosíntesis de flavonoides y al
remodelamiento de la cromatina (Casati y col. 2008). Es importante destacar que estos
cambios epigenéticos pueden ser transmitidos a las siguientes generaciones. Molinier y
col. (2006) demostraron que la progenie de plantas de Arabidopsis irradiadas con UV-C
poseía un incremento en la recombinación homóloga sin haber sido sometidas
previamente a este estrés.
Finalmente, se reportaron cambios estructurales en tomate provocados por la
irradiación con UV-C; dichos cambios limitarían la colonización de Botrytis cinerea a las
capas celulares externas del fruto. Las modificaciones provocadas por la radiación
incluyen cambios en la superficie del fruto (Charles y col. 2007c), modificaciones
ultraestructurales en el parénquima (Charles y col. 2007a) y la acumulación de
compuestos fenólicos, la cual favorece el refuerzo de la pared celular debido a la
lignificación y suberización de las células del epicarpo y parte del mesocarpo (Charles y
col. 2007b).
28
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Objetivos
A. Objetivo general
Analizar las bases bioquímicas y fisiológicas de procesos implicados en la
maduración de frutos y determinar el efecto de la irradiación con UV-C sobre el
metabolismo del fruto y la extensión de su vida postcosecha.
B. Objetivos específicos
Analizar el efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad de enzimas y expresión
de genes asociados al metabolismo de la pared celular del fruto durante la
postcosecha.
Caracterizar el efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión de enzimas
relacionadas con mecanismos de defensa: fenilalanina amonio liasa (PAL), peroxidasa,
polifenoloxidasa (PPO), y proteínas relacionadas a la patogénesis (proteínas PR).
Caracterizar la actividad y expresión génica de fenilalanina amonio liasa de frutilla
(FaPAL1) a lo largo de la maduración, en dos cultivares con diferente acumulación de
pigmentos (antocianinas).
30
Capítulo I
“Efecto del tratamiento con UV-C sobre la
degradación de la pared celular del fruto”
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
Capítulo I: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la degradación de la pared

celular del fruto
1. Introducción
El excesivo ablandamiento de los frutos es el principal factor limitante de su vida
en bandeja y almacenamiento postcosecha (Brummell y Harpster 2001). Este cambio en la
textura que ocurre normalmente durante la maduración de los frutos carnosos tiene gran
influencia sobre otros aspectos asociados a la calidad de los mismos, como por ejemplo la
infección por parte de patógenos en la postcosecha. Aunque existen diversos eventos
metabólicos responsables de los cambios en la textura de los frutos, la modificación en la
composición de la pared celular, especialmente en la fuerza mecánica de la pared y en la
adhesión de las células, es considerada uno de los factores más importantes y
determinantes (Goulao y Oliveira 2008).
Las paredes celulares de las plantas son estructuras complejas y dinámicas
compuestas mayormente por polisacáridos de alta masa molecular, proteínas glicosiladas
y en algunos casos ligninas (Somerville y col. 2004). La unión de estos polímeros conforma
una arquitectura particular que le confiere a la pared diferentes funciones mecánicas y
bioquímicas. Entre las funciones mecánicas se incluyen proveer de rigidez a la planta y
actuar como barrera física contra los estreses bióticos y ambientales. En cuanto a las
funciones bioquímicas, estas abarcan la reorganización de los componentes de la pared y
participación en mecanismos de señalización en respuesta al ataque de patógenos y a
diversos tipos de estreses abióticos. Estas características de las paredes celulares les
permiten a las plantas crecer, evitar o disminuir la depredación, minimizar la pérdida de
agua y funcionar exitosamente, lo que incluye lograr su reproducción, en ambientes muy
diversos (Sarkar y col. 2009).
1.1. Composición de la pared celular

Los componentes que forman las paredes celulares primarias de las dicotiledóneas
son celulosa, hemicelulosas, pectinas y proteínas estructurales.
32
1.1.1. Celulosa
La celulosa está compuesta por cadenas lineales de β-1,4-glucanos que se
encuentran asociadas a través de puentes de hidrógeno, en un número aproximado de 30
a 36 cadenas, formando microfibrillas de un diámetro de 3 nm y aproximadamente 7 μm
de largo (Figura 8) (Somerville y col. 2004). La región interna de las microfibrillas posee
una estructura cristalina que excluye las moléculas de agua, mientras que las capas
externas son más amorfas, permitiendo de esta manera el entrecruzamiento con otros
componentes de la pared (Pauly y col. 1999).
Glucosa
Celulosa
Microfibrilla de celulosa
Figura 8: Estructura de las celulosas. Adaptado de Sarkar y col. (2009).
A diferencia de los demás componentes de la pared celular que son sintetizados a

través de la vía secretora, la celulosa se sintetiza por medio de complejos enzimáticos
(celulosa sintasa) dinámicos, en forma de “rosetas”, que se encuentran en la membrana
plasmática (Lerouxel y col. 2006). Es de destacar que la deposición de las microfibrillas en
la pared celular está caracterizada por una orientación controlada. En las paredes
primarias, su orientación es generalmente perpendicular al eje de elongación celular, lo
cual restringe el hinchamiento lateral a la vez que permite la expansión longitudinal
(Somerville y col. 2004).
33
1.1.2. Hemicelulosas
Las hemicelulosas son polisacáridos ramificados que contienen un esqueleto de
azúcares neutros (Somerville y col. 2004); en general, son compuestos neutros o
levemente ácidos y no poseen ácido galacturónico en su composición (Brummell 2006).
Los principales tipos de hemicelulosas que se encuentran presentes en la pared primaria
son:
a- Xiloglucanos: son cadenas de β-1,4-glucanos (similar a las celulosas pero sin

estructura cristalina) con ramificaciones laterales de D-xilosa, algunas de las cuales
están sustituidas a su vez por β-D-galactosa y eventualmente α-L-fucosa (Fig. 9).
b- Glucomananos: están formados por una cadena principal donde alternan β-1,4-
glucanos y β-1,4-mananos, algunas veces con cadenas laterales simples de α-D-
galactosa (Figura 9).
Glucosa Xilosa Galactosa Fucosa Manosa Arabinosa
Xiloglucano Glucomanano
Xilano
Glucogalactomanano
Figura 9: Estructura de los principales tipos de hemicelulosas. Adaptado de

Sarkar y col. (2009)
c- Xilanos: son polímeros compuestos por una cadena principal de β-1,4-xilanos,

sustituidos por residuos de ácido α-D-glucurónico y de α-L-arabinosa (Figura 9).
34
1.1.3. Pectinas
Son un conjunto heterogéneo de polímeros que se definen por la presencia de
ácido α-D-galacturónico en su estructura (Somerville y col. 2004). En general, representan
uno de los grupos mayoritarios de la pared junto con la celulosa y las hemicelulosas, sin
embargo, en las paredes celulares de los frutos pueden llegar a constituir la mitad del
contenido polimérico total (Brummell 2006). Se cree que poseen un rol importante en el
control de la porosidad de la pared celular, en la adhesión entre células vecinas y en el
control del ambiente iónico del apoplasto (Carpita y Gibeaut 1993). Existen tres tipos
principales de pectinas:
a- Homogalacturonanos: son polímeros lineales de ácido α-1,4- galacturónico (Figura

10), que pueden presentar esterificación en el C-6 y eventualmente estar
acetilados en el C-2 o C-3. Estas pectinas serían sintetizadas con un alto porcentaje
de grupos carboxilos unidos a metilos, lo que permitiría disminuir la repulsión
entre estos polímeros (Carpita y McCann 2000).
b- Ramnogalacturonanos tipo I: son una familia de polisacáridos pécticos que

contienen un esqueleto principal de repeticiones del disacárido [→2)-α-L-
rhamnosa-(1→4)-α-L-ácido galacturónico-(1→]n (Ridley y col. 2001). Entre el 20 y
el 80% de los residuos de ramnosa pueden estar sustituidos en el C-4. Esta
sustitución puede consistir de un único residuo de β-D-galactosa, o de una cadena
polimérica de arabinogalactanos I o arabinanos (Figura 10). Los arabinogalactanos
I están formados por una cadena principal de β-D-galactosa unida por enlaces β-
1,4 y pueden existir eventuales sustituciones de L-arabinosa mediante uniones α-
1,3 (Ridley y col. 2001). Los arabinanos están compuestos por una cadena
principal de α-1,5-L-arabinosa que puede estar sustituida con α-L-arabinosa-
(1→2)-α-L-arabinosa-(1→3) y/o α-L-arabinosa-(1→3)-α-L-arabinosa-(1→3) (Ridley
y col. 2001). De esta manera, existirían regiones en los ramnogalacturonanos tipo I
que poseen numerosas cadenas laterales de arabinogalactanos y arabinanos,
formando regiones altamente ramificadas (“hairy”) de las pectinas (Vincken y col.
2003).
35
Ac. galacturónico Ramnosa
Homogalacturonano Ramnogalacturonano I Ramnogalacturonano II
Figura 10: Principales monómeros y conformación estructural de diferentes

tipos de pectinas. Adaptado de Sarkar y col. (2009).
c- Galacturonanos sustituidos: son un grupo diverso de polisacáridos que contienen

una cadena principal lineal de moléculas de ácido α-D-galacturónico unidas por
enlaces α-1,4 (Ridley y col. 2001). Dentro de este grupo de pectinas se encuentran
los ramnogalacturonanos tipo II (Figura 10), que se encuentran ampliamente
distribuidos en las paredes celulares primarias de las plantas superiores (O'Neill y
col. 2004). Estos polisacáridos son parecidos a los homogalacturonanos pero
poseen cadenas laterales complejas formadas por diferentes tipos de azúcares
neutros (Brummell y Harpster 2001). También pertenecen a este grupo de
galacturonanos sustituidos los xilogalacturonanos, que contienen residuos de β-D-
xilosa unidos al C-3 de la cadena principal (Ridley y col. 2001).
1.1.4. Proteínas estructurales

Son los componentes de la pared celular menos estudiados y menos abundantes.
Algunas de estas proteínas se encuentran altamente glicosiladas (Brummell y Harpster
2001). Se las clasifica en tres tipos diferentes de acuerdo a la abundancia de ciertos
aminoácidos en: HPGP (glicoproteínas ricas en hidroxiprolina), PGP (glicoproteínas ricas
en prolina) y GGP (glicoproteínas ricas en glicina) (Carpita y McCann 2000).
36
1.2. Estructura de la pared celular
Lámina
media
Pectinas
Pared celular
primaria
Celulosa
Membrana
plasmática
Hemicelulosas
Figura 11: Modelo aceptado de la pared celular, adaptado de Smith (2001). Se

aprecian las hemicelulosas (líneas de color rojo) entrecruzando microfibrillas
de celulosa (cilindros de color celeste). Las pectinas (líneas irregulares de color
negro) se disponen ocupando los espacios entre la red celulosa-hemicelulosa.
Por sobre la pared celular primaria se observa la lámina media.
Distintos modelos han sido propuestos para explicar la distribución de los

polisacáridos en la pared celular. En el más aceptado, la pared celular estaría formada por
moléculas de xiloglucanos unidas por puentes de hidrógeno a regiones específicas de las
microfibrillas de celulosa, formando de esta manera una red de celulosa-xiloglucano. A su
vez, esta red estaría embebida en una matriz de pectinas que incluye otros componentes
menos abundantes como compuestos fenólicos, proteínas estructurales, enzimas, etc.
(Figura 11) (Cosgrove 2001).
1.3. Proteínas que modifican la pared celular

Durante la maduración de los frutos se producen una serie de cambios, entre los
que se encuentra la pérdida de firmeza de los mismos, provocada principalmente por el
desensamblaje de la pared celular. Aunque existen mecanismos no-enzimáticos mediados
37
por radicales libres que pueden estar implicados en esta degradación (Fry y col. 2001),
está ampliamente aceptado que la principal responsabilidad corresponde a la acción de
enzimas y proteínas que modifican polisacáridos y que son secretadas hacia el apoplasto.
A continuación se describen las proteínas que han sido mejor caracterizadas.
1.3.1. Poligalacturonasas (PGs)

Las poligalacturonasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de las uniones α-1,4
entre residuos de ácido galacturónico presentes en las pectinas (Figura 12). Existen tanto
exo- (EC 3.2.1.67) como endo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.15). Las exo-PGs remueven
unidades simples de ácidos galacturónicos de los extremos de los ácidos
poligalacturónicos, mientras que las endo-PGs cortan enlaces internos de estos polímeros
al azar (Brummell y Harpster 2001). El principal sustrato de PG en la pared celular son los
homogalacturonanos, los que son secretados al apoplasto con un alto grado de
metilesterificación del grupo carboxilo. Dado que PG actúa principalmente sobre el
sustrato demetilado, sería necesaria la acción previa de pectin metilesterasas para
remover un cierto número de grupos metilo presentes en la pectina antes de que pueda
actuar dicha enzima (Carpita y McCann 2000). En el caso particular de frutilla, durante
muchos años no se pudo detectar actividad PG por lo cual se concluyó que esta actividad
enzimática estaba ausente en este fruto. Sin embargo, Nogata y col. (1993) detectaron
actividad PG en la variedad Toyonoka y lograron purificar tres isoformas de la enzima
(una endo- y dos exo-PGs). También existen controversias con respecto a la expresión de
genes que codifican para PGs. Redondo-Nevado y col. (2001) caracterizaron un gen de
frutilla, al que denominaron sPG, que codificaría para una endo-poligalacturonasa
putativa, que se expresaba en el estadio blanco del cultivar Chandler. Posteriormente, se
analizó la expresión de dos ARNm (FaPG1 y T-PG) provenientes de la transcripción de sPG,
los cuales fueron detectados en diferentes estadios de las distintas variedades de frutilla
analizadas (Villarreal y col. 2007). De estos dos transcriptos, FaPG1 codificaría para una
PG activa mientras que T-PG corresponde a una versión truncada que carecería de
actividad PG, y que se acumuló preferentemente durante la maduración de cultivares que
producen frutos más firmes. El tratamiento de los frutos con ácido α-naftalenacético
(NAA) redujo la expresión de ambos genes, a la vez que provocó una disminución en la
cantidad de la proteína PG y en la actividad poligalacturonasa total (Villarreal y col. 2009).
38
De esta manera, la expresión de estos genes estaría regulada negativamente por auxinas,
al igual que ocurre con un gran número de genes que se expresan durante la maduración
de este fruto no-climatérico, incluidos varios que codifican para enzimas de degradación
de la pared celular. En un reciente trabajo se describió otra PG de frutilla denominada
FaPG2, pero a diferencia de FaPG1 su expresión no se modificó a partir del estadio
blanco. En el mismo trabajo se construyeron plantas transgénicas con una secuencia anti-
sentido de FaPG1, y el análisis de los componentes de pared de estas plantas indicaron
que, a diferencia de lo que se creía en un principio, FaPG1 tendría un rol relevante en el
ablandamiento de frutilla (Quesada y col. 2009).
1.3.2. Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2)

El metabolismo de pectinas también puede estar mediado por la acción de
pectato liasas (PLs). Estas enzimas actúan en los mismos sitios en que lo hace PG (Figura
12), pero el mecanismo de reacción es diferente. La pectato liasa cataliza una reacción de
β-eliminación que introduce una insaturación entre los carbonos C4-C5 en el extremo no
reductor del producto de reacción (Sozzi y Civello 2005). En frutilla, se clonaron tres genes
Endo poligalacturonasa
Pectin metilesterasa
-α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)- AG -α(1→4)-
Exo poligalacturonasa Pectato liasa
Ácido D-galacturónico, algunos se muestran

AG metil esterificados ( )
Figura 12: Principales enzimas que actúan sobre el homogalacturonano.

Algunos residuos de ácido galacturónico se encuentran metil esterificados.
Adaptado de Somerville y col. (2004).
que codifican para pectato liasa: plA, plB y plC (Benítez-Burraco y col. 2003). Los tres
transcriptos se expresaron específicamente en fruto, aumentando durante la maduración.
Si bien la actividad PL no ha podido detectarse en frutilla hasta el momento, plantas
39
transgénicas que sobreexpresan constitutivamente la secuencia antisentido de la plC

rindieron frutos con mayor firmeza, menor solubilización y depolimerización de pectinas y
un mayor grado de contacto entre células vecinas que los controles sin transformar
(Jiménez-Bermúdez y col. 2002; Santiago-Domenech y col. 2008; Youssef y col. 2009).
1.3.3. Pectin metilesterasas (PMEs, EC 3.1.1.11)

Estas enzimas provocan la demetilación de pectinas al catalizar la hidrólisis de
metil-ésteres del C-6 de residuos de ácido galacturónico (Figura 12). La demetilación de
pectinas genera grupos carboxilos libres, lo que conduce a un cambio en el pH y en la
carga eléctrica de la pared celular, facilitando la formación de puentes de calcio y de esta
manera refuerza la estructura de la pared. Sin embargo, la eliminación de grupos metilos
de las pectinas también permite un mayor acceso de otras enzimas de degradación de
pectinas como las poligalacturonasas, lo cual tiende a debilitar la pared celular (Brummell
y Harpster 2001). En frutilla se detectó actividad PME en frutos en distintos grados de
madurez. La actividad enzimática se incrementa durante la maduración, excepto en
estadios sobremaduros en los cuales se observa un descenso (Barnes y Patchett 1976;
Draye y Van Cutsem 2008). De este modo, la actividad PME genera un aumento de la
cantidad de pectinas ácidas presentes en la pared celular (Draye y Van Cutsem 2008). En
plantas, las PMEs existen como familias multigénicas cuyos miembros poseen diferentes
patrones de expresión. Castillejo y col. (2004) caracterizaron y clonaron cuatro genes que
corresponden a PMEs de frutilla, denominados FaPE1, FaPE2, FaPE3 y FaPE4, pero sólo
uno de ellos se expresa exclusivamente en fruto y de manera asociada a la maduración.
1.3.4. Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207)

Las XETs hidrolizan las cadenas principales β-1,4-glucano de los xiloglucanos
(actuando como donante) y transfieren el fragmento que contiene el extremo reductor
generado a otro polímero de xiloglucano (que actúa como aceptor) o a oligasacáridos
resultantes de la acción de endoglucanasas sobre el xiloglucano (Sozzi y Civello 2005). Se
detectó actividad XET en varios frutos, entre los cuales se encuentran tomate (Maclachlan
y Brady 1994), kiwi (Redgwell y Fry 1993; Percy y col. 1996) y manzana (Percy y col. 1996).
La distribución de la actividad de esta enzima en el kiwi es bastante heterogénea, y se
observan diferentes niveles de actividad en distintas zonas del fruto. Además, se hallaron
40
altos niveles de actividad en estadios tempranos del desarrollo, lo cual coincide con el
período en el cual se produce una gran expansión celular (Percy y col. 1996). En tomate se
generaron líneas de plantas transgénicas con expresión de genes XET antisentido para
genes XET que normalmente se expresan en los primeros estadios del desarrollo del fruto
y comienzo de la maduración, y se obtuvieron frutos más pequeños, hecho que
concuerda con la suposición de que XET intervendría en la expansión celular y en el
crecimiento del fruto (Asada y col. 1999). En cambio, cuando se analizaron líneas
antisentido para un gen XET específico de la maduración, los frutos obtenidos no
presentaron diferencias de firmeza con respecto a los controles (Brummell y Harpster
2001). En frutilla no se han descripto hasta el momento ni actividad ni expresión XET.
1.3.5. Expansinas (EXPs)

Las expansinas son miembros de una familia de pequeñas proteínas (25-27 kD)
que actuarían causando la ruptura reversible de los puentes de hidrógeno entre
microfibrillas de celulosa y glicanos no celulósicos, particularmente xiloglucanos, lo cual
permitiría la relajación de la pared celular (McQueen-Mason y Cosgrove 1994). Se
describieron dos familias de expansinas denominadas α- y β-expansinas que son capaces
de actuar del modo descrito sobre los componentes de la pared celular, pero que difieren
en su identidad de secuencia de aminoácidos (Cosgrove 1999). De esta manera, estas
proteínas han sido asociadas a procesos que involucran crecimiento y/o expansión
celular, tales como elongación de hipocótilos (McQueen-Mason y col. 1992) o coleóptilos
(Cosgrove y Li 1993), desarrollo de hojas jóvenes (Keller y Cosgrove 1995) y desarrollo y
maduración de frutos (Rose y col. 1997; Brummell y col. 1999; Civello y col. 1999; Hiwasa
y col. 2003). En frutilla se han descripto y caracterizado siete expansinas (Civello y col.
1999; Harrison y col. 2001), de las cuales FaEXP2 y FaEXP5 se expresan mayoritariamente
en frutos y su expresión aumenta a medida que avanza la maduración. Asimismo, se
observó que la expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5 es más temprana e intensa en
variedades con menor firmeza, lo que indicaría una correlación entre la expresión de
estos genes y el ablandamiento de frutilla (Dotto y col. 2006).
41
1.3.6. Endo-1,4-β-D glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4)

Las EGasas hidrolizan uniones internas de residuos de glucósidos unidos por
enlaces β-1,4 (Figura 13). Frecuentemente se hace referencia a estas enzimas como
celulasas, pero esto no es correcto en el caso de las plantas superiores, ya que las
endoglucanasas provenientes de estas fuentes carecen de la capacidad de degradar
celulosa cristalina. In vitro, son capaces de hidrolizar xiloglucanos, celulosa no cristalina y
un derivado soluble de la celulosa, carboximetilcelulosa (CMC) (Hatfield y Nevins 1986).
En la pared celular, sus posibles sustratos serían xiloglucanos y segmentos de celulosa no-
cristalina (Brummell y Harpster 2001). En frutilla han sido clonados dos genes que
codifican para EGasas. Uno de ellos, Cel1, se expresó específicamente en el fruto, su nivel
de expresión se incrementó durante la maduración, y además esta expresión fue
fuertemente reprimida por auxinas (Harpster y col. 1998). El segundo gen, Cel2, fue
detectado en frutos maduros, pero también en frutos verdes y tejidos vegetativos
(Trainotti y col. 1999; Llop-Tous y col. 1999). Posteriormente, se generaron plantas
transgénicas con una fuerte supresión de la expresión de Cel1 y de la actividad enzimática
EGasa total, pero que no observaron diferencias en el ablandamiento de los frutos
respecto a plantas controles (Wooley y col. 2001; Palomer y col. 2006). Dado que la
expresión de Cel2 no fue alterada en estas plantas transgénicas, los autores sugirieron
que el producto de Cel2 podría ser suficiente para compensar la falta de expresión de
Cel1. Sin embargo, cuando se obtuvieron plantas antisentido del gen Cel2 (también
denominado FaEG3), los frutos presentaron un mayor contenido de hemicelulosas de alto
peso molecular pero su firmeza tampoco difería con respecto a la de frutos controles
(Mercado y col. 2010).
42
Gal Gal
-β(1→2)-
-β(1→2)-
β-galactosidasa
Xil Xil Xil Xil Xil
-α(1→6)-
-α(1→6)-
-α(1→6)-
-α(1→6)-
-α(1→6)-
α-xilosidasa
-β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)-
Endo β-1,4-glucanasa
Glu D-glucosa Xil D-xilosa Gal D-galactosa
Figura 13: Esquema del xiloglucano incluyendo los sitios de acción de algunas
de las enzimas que lo modifican. Adaptado de Somerville y col. (2004).
1.3.7. β-D-galactosidasas (β-gals, EC 3.2.1.23)

Estas enzimas catalizan la hidrólisis de residuos β-D-galactosilos terminales de los
extremos no reductores de β-D-galactósidos (Lashbrook 2005). Los sustratos de estas
enzimas serían β-1,4-galactanos no ramificados presentes en las cadenas laterales de los
ramnogalacturonanos tipo I (Figuras 14) y residuos β-D-galactosilo pertenecientes a
sustituciones que poseen los xiloglucanos (Figura 13). En frutilla se han caracterizado tres
genes que codificarían para β-Gals, Faβgal1, Faβgal2 y Faβgal3 (Trainotti y col. 2001). Los
tres genes pudieron ser detectados tanto en frutos como en tejidos vegetativos, pero solo
la expresión de Faβgal1 aumentó con el transcurso de la maduración. La actividad β-Gal
se estudió únicamente en el cultivar Chandler, y la misma fue indetectable o muy baja en
estadios de desarrollo, pero aumentó notablemente al comenzar la maduración del fruto
(Trainotti y col., 2001).
43
-α(1→2)- Rha -α(1→4)- AG -α(1→2)- Rha -α(1→4)- AG -α(1→2)- Rha -α(1→4)- AG -α(1→2)- Rha -α(1→4)- AG -α(1→2)-
-α(1→4)-
-β(1→4)-
-β(1→4)-
β-galactosidasa
Ara Gal Gal
-α(1→5)-
-β(1→4)-
Ara Ara -α(1→3)- Gal
-α(1→5)-
-β(1→4)-
arabinano arabinogalactano
Ara -α(1→3)- Ara -α(1→3)- Ara Gal
-α(1→5)-
-β(1→4)-
α-L-arabinofuranosidasa Ara Ara -α(1→3)- Gal
-α(1→5)-
-β(1→4)-
Rha L-ramnosa AG Ácido D-galacturónico Gal D-galactosa Ara L-arabinosa
Figura 14: Representación esquemática del ramnogalacturonano I, junto con

el sitio de acción de algunas enzimas intervinientes en su modificación.
Adaptado de Somerville y col. (2004).
1.3.8. α-L-arabinofuranosidasas (α-L-aras, EC 3.2.1.55)

Las enzimas α-L-aras son exo-hidrolasas que participan en la remoción de residuos
terminales α-L-arabinofuranosilos no reductores de varios homopolisacáridos
(arabinanos) y heteropolisacáridos (arabinogalactanos, arabinoxilanos,
arabinoxiloglucanos, glucuronoarabinoxilanos, etc.) de polímeros pécticos y
hemicelulósicos, y de distintos glucoconjugados (Sozzi y Civello 2005). A modo de
ejemplo, se ilustra su acción sobre RG I y glucoarabinoxilanos en las figuras 14 y 15,
respectivamente. La actividad α-L-ara ha sido determinada durante la maduración de
diferentes frutos, como por ejemplo pera japonesa (Tateishi y col. 1996; Tateishi y col.
2005), manzana (Yoshioka y col. 1995; Goulao y col. 2007), durazno (Brummell y col.
2004; Jin y col. 2006), tomate (Sozzi y col. 2002; Itai y col. 2003) y banana (Zhuang y col.
2007). En el caso de frutilla, se reportó recientemente el clonado de tres genes completos
que codificarían para diferentes isoformas de la enzima. El análisis de la expresión al nivel
de ARNm indicó que los tres genes se expresan tanto durante el desarrollo como en la
maduración del fruto. Este perfil de expresión no coincide totalmente con el patrón de
44
actividad enzimática, dado que no se pudo detectar actividad en los estadios más
inmaduros. La actividad de la enzima aumentó gradualmente a través de la maduración, y
se hallaron niveles de actividad más altos en la variedad Toyonoka que posee una mayor
tasa de ablandamiento (Rosli y col. 2009).
1.3.9. β-D-xilosidasas (β-xils, EC 3.2.1.37)

Estas enzimas son capaces de hidrolizar enlaces terminales β-1,4 entre residuos de
xilosa del extremo no reductor de xilo-oligosacáridos (Cleemput y col. 1997). De este
modo, las β-D-xilosidasas usarían como sustrato a los productos originados por la acción
de las xilanasas sobre los xilanos (Figura 15). Se ha descripto la presencia de actividad β-xil
en frutos como palta (Ronen y col. 1991), frutos de carozo (Bouranis y Niavis 1992),
tomate (Itai y col. 2003), oliva (Fernández-Bolaños y col. 1995) y pera japonesa (Itai y col.
1999). En el caso particular de frutilla, se detectó la actividad de la enzima en todos los
estadios de maduración del fruto. Asimismo, un gen que codifica para una β-xilosidasa
putativa (FaXyl1) fue clonado y se determinó que su expresión estaba
predominantemente asociada a los tejidos del receptáculo (Martínez y col. 2004). Un
análisis posterior de la expresión y actividad enzimática en diferentes variedades de
frutilla indicó que existía una acumulación mayor y más temprana de β-xilosidasa en la
variedad que presentaba la mayor reducción de firmeza durante la maduración del fruto
(Bustamante y col. 2006).
AGl xilanasa Ara

-α(1→2)-
-α(1→2)-
α-L-arabinofuranosidasa
Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)-
β-xilosidasa
AGl Ácido D-glucurónico Xil D-xilosa Ara L-arabinosa
Figura 15: Representación esquemática del (glucoronoarabino) xilano y de los

posibles sitios de acción de las enzimas más caracterizadas que están
involucradas en su modificación. Adaptado de Somerville y col. (2004).
45
1.3.10. Endo-β-1,4-D-xilanasas (Xasas, EC 3.2.1.8)

Estas enzimas son responsables de la hidrólisis interna de los enlaces β-1,4 entre
residuos de xilosa que forman parte de los xilanos (Figura 15), principalmente en las zonas
donde éstos no se encuentran sustituidos por residuos de arabinosa (Cleemput y col.
1997). La actividad de esta enzima fue detectada en frutos maduros de palta, y su
actividad no varió durante un período de almacenamiento de 8 días (Ronen y col. 1991).
En papaya se aisló un gen que codificaría para una Xasa (CpaEXY1). La comparación de la
expresión de este gen en tres variedades diferentes de este fruto, mostró una mayor
acumulación de mensajero, proteína y actividad enzimática durante la maduración de la
variedad más blanda (Manenoi y Paull 2007). Hasta el momento, no se ha descripto
actividad o expresión Xasa en frutilla.
46
CAPÍTULO I: RESULTADOS
2. Resultados
2.1. Comparación de la firmeza en frutos controles y tratados con UV-C

Como se describió anteriormente, uno de los cambios más importantes que
ocurren durante la maduración de frutilla, y que es uno de los principales determinantes
de su breve vida postcosecha, es el ablandamiento o cambio en la textura del fruto. Por
esta razón, se decidió analizar el efecto de la radiación UV-C sobre este parámetro de
calidad. Para ello se cosecharon frutos en el estadio de madurez 50% rojo y se separaron
en dos lotes, uno de los cuales fue irradiado con UV-C y el otro dejado como control. A
continuación, los frutos se almacenaron durante 4 d a 20 °C, evaluándose la firmeza de
los frutos durante este período.
3,8
Control
3,6 UV-C
**
3,4 **
3,2 **
Firmeza (N)
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
0 2 3 4
Días a 20 ºC
Figura 16: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la firmeza de frutilla. Se
cosecharon frutillas (50% R) las cuales fueron tratadas con UV-C (4,1 KJ m-2) o
dejadas como controles sin tratar. Después, todos los frutos se almacenaron a
20 °C y se midió la firmeza a diferentes tiempos (0, 2, 3 y 4 días post-
irradiación). El doble asterisco indica que los valores son estadísticamente
diferentes de su correspondiente control a P<0,01.
Al analizar los datos obtenidos, pudimos observar un descenso en la firmeza

durante el almacenamiento a 20 °C en ambas condiciones, frutos controles y tratados. Sin
embargo, los frutos no irradiados mostraron un ablandamiento prematuro respecto a los
47
tratados con UV-C (Figura 16). Inmediatamente después de la irradiación (0 h), las
diferencias en los valores de firmeza no fueron significativas entre los frutos controles y
los tratados. Por el contrario, después de 2, 3 y 4 días de almacenamiento a 20 °C, los
frutos irradiados permanecieron más firmes que los controles.
2.2. Expresión de genes de degradación de la pared celular y efecto del

tratamiento con UV-C
2.2.1. Expansinas
Para el estudio del efecto del UV-C sobre la expresión de genes de degradación de
la pared celular utilizamos la variedad Aroma. Hasta el momento, no existían datos acerca
de la expresión de expansinas durante la maduración de esta variedad, y dado que en
frutilla los niveles de expresión de genes asociados a maduración son dependientes de la
variedad (Dotto y col. 2006; Bustamante y col. 2006; Villarreal y col. 2007), se decidió
analizar los patrones de FaEXP2 y FaEXP5, dos expansinas específicas de fruto, y de
FaEXP4, expansina que además se expresa en otros tejidos de la planta de frutilla
(Harrison y col. 2001) (Figura 17).
Como se puede observar en la figura 17A, la acumulación de transcriptos en el
caso de FaEXP2 se incrementó fuertemente entre los estadios 25% y 50% rojo, y continuó
aumentando hasta el estadio 100% para finalmente descender en el sobremaduro. En
cambio, el mensajero de FaEXP4 pudo ser detectado en todos los estadios de
maduración, aunque su expresión fue más baja en los estadios inmaduros (VP, VG y BL),
se incrementó en el 25% y alcanzó el nivel más alto en el estadio 75% rojo (Figura 17B). En
el caso de FaEXP5, se detectó una leve señal en el estadio 50% rojo y la misma se
incrementó hasta el final de la maduración (Figura 17C).
48
VP VG BL 25 50 75 100 SM
(A)
FaEXP 2
ARNr 18S
(B)
FaEXP 4
ARNr 18S
(C)
FaEXP 5
ARNr 18S
Figura 17: Expresión de genes de expansina durante la maduración de la

variedad Aroma. (A) FaEXP2 (B) FaEXP4 (C) FaEXP5. Los estadios analizados
(verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo
(50), 75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)) se muestran en la
parte superior y las sondas utilizadas en la parte izquierda de la figura.
Posteriormente, se analizó el efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión

de estos tres genes (FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5) (Figura 18). Se detectaron diferencias en
la expresión de los genes mencionados en frutos controles e irradiados en las primeras
horas post-tratamiento. En el grupo de frutos mantenidos como control se observó un
incremento en los tres transcriptos de expansinas durante las primeras horas después de
la cosecha, mientras que en los frutos tratados con UV-C se encontró una menor
expresión de FaEXP2 y FaEXP5. Este efecto fue claramente visible 4 h después de la
irradiación de los frutos (Figura 18A y C). Una tendencia similar se vio en la expresión de
FaEXP4, pero en menor proporción (Figura 18B). Pasado este tiempo, después de 18 h de
incubación, se observaron los mismos niveles de expresión en las muestras controles y
tratadas, y después de 24 h la expresión en los frutos tratados fue más alta que en los
controles; este efecto fue más marcado en el caso de FaEXP4 (Figura 18B). Finalmente,
después de 48 h a 20 °C, la expresión de las tres expansinas descendió en los frutos
irradiados y permaneció más baja que en sus respectivos controles.
49
0h 4h 18 h 24 h 48 h
(A) C T C T C T C T C T
FaEXP 2
ARNr 18S
(B)
FaEXP 4
ARNr 18S
(C)
FaEXP 5
ARNr 18S
Figura 18: Expresión de genes de expansinas en frutos controles y tratados

con UV-C. (A) FaEXP2; (B) FaEXP4; (C) FaEXP5. Diferentes condiciones (control
(C) y tratados con UV-C (T)) y tiempos de almacenaje a 20 °C (0, 4, 18, 24 y 48
h) se muestran en la parte superior y las sondas utilizadas (FaEXP2, FaEXP4,
FaEXP5 o ARNr 18S) en la parte izquierda de la figura
2.2.2. Expresión de FaCel1 y actividad endo-1,4-β-D-glucanasa

Cuando se analizó la expresión de FaCel1, gen que codifica para una endo-1,4-β-D-
glucanasa putativa de frutilla, se detectó muy baja señal en los estadios blanco y 25% rojo
de la variedad Aroma (Figura 19A). Sin embargo, el mensajero se acumuló gradualmente
hasta el estadio 100% rojo donde la expresión alcanzó el nivel máximo, decreciendo
levemente en el sobremaduro (Figura 19A). Este patrón de expresión encontrado para
FaCel1 en la variedad Aroma es similar a los obtenidos en trabajos previos, en los que se
utilizaron las variedades Selva y Chandler (Harpster y col. 1998; Trainotti y col. 1999; Llop-
Tous y col. 1999).
En la figura 19B se muestran los perfiles de expresión de FaCel1 en frutos
controles e irradiados. En la misma, se puede observar que la irradiación con UV-C redujo
levemente la expresión de este gen desde las 4 hasta las 24 h después del tratamiento.
Por el contrario, se observó una expresión de FaCel1 similar o mayor en los frutos
tratados después de 48 ó 72 h a 20 °C con respecto a los no irradiados.
50
A
VP VG BL 25 50 75 100 SM
FaCel 1
ARNr 18S
B
0h 4h 8h 24 h 48 h 72 h 96 h
C T C T C T C T C T C T C T
FaCel 1
ARNr 18S
Figura 19: Expresión de FaCel1 durante la maduración de frutillas del cultivar

Aroma (A) y después del tratamiento con UV-C (B). En la parte superior de la
figura se indican los estadios analizados (verde pequeño (VP), verde grande
(VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo (50), 75% rojo (75), 100% rojo (100)
y sobremaduro (SM)), y las diferentes condiciones (control (C) y tratado con
UV-C (T)) a distintos tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 8, 24, 48, 72 y
96 h). Las sondas utilizadas (FaCel1 o ARNr 18S) se indican a la izquierda de la
figura.
Para completar los estudios de expresión de FaCel1, decidimos analizar cómo se

comportaba la actividad de la enzima frente al tratamiento con UV-C. Se pudo detectar
actividad endo-β-1,4-glucanasa en ambas condiciones, frutos controles y tratados con UV-
C, en los 3 tiempos de almacenamiento analizados (0, 24 y 48 h; Figura 20). Se detectó
una actividad enzimática significativamente (P<0,05) reducida en los frutos irradiados
después de 24 h de almacenamiento a 20 °C. Luego, la misma decreció en ambos grupos
de frutos controles y tratados, sin observarse diferencias significativas entre ellos.
51
0,025
Control
UV-C
Actividad endo--1,4-glucanasa 0,020
mol s kg )
-1
0,015
-1
**
0,010
0,005
0,000
0 24 48
Tiempo (h)
Figura 20: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad endo-β-1,4-
glucanasa. Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ m-2), y luego se
almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la enzima se
expresó en micromoles de glucosa por segundo y por kilogramo de fruto. El
doble asterisco indica que los valores son estadísticamente diferentes de su
correspondiente control a P<0,01.
2.2.3. Expresión de FaPE1 y actividad pectin-metilesterasa (PME)

En el caso de pectin-metilesterasa, no se pudo detectar ARN mensajero de FaPE1
utilizando la técnica de Northern blot, por lo cual se analizó la expresión de este gen
mediante RT-PCR semicuantitativa. El análisis de la expresión de FaPE1 durante la
maduración de la variedad Aroma indicó la presencia de transcriptos a partir del estadio
blanco (Figura 21A). La expresión del gen decreció en el 25% rojo y alcanzó su nivel más
bajo en el estadio 50%. Luego, la señal detectada aumentó hasta alcanzar niveles
elevados en el estadio 75% que se mantuvieron similares hasta el final de la maduración
(Figura 21A). Estos resultados son similares a los reportados por Castillejo y col. (2004) en
la variedad Chandler, donde también se encontró un doble pico en la expresión de FaPE1
a lo largo de la maduración.
Por otro lado, el perfil de expresión de este gen no mostró importantes diferencias
entre los frutos controles y los tratados durante el almacenamiento. La única diferencia
observada fue una leve disminución en la expresión después de 4 h de finalizada la
52
irradiación. En los restantes tiempo analizados, la expresión del gen permaneció sin
variaciones tanto en controles como en tratados (Figura 21B).
En lo que respecta a la actividad de la enzima, inmediatamente después del
tratamiento (0 h), la actividad PME fue significativamente (P<0,05) más baja en los frutos
irradiados con UV-C con respecto a sus correspondientes controles (Figura 22). No
obstante, después de 24 y 48 h no se encontraron diferencias entre controles y tratados.
A
VG BL 25 50 75 100 SM
FaPE 1
ARNr 18S
B 0h 4h 18 h 24 h 48 h
C T C T C T C T C T
FaPE 1
ARNr 18S
Figura 21: Expresión de FaPE1 durante la maduración de frutillas Aroma (A)

y después del tratamiento con UV-C (B). En la parte superior de la figura se
indican los estadios analizados (verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25),
50% rojo (50), 75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)), diferentes
condiciones (control (C) y tratado con UV-C (T)) y tiempos de almacenamiento
a 20 °C (0, 4, 18, 24 y 48 h). Las sondas utilizadas (FaPE1 o ARNr 18S) se
indican en la parte izquierda de la figura.
53
5
Control
UV-C
4
**
Actividad PME
(mol s kg )
-1
3
-1
0
0h 24 h 48 h
Tiempo (h)
Figura 22: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad pectin-
metilesterasa (PME). Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ m-2), y
luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la enzima
se expresó en micromoles de ácido galacturónico por segundo y por kilogramo
de fruto. El doble asterisco indica que los valores son estadísticamente
2.2.4. Expresión de FaPG1 y actividad poligalacturonasa

La expresión de FaPG1 fue muy baja en todos los estadios de maduración
analizados del cultivar Aroma. Cabe destacar, que se debieron utilizar membranas
conteniendo el doble de ARN (20 μg, ver Materiales y Métodos 6) de lo utilizado en el
resto de los ensayos de expresión. A pesar de esto, sólo se encontraron transcriptos de
FaPG1 principalmente en los frutos de estadio 100% rojos, aunque también se detectó
una leve señal en el estadio 50% y 75% rojo (Figura 23A).
54
A
VP VG BL 25 50 75 100 SM
FaPG 1
ARNr 18S
B
0h 4h 8h 24 h 48 h 72 h 96 h
C T C T C T C T C T C T C T
FaPG 1
ARNr 18S
Figura 23: Expresión de FaPG1 durante la maduración de Aroma (A) y

después del tratamiento con UV-C (B). Los estadios analizados (verde
pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25), 50% rojo (50),
75% rojo (75), 100% rojo (100) y sobremaduro (SM)), diferentes condiciones
(control (C) y tratado con UV-C (T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4,
8, 24, 48, 72 y 96 h) se muestran en la parte superior de la figura. Las sondas
utilizadas (FaPG1 o ARNr 18S) se muestran en la parte izquierda de la figura.
De modo similar a lo realizado para los otros genes de pared, frutos en el estadio
50% rojo se irradiaron con UV-C, y se analizó posteriormente el efecto sobre la expresión
de FaPG1 (Figura 23B). En este caso, los frutos controles mostraron baja expresión
durante las primeras 24 h a 20 °C, excepto por un leve incremento después de las 8 h.
Posteriomente, el nivel de transcriptos FaPG1 permaneció aproximadamente constante
durante las restantes 96 h de almacenamiento (Figura 23B). De manera contraria a lo
observado para los controles, la expresión del gen en los frutos tratados fue baja durante
las primeras 8 h después de la irradiación, pero se incrementó a un nivel más elevado que
los controles después de 48 h de almacenamiento. Finalmente, a las 72 y 96 h, la
expresión en frutos controles y tratados permaneció en niveles similares.
En cuanto a la actividad de la enzima, en el caso de PG, el tratamiento no afectó
significativamente su actividad en las primeras 24 h después de la irradiación. Sin
embargo, después de 48 h de almacenamiento a 20 °C, la actividad PG se redujo a la
mitad en los frutos tratados con respecto a los valores obtenidos en el control (Figura 24).
55
0,005
Control
UV-C
0,004
Actividad PG total
(mol s kg )
-1
0,003
-1
0,002
0,001
0,000
0 24 48
Tiempo (h)
Figura 24: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad
poligalacturonasa total (PG). Se irradiaron frutillas (50% R) con UV-C (4,1 KJ
m-2), y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 24 y 48 h. La actividad de la
enzima se expresó en micromoles de ácido galacturónico por segundo y por
kilogramo de fruto. El asterisco indica que los valores son estadísticamente
56
CAPÍTULO I: DISCUSIÓN
3. Discusión
La degradación de la pared celular ha sido considerada el principal factor
involucrado en el ablandamiento de los frutos carnosos. Esta degradación de los
componentes de la pared celular está relacionada con la acción de diversas enzimas y
proteínas que actúan sobre la misma (Brummell y Harpster 2001). En frutilla, estudios
realizados en los que se compararon diferentes variedades que poseen firmeza
contrastante, revelaron que existen diferencias en el metabolismo de la pared celular,
principalmente en la depolimerización y solubilización de pectinas (Rosli y col. 2004), y en
la expresión de genes que modifican la pared celular en las distintas variedades (Salentijn
y col. 2003). En particular, se reportaron datos que indican que existe una correlación
entre una expresión más alta y temprana de tres genes de expansinas que se expresan en
frutos, FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5, con un mayor ablandamiento de los mismos (Dotto y
col. 2006).
En este trabajo se utilizaron frutillas de la variedad Aroma, cuya firmeza varía
desde 3,4 N en el estadio 50% rojo hasta 2,9 N en el estadio 100% rojo (Figura 16), lo cual
indica que la variedad produce frutos bastante firmes, con valores de firmeza intermedios
entre los correspondientes a las variedades Selva y Camarosa, estudiadas previamente en
nuestro laboratorio (Dotto y col. 2006). Dado que los perfiles de expresión de este tipo de
genes durante la maduración dependen de la variedad analizada, y que no existían datos
bibliográficos, primero se analizó la expresión de los genes de interés durante la
maduración de frutos de la variedad Aroma. La expresión de FaEXP2 y FaEXP5 es
específica del fruto y se incrementa en los estadios tardíos de maduración (Civello y col.
1999; Harrison y col. 2001), mientras que FaEXP4 se expresa no sólo en el fruto sino
también en otros tejidos de la planta (Harrison y col. 2001). En la figura 17, se puede
observar que la expresión de FaEXP2 y FaEXP5 en la variedad Aroma se incrementó
durante la maduración, mientras que el mensajero de FaEXP4 pudo ser detectado en
todos los estadios desde el verde pequeño (VP) hasta el sobremaduro (SM) con leves
diferencias de intensidad entre ellos. De esta manera, se podría decir que los perfiles de
expresión de los genes de expansinas analizados en este trabajo, son similares a aquellos
reportados para Selva, otro cultivar firme con baja tasa de ablandamiento (Dotto y col.
2006). Además de las expansinas, se analizaron los patrones de expresión de otras tres
enzimas de degradación de la pared celular. En el caso de FaCel1, sus transcriptos son
57
detectables tempranamente en el desarrollo del fruto en el estadio blanco (BL) y se

acumulan hasta su nivel máximo en el 100% rojo (figura 19A). Este patrón de expresión
coincide con los obtenidos para otras variedades de frutilla (Harpster y col. 1998; Trainotti
y col. 1999; Llop-Tous y col. 1999). El análisis de la expresión de FaPE1, en este caso por
RT-PCR semicuantitativa, indicó la presencia de dos picos de acumulación de transcriptos,
uno en el estadio blanco y otro en el 100% rojo (Figura 21A). Este resultado concuerda
con los obtenidos para una variedad más blanda, denominada Chandler (Castillejo y col.
2004). Por último, los transcriptos de FaPG1 fueron casi indetectables en los estadios 50%
y 75% rojo y sólo se observó una señal clara en el 100% (Figura 23A). El gen de FaPG1 fue
aislado a partir de una biblioteca de ADN complementario construida a partir de frutos de
la variedad Chandler (Villarreal y col. 2007), y su secuencia es homóloga a la del clon
genómico spG (Redondo-Nevado y col. 2001) y a la del ADNc denominado D15 (Salentijn y
col. 2003). Estas tres secuencias son casi idénticas, lo que sugiere que pertenecen al
mismo gen, pero los patrones de expresión reportados difieren sustancialmente.
Mientras Redondo-Nevado y col. (2001) detectaron expresión de spG solamente en el
estadio blanco y sugieren que el gen podría estar involucrado en la producción de
oligosacarinas en vez de en la degradación de pectinas, tanto la expresión de D15 como la
de FaPG1 se incrementan durante la maduración en cuatro cultivares diferentes de
frutilla (Salentijn y col. 2003; Villarreal y col. 2007). Además, los niveles más altos de
transcriptos se encontraron en las variedades más blandas (Salentijn y col. 2003; Villarreal
y col. 2007). De esta manera, la baja expresión de FaPG1 que encontramos en la variedad
Aroma correlaciona con la firmeza alta encontrada en este cultivar, y está de acuerdo con
la idea de que la actividad de PG tiene un rol determinante en la firmeza de frutilla, a
diferencia de lo que se creía anteriormente.
Por otro lado, en diversos trabajos se ha detectado que el tratamiento con UV-C
retrasa la maduración y mantiene la firmeza durante la postcosecha de frutos de distintas
especies. En durazno, por ejemplo, la irradiación con UV-C redujo el ablandamiento de los
frutos durante el almacenamiento a 5 °C seguido de 7 días a 20 °C (Gonzalez-Aguilar y col.
2004). Similares resultados se obtuvieron en pimiento (Vicente y col. 2005b), tomate
(Maharaj y col. 1999; Barka y col. 2000) y boysenberry (hibrido de Rubus) (Vicente y col.
2004). En el caso de frutilla, diferentes dosis de UV-C (1 y 4,1 KJ/m2) redujeron el
ablandamiento de los frutos en las variedades Kent y Seascape, respectivamente (Baka y
58
col. 1999; Pan y col. 2004). Los experimentos realizados en el presente trabajo se llevaron
a cabo irradiando frutos (50% rojo) con una dosis de UV-C de 4,1 KJ m-2, y evaluando
posteriormente los efectos del tratamiento durante 4 días de almacenamiento a 20 °C.
Cuando se compararon estos frutos con sus respectivos controles, se encontró que las
frutillas tratadas permanecían más firmes. Para poder estudiar cuál era el efecto del UV-C
sobre el ablandamiento de los frutos a nivel molecular, analizamos qué ocurría con las
enzimas involucradas en la degradación de la pared celular durante la maduración. En
tomate, Barka y col. (2000) reportaron que el incremento de actividad de un grupo de
enzimas que degradan pared celular (poligalacturonasa, pectin-metilesterasa, celulasa,
xilanasa y β-D-galactosidasa) durante el almacenamiento, se redujo significativamente en
los frutos tratados con UV-C. Los mismos autores sugirieron que el retraso en el
ablandamiento en los frutos irradiados podría ser debido a una menor degradación de la
pared celular, y que estas enzimas eran los posibles blancos de la irradiación con UV-C.
Hasta el momento, muy pocos estudios han analizado el problema a nivel de expresión de
proteínas en frutos, y ninguno a nivel de acumulación de transcriptos.
Tal como se describió previamente, el tratamiento con UV-C afectó la expresión
de tres genes de expansinas (FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5). Además, algunas de las
diferencias encontradas entre los controles y los frutos irradiados se observaron al
comienzo del experimento. Los frutos controles mostraron un incremento de los tres
transcriptos de expansinas durante las primeras horas después de la cosecha. En cambio,
el tratamiento con UV-C previno dicho incremento de la expresión de las tres expansinas.
Particularmente, el efecto fue visible para la expresión de FaEXP2 y FaEXP5, 4 h después
de la exposición a la luz UV-C (Figura 18). Estos dos genes de expansinas (FaEXP2 y
FaEXP5) se expresan específicamente durante la maduración de frutos, de manera que
existe una correlación positiva entre sus niveles de expresión y el ablandamiento de los
frutos (Dotto y col. 2006). Hasta el momento se ha postulado que las expansinas
contribuyen a la relajación de la pared celular mediante la ruptura de los puentes de
hidrógeno que existen entre las microfibrillas de celulosa y los xiloglucanos (Brummell y
Harpster 2001). Esta acción también facilitaría el acceso de enzimas que degradan la
pared celular a sus sustratos naturales, incrementando el ablandamiento del fruto (Rose y
col. 1997). De esta manera, la reducción en la expresión de genes de expansinas
provocada por el tratamiento con UV-C podría disminuir el efecto de estas proteínas
59
sobre la pared celular y, por otro lado, retrasar el acceso de otras enzimas a sus
respectivos sustratos presentes en la pared celular.
A diferencia de lo observado para las expansinas, el efecto de la irradiación sobre
la expresión de FaCel1 fue más duradero, ya que se redujeron los niveles de transcriptos
aun después de 24 horas de almacenamiento (Figura 19B). Después de transcurrido este
tiempo, el nivel de expresión del gen se incrementó con respecto a sus respectivos
controles. En cambio, la medición de la actividad enzimática reveló que la irradiación
redujo la actividad endoglucanasa después de 24 h de almacenamiento, aunque la
actividad fue similar en frutos controles y tratados después de 48 h a 20 °C (Figura 20). En
tomate, el tratamiento con UV-C disminuyó la actividad endoglucanasa durante el
almacenamiento (Barka y col. 2000), lo que podría llevar a una menor modificación de los
xiloglucanos, ya que ha sido propuesto que la enzima endo-β-1,4-glucanasa actúa in vivo,
degradando xiloglucanos y celulosa no cristalina (Llop-Tous y col. 1999).
La de-esterificación de poliurónidos por las pectinesterasas puede incrementar la
rigidez de la pared celular debido a que provee de nuevos sitios de interacción para el ión
Ca+2, favoreciendo la agregación de poliurónidos formando una estructura de tipo gel. Sin
embargo, esta misma de-esterificación hace que los poliurónidos sean más suceptibles a
la degradación por enzimas pectinolíticas, tales como poligalacturonasa y pectato liasa
(Brummell y Harpster 2001), ya que estas enzimas actúan preferentemente sobre
sustratos demetilados. En nuestro trabajo analizamos la expresión del gen fruto
específico FaPE1 utilizando la técnica de RT-PCR semicuantitativa. La expresión fue
levemente afectada por la irradiación, decreciendo los niveles de transcriptos sólo
después de 4 h de irradiados los frutos (Figura 21B). Los frutos tratados también
mostraron una menor actividad PME inmediatamente después del tratamiento (Figura
22). De esta manera, la leve reducción de la expresión de FaPE1 en los frutos tratados
después de la irradiación, junto con la reducción en la actividad PME, podría disminuir la
afinidad por sus sustratos de otras enzimas que modifican la pared celular, contribuyendo
a reducir el ablandamiento del fruto.
En cuanto a FaPG1, la expresión observada de este gen es muy baja en la variedad
Aroma, en concordancia con lo hallado en otras variedades firmes como Selva y Camarosa
(Villarreal y col. 2007). La irradiación con UV-C modificó la expresión de FaPG1 de forma
variada, en algunos tiempos de almacenamiento la expresión se incrementó en los frutos
60
tratados (24 y 48 h) y en otros decreció (8 h) (Figura 23B). Este patrón encontrado para la
expresión del gen, no correlaciona con el efecto del tratamiento sobre la actividad de la
enzima (Figura 24). La irradiación no modificó la actividad PG incluso hasta 24 h después
del tratamiento, pero después de 48 h los frutos tratados exhibieron una menor
actividad. Con respecto a la sonda utilizada para el análisis de FaPG1, la misma reconoce,
en otros cultivares, no solo a FaPG1 sino también a T-PG. Este último codifica para un
mensajero más corto (idéntica a FaPG1 excepto por 85 pb) que resultaría en una proteína
truncada carente de actividad PG y que se acumula en las variedades más firmes
(Villarreal y col. 2007). Además, recientes reportes mostraron la existencia de otro gen
correspondiente a una poligalacturonasa de frutilla (FaPG2) cuyo mensajero también se
acumula durante la maduración del fruto (Quesada y col. 2009). La existencia de varios
mensajeros diferentes podría explicar, al menos parcialmente, la falta de correlación
entre la actividad enzimática y los datos de transcripción. Cabe destacar, que cuando
medimos actividad PG total estamos detectando tanto las exo- como las endo-PGs. En
concordancia con nuestros resultados, Barka y col. (2000) reportaron una reducción en la
actividad PG cuando frutos de tomate fueron irradiados con UV-C. Particularmente en
frutilla, se detectó una importante solubilización y depolimerización de pectinas al final
de la maduración de los frutos, principalmente en los frutos más blandos (Rosli y col.
2004). De esta manera, una reducción en la actividad PG podría disminuir la
depolimerización de pectinas durante la maduración, lo que contribuiría a la mayor
firmeza encontrada en los frutos irradiados.
En resumen, en esta parte del trabajo encontramos que la irradiación con UV-C
retrasa el ablandamiento durante la maduración de las frutillas almacenadas. El
tratamiento también cambió los perfiles de expresión de diferentes genes que codifican
enzimas y proteínas que modifican la pared celular. Los frutos tratados mostraron una
menor expresión de FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 y FaPE1 después de las 4 h, de FaCel1
durante las primeras 24 h, y de FaPG1 después de 8 h post-irradiación con UV-C. Además,
el nivel de transcriptos de las tres expansinas se incrementó por encima del nivel
encontrado en sus respectivos controles después de 24 h, y en el caso de FaCel1 y FaPG1
el incremento ocurrió también más tarde (48 h). La medida de actividad de las distintas
enzimas indicó que el tratamiento disminuyó la actividad de PG, endoglucanasa y PME a
diferentes tiempos de almacenamiento. La irradiación no provocó, en ninguno de los
61
casos, un incremento en las actividades de estas enzimas. De esta manera, de acuerdo

con los resultados obtenidos, la irradiación con UV-C retrasa el ablandamiento en frutilla
probablemente reduciendo la expresión de un grupo de genes, los cuales están
involucrados en el desensamblaje de la pared celular. La reducción de la expresión de
estos genes al nivel de la transcripción se observó durante las primeras horas posteriores
al tratamiento, mientras que la reducción de la actividad enzimática de las proteínas
correspondientes se produjo al inicio del tratamiento en el caso de PME, o luego de uno y
dos días de almacenamiento para endoglucanas y PG, respectivamente.
62
CAPITULO II
“EFECTO DEL TRATAMIENTO CON UV-C SOBRE LA DEFENSA
CONTRA PATÓGENOS”
CAPÍTULO II: INTRODUCCIÓN
Capítulo II: “Efecto del tratamiento con UV-C sobre la defensa contra patógenos”
1. Introducción
Como se mencionó en el capítulo I, la degradación de la pared celular de los frutos
es uno de los principales factores que provocan el ablandamiento de los mismos. A su
vez, esta degradación y ablandamiento generan una mayor susceptibilidad de los frutos a
la infección por organismos patógenos. Esta interacción entre desensamblaje de la pared
y susceptibilidad a patógenos quedó evidenciada cuando al suprimirse simultáneamente
dos genes que codifican para enzimas que degradan la pared celular en tomate (LePG y
LeExp1) se obtuvo una reducida susceptibilidad a Botrytis cinerea (Cantu y col. 2008).
Los principales patógenos que pueden atacar los frutos son Botrytis cinerea,
Rhizopus stolonifer, Mucor mucedo y Colletotrichum dematium. En el caso de frutilla,
Botrytis cinerea es uno de los hongos que produce mayores pérdidas durante los períodos
de producción y postcosecha del fruto.
1.1. La podredumbre negra causada por Botrytis cinerea

Botrytis cinerea (telomorfo: Botryotinia fuckeliana) es un patógeno de plantas con
un estilo de vida necrotrófico, que causa serias pérdidas en más de 200 cultivos alrededor
del mundo. Este hongo es principalmente destructivo sobre tejidos senescentes o
maduros de las dicotiledóneas, pero generalmente entra en los mismos, en estadios
tempranos de desarrollo y permanece quiescente por un considerable período de tiempo.
Posteriormente, cuando el ambiente es propicio y la fisiología del hospedador cambia se
desarrolla la enfermedad (Williamson y col. 2007).
Los cultivos más afectados por este hongo incluyen vegetales como repollo,
lechuga, brócoli y pequeños frutos como uva, frutilla, arándano y frambuesa. También
puede afectar a kiwi, manzanas y peras. Es importante destacar que esta enfermedad es
difícil de controlar ya que posee una amplia variedad de modos de ataque, diversos
hospedadores como fuente de inóculo y la posibilidad de sobrevivir como micelio y/o
conidio y por largos períodos de tiempo en forma de esclerocio sobre desechos vegetales
(Williamson y col. 2007). Entre los síntomas más comunes se encuentra el desarrollo de
una podredumbre blanda, acompañada por colapso y pérdida de agua de los tejidos del
parénquima, seguido de una rápida aparición de masas grises de conidios (Figura 25A y
64
B). En el caso de frutos con pieles gruesas, como por ejemplo kiwi, estos síntomas son
recién evidentes cuando se los corta y se observa su interior. Al afectar los pétalos de las
flores, el daño producido por el hongo varía desde pequeñas manchas hasta una gran
podredumbre de los tejidos, dependiendo de las condiciones ambientales (Figura 25C).
A B
Figura 25: Síntomas producidos por Botrytis cinerea en (A) frutilla (B)
frambuesas y (C) pétalos de rosa.
El ciclo de vida de Botrytis cinerea incluye dos estadios (Figura 26): uno vegetativo
y uno reproductivo. El estadio vegetativo, comprende al micelio capaz de producir
conidios asexuales (estrictamente macroconidios del estadio anamorfo de Botrytis),
esclerocios y microconidios (espermatidas) (Elad y col. 2007). Los esclerocios se
desarrollan dentro de los tejidos muertos del hospedador y representan un importante
mecanismo de supervivencia del hongo. Estas estructuras comienzan a crecer en
primavera en las regiones templadas para producir conidióforos (Figura 27C) y conidios
multinucleados (Figura 27D), los que sirven como fuente primaria de inóculo dentro de
los cultivos.
65
Conidióforo Conidios
Esporas
sobre la
superficie
del fruto
Germinación
Ciclo de
verano
Micelio Esclerocio
Comienzo de la
podredumbre
Ciclo de
invierno
Figura 26: Ciclo de vida a través del cual se propaga Botrytis cinerea.
El micelio también sobrevive dentro de los restos del hospedador muerto y dentro
de algunas semillas. En los cultivos perennes, las hojas muertas, flores y frutos
momificados contienen masas de micelios que en las condiciones adecuadas pueden
producir conidios e iniciar la infección. Además, el patógeno puede formar microconidios
en los cultivos vegetales viejos, que funcionan como espermátidas. De esta manera, el
ciclo sexual involucra la espermatización de los esclerocios, llevando a la producción de
apotecios (Figura 27A) y ascos con ocho ascosporas (Figura 27B) producidas luego de la
meiosis (Williamson y col. 2007). Los conocimientos sobre el ciclo sexual de este hongo
son escasos debido a que es muy raro encontrar estructuras sexuales en la naturaleza,
aunque se puede lograr bajo ciertas condiciones en el laboratorio (Elad y col. 2007).
66
A B
C D
Figura 27: Estructuras reproductivas sexuales (A y B) y asexuales (C y D)

que forman parte del ciclo de vida de Botrytis cinerea. (A) Apotecios; (B)
Ascos con ascosporas; (C) Conidióforo; (D) Conidio germinando.
Como se mencionó anteriormente, Botrytis es un hongo necrotrófico. Esto

significa que durante el proceso de invasión provoca la muerte de las células
hospedadoras. El ciclo de la enfermedad, comienza con la ubicación de un conidio sobre
la superficie hospedadora, el cual germina y desarrolla un apresorio que facilita su
penetración en los tejidos. Esta invasión puede ser llevada a cabo por penetración activa
o ingreso pasivo. Por un lado, Botrytis es un hongo oportunista que puede iniciar la
infección a través de heridas o sitios previamente infectados por otros patógenos, pero
también es perfectamente capaz de penetrar superficies intactas. La penetración de la
cutícula y epidermis desencadena una explosión oxidativa en la interfase planta-hongo
que promueve el progreso de la enfermedad (Williamson y col. 2007). Una vez que ha
penetrado la pared celular de la epidermis, el hongo produce varias enzimas que
degradan la pared celular del hospedador provocando su ruptura con la consiguiente
liberación de carbohidratos que sirven de fuente de carbono para el patógeno (Elad y col.
2007).
67
1.2. Mecanismos de defensa de las plantas

Las plantas disponen de un amplio espectro de mecanismos de defensa en
respuesta al ataque de agentes patógenos. Esta respuesta coincide frecuentemente con
una gran producción de especies reactivas de oxigeno (ROS), proceso conocido como
explosión oxidativa, que está asociada a una necrosis en el sitio de invasión. Esta
respuesta defensiva se denomina respuesta hipersensible, o HR, y confiere resistencia a
un amplio rango de patógenos biotróficos (Elad y col. 2007). Sin embargo, este
mecanismo no es completamente efectivo contra patógenos necrotróficos y actualmente
existen evidencias que sugieren que los mismos se verían beneficiados, ya que la necrosis
producida en el tejido vegetal favorece la colonización y dispersión del patógeno (Govrin
y Levine 2000; Mayer y col. 2001; Glazebrook 2005). No obstante, las plantas poseen
otras herramientas para combatir estas infecciones, tales como la producción de
metabolitos secundarios, el reforzamiento de las paredes celulares para incrementar las
barreras estructurales y la síntesis de proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) (Van
Loon y col. 2006).
1.2.1. La vía fenilpropanoide y fenilalanina amonio liasa (PAL)

Un grupo abundante de metabolitos secundarios presentes en las plantas se
produce a partir de la vía fenilpropanoide (Figura 28), la cual deriva del aminoácido L-
fenilalanina. La primera etapa de esta vía involucra la eliminación del grupo amino para
formar ácido cinámico, reacción catalizada por la fenilalanina amonio liasa (PAL). De esta
manera, PAL se sitúa en un punto de ramificación entre el metabolismo primario y el
secundario, lo que implica que esta enzima forma parte de un importante paso
regulatorio en la síntesis de muchos compuestos fenólicos (Taiz y Zeiger 1998).
Existe una amplia variedad de compuestos fenilpropanoides que cumplen
diversas funciones en las plantas, como por ejemplo la de defensa contra patógenos,
atracción de polinizadores y dispersión de semillas, formación de paredes celulares
secundarias, protección contra el daño producidos por los rayos UV, etc. (Taiz y Zeiger
1998). En el caso de los productos que actúan en la defensa de las plantas, pueden ser
clasificados dentro de tres amplios grupos según su comportamiento: fitoalexinas,
fitoancipientes y moléculas de señalización (Dixon y col. 2002). Las fitoalexinas son
aquellos compuestos inducibles por la presencia del patógeno y los fitoancipientes se
68
encuentran preformados en las plantas. En cuanto a las moléculas de señalización, una de

las más conocidas es el ácido salicílico, el cual está involucrado en mecanismos de
respuestas de defensa locales y sistémicas (Dixon y col. 2002). Una variedad de
compuestos fenólicos simples, que incluye a antocianinas, estilbenos, flavonoides,
isoflavonas, precursores de ligninas (monolignoles), y otros compuestos, son
fundamentales en muchas especies para combatir a los patógenos tanto de forma
directa, inhibiendo su crecimiento, germinación e invasión, como también a través de la
formación de barreras estructurales que limitan su penetración (Dixon 2001). Se ha
comprobado que el incremento en la producción de estos compuestos mejora la
resistencia a enfermedades (He y Dixon 2000).
Como se mencionó anteriormente, PAL es una enzima clave en esta vía y por lo
tanto importante en la generación de compuestos de defensa. En este sentido, una
reducción de PAL en plantas transgénicas provocó la disminución de la resistencia local de
las plantas frente a los patógenos (Maher y col. 1994). Dado que esta enzima está
involucrada en la ruta de biosíntesis de antocianinas, y que estos compuestos son los
principales responsables del característico color de las frutillas, la medida de la actividad
PAL ha sido utilizada ampliamente para caracterizar la maduración de este fruto (Given y
col. 1988b; Cheng y Breen 1991). Sin embargo, no existen datos hasta el momento de
genes que codifiquen para esta enzima en frutilla, ni se ha analizado la expresión de los
mismos durante la maduración (ver capítulo III).
1.2.2. Polifenol oxidasa (PPO)

Las polifenol oxidasas (PPO) son enzimas que se encuentran presentes en la
mayoría de los tejidos vegetales y catalizan la oxidación de compuestos fenólicos a
quinonas (Yoruk y Marshall 2003). Las quinonas formadas son muy inestables y
rápidamente polimerizan en pigmentos marrones que causan una coloración pardusca no
deseada en muchos frutos y vegetales durante su postcosecha. Por otro lado, estos
compuestos poseen propiedades antimicrobianas y son uno de los primeros signos de
respuesta a daño o ataque fúngico (Yoruk y Marshall 2003). Esto fue corroborado en
plantas de tomate a las que se les incrementó la expresión de PPO, las cuales mostraron
un elevado aumento en la resistencia a enfermedades (Li y Steffens 2002). En
comparación con los controles, estas líneas transgénicas presentaron una menor
69
severidad en los síntomas de la enfermedad, demostrando la importancia de esta enzima

en la restricción del desarrollo de patógenos de plantas (Li y Steffens 2002).
Fenilalanina
PAL
Derivados del
ácido benzoico
(ácido salicílico)
Ácido trans-cinámico
Compuestos implicados
en la suberización
Cumarinas
Precursores de Ácido para-cumárico

Estilbeno
ligninas
Flavonoides
Antocianinas
Cumaroil CoA Chalconas Flavanonas Taninos

condensados
Figura 28: Esquema de la vía fenilpropanoide y sus principales

derivados.
Hasta el momento, se ha descripto a PPO en diferentes frutos de interés

económico como durazno (Wong y col. 1971), ananá (Das y col. 1997), manzana (Marques
y col. 1995), pera (Espín y col. 1996; Gauillard y Richard-Forget 1997) y uva (Lamikanra y
col. 1992). En frutilla, la presencia de PPO fue descripta por Wesche-Ebeling y
Montgomery (1990). Asimismo, la enzima fue extraída, parcialmente caracterizada y
purificada a partir de frutos de la variedad Selva (Serradel y col. 2000).
1.2.3. Peroxidasas
Las peroxidasas (EC 1.11.1.7) son enzimas que se encuentran ampliamente
distribuidas en plantas. Las mismas pueden ser intracelulares o ser secretadas hacia la
70
pared celular (Passardi y col. 2004). Existe una amplia variedad de funciones asignadas a
estas enzimas: por un lado, son conocidas por proveer protección contra la oxidación
biológica, pero también pueden actuar promoviendo la formación de especies altamente
reactivas como radicales libres, que podrían producir daño celular o en algunos casos
proteger a la planta del ataque de patógenos (Campa 1991). Asimismo, estas enzimas
están vinculadas al catabolismo de auxinas, entrecruzamiento de proteínas de la pared
celular y elongación de las células (Hiraga y col. 2001). Sin embargo, una de las funciones
más relacionadas con las peroxidasas, es su participación en la formación de lignina y
suberina. Las peroxidasas pueden catalizar estos procesos como parte normal del
desarrollo de la pared celular durante el crecimiento, o lo que es más importante, en
respuesta a varios factores externos como daño mecánico y ataque de patógenos,
generando barreras físicas que limitan la penetración de los mismos (Passardi y col.
2004).
En frutilla, una enzima con actividad peroxidada fue purificada y caracterizada
durante la maduración (Civello 1995). Asimismo, se describió que un gen correspondiente
a una peroxidasa era expresado diferencialmente en respuesta a la infección con
Colletotrichum (Casado-Diaz y col. 2006).
1.2.4. Proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs)

Las PRs son proteínas codificadas por las plantas hospedadoras que se inducen
específicamente en situaciones de infección por patógenos o relacionadas a ellas. Estas
proteínas pueden acumularse en forma local o sistémica, participando en este último
caso en el desarrollo de la resistencia sistémica adquirida (SAR) contra futuras infecciones
(Van Loon y Van Strien 1999). Las PRs también pueden ser inducidas por estreses
abióticos, como por ejemplo daño mecánico, estrés por frío y estrés osmótico (Van Loon y
col. 2006).
Actualmente, las PRs comprenden 17 familias que se numeran en el orden en el
cual se fueron descubriendo, y se clasifican de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y
biológicas comunes (Van Loon y col. 2006). Algunas de estas familias son enzimas que
limitan la actividad, crecimiento y dispersión del patógeno, como las PR-2 que
corresponden a β-1,3 glucanasas y las PR-3, 4, 8 y 11 denominadas quitinasas. Las
quitinasas, al igual que los inhibidores de proteinasas (PR-6), pueden actuar contra
71
hongos, nematodos e insectos herbívoros. Miembros de la familia PR-8 poseen actividad

lisozima contra bacterias, mientras que las tioninas (PR-13) y las defensinas (PR-12)
poseen actividad antibacteriana y antifúngica. Las proteínas PR-1 son frecuentemente
usadas como marcadores de un aumento en el estado defensivo de las plantas, pero su
actividad biológica es hasta el momento desconocida. Las PR-7 son endoproteinasas y las
PR-9 incluyen a un tipo específico de peroxidasas que actuarían en el fortalecimiento de
la pared celular. Las PR-10 muestran homología con ribonucleasas y las PR-5 incluyen a las
proteínas semejantes a taumatinas. Las familias PR-15, 16 y 17 son las últimas
incorporadas. Las proteínas agrupadas en las familias PR-15 y 16 son típicas de
monocotiledóneas y corresponden a las oxalato-oxidasas con actividad superóxido
dismutasa (Van Loon y col. 2006).
En cuanto a su ubicación en la célula, muchas de estas proteínas son sintetizadas
con un péptido señal N-terminal de translocación al retículo endoplasmático, que facilita
su secreción al apoplasto. De este modo, estas proteínas se acumulan extracelularmente.
Otras PRs poseen extensiones adicionales que las dirigen hacia la vacuola (Van Loon y col.
2006).
1.2.4.1. Quitinasas (EC 3.2.1.14)

Dentro de los compuestos antifúngicos sintetizados por las plantas se encuentran
las quitinasas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de quitina, un homopolímero lineal de
residuos β-1,4 N-acetilglucosamina (Collinge y col. 1993) y uno de los principales
componentes de las paredes celulares de los hongos (Theis y Stahl 2004).
Como se mencionó anteriormente, basado en sus propiedades biológicas,
actividad y similitud de secuencia, las quitinasas son agrupadas dentro de diferentes
familias de proteínas PRs. Las PR-3 incluyen quitinasas de clase Ia, Ib, II, IV, VI y VII; las
quitinasas de clase III pertenecen a PR-8, y las de clase V a PR-11. Además, dentro del
grupo de las PR-4 se encuentran proteínas con baja actividad endoquitinasa. Por otro
lado, las quitinasas de las clases Ia, III y VI se encuentran localizadas en las vacuolas,
mientras que las quitinasas ácidas pertenecientes a las clases Ib, II, IV, V y VII son
secretadas al apoplasto. Considerando la ubicación celular, se han propuesto diferentes
mecanismos de acción de las mismas asociados a la defensa. Las quitinasas extracelulares
serían parte de una respuesta inducida tempranamente, y podrían actuar directamente
72
bloqueando el crecimiento de las hifas y posiblemente también de manera indirecta

liberando elicitores que inducirían otras reacciones de defensa en el hospedador. Por otro
lado, las quitinasas vacuolares funcionarían más tarde en el proceso de infección, una vez
que las células han colapsado y liberado el contenido vacuolar en el compartimento
extracelular (Collinge y col. 1993).
Se han encontrado varias de estas enzimas en diferentes frutos como naranja
(Porat y col. 2001), uva (Robinson y col. 1997; Robert y col. 2002), ananá (Taira y col.
2005) y limón (Gomi y col. 2002). En el caso de frutilla, se describieron tres quitinasas
diferentes, dos de clase II (FaChi2-1 y FaChi2-2) cuya expresión se induce en presencia del
patógeno y una de clase III (FaChi3) (Khan y Shih 2004). Asimismo, se han obtenido
plantas de frutilla transgénicas que sobreexpresan una quitinasa heteróloga, las cuales
presentan una mayor resistencia a Botrytis con respecto a las plantas controles (Vellicce y
col. 2006).
1.2.4.2. β-1,3 glucanasas (EC 3.2.1.39)

Los glucanos son el segundo componente en abundancia de las paredes celulares
de los hongos, de modo que las glucanasas son potentes proteínas antifúngicas. Las β-1,3
glucanasas están incluidas dentro de las proteínas PR-2 y se subdividen en tres clases
diferentes (Theis y Stahl 2004). Las glucanasas de clase I son proteínas básicas de
aproximadamente 33 kDa que se localizan en la vacuola y son sintetizadas como
preproteínas sin actividad enzimática hasta que son procesadas (Sticher y col. 1992). Las
clases II y III incluyen proteínas ácidas y extracelulares de aproximadamente 36 kDa.
Al igual que las quitinasas, las β-1,3 glucanasas poseen una actividad antifúngica
directa y una indirecta. La directa se refiere a la capacidad que poseen de catalizar la
hidrólisis de los β-1,3 glucanos de las paredes de los hongos, lo que lleva a un
debilitamiento de la pared y lisis celular. La indirecta, es debida a los oligasacáridos
liberados durante la digestión de la pared, los cuales son percibidos por las plantas como
elicitores e inducen posteriores respuestas de defensa (Theis y Stahl 2004). Además de su
importante rol en la defensa de las plantas, las β-1,3 glucanasas están involucradas en
varios procesos fisiológicos y de desarrollo entre los que se incluye la maduración de
frutos (Peumans y col. 2000).
73
Se describieron tres β-1,3 glucanasas en frutilla, todas pertenecientes a la clase II

de glucanasas ácidas (Khan y col. 2003; Shi y col. 2006). Los genes codificantes de
endoglucanasas FaBG2-1 y FaBG2-3 se expresan en fruto y se inducen cuando los mismos
son infectados con patógenos (Shi y col. 2006).
1.2.4.3. Proteínas semejantes a osmotinas (Osmotin-like proteins)

Otras proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) que se reportaron en frutilla
son proteínas semejantes a osmotinas (FaOLP1 y FaOLP2) (Wu y col. 2001; Zhang y Shih
2007). En general, las osmotinas pertenecen al grupo de proteínas semejantes a
taumatinas (TLPs) o PR-5. Las osmotinas se identificaron originalmente por ser una de las
proteínas que más se acumulan durante el estrés osmótico (Singh y col. 1985). También,
la expresión de estas proteínas puede ser activada por infecciones microbianas y por una
variedad de estreses abióticos (Van Loon y Van Strien 1999). Además de su rol contra
patógenos, se piensa que podrían tener otras funciones fisiológicas y en el desarrollo,
incluyendo la formación de flores (Neale y col. 1990), maduración de frutos (Salzman y
col. 1998) y actividad anticongelante (Hon y col. 1995).
En frutilla, FaOLP2 se expresa en diferentes órganos de la planta, entre ellos frutos
verdes y maduros. Además, los niveles de mensajeros de este gen aumentan
considerablemente ante diferentes tipos de estreses abióticos (Zhang y Shih 2007).
74
CAPÍTULO II: RESULTADOS
2. Resultados
2.1. Inoculación de frutos con Botrytis cinerea

La capacidad del tratamiento con UV-C para controlar las enfermedades
postcosecha parece deberse a dos diferentes mecanismos, un efecto germicida directo y
un efecto indirecto sobre el patógeno provocado por la inducción en el fruto de
diferentes mecanismos de defensa (Shama y Alderson 2005). Para poder evaluar esta
última posibilidad en la interacción de frutilla con el hongo necrotrófico Botrytis cinerea,
decidimos inocular con una suspensión de conidios, frutos previamente tratados con UV-
C y frutos sin irradiar (control). Posteriormente, se evaluó diariamente durante 9 días la
aparición del micelio macroscópico del hongo (Figura 29).
70
Control
60 UV-C
50
Frutos infectados (%)
40
30
20
10
0 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
Figura 29: Efecto del tratamiento con UV-C sobre el decaimiento de frutilla.
Frutillas (75% R) se dejaron sin irradiar (Control) o se trataron con UV-C (4,1 KJ
m-2). Después de 8 h, todos los frutos fueron inoculados con una suspensión de
104 conidios ml-1 y luego se almacenaron a 20 °C durante 9 días. El desarrollo
externo de micelio macroscópico fue evaluado diariamente y los datos se
expresaron como porcentaje de frutos infectados.
Tanto los frutos tratados como los controles no presentaron infección fúngica
visible hasta después de 72 h post-inoculación (Figura 29). Posteriormente, el porcentaje
de frutos infectados fue similar entre controles y tratados hasta el día 5. Luego, los frutos
75
irradiados con UV-C presentaron un menor decaimiento comparados con los controles.
En el día 9 de almacenamiento a 20 °C, aproximadamente el 60% de los frutos controles
mostró señales de ataque fúngico mientras sólo el 30% de los frutos irradiados poseía
este tipo de síntomas.
2.2. Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión de genes relacionados
a la defensa
Al observar una menor infección en los frutos previamente irradiados con UV-C
con respecto a los controles, decidimos estudiar si utilizando este tipo de tratamiento
físico se inducen enzimas relacionadas a la defensa contra patógenos. De esta manera,
analizamos la expresión de genes relacionados a dicho proceso, previamente descriptos
en frutilla, y la actividad de las enzimas implicadas.
2.2.1. Fenilalanina amonio liasa (PAL) y proteína semejante a osmotina (OLP)
0h 4h 10 h 24 h 48 h
C T C T C T C T C T
A
FaPAL
ARNr 18S
B
FaOLP2
ARNr 18S
Figura 30: Expresión de FaPAL (A) y FaOLP2 (B) en frutos controles y tratados
con UV. Las diferentes condiciones analizadas (control (C) y tratado con UV-C
(T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 10, 24 y 48 h) se muestran en
la parte superior de la figura. Las sondas utilizadas (FaPAL, FaOLP2 o ARNr
18S) se muestran en la parte izquierda de la figura.
Hasta el momento no se han descripto en la bibliografía genes completos de

fenilalaninas amonio liasas de frutilla. Por lo tanto diseñamos cebadores a partir de una
secuencia parcial (264 pb) encontrada en el GenBank perteneciente a la variedad Andana
crown, que nos permitió fabricar una sonda de 250 pb (Tabla II). La misma fue utilizada
76
para analizar la expresión del gen correspondiente utilizando la técnica de Northern blot.
El análisis del efecto de la irradiación con UV-C sobre la expresión de FaPAL mostró
pequeñas diferencias entre los frutos controles y tratados (Figura 30A). Inmediatamente
después del tratamiento (0 h) y después de 24 h a 20 °C, observamos un leve aumento en
el nivel de mensajeros en los frutos tratados con respecto a sus respectivos controles. Sin
embargo, la expresión de este gen se redujo en los frutos irradiados después de 10 h de
almacenamiento.
2,5e-5 Control
Tratado
** *
*
2,0e-5
*
Actividad PAL
(DO s kg )
-1
1,5e-5
-1
1,0e-5
5,0e-6
0,0
0 4 10 24 48
Tiempo (h)
Figura 31: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad PAL. Frutillas
(75% R) se dejaron sin irradiar (Control) o se trataron con UV-C (4,1 KJ m-2) y
luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 4, 10, 24 y 48 h. La actividad de la
enzima se expresó como la variación en la densidad óptica (DO) por segundo y
por kilogramo de fruto. El simple y doble asterisco indican que los valores son
estadísticamente diferentes de sus correspondientes controles a P<0,05 y
P<0,01, respectivamente.
En cuanto a la actividad PAL, se detectó tanto en frutos controles y tratados con

UV-C en los 5 tiempos de almacenamiento analizados (Figura 31). El patrón de actividad
observado para esta enzima fue similar al encontrado para la expresión de FaPAL, aunque
las diferencias fueron mucho más acentuadas. Se detectó un incremento
estadísticamente significativo (P<0,01 y P<0,05, respectivamente) inmediatamente
después de la irradiación (0 h) y a las 4 h de almacenamiento en los frutos tratados. A las
10 h, no se encontraron diferencias entre controles y tratados, pero a las 24 y 48 h de
77
almacenamiento la actividad PAL en los frutos irradiados fue claramente mayor que su
correspondiente control.
Entre las proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) descriptas en frutilla, se
encuentra FaOLP2 (Zhang y Shih 2007), que es una osmotina que pertenece a la familia de
las taumatinas o PR-5. Estas proteínas tienen actividad antifúngica in vitro aunque no se
conoce su modo de acción (Van Loon y col. 2006). Cuando analizamos la expresión de
FaOLP2 por Nortern blot, no obtuvimos diferencias entre frutos controles y tratados
durante el período de almacenamiento analizado en este trabajo (Figura 30B).
2.2.2. Quitinasas
En este trabajo también se analizó la expresión de tres diferentes quitinasas cuyas
secuencias habían sido descriptas previamente en frutilla (Khan y Shih 2004). Debido a la
similitud de secuencias entre ellas, el estudio se realizó utilizando la técnica de RT-PCR
semicuantitativa (Figura 32). En el caso de FaChi2-1 (AF147091), no se observaron
diferencias entre frutos controles e irradiados a todos los tiempos analizados, excepto por
un descenso del nivel de mensajero en los frutos tratados a las 48 h post-irradiación. Los
perfiles de expresión encontrados tanto para FaChi2-2 (AF320111) como para FaChi3
(AF134347) fueron similares. En ambos casos, los mensajeros se incrementaron en los
frutos tratados con UV-C inmediatamente después del tratamiento (0 h). Posteriormente,
no se observaron diferencias entre frutos controles e irradiados hasta el final del
almacenamiento (48 h), cuando la expresión en los frutos tratados con UV-C tuvo un
marcado descenso comparado con el control (Figura 32).
0h 4h 10 h 24 h 48 h
C T C T C T C T C T
FaChi2-1
FaChi2-2
FaChi3
ARNr 18S
Figura 32: Expresión de diferentes quitinasas en frutos controles y tratados

con UV-C. Las diferentes condiciones analizadas (control (C) y tratado con UV-
C (T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 10, 24 y 48 h) se muestran
en la parte superior y las sondas utilizadas (FaChi2-1, FaChi2-2, FaChi3 o ARNr
18S) se muestran en la parte izquierda de la figura.
78
Sabiendo que estas enzimas degradan la fracción de quitina que forma parte de la
pared celular de los hongos, utilizamos este compuesto unido a un colorante (Chitin
azure, Sigma) como sustrato para medir la actividad de la enzima. El análisis de la
actividad quitinasa mostró que el tratamiento no la afectó significativamente en las
primeras 4 h después de la irradiación. Sin embargo, después de 10 h de
almacenamiento, la actividad quitinasa en los frutos tratados se incrementó a casi al
doble de los valores observados en el control. Posteriormente, el nivel de actividad en los
frutos tratados decreció y no se encontraron diferencias entre controles y tratados
(Figura 33).
3,5e-3
Control
3,0e-3 * Tratado
2,5e-3
Act. Quitinasa
-1
2,0e-3
DO s kg
-1
1,5e-3
1,0e-3
5,0e-4
0,0
0 4 10 24 48
Tiempo (h)
Figura 33: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad quitinasa.
m-2) y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 4, 10, 24 y 48 h. La actividad de
la enzima se expresó como la variación en la densidad óptica (DO) por
segundo y por kilogramo de fruto. El simple asterisco indica que los valores
son estadísticamente diferentes de sus correspondientes controles a P<0,05.
2.2.3. β-1,3 glucanasa

Tres genes de β-1,3 glucanasa se describieron en frutilla (Khan y col. 2003; Shi y
col. 2006), aunque sólo dos de ellos se expresan en el fruto. El estudio de estas β-1,3
glucanasas de frutilla mostró diferentes patrones de expresión. Cuando analizamos
FaBG2-1 (AY170375) encontramos un incremento en la expresión en los frutos tratados a
79
0 y 4 h de almacenamiento (Figura 34). Sin embargo, el nivel de ARN mensajero decreció

y permaneció bajo comparado con su correspondiente control después de 10 y 48 h post-
irradiación. En el caso de FaBG2-3 (AY989819), la expresión fue casi indetectable en todos
los tiempos analizados, tanto en frutos controles como tratados, excepto en el caso de
frutos irradiados después de 24 h de almacenamiento, en los cuales se detectó un
incremento en los niveles de mensajeros. Finalmente, 48 h después de la irradiación los
niveles de expresión en los tejidos tratados se redujeron, pero permanecieron más altos
que los obtenidos para los controles.
0h 4h 10 h 24 h 48 h
C T C T C T C T C T
FaBG2-1
FaBG2-3
ARNr 18S
Figura 34: Expresión de diferentes β-1,3glucanasas en frutos controles y

tratados con UV-C. Las diferentes condiciones analizadas (control (C) y tratado
con UV-C (T)) y tiempos de almacenamiento a 20 °C (0, 4, 10, 24 y 48 h) se
muestran en la parte superior y las sondas utilizadas (FaBG2-1, FaBG2-3 o
ARNr 18S) se muestran en la parte izquierda de la figura.
En el caso de esta enzima, la actividad permaneció baja y sin variaciones durante

el almacenamiento en los frutos controles (Figura 35). No obstante, en los tejidos
tratados se observó un incremento significativo (P<0,01) a las 4 y 24 h post- irradiación,
duplicando los valores encontrados en los controles. En los demás tiempos analizados, la
actividad fue similar entre frutos controles y tratados.
80
8e-6
** Control
** Tratado
Act. -1,3 glucanasa 6e-6

(DO s kg )
-1 -1
4e-6
2e-6
0
0 4 10 24 48
Tiempo (h)
Figura 35: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad β-1,3
glucanasa. Frutillas (75% R) se dejaron sin irradiar (Control) o se trataron con
UV-C (4,1 KJ m-2) y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 4, 10, 24 y 48 h. La
actividad de la enzima se expresó como la variación en la densidad óptica (DO)
por segundo y por kilogramo de fruto. El doble asterisco indica que los valores
son estadísticamente diferentes de sus correspondientes controles a P<0,01.
2.2.4. Polifenoloxidasa (PPO)

En el estudio de la influencia del UV-C sobre la actividad de enzimas de defensa, es
interesante analizar a polifenoloxidasa (PPO). Por un lado, porque la misma se detectó,
purificó y caracterizó en frutilla (Serradel y col. 2000) y por otro, porque esta enzima
cataliza varios procesos metabólicos que llevan a la formación de quinonas. La
acumulación de quinonas es uno de los primeros signos de respuesta al ataque fúngico y
al daño mecánico y las mismas tienen propiedades antimicrobianas efectivas (Yoruk y
Marshall 2003). En la figura 36 se muestran los resultados de la medida de PPO en frutos
irradiados y controles. Ningún efecto del tratamiento con UV-C pudo ser detectado
durante las primeras 4 h de almacenamiento. Sin embargo, después de 10, 24 y 48 h la
actividad PPO se incrementó abruptamente en los frutos irradiados, observándose el
mayor nivel a las 48 h. Los valores obtenidos en los frutos tratados con UV-C para este
último tiempo analizado (48 h), superaron en más del doble a los observados en los
respectivos controles.
81
7
Control **
Tratado
6
5
Actividad PPO
(DO s-1 kg-1)
**
3
*
2
0
0 4 10 24 48
Tiempo (h)
Figura 36: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad

Polifenoloxidasa (PPO). Frutillas (75% R) se dejaron sin irradiar (Control) o se
trataron con UV-C (4,1 KJ m-2) y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 4, 10,
24 y 48 h. La actividad de la enzima se expresó como la variación en la
densidad óptica (DO) por segundo y por kilogramo de fruto. El simple y doble
asterisco indica que los valores son estadísticamente diferentes de sus
correspondientes controles a P<0,05 y P<0,01.
2.2.5. Peroxidasas
Las peroxidasas son enzimas que poseen diferentes funciones en las plantas.
Particularmente, en el caso de la defensa contra patógenos su importancia radica en que
participan en los estadios tardíos de la formación de ligninas. Estos polímeros se
acumulan formando una barrera mecánica que impide la invasión del patógeno. El
análisis de la actividad peroxidasa (Figura 37) mostró similares resultados a los obtenidos
para la enzima β-1,3 glucanasa (punto 2.2.3). Inmediatamente después de la irradiación
con UV-C, la actividad de la enzima fue similar en los frutos controles y los tratados.
Después de esto, observamos un incremento en la actividad en los frutos irradiados
durante las primeras horas de almacenamiento (4 h). A 10 y 24 h, los valores obtenidos
para los tejidos tratados disminuyeron hasta niveles similares que los presentes en los
controles. Finalmente, la actividad peroxidasa en los frutos tratados aumentó al final del
almacenamiento, alcanzando valores cercanos al doble de los hallados en el control.
82
10
Control
Tratado
** **
Actividad Peroxidasa 8
6
(DO s-1 kg-1)
0
0 4 10 24 48
Tiempo (h)
Figura 37: Efecto del tratamiento con UV-C sobre la actividad peroxidasa.
m-2) y luego se almacenaron a 20 °C durante 0, 4, 10, 24 y 48 h. La actividad de
la enzima se expresó como la variación en la densidad óptica (DO) por
segundo y por kilogramo de fruto. El doble asterisco indica que los valores son
estadísticamente diferentes de sus correspondientes controles a P<0,01.
83
CAPÍTULO II: DISCUSIÓN
3. Discusión
Durante la maduración, los frutos sufren cambios bioquímicos y fisiológicos en el
metabolismo de sus tejidos que son regulados por un set de señales conservadas en el
desarrollo (Adams-Phillips y col. 2004). Estos cambios incluyen las modificaciones en el
color, sabor, textura y contenido nutricional (Perkins-Veazie 1995). Algunas de estas
modificaciones son deseadas por los consumidores pero, por otro lado, incrementan la
susceptibilidad a patógenos necrotróficos como Botrytis cinerea y provocan grandes
pérdidas económicas. La frutilla es uno de los cultivos más severamente afectado por el
“moho gris”. El principal signo de esta infección es el desarrollo de una podredumbre
blanda, que provoca el colapso de los tejidos del parénquima con la consiguiente pérdida
de agua, seguido de la aparición de masas grises de conidios (Williamson y col. 2007). En
esta parte del trabajo, irradiamos frutillas con una dosis hormética de UV-C (254 nm) y
posteriormente las inoculamos con una suspensión de conidios de Botrytis cinerea.
Después de esto, analizamos el número de frutos controles (sin irradiar) y tratados que
poseían síntomas macroscópicos de infección. Los resultados mostraron que la previa
irradiación de los frutos con UV-C resultó en un menor porcentaje de frutos afectados,
aunque las diferencias entre los frutos no irradiados e irradiados se hicieron más
evidentes en los últimos días de almacenaje (5-9 d) a 20 °C, cuando el porcentaje de
frutos controles afectados duplicó al de frutos tratados que desarrollaron la infección
(Figura 29). En trabajos reportados previamente, se observó una reducción en el
decaimiento de pimientos tratados con UV-C y posteriormente inoculados con Botrytis
cinerea (Mercier y col. 2001). De forma similar, se obtuvo una significante reducción de la
severidad de la infección y de la enfermedad en uvas tratadas con una combinación de
UV-C y quitosano (Romanazzi y col. 2006). Además, el crecimiento fúngico sobre frutillas
se retardó usando dosis de UV-C de 0,05 y 1,5 J cm-2 (Marquenie y col. 2002). El hecho de
que frutos que fueron irradiados con luz UV-C y luego inoculados con patógenos
muestren menos síntomas macroscópicos de infección que sus respectivos controles,
sugiere la posible existencia de un efecto del tratamiento sobre los tejidos del fruto que
afecta indirectamente el desarrollo de micelio. Este efecto podría incluir la acumulación
de sustancias antifúngicas, razón por la cual analizamos la expresión y actividad de un
grupo de enzimas de frutilla que están relacionadas con la defensa de las plantas contra
patógenos.
84
Es sabido que la irradiación con UV-C estimula la vía fenilpropanoide en varios

frutos, principalmente por la activación de fenilalanina amonio liasa (PAL), una enzima
clave en esta vía (Dixon y col. 2002). La actividad PAL fue estimulada por este tipo de
radiación en varios frutos como pomelo (Droby y col. 1993) y durazno (El Ghaouth y col.
2003). En el caso de frutilla, encontramos un aumento en la expresión y actividad PAL a
tiempos tempranos y tardíos después de la irradiación (Figura 30A y 31). Algunos de los
componentes sintetizados por la vía fenilpropanoide están implicados en un rol protector
contra los patógenos a través de la inhibición de su crecimiento, la inactivación de
enzimas fúngicas que contribuyen a la maceración de los tejidos, y al refuerzo de las
paredes celulares vegetales. La estimulación de la expresión o actividad PAL por el UV-C
sugiere la activación de algunos mecanismos de defensa en el fruto, probablemente a
través de la acumulación de compuestos fenólicos. Además, se produjo un aumento en la
actividad peroxidasa debido al tratamiento a las 4 y 48 h de almacenamiento (Figura 37).
Esta enzima está relacionada con los últimos pasos de la síntesis de polímeros de lignina
(Passardi y col. 2004). Por lo tanto, es posible que las enzimas peroxidasa y PAL pudieran
estar implicadas en la formación de barreras para prevenir la penetración del patógeno
en el sitio de daño. En este sentido, existen reportes de modificaciones bioquímicas de la
pared celular de tomates expuestos a dosis horméticas de UV-C, con acumulación de
fenoles, lignina y suberina en las primeras capas de tejido (Charles y col. 2007b).
La síntesis y acumulación de compuestos fenólicos después de la irradiación con
UV-C podría también jugar un rol indirecto en la protección del fruto, actuando como
sustratos naturales de PPO. Uno de los roles propuestos para los productos de reacción
de esta enzima (quinonas) en la defensa de las plantas es su acción como bactericida y
fungicida (Yoruk y Marshall 2003). A nuestro entender, no existen hasta el momento
datos disponibles en lo que respecta a la activación de la actividad PPO por el tratamiento
con UV-C en frutos. Cabe entonces destacar que en los experimentos aquí realizados se
observó que la actividad PPO se indujo desde las 10 h post-tratamiento hasta el final del
almacenamiento a 20 °C (Figura 36).
Existen pocos trabajos en los cuales se ha analizado la relación entre proteínas
relacionadas a la patogénesis (PRs) e irradiación con UV-C. Porat y col. (1999) encontraron
que el tratamiento con UV-C estaba involucrado en la resistencia del pomelo a Penicillium
digitatum y en la estimulación de proteínas PR. Mientras que la expresión de proteínas
85
correspondientes a quitinasas se incrementó con el UV, fue necesaria una combinación

de daño mecánico e irradiación para gatillar la expresión de las β-1,3 glucanasas. En
zanahoria, una proteína de 24 KDa correspondiente a una quitinasa se indujo en tejidos
directamente expuestos a la radiación UV e infectados con Botrytis cinerea (Mercier y col.
2000). También, la inducción de quitinasa, β-1,3 glucanasa y PAL fue reportada en
durazno (El Ghaouth y col. 2003). La irradiación de los frutos resultó en la acumulación de
los transcriptos unas pocas horas después del tratamiento, y un poco después se observó
un incremento transitorio en la actividad de estas tres enzimas (El Ghaouth y col. 2003).
Cuando analizamos la expresión de tres quitinasas previamente reportadas en frutilla
(Khan y Shih 2004), solamente se encontró una inducción de la expresión en el caso de
FaChi2-2 y FaChi3 inmediatamente de realizado el tratamiento (0 h) (Figura 32). Las
mediciones de actividad enzimática revelaron que existiría una inducción a las 10 h post-
tratamiento, hasta niveles de actividad de aproximadamente el doble de los valores
observados en el control (Figura 33). La expresión génica obtenida para β-1,3 glucanasas
es diferente a la encontrada para las quitinasas. Previamente se habían estudiado
diferentes genes de β-1,3 glucanasas (Khan y col. 2003; Shi y col. 2006), los cuales
presentaron diferencias en el efecto del UV-C sobre sus patrones de expresión. En FaBG2-
1 (Figura 34), el incremento en los niveles de mensajeros de los frutos tratados se detectó
al comienzo del almacenamiento (0 y 4 h), pero en el caso de FaBG2-3, los frutos
irradiados mostraron un mayor expresión con respecto a los controles al final del
almacenamiento (24 y 48 h post-tratamiento). De esta manera, se podría relacionar a la
actividad de la enzima detectada como el resultado de la expresión de los dos genes
analizados, y probablemente de algún otro gen aún no descripto. Los valores encontrados
siguieron un patrón que se destaca por dos aumentos en la actividad enzimática en los
frutos tratados, un primer incremento a las 4 h y el segundo a las 24 h de
almacenamiento (Figura 35). Este resultado está de acuerdo con los hallados en reportes
previos (Charles y col. 2009). Estos autores registraron una inducción de quitinasas
constitutivas e inducibles por Botrytis cinerea y proteínas β-1,3 glucanasas con
actividades ácidas y básicas, en tomates tratados con UV-C (Charles y col. 2009).
Finalmente, estudiamos la expresión génica de la osmotina FaOLP2 (PR-5) aunque
no pudo detectarse ninguna diferencia entre frutos controles y tratados. El hecho de que
la expresión de FaOLP2 sea estimulada por ácido salicílico (SA), una importante molécula
86
señal que interviene en las respuestas de las plantas a patógenos (Zhang y Shih 2007),
tornaba a esta proteína un candidato muy interesante para evaluar el efecto de un
tratamiento como el UV-C. Existe otra proteína semejante a osmotina (FaOLP1) descripta
en frutilla (Wu y col. 2001). Como en el caso de FaChi2-1, podría ocurrir que la irradiación
con UV-C no tenga ningún efecto sobre la expresión de FaOLP2 pero que sí estimule la
expresión de otros genes semejantes a osmotinas que están presentes en frutilla y que
son aún desconocidos. Es necesario realizar otros experimentos para poder confirmar
esta hipótesis.
A modo de resumen de esta parte del trabajo de tesis, se puede afirmar que el
tratamiento postcosecha de frutillas con UV-C, realizado pocas horas previas a la
inoculación con Botrytis cinerea, reduce el porcentaje de frutos infectados durante los
últimos días de almacenamiento. Además, la irradiación de los frutos con UV-C
incrementa la expresión y actividad de varias enzimas (PAL, peroxidasa, PPO, quitinasas y
β-1,3 glucanasas) que están involucradas en diferentes mecanismos de defensa contra
patógenos. De esta manera, es probable que el efecto benéfico de la irradiación con UV-C
esté mediado, al menos parcialmente, por la capacidad de la radiación para disparar
diferentes mecanismos de defensa que incrementan la resistencia de los frutos frente a la
infección con este patógeno.
87
CAPITULO III
“CARACTERIZACIÓN DE FENILALANINA AMONIO LIASA (PAL) EN
VARIEDADES DE FRUTILLA CON DIFERENTE ACUMULACIÓN DE
ANTOCIANINAS”
CAPÍTULO III: INTRODUCCIÓN
Capítulo III: “Caracterización de fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades de

frutillas con diferente acumulación de antocianinas”
1. Introducción
Durante su maduración, los frutos sufren diversos cambios bioquímicos y
fisiológicos que los tornan atractivos para aquellos organismos que contribuyen a la
dispersión de sus semillas (Giovannoni 2001). Entre estos cambios, uno de los más
importantes es la modificación del color, proceso que comienza con la degradación de las
clorofilas seguido de la acumulación de otros pigmentos coloreados (Giovannoni 2004).
Los carotenoides son uno de los dos principales grupos de pigmentos coloreados
presentes en las plantas. Estos compuestos son terpenoides, liposolubles, de coloración
amarilla, naranja o roja, y sirven también como pigmentos accesorios en la fotosíntesis
(Taiz y Zeiger 1998). El otro grupo está conformado por las antocianinas, compuestos
hidrosolubles que se almacenan en las vacuolas. En el caso particular de frutilla, éste
constituye el principal grupo de pigmentos que se acumulan durante su maduración y que
por lo tanto es uno de los principales parámetros que determinan la calidad del fruto.
1.1. Las antocianinas

Como se mencionó anteriormente, las antocianinas son un grupo de pigmentos
naturales que pertenecen a la familia de los flavonoides. Las mismas son responsables de
otorgar color rojo, rosa, púrpura o azul a diversos órganos de las plantas entre los que se
encuentran flores y frutos. De esta manera, son de vital importancia como atrayentes de
polinizadores y para la dispersión de las semillas (Taiz y Zeiger 1998).
Las antocianinas se encuentran glicosiladas, y los correspondientes derivados
deglicosilados se denominan antocianidinas. Dependiendo del número y posición de los
grupos sustituyentes hidroxilos y metoxilos se pueden describir diferentes tipos de
antocianidinas (de Pascual-Teresa y Sanchez-Ballesta 2008), de las cuales las más
comúnmente encontradas en la naturaleza se muestran esquematizadas en la figura 38.
Sin embargo, no solo los grupos sustituyentes presentes en las antocianidinas determinan
el color final de estos pigmentos, sino que también influyen la presencia de ésteres
aromáticos en su esqueleto principal, la formación de complejos con iones metálicos y
copigmentos de flavona y el pH de la vacuola en la cual son almacenadas (Taiz y Zeiger
89
1998). Además, el contenido de estos pigmentos puede variar debido a factores externos
como intensidad y tipo de luz, y temperatura (de Pascual-Teresa y Sanchez-Ballesta 2008).
Antocianidinas Color
Pelargonidina Rojo anaranjado
Cianidina Rojo purpura
Delfinidina Rojo azulado
Petunidina Purpura
Peonidina Rojo rosado
Malvidina Rojo azulado
Figura 38: Estructura química y colores característicos de las principales

antocianidinas presentes en plantas. Adaptados de (de Pascual-Teresa y Sanchez-
Ballesta 2008).
Las antocianidinas más comunes en las plantas superiores son cianidina, presente
en un 50% de los casos, y pelargonidina, peonidina y delfinidina, presentes en un 12% (de
Pascual-Teresa y Sanchez-Ballesta 2008). En frutilla, las antocianidinas presentes en
mayor cantidad son las pelargonidinas, seguidas en mucho menor medida por las
cianidinas (da Silva y col. 2007).
Además de las funciones mencionadas anteriormente, las antocianinas también
pueden actuar en las plantas como antioxidantes, fitoalexinas o como agentes
antibacterianos (Kong y col. 2003). Por otro lado, desde el punto de vista productivo
aportan calidad a los frutos haciéndolos más atractivos para los consumidores por sus
llamativos colores. Es de destacar que en los últimos años creció el número de estudios
sobre diversos efectos benéficos y protectivos para la salud humana de las antocianinas
presentes en frutos y vegetales. Entre ellos se destacan su contribución en la protección
antioxidante, el mantenimiento de la integridad del ADN, y sus efectos antiinflamatorios,
antimutagénicos y cardioprotectores debido a su capacidad para mantener la
permeabilidad vascular (Bagchi y col. 2004).
1.2. Síntesis de antocianinas a través de la vía fenilpropanoide

La vía de síntesis de antocianinas involucra varias enzimas, como PAL (fenilalanina
amonio liasa), CHS (chalcona sintasa), CHI (chalcona isomerasa), (F3H) flavanona 3-
90
hidroxilasa, (DFR) dihidroflavonol 4-reductasa, (F3’H) flavonoide 3-hidroxilasa, (ANS)

antocianidin sintasa y (F3GT) flavonoide 3-O-glucosiltransferasa (Figura 39).
Fenilalanina
PAL
Acido cinámico
C4H, 4CL
p-coumaroil-CoA Vía fenilpropanoide general
Malonil CoA CHS Vía flavonoide

Naringerin chalcona
CHI
Naringerina (flavanona)
F3H
Dihidroxikaemferol
DFR F3’H
Leucopelargonidina Dihidroxiquercitina
DFR
ANS
Leucocianidina
Pelargonidina
ANS
F3GT Cianidina
Pelargonidin 3-O-glucósido F3GT
Cianidin 3-O-glucósido
Figura 39: Esquema de la vía de biosíntesis de antocianinas con énfasis en los

principales productos obtenidos en frutilla. PAL: fenilalanina amonio liasa; C4H:
cinamato 4-hidroxilasa; 4CL: 4-cumarato CoA ligasa; CHS: chalcona sintasa; CHI:
chalcona isomerasa; F3H: flavanona 3-hidroxilasa; DFR: dihidriflavonol 4-
reductasa; F3’H: flavonoide 3 hidroxilasa; ANS: antocianidin sintasa; F3GT:
flavonoide 3-O-glucosiltransferasa.
Según los trabajos publicados hasta el momento, existen dos grupos de genes que
se requieren para la biosíntesis de antocianinas: genes estructurales, que codifican para
enzimas que directamente participan en la formación de antocianinas y otros flavonoides
como los que se mencionaron previamente, y genes regulatorios que controlan la
transcripción de los genes estructurales. Las actividades de las enzimas en varias de las
ramificaciones de la vía se encuentran altamente reguladas. A su vez, la vía está también
91
regulada diferencialmente en el desarrollo y variaciones ambientales (Winkel-Shirley

2001). Existen también evidencias que indicarían que las enzimas involucradas en el
metabolismo flavonoide estarían asociadas a membranas, formando así complejos
multienzimáticos que tendrían implicancias en la eficiencia, la especificidad y la
regulación de esta vía (Winkel-Shirley 1999; Winkel-Shirley 2001; Winkel 2004). De esta
manera, se produciría lo que se denomina “canalización metabólica” que permitiría
controlar el flujo entre múltiples ramificaciones de una misma vía que frecuentemente
funcionan en la misma célula (Figura 40) (Winkel 2004).
derivados de cianidina
quercitina
fenilalanina kaempferol
malonil-CoA
derivados de pelargonidina
Figura 40: Modelo de la organización de las enzimas de la vía fenilpropanoide

para la producción de antocianidinas y flavonoles. Ejemplo de lo que
posiblemente ocurriría en frutilla. PAL: fenilalanina amonio liasa; C4H: cinamato
4-hidroxilasa; 4CL: 4-cumarato CoA ligasa; CHS: chalcona sintasa; CHI: chalcona
isomerasa; F3H: flavanona 3-hidroxilasa; DFR: dihidriflavonol 4-reductasa; F3’H:
flavonoide 3 hidroxilasa; FLS: flavonol sintasa; ANS: antocianidin sintasa; F3GT:
flavonoide 3-O-glucosiltransferasa.
Como se mencionó en el capítulo II, PAL es la primera enzima que actúa en la vía
fenilpropanoide catalizando la formación de ácido cinámico a partir del aminoácido L-
fenilalanina, en una reacción que es considerada clave dado que representa el punto de
control del flujo de entrada de carbono a esta vía (Taiz y Zeiger 1998). Además de las
antocianinas, por esta vía se sintetizan también otros compuestos que poseen diferentes
funciones importantes para las plantas, como por ejemplo defensa contra patógenos,
protección contra el daño provocado por los rayos UV, formación de paredes celulares
secundarias, etc. En relación a la síntesis de pigmentos, existen diversos trabajos donde
se observa que los niveles de ARN mensajero de PAL aumentan en concordancia con la
92
acumulación de antocianinas en frutos de arándano y naranja (Jaakola y col. 2002; Lo

Piero y col. 2005).
En plantas, generalmente estas enzimas son codificadas por familias de genes que
poseen desde 2 miembros, como es el caso de frambuesa (Kumar y Ellis 2001), 3 en
poroto (Liang y col. 1989), 4 en perejil (Lois y col. 1989) y Arabidopsis (Wanner y col.
1995), 5 en tomate (Lee y col. 1992; Guo y Wang 2009) y hasta un máximo de 40 a 50
genes en papa (Joos y Hahlbrock 1992). En general, es muy poco lo que se conoce de
estos genes en frutos; particularmente en frutilla, en donde sólo existen trabajos que
describen la actividad de esta enzima durante la maduración (Given y col. 1988b; Cheng y
Breen 1991). Hasta el momento no se han obtenido genes completos de PAL de frutilla y
por lo tanto no se ha podido caracterizar a los mismos en relación a la acumulación de
antocianinas en estos frutos, atributo muy importante en la determinación de la calidad
de estos frutos. De esta manera, nos propusimos obtener la secuencia completa de PAL
de frutilla y analizar su expresión y actividad durante la maduración de dos variedades
que poseen diferencias en la acumulación de pigmentos, estudiando no sólo el fruto
entero, sino también lo que ocurre en diferentes tejidos del mismo.
93
CAPÍTULO III: RESULTADOS
2. Resultados
2.1. Clonado y caracterización del ADNc completo correspondiente a una PAL

de frutilla
Mediante la búsqueda en una biblioteca de ADNc y con la utilización de la técnica
de 5’RACE (ver Materiales y Métodos 17), se obtuvo la secuencia completa de una PAL de
frutilla a la que denominamos FaPAL1. La misma consta de un marco abierto de lectura
de 2167 pb que codificaría para una proteína de 719 amino ácidos (Figura 41) con masa
molecular predicha de 78,026 KDa y un pI teórico de 6,13. Además, se obtuvieron 306 y
266 pb correspondientes a las regiones 5’y 3’ no traducibles, respectivamente.
Al realizar un alineamiento con otras PALs de plantas y particularmente de frutos
(Figura 41), encontramos que nuestra secuencia tenía un 89,7% de identidad con RiPAL1
de frambuesa (Rubus ideaus, Q9M568) (Kumar y Ellis 2001). También compartía un 80,2%
de identidad aminoacídica con una PAL perteneciente a cereza (Prunus avium,
AAC78457), un 79% con tomate (Solanum lycopersicom, P35511) y un 77,2% con una PAL
perteneciente a Arabidopsis thaliana (NP_181241). Por otro lado, este alineamiento puso
de manifiesto la presencia de un gran número de residuos conservados entre estas
especies (Figura 41) y de un único dominio denominado PAL-HAL (fenilalanina amonio
liasa-histidin amonio liasa) que presenta todos los residuos que formarían parte del sitio
activo de la enzima (Figura 41) (Röther y col. 2001). Cabe destacar que estas proteínas
son activas como homotetrámeros, por lo que en el dominio PAL-HAL se encontraron los
92 residuos que interaccionan para formar esta estructura cuaternaria. También, se pudo
observar un putativo sitio de fosforilación post-traduccional (Thr-545) detectado
previamente en la secuencia de una PAL perteneciente a poroto (Phaseolus vulgaris)
(Allwood y col. 1999).
Para el estudio de las relaciones evolutivas entre PALs, se utilizaron diversas
secuencias de proteínas pertenecientes a PALs de vegetales y hongos, pero también se
incluyeron HALs (histidin amonio liasas). Estas enzimas son homólogas a PAL y se
encuentran presentes en bacterias y animales; poseen una función análoga a la de PAL en
plantas, catalizando en este caso la conversión de L-histidina en trans-urocanato.
Utilizando el programa Mega 4.0 (Tamura y col. 2007) con un bootstrap de 1000 réplicas,
94
se formaron 3 grandes grupos: el de las HALs de bacterias, el correspondiente a las PALs

de hongos y el que incluye a las PALs de plantas (Figura 42).
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
*** * ##
* * #* ######## #
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
***** *
## # #
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
## ## # # * *## ##
# ### ## # ## ## ## *
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
### *
# ####### ## # # # # # # # # ## # #### # ###### #### ##
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
##### # ## # ##
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
FaPAL1
R. ideaus
S. lycopersicum
P. avium
A. thaliana
Figura 41: Alineamiento de la secuencia proteica predicha para FaPAL1 con PAL
de frambuesa (Rubus ideaus, Q9M568), tomate (Solanum lycopersicon, P35511),
cereza (Prunus avium, AAC78457) y Arabidopsis thaliana (NP_181241). El
alineamiento se generó con el método ClustalW (Thompson y col. 1994). Los
aminoácidos se numeraron de acuerdo con la estructura primaria de las
proteínas, con residuos idénticos y similares representados en cajas color negro y
gris, respectivamente. El dominio PAL-HAL se encuentra marcado con una línea
por encima del alineamiento. Símbolos: *, residuos pertenecientes al sitio activo;
#, residuos que interaccionan en el homotetrámero; ▲, sitio putativo de
fosforilación.
95
Como era de esperar, FaPAL1 se ubicó dentro del grupo de las plantas
dicotiledóneas formando un cluster con la proteína RiPAL1 perteneciente también a la
familia de las Rosáceas (Figura 42).
Plantas (PAL)
Dicotiledónes
Monocotiledónes
Hongos (PAL)
Bacterias (HAL)
Figura 42: Análisis filogenético incluyendo miembros de PALs de plantas y hongos

y HALs de bacterias. Los números de acceso del GenBank se indican al costado del
nombre de la proteína. El dendrograma se construyó usando el programa Mega
4.0 (Tamura y col. 2007) para generar un alineamiento que se sometió al análisis
de reconstrucción de filogenia utilizando el método de Neighbor-Joining (Saitou y
Nei 1987) (corrección modelo amino Poisson, bootstrap con 1000 replicados). Al
lado de las ramificaciones se muestra el porcentaje de réplicas de árboles en las
cuales los taxa se asociaron en un mismo grupo, dentro de las 1000 réplicas
realizadas.
96
2.2. Expresión de FaPAL1 en diferentes tejidos de frutilla

La expresión génica de FaPAL1 se analizó en diferentes tejidos vegetativos y
reproductivos de la planta. Para la detección del ARN mensajero se utilizó la sonda
obtenida a partir de los cebadores fPAL3utr y rPAL3utr (ver Tabla II de Materiales y
32
Métodos) marcada con P. En este experimento, se observó señal sólo en los tejidos
correspondientes a fruto 100% rojo perteneciente tanto a la variedad Toyonoka como a la
variedad Camarosa (Figura 43), aunque en esta última la señal fue más intensa. Este
patrón sugiere que, considerando los tejidos que fueron analizados en este trabajo,
FaPAL1 poseería una expresión específica del fruto.
Figura 43: Expresión génica de FaPAL1 en diferentes tejidos por Northern-blot. En

la parte superior de la figura se indican los tejidos analizados (raíz (R), hoja (H),
sépalos (S), pétalos (P), aquenios de frutos verde grande (AqVG), aquenios de
frutos 75% rojo (Aq75), frutos 100% rojo de la variedad Toyonoka (T100) y frutos
100% rojo de la variedad Camarosa (C100)). Las sondas utilizadas (FaPAL1 o
ARNr 18S) se indican a la izquierda de la figura.
2.3. Fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con diferentes

acumulación de antocianinas
2.3.1. Acumulación de pigmentos (antocianinas) en Camarosa y Toyonoka

Para analizar la relación entre fenilalanina amonio liasa y la acumulación de
antocianinas en frutilla, decidimos comparar dos variedades que poseen diferente
coloración una vez maduras. Como se muestra en la figura 44, los frutos de la variedad
Camarosa desarrollan un color rojo muy intenso durante la maduración, mientras que los
frutos de la variedad Toyonoka desarrollan una coloración rojiza mucho más tenue
(Figura 44).
97
Figura 44: Variedades de frutilla que poseen diferente coloración durante su

maduración. En la parte superior de la figura se indican los distintos estadios de
maduración (verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R)
y 100% rojo (100%R). Las dos variedades analizadas (Camarosa y Toyonoka) se
indican a la izquierda de la figura.
Para corroborar que la diferencia de coloración entre las dos variedades se debía a
una diferente acumulación de antocianinas durante la maduración, se midió la cantidad
presente de estos pigmentos en los distintos estadios de maduración analizados (Figura
45). La cantidad de antocianinas fue casi indetectable en los estadios verde pequeño y
blanco en ambos cultivares. En ambos casos, el contenido de estos pigmentos aumentó
gradualmente a partir del estadio 50% rojo hasta alcanzar su máximo en el estadio
100%R. Sin embargo, aunque no se observaron diferencias significativas en el estadio 50%
rojo entre las dos variedades, Camarosa acumuló mayor cantidad de antocianinas con
respecto a Toyonoka en los estadios de madurez más avanzados. El contenido de
antocianinas en frutos de la variedad Camarosa en estadios de madurez 75%R y 100%R
fue aproximadamente dos y cinco veces mayor, respectivamente, que en Toyonoka
(Figura 45).
98
1000
Toyonoka
Camarosa
800 **
Antocianinas
600
(nmol * g )
-1
400
**
200
0
VP BL 50 % 75 % 100 %
Estadios de maduración
Figura 45: Acumulación de antocianinas en variedades de frutilla que poseen

diferente coloración durante su maduración. Se realizó la extracción de los
pigmentos con una solución de metanol-HCl 1% v/v en los distintos estadios de
maduración (verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R)
y 100% rojo (100%R)). Las variedades analizadas fueron Camarosa y Toyonoka.
La cantidad de antocianinas se expresó en nanomoles por gramo de fruto. El
doble asterisco indica que los valores son significativamente diferentes (P < 0,01)
entre ambas variedades comparando frutos pertenecientes al mismo estadio de
maduración.
2.3.2. Expresión de FaPAL1 durante la maduración de Camarosa y Toyonoka

En un primer intento de analizar lo que ocurría con la expresión de PAL de frutilla
durante la maduración de ambas variedades, se sintetizó una sonda a partir de la única
secuencia nucleotídica parcial (264 pb) de esta enzima, disponible en el GenBank,
perteneciente a la variedad de frutilla Andana crown (AJ871757). El patrón de expresión
obtenido fue similar en ambas variedades. La señal correspondiente al transcripto se
detectó a partir del estadio verde pequeño, desapareció completamente en el blanco y
luego se observó una acumulación gradual desde el estadio 50% rojo hasta el final de la
maduración (100% rojo) (Figura 46). Sin embargo, en todos los estadios analizados, la
variedad Camarosa presentó una señal de expresión del gen mucho más intensa con
respecto a Toyonoka, indicando que la expresión de este gen es mayor en dicha variedad.
99
VP BL 50%R 75%R 100%R
FaPAL
Camarosa
ARNr 18S
FaPAL
Toyonoka
ARNr 18S
Figura 46: Expresión de FaPAL en variedades de frutilla que poseen diferente

acumulación de antocianinas durante la maduración. En la parte superior de la
figura se indican los distintos estadios analizados (verde pequeño (VP), blanco
(BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo (100%R)). Las dos variedades
(Camarosa y Toyonoka) y diferentes sondas (FaPAL y ARNr 18S) utilizadas se
indican a la derecha e izquierda de la figura, respectivamente.
Una vez obtenida la secuencia completa de la PAL de frutilla (FaPAL1), se preparó

una nueva sonda para determinar nuevamente la expresión de este gen durante la
maduración de ambas variedades. En este caso, la sonda fue sintetizada a partir de una
de las regiones no codificantes del ARN mensajero (3’UTR) basado en el conocimiento de
que estas enzimas, en diferentes especies de plantas, conforman familias génicas cuyos
miembros son muy similares entre sí, y que las mayores divergencias entre las secuencias
se encuentran en sus regiones no traducibles. De esta manera, obtuvimos un patrón de
expresión diferente al anterior, probablemente más representativa de la expresión del
gen FaPAL1, donde la señal obtenida en el estadio verde pequeño desaparece y se hace
mucho más tenue en los demás estadios analizados (Figura 47). Sin embargo,
nuevamente la mayor expresión de FaPAL1 se detectó en la variedad Camarosa.
100
VP BL 50%R 75%R 100%R
FaPAL1
Camarosa
ARNr 18S
FaPAL1
Toyonoka
ARNr 18S
Figura 47: Expresión de FaPAL1 en variedades de frutilla que poseen diferente

acumulación de antocianinas durante la maduración. En la parte superior de la
figura se indican los distintos estadios analizados (verde pequeño (VP), blanco
(BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo (100%R)). Las dos variedades
(Camarosa y Toyonoka) y diferentes sondas (FaPAL1 y ARNr 18S) utilizadas se
indican a la derecha e izquierda de la figura, respectivamente.
2.3.3. Actividad PAL durante la maduración de ambas variedades

Se midió la actividad PAL durante la maduración de frutillas pertenecientes a las
variedades Camarosa y Toyonoka (Figura 48). La misma fue detectada en todos los
estadios analizados en ambas variedades, no observándose diferencias significativas de la
actividad en los estadios comprendidos entre el verde pequeño y el 75% rojo inclusive.
Sin embargo, en el 100% rojo, la actividad PAL disminuyó levemente en la variedad
Toyonoka, mientras que en la variedad Camarosa aumentó bruscamente alcanzando
valores 5 veces mayores que los hallados en Toyonoka (Figura 48).
101
3,55e-5 Toyonoka **
Camarosa
3,50e-5
3,45e-5
Actividad PAL
(DO s-1 kg-1)
3,40e-5
3,00e-6
2,00e-6
1,00e-6
0,00
VP BL 50%R 75%R 100%R
Estadios de maduración
Figura 48: Actividad PAL durante la maduración de variedades con diferente

acumulación de antocianinas. Se analizaron distintos estadios de maduración
(verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo
(100%R)) en ambas variedades (Camarosa y Toyonoka). La actividad de la enzima
se expresó como la variación de DO por segundo y por kilogramo de fruto. El
doble asterisco indica que los valores pertenecientes al mismo estadio de
maduración son estadísticamente diferentes entre sí a P<0,01.
2.4. Fenilalanina amonio liasa en variedades de frutilla con acumulación

diferencial de pigmentos dentro de distintos tejidos del fruto
2.4.1. Acumulación de antocianinas en los tejidos externos e internos de frutos

de las variedades Camarosa y Toyonoka
Además de las diferencias en el desarrollo del color previamente descriptas para
estas variedades (punto 2.3.1.), también observamos que dichos frutos acumulan
pigmentos de manera diferente en sus tejidos (Figura 49). Mientras que Camarosa
desarrolla un color rojo más homogéneo desde el exterior hasta el interior del fruto,
Toyonoka prácticamente no acumula pigmentos en la parte interna del mismo (Figura
49).
102
Figura 49: Variedades de frutilla que poseen diferente desarrollo de coloración en

los tejidos del fruto, durante su maduración. En la parte superior de la figura se
indican los distintos estadios de maduración (verde pequeño (VP), blanco (BL),
50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo (100%R)). Las dos variedades
analizadas (Camarosa y Toyonoka) se indican a la izquierda de la figura.
Para facilitar el estudio, se consideró como parte externa del fruto al tercio
externo que comprende la epidermis y parte del parénquima, y como parte interna a los
dos tercios restantes, que comprenden lo que queda de parénquima y la zona medular
(Figura 50). Las partes externas e internas de frutos de ambas variedades fueron
separadas y se midió la cantidad de antocianinas presente en las mismas (Figura 51).
Figura 50: Sección de una frutilla donde se señalan las regiones consideradas
como externa e interna del fruto.
103
Como se mencionó previamente para el caso de los frutos enteros, la cantidad de

antocianinas aumentó con el transcurso de la maduración en ambas variedades. Los
resultados mostrados en la Figura 51 indican que el contenido de antocianinas es mayor
en el tejido externo tanto en Toyonoka como en Camarosa. Asimismo, la variedad
Camarosa acumuló mayor cantidad de pigmentos en ambas regiones del fruto con
respecto a Toyonoka. Cabe destacar que la acumulación de antocianinas en el tejido
interno de Camarosa es mayor que la observada en el tejido externo de Toyonoka. En
esta ultima variedad, no se detectaron pigmentos en los tejidos internos hasta el estadio
maduro (100% rojo), en el cual se determinó la presencia de una pequeña cantidad de
antocianinas.
Camarosa Toyonoka
1000
**
Externo Externo
Interno Interno
800
Antocianinas
600
(nmol g )
-1
**
400
**
**
200
** **
0
VP BL 50%R 75%R 100%R VP BL 50%R 75%R 100%R
Estadios de maduración Estadios de maduración
Figura 51: Acumulación de antocianinas en los tejidos externos e internos de

variedades de frutilla (Toyonoka y Camarosa) que poseen diferente coloración
durante su maduración. Se realizó la extracción de los pigmentos con una
solución de metanol-HCl 1% v/v en tejidos externos e internos de los distintos
estadios de maduración (verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo (50%R), 75%
rojo (75%R) y 100% rojo (100%R). La cantidad de antocianinas se expresó en
nanomoles por gramo de fruto. El doble asterisco indica que los valores son
significativamente diferentes (P<0,01) entre tejidos externo e interno de frutos
pertenecientes al mismo estadio de maduración.
2.4.2. Expresión de FaPAL1 en tejidos externos e internos de las variedades

Toyonoka y Camarosa
Cuando analizamos la expresión de FaPAL1 en ambos tejidos (externo e interno)
en las dos variedades, observamos que la expresión de este gen era más temprana en los
104
tejidos externos de ambas variedades (Figura 52). En estos tejidos se obtuvo señal a partir
del estadio 50% rojo y la misma se mantuvo constante hasta el final de la maduración. En
cambio en los tejidos internos el patrón de expresión fue diferente: mientras que en
Camarosa se observa señal desde el estadio 50% hasta el 100% rojo, con un máximo en el
75%, en Toyonoka hay una leve señal en el estadio 75 y 100% rojo. Igual que ocurrió con
la expresión de FaPAL1 en los frutos enteros, tanto en el tejido externo como en el
interno Camarosa posee mayores niveles de transcriptos que Toyonoka (Figura 52).
externo interno
VP BL 50%R 75%R 100%R VP BL 50%R 75%R 100%R
FaPAL1
Camarosa
ARNr 18S
FaPAL1
Toyonoka
ARNr 18S
Figura 52: Expresión de FaPAL1 en diferentes tejidos (externo e interno) de

variedades de frutilla que poseen diferente acumulación de antocianinas durante
la maduración. En la parte superior de la figura se indican los distintos estadios
(verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo
(100%R)) y tejidos (externo e interno) analizados. Las dos variedades (Camarosa y
Toyonoka) y diferentes sondas (FaPAL1 y ARNr 18S) utilizadas se indican a la
derecha e izquierda de la figura, respectivamente.
2.4.3. Actividad PAL en tejidos externos e internos de las variedades Camarosa

y Toyonoka
Se midió la actividad de la enzima en los tejidos externos e internos de ambas
variedades, y los resultados se ilustran en la Figura 53. Sorprendentemente, las
mediciones de la actividad PAL en ambos tejidos arrojaron valores más altos en los tejidos
internos que en los externos, tanto en Camarosa como en Toyonoka. Particularmente, en
los tejidos externos de Camarosa la actividad PAL presentó valores dentro del rango de
los obtenidos para Toyonoka. Sin embargo, en la parte interna del fruto la actividad
comenzó a aumentar en el estadio 50% para alcanzar un máximo en el 75%,
disminuyendo posteriormente en el 100% rojo, pero siempre se mantuvo por encima de
105
los valores observados en los tejidos externos de esta variedad. En Toyonoka, la actividad
PAL fue significativamente más alta en los tejidos internos pertenecientes a los estadios
de maduración blanco y 50%, no encontrándose diferencias en el 75% con respecto a la
parte externa del fruto. Por último, la actividad mostró un fuerte aumento en el tejido
interno del estadio 100% donde se observaron los valores más altos para esta variedad
(figura 53).
Camarosa Toyonoka
Toyonoka
1,2e-4
D
1,0e-4
8,0e-5
(DO s-1 kg-1)
Actividad PAL
6,0e-5 E
C
4,0e-5
E
2,0e-5 e B
d C d
c d B
c e
a b a a b a
0,0
VP BL 50%R 75%R100%R VP BL 50%R 75%R100%R VP BL 50%R 75%R100%R VP BL 50%R 75%R100%R
externo interno externo interno
Estadios de maduración Estadios de maduración
Figura 53: Actividad PAL durante la maduración en diferentes tejidos (externos e

internos) de variedades con distinta acumulación de antocianinas. Se analizaron
distintos estadios de maduración (verde pequeño (VP), blanco (BL), 50% rojo
(50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo (100%R)) y tejidos del fruto (externo e
interno), en ambas variedades (Camarosa y Toyonoka). La actividad de la enzima
se expresó como la variación de DO por segundo y por kilogramo de fruto. Letras
minúsculas y mayúsculas representan diferencias significativas (P<0,05) entre
diferentes tejidos dentro de un mismo estadio de maduración pertenecientes a la
misma variedad.
106
CAPÍTULO III: DISCUSIÓN
3. Discusión
Fenilalanina amonio liasa (PAL) es una enzima clave de la vía fenilpropanoide en
las plantas, a partir de la cual se sintetizan muchos compuestos importantes que poseen
diversas funciones biológicas como defensa contra patógenos, protección contra los rayos
UV, señalización, etc. (Taiz y Zeiger 1998). Entre los productos sintetizados a partir de esta
vía, se encuentran las antocianinas, pigmentos muy importantes como atrayentes de
insectos y animales que ayudan a la polinización de las flores y posteriormente a la
dispersión de las semillas. Estos pigmentos se acumulan a lo largo de la maduración de
ciertos frutos otorgándoles, desde el punto de vista comercial, un gran valor económico al
hacerlos sumamente atractivos para los consumidores. Particularmente en frutilla, las
antocianinas se acumulan en los estadios maduros de los frutos haciéndolas vistosas y
confiriéndoles a quienes los consumen, atributos benéficos para la salud, otra
particularidad que hace aún más interesantes los estudios de estos pigmentos en frutos
(Bagchi y col. 2004; de Pascual-Teresa y Sanchez-Ballesta 2008).
Aunque existen varios estudios previos en los que se analiza la actividad PAL a lo
largo de la maduración de frutilla (Given y col. 1988b; Cheng y Breen 1991; Halbwirth y
col. 2006), es la primera vez que se obtiene la secuencia completa de una PAL en este
fruto. Hasta el momento del inicio de la presente tesis, sólo existía en el GenBank una
secuencia parcial de una PAL de frutilla. Dicha secuencia de 264 pb, que había sido
descripta en la variedad Andana crown (AJ871757), fue empleada para fabricar la sonda
que se utilizó para la búsqueda en la biblioteca de ADNc y para los primeros estudios de
expresión realizados. Posteriormente se sumaron al GenBank 5 secuencias parciales de
563 pb denominadas FaPAL1 (AB360390), FaPAL2 (AB360391), FaPAL3 (AB36392),
FaPAL4 (AB360393) y FaPAL5 (AB360394). Utilizando las técnicas mencionadas
anteriormente, obtuvimos una secuencia completa de 2656 pb, que codificaría para una
proteína de 719 aminoácidos, tamaño que se encuentra dentro del rango reportado para
las PAL descriptas en otras especies de plantas. El análisis y la comparación de FaPAL1 con
otras proteínas de frutos y plantas, revelaron que la proteína contiene un gran dominio,
conservado desde bacterias hasta plantas y animales, denominado PAL-HAL dentro del
cual se encontrarían todos los residuos que formarían parte del sitio activo de la enzima
(Schwede y col. 1999; Röther y col. 2001) y todos aquellos que participarían en la
interacción de las cadenas polipeptídicas para formar el homotetrámero (Figura 41). Esto
107
nos hace pensar que estaríamos frente a un gen que codifica para una enzima que sería
funcional en frutilla. Utilizando el programa PSORT (Nakai y Kanehisa 1991), no se obtuvo
ningún tipo de péptido señal para esta proteína, lo que sugiere que la misma es
acumulada en el citoplasma, coincidiendo con los datos conocidos hasta el momento con
respecto a la ubicación celular de estas enzimas (Winkel-Shirley 1999; Winkel-Shirley
2001; Winkel 2004). Por otro lado, la secuencia de FaPAL1 incluye un sitio de fosforilación
conservado en las PALs de plantas (Figura 41), lo que indicaría una posible regulación de
la actividad de esta enzima a través de este mecanismo postraduccional (Allwood y col.
1999).
El análisis filogenético realizado con la proteína, mostró que la misma es muy
cercana a la enzima RiPAL1 de frambuesa (Rubus ideaus), especie perteneciente a la
familia de las rosáceas al igual que frutilla (Figura 42). Sin embargo, el patrón de
expresión de RiPAL1 es completamente diferente al de FaPAL1, dado que la primera se
expresa en diferentes tejidos de la planta y en todos los estadios de maduración del fruto,
principalmente en los inmaduros (Kumar y Ellis 2001), mientras que la segunda es
específica de fruto (Figura 43) y su expresión aumenta hacia el final de la maduración,
coincidiendo con el momento en que la acumulación de antocianinas es mayor (Figura 47
y 45, respectivamente).
Las variedades Camarosa y Toyonoka de frutilla desarrollan diferente grado de
coloración al madurar (Figura 44), y ésto se debe a que la primera de ellas presenta una
mayor acumulación de antocianinas durante la maduración (Figura 45). Tratando de
establecer si existía una relación entre la expresión de FaPAL1 y la acumulación de
pigmentos durante la maduración de estos frutos, se determinó que la expresión de
FaPAL1 fue mayor en la variedad más coloreada (Figura 47) y que la actividad PAL fue 5
veces más alta en estos frutos con respecto a Toyonoka en el estadio maduro (Figura 48).
Trabajos previos realizados en frutilla relacionan un pico de actividad PAL obtenido en los
últimos estadios de maduración con el aumento gradual y simultáneo de antocianinas
observado en estos frutos (Given y col. 1988b; Cheng y Breen 1991). En nuestro trabajo
este pico de actividad no se manifiesta en Toyonoka, que es justamente la variedad que
posee una menor acumulación de pigmentos durante su maduración (Figura 48).
En plantas, las PALs están codificadas por pequeñas familias génicas (Kumar y Ellis
2001; Liang y col. 1989; Lois y col. 1989; Wanner y col. 1995; Lee y col. 1992; Guo y Wang
108
2009), con la excepción de papa donde se encontraron alrededor de 40 isoformas de PAL

(Joos y Hahlbrock 1992). Existen varios indicios que sugieren que lo mismo ocurriría en
frutilla, y que por lo tanto estamos analizando una de todas las PALs que estarían
presentes en esta especie. En primer lugar, y como se mencionó previamente en esta
discusión, en las bases de datos se encuentran 5 fragmentos diferentes de PALs de
frutilla. Además, los resultados obtenidos en los experimentos de expresión realizados
con diferentes sondas, construidas a partir de zonas distintas dentro de la secuencia del
gen, mostraron patrones que difieren entre sí. Al utilizar la sonda correspondiente a un
fragmento que se encuentra dentro del marco abierto de lectura, se encontró señal de
expresión en fruto inmaduro (VP) como así también a lo largo de la maduración (Figura
46). Sin embargo, al fabricar una sonda en una región más específica del transcripto
(3’UTR) no se obtuvo señal en el estadio verde pequeño y aunque la expresión fue
nuevamente más elevada en Camarosa, la diferencia de expresión entre ambas
variedades fue mucho menor a la observada anteriormente. Por último, al medir
actividad PAL encontramos diferencias al compararla con el patrón de expresión de
FaPAL1 observado previamente (Figura 48). Por un lado, detectamos actividad PAL en
todos los estadios de maduración analizados, inclusive en los inmaduros donde no se
observó expresión del gen. Además, se hallaron diferencias significativas en la actividad
PAL entre las variedades, solamente en el estadio 100% rojo, mientras que las diferencias
en la expresión ya son evidentes desde el estadio 50%. Todos estos datos, sugieren la
presencia de más de una enzima con actividad PAL en el fruto.
Además de las diferencias encontradas comparando los frutos enteros de ambas
variedades, es también evidente que la acumulación de pigmentos desde el exterior del
fruto hasta los tejidos internos es distinta. La variedad Camarosa desarrolla color rojo
tanto en el tejido externo del fruto como en el interno, mientras que los frutos de la
variedad Toyonoka permanecen prácticamente blancos en su interior (Figura 49). Esto fue
corroborado cuando se midieron las antocianinas en estos tejidos (Figura 51). En
Toyonoka no se detectaron pigmentos hasta el estadio 100% rojo en sus tejidos internos,
y los niveles de antocianinas fueron muy bajos comparados con los tejidos externos. Por
otro lado, Camarosa presentó valores más altos de antocianinas que Toyonoka, inclusive
comparando sus tejidos internos con los externos de esta última variedad. De la misma
manera, la expresión de FaPAL1 en estos tejidos fue diferente. Nuevamente, Camarosa
109
presentó mayor intensidad de señal que Toyonoka tanto en la parte interna como en la
externa del fruto, y la menor expresión de este gen fue observada en los tejidos internos
de esta última variedad, coincidiendo nuevamente con los datos obtenidos para
antocianinas. Sin embargo, las medidas de actividad PAL no coincidieron con los patrones
de expresión de FaPAL1, otro dato que nos indicaría que estaríamos en presencia de una
familia génica en frutilla, cuyos miembros podrían direccionar a la vía fenilpropanoide
hacia la formación de distintos productos mediante las diferentes ramificaciones de esta
ruta. En otros frutos, diferentes patrones de expresión encontrados para varias isoformas
de esta enzima fueron relacionados a distintas funciones: las PALs que se expresan
temprano en el desarrollo del fruto estarían implicadas en la síntesis de flavonoides y
compuestos fenólicos relacionados con la defensa de los frutos contra el ataque de
patógenos, mientras que las que se expresan mayormente hacia el final de la maduración
estarían relacionadas a la acumulación de antocianinas (Kumar y Ellis 2001; Guo y Wang
2009). Esto también fue postulado para frutilla, al encontrarse un doble aumento de la
actividad PAL en estos frutos. El primero de ellos, observado a los 5 días post-antesis,
concuerda con un aumento en los niveles de fenoles encontrados en ese momento del
desarrollo y el segundo pico de actividad PAL (27 días post antesis) que correlaciona con
la acumulación de antocianinas al final de la maduración (Cheng y Breen 1991).
Si se analiza la acumulación de antocianinas en los diferentes tejidos del fruto, en
ambas variedades, en relación a la actividad PAL presente en estos tejidos, nuevamente
se observan discrepancias ya que, los tejidos internos que acumulan menor cantidad de
pigmentos poseen mayor actividad PAL, tanto en Toyonoka como en Camarosa.
Posiblemente, esto se deba a que PAL no es la enzima que se encuentra en el punto de
regulación de la vía de las antocianinas. De esta manera, que haya una mayor actividad
PAL no implica que la misma se deba traducir en un mayor contenido de antocianinas,
dado que el ácido cinámico producido podría ser utilizado en la síntesis de otros
compuestos fenólicos en estos tejidos. Otra posible explicación podría ser que los
productos de la acción de PAL migren hacia la parte externa del fruto donde finalmente
fuesen transformados en antocianinas. Aunque existen trabajos que sugieren una
compartimentalización de la vía fenilpropanoide por medio del transporte intercelular
(Kaltenbach y col. 1999), otros autores proponen que los productos de esta vía se
acumulan sólo en las células en donde se producen (Dixon y Paiva 1995) y que esta ruta
110
se encontraría organizada en cada célula formando lo que se denomina “canalización

metabólica” (Hrazdina y col. 1982; Winkel 2004). Por otro lado, en trabajos recientes
realizados en dos variedades diferentes de uva, se caracterizó un transportador de
flavonoides homólogo a un transportador de bilirrubina de mamíferos (BTL). Estas
proteínas se expresaron mayormente en la piel de los frutos (donde se acumula la mayor
cantidad de pigmentos), tanto en vacuola como en pared celular, aumentando su
expresión hacia el final de la maduración (Braidot y col. 2008; Bertolini y col. 2009). Sin
embargo, en cualquiera de los casos son necesarios experimentos adicionales que nos
permitan dilucidar los mecanismos involucrados en la síntesis de antocianinas en frutilla.
En resumen, en esta parte del trabajo se obtuvo por primera vez la secuencia
completa de una PAL de frutilla (FaPAL1), que de acuerdo a los programas
bioinformáticos utilizados poseería todos los residuos necesarios para ser una proteína
funcional. Asimismo, se caracterizó la expresión de este gen comparando dos variedades
de frutilla con diferente acumulación de antocianinas en el fruto entero y en los
diferentes tejidos que lo conforman, observándose una correlación entre la expresión de
este gen y la mayor cantidad de pigmentos presentes en la variedad Camarosa. Por
último, se midió actividad PAL en estos frutos obteniéndose también mayores valores en
la variedad mas coloreada, aunque los patrones no son coincidentes con la expresión del
gen, lo cual sugiere la existencia de una familia génica de PAL en frutilla.
111
CONSIDERACIONES FINALES
Consideraciones finales
Tanto frutilla como otros frutos, sufren diversos cambios durante su maduración
entre los que se incluyen degradación de clorofilas y síntesis de pigmentos, generación de
aroma, modificaciones en el contenido de azúcares y cambios en la textura o
ablandamiento. Este ablandamiento es producido principalmente por enzimas que
degradan los diferentes componentes de las paredes celulares de los frutos provocando,
a su vez, que los mismos sean más susceptibles al ataque de patógenos. Todos estos
factores contribuyen a una menor vida postcosecha del fruto.
Durante mucho tiempo se emplearon diversos tratamientos químicos para evitar
las pérdidas ocasionadas en los frutos durante su producción y su postcosecha. Sin
embargo, en los últimos años surgieron nuevas tendencias que buscan la implementación
de tecnologías que sean inocuas tanto para los seres humanos como para el medio
ambiente. Entre éstas se encuentran los tratamientos con luz UV-C, que además de no ser
contaminantes, está comprobado que producen un retraso en la maduración, controlan la
infección por patógenos, son económicos y existe la posibilidad de combinarlos con otros
métodos físicos. Sin embargo, son escasos los trabajos que estudian los aspectos celulares
y moleculares del efecto de este tipo de tratamiento físico sobre los frutos.
Como se mencionó anteriormente, uno de los principales factores que acortan la
vida postcosecha es el ablandamiento, el cual es provocado principalmente por la acción
de enzimas y proteínas que desensamblan los diferentes componentes de la pared celular
de los frutos. De esta manera, en el capítulo I de la tesis nos propusimos analizar el efecto
del UV-C sobre la expresión y la actividad de estas proteínas. De acuerdo a los resultados
obtenidos, la irradiación con UV-C retrasa el ablandamiento durante la maduración de
frutillas almacenadas reduciendo la expresión de un grupo de genes involucrados en el
desensamblaje de la pared celular. Observamos una reducción de la expresión de genes
de degradación de pared en las primeras horas posteriores al tratamiento, mientras que
la reducción en la actividad enzimática de las proteínas correspondientes se produjo al
inicio del tratamiento en el caso de PME, o luego de uno o dos días de almacenamiento
para endoglucanasas y PG, respectivamente.
Botrytis cinerea es uno de los principales patógenos de frutilla y el responsable de
grandes pérdidas durante su producción y comercialización. En la segunda parte de este
113
trabajo, pudimos observar que frutos que fueron previamente irradiados con UV-C y
luego inoculados con una cepa de este hongo presentaban una importante disminución
en el porcentaje de frutos infectados. Además, la irradiación de los frutos con UV-C
incrementó la expresión y actividad de varias enzimas (PAL, peroxidasa, PPO, quitinasa y
β-1,3 glucanasa) que están involucradas en diferentes mecanismos de defensa contra
patógenos. De esta manera, es probable que el efecto benéfico de la irradiación con UV-C
esté mediado, al menos parcialmente, por la capacidad de la radiación para disparar
diferentes mecanismos de defensa que incrementan la resistencia de los frutos frente a la
infección con este patógeno.
En el estudio de las diferentes enzimas que participan en la defensa contra
patógenos analizamos a fenilalanina amonio liasa (PAL). Esta enzima tiene gran
importancia en frutilla, por encontrarse al comienzo de la vía fenilpropanoide a partir de
la cual se sintetizan, entre otros metabolitos, las antocianinas. Estos compuestos son los
principales pigmentos que se acumulan durante la maduración de frutilla y su contenido
constituye un atributo importante de calidad. Pese a la relevancia de esta enzima en la
maduración de frutilla, no existían secuencias completas de este gen en las bases de
datos analizadas. Como se detalla en el capítulo III de esta tesis, obtuvimos la secuencia
completa de una PAL de frutilla (FaPAL1) que codificaría, según el análisis de su
secuencia, para una proteína funcional. Además caracterizamos su expresión durante la
maduración de dos variedades con diferente acumulación de pigmentos, y se observó una
correlación entre la expresión de este gen, la actividad de la enzima y una mayor cantidad
de pigmentos presente en una de las variedades analizadas (Camarosa). Asimismo,
distintos resultados experimentales sugieren que este gen no es único, sino que
pertenecería a una familia génica de PAL en frutilla.
Uno de los resultados más auspiciosos de esta tesis es la demostración de que un
breve tratamiento con radiación UV-C permite no sólo retrasar la maduración sino que
también disminuye el ataque de patógenos, debido en parte a la inducción de una
respuesta activa en el tejido del fruto. Más aún, estaría ejerciendo su conocido efecto
germicida. Una mayor caracterización de los genes aquí descritos, sumado a una
extensiva búsqueda de otros genes que se activan en respuesta al tratamiento permitirá
identificar genes de interés, de suma utilidad para el diseño de estrategias de
conservación poscosecha, particularmente en lo referente a la defensa contra patógenos.
114
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
1. Material Vegetal
Se utilizaron frutillas (Fragaria x ananassa, Duch.) obtenidas de cultivos locales (La
Plata, Provincia de Buenos Aires, Argentina). Para el estudio del efecto del tratamiento
con UV-C sobre la expresión de genes asociados a la degradación de la pared celular, se
utilizó la variedad Aroma. En el caso del análisis de genes de defensa del fruto se utilizó la
variedad Toyonoka. Esta última variedad, junto con Camarosa, fue empleada para la
caracterización de fenilalanina amonio liasa (PAL). Para estos estudios, los frutos se
cosecharon y se clasificaron según su tamaño y color superficial en: verde pequeño (VP),
verde grande (VG), blanco (BL), 25% rojo (25%R), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R),
100% rojo (100%R) y sobremaduro (SM). Se procesaron aproximadamente 50 frutos de
cada estadio de maduración. A los mismos se les retiró el cálix y el pedúnculo.
Finalmente, se cortaron en fragmentos pequeños para su posterior congelado en
nitrógeno líquido y almacenado a -20 °C.
Además, se recolectaron raíces (R), hojas (H), sépalos (S), pétalos (P) y aquenios de
frutos verde grande (AqVG) y 75% rojo (Aq75) de la variedad Toyonoka. Las muestras se
congelaron con nitrógeno líquido y se guardaron a -80 °C para su posterior uso.
2. Tratamiento con UV-C

Se cosecharon frutillas (Fragaria x ananassa, Duch.) en el estadio de maduración
50% rojo. Inmediatamente, los frutos se transportaron al laboratorio donde se
seleccionaron 360 frutos de tamaño uniforme y ausencia de daño externo. De los frutos
seleccionados, 180 se irradiaron con UV-C y el resto fueron usados como controles. Para
el tratamiento con UV-C, los frutos fueron ubicados debajo de un banco de lámparas
germicidas de UV-C (TUV G30T8, 30W, Philips) e irradiados a una distancia de 30 cm hasta
obtener una dosis de 4,1 KJ m-2. La dosis de UV-C fue medida con un radiómetro digital
(Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, USA). Los frutos tratados (T) y
controles (C) fueron almacenados a 20 °C por un máximo de 96 h. Durante este período,
se tomaron 30 frutos irradiados y 30 controles a las 0, 48, 72 y 96 h, se les midió la
firmeza, se los cortó en pequeños trozos, se los congeló con nitrógeno líquido y se los
almacenó a -20 °C hasta su uso. Además, se colectaron 20 frutos tratados y controles
116
después de 4, 8 (ó 10 ó 18) y 24 h de almacenamiento, se cortaron en pequeños trozos, se

congelaron y guardaron a -20 °C.
3. Determinación de la firmeza
La firmeza fue medida en frutos controles y tratados después de 0, 48, 72 y 96 h
de almacenamiento a 20 °C, usando un Analizador de Textura (Texture Analyzer, TA.XT2,
Stable Micro Systems Texture Technologies), provisto de una sonda de 3 mm de
diámetro. Cada fruto fue penetrado 7 mm a una velocidad de 0,5 mm s-1, determinándose
la fuerza máxima que se debe realizar para penetrar el fruto. Se realizaron 3 mediciones
en la zona ecuatorial de cada fruto. Se emplearon 30 frutos en cada combinación de
tratamiento (irradiados o controles) y cada tiempo analizado (0, 48, 72 y 96 h).
4. Inoculación de frutos con Botrytis cinerea

El hongo necrotrófico Botrytis cinerea utilizado para este ensayo fue aislado de
cepas puras del IIB-INTECH (cepa ICFC377/00). Las cepas fueron cultivadas en tubos que
contenían el medio dextrosa-papa-agar (PDA) (ver apéndice), a 25 °C hasta el desarrollo
de los conidios. Luego, los conidios se resuspendieron en 0,03% v/v de Tween-20 y se
filtraron a través de 8 capas de gasa estéril. Después de calcular la cantidad de conidios
por ml de suspensión utilizando una cámara de Neubauer, el filtrado se diluyó a una
concentración final de 104 conidios ml-1 y se utilizó para la inoculación de los frutos.
Frutillas en un estadio de maduración 75% rojo se desinfectaron con 2% v/v de solución
comercial de hipoclorito de sodio (55 g de Cl2 activo l-1). Después de la desinfección
externa, la mitad de los frutos fue tratada con UV-C como se indica en 2 y la otra mitad
fue mantenida como control. Para prevenir contaminación entre frutos, los mismos
fueron puestos en bandejas de plástico individuales, inoculados con 20 μl de la
suspensión de esporas y almacenados a 20 °C durante 9 días. La aparición de señales
externas macroscópicas de crecimiento del hongo fue evaluada visualmente cada día
durante el período de almacenamiento y los resultados se expresaron como porcentaje
(%) de frutos infectados.
117
5. Extracción de ARN total

La extracción de ARN total se realizó usando el método de borato caliente (Wan y
Wilkins 1994). Para esto se trituraron 4 g de fruto con N2 líquido. Luego, se agregaron 15
ml de buffer de extracción (borato de sodio decahidratado (Bórax) 0,2 M; EDTA 30 mM;
SDS 1% p/v; deoxicolato de sodio 1% p/v; pH 9) previamente calentado a 80 °C. Antes de
utilizar el buffer se le agregaron los siguientes reactivos: DTT 10 mM; Nonidet P-40 1% v/v
y PVP-40 2% p/v. Al homogenato resultante se le agregó 150 μl de Proteinasa K (20 mg
ml-1) y se incubó 90 min a 42 °C. Posteriormente, se adicionaron 100 μl de KCl 2 M por
cada 1 ml de buffer de extracción y se incubó en hielo durante una hora. Se centrifugó a
12.000 x g a 4 °C durante 20 min, se recuperó el sobrenadante y se le agregó 1/3 del
volumen de LiCl 8 M. Se incubó a 4 °C durante toda la noche.
Al día siguiente, la mezcla se centrifugó a 12.000 x g a 4 °C durante 20 min, se
descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado 3 veces con 5 ml de LiCl 2 M frío,
centrifugando cada vez durante 10 min a 4 °C a 12.000 x g. El precipitado se resuspendió
en 2 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y se centrifugó durante 10 min a 4°C. El sobrenadante
se trató con 200 μl de acetato de potasio 2 M, pH 5,5 y se incubó en hielo durante 20 min
para eliminar los polisacáridos. Luego se centrifugó a 4 °C durante 10 min, al
sobrenadante se le agregaron 2,5 volúmenes de etanol absoluto y se lo dejó a -80 °C
durante 2:30 h. Luego de centrifugar a 9.700 x g a 4 °C durante 30 min, el ARN precipitado
se disolvió en 300 μl de agua tratada con DEPC (Diethyl pirocarbonate). Posteriormente,
se volvió a precipitar el ARN con 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M pH 6,0 y 2,5
volúmenes de etanol absoluto y se dejó durante toda la noche a -20 °C.
Finalmente, se centrifugaron las muestras a 16.000 x g durante 20 min a 4 °C y el
precipitado se lavó con etanol 70% v/v, centrifugando nuevamente a 16.000 x g durante 5
min a 4 °C. Luego de eliminar el etanol residual en un desecador al vacío, se disolvió el
ARN en 50 μl de agua tratada con DEPC. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su
uso.
6. Electroforesis de ARN en geles de agarosa-formaldehído y transferencia a

membranas
Para chequear la integridad del ARN extraído, cada muestra de ARN total (2 μl) fue
analizada por electroforesis en geles desnaturalizantes que contenían 1% p/v de agarosa,
118
1% v/v de formaldehído y MOPS 1X (ver apéndice). Previo a su siembra, se

desnaturalizaron las muestras durante 10 min, en una mezcla que contenía MOPS 1X,
formamida 50% v/v, formaldehído 20% v/v y bromuro de etidio 0,3 μg μl-1. En el caso de
los geles utilizados para realizar la transferencia, la concentración de agarosa fue de 1,2%
p/v y se sembraron 10 μg de RNA, previamente cuantificado en espectrofotómetro
(BioPhotometer Eppendorf). La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 60 V en
una solución de MOPS 1X.
Los geles se lavaron dos veces en agua destilada durante 10 min para eliminar el
exceso de formaldehído y se transfirieron por capilaridad a una membrana de nailon
Hybond-N+ (Amersham-GE Helthcare) utilizando una solución de SSC 20X (ver apéndice).
Luego, las membranas se secaron a temperatura ambiente y se fijó el ARN utilizando luz
ultravioleta para provocar el entrecruzamiento del mismo con la estructura de la
membrana (UV-Stratalinker, Stratagene).
7. Northern blot
7.1. Prehibridización de las membranas

Todas las membranas fueron incubadas durante 4 h a 42 °C con una solución de
formamida 50% v/v; SSPE 5X (ver apéndice); Denhart 1X (ver apéndice) y SDS 0,2% p/v,
con el agregado de 0,2 g l-1 de ADN de esperma de salmón como agente bloqueante.
7.2. Preparación de sondas

Todas las sondas fueron obtenidas a partir de reacciones de PCR, utilizando
cebadores específicos (Tabla II).
119
Tabla II: Descripción de cebadores utilizados en diferentes experimentos. Se

muestra el gen que amplifican, la nomenclatura y secuencia de los cebadores y el
uso de los mismos.
Gen Cebador Secuencia 5’-3’ Uso

FaPE1 FaPME1 GTT AAC TCT AGC ACA CCT AC Sonda para Northern
FaPME2 TTA GGC ATA GAA TGC AAC AC blot
FaPAL fFaPAL GAT GTC AAC TCC TTG GGA CTG Sonda para Northern
rFaPAL TCC ACG ACT GAG AGC AGG TG blot. Búsqueda en
biblioteca de ADNc.
5’WPAL ATC AAC TCT GTC AAC GAC AAT CC Secuenciación clones
3’WPAL TGT ACA ATG GAT AAG ACC TGC Secuenciación clones
5’WPAL2 GGT ATG GCT TCT GTG GTG CTG Secuenciación clones
FaPALrace5a TGC AGC TTC AAT CTG GCC CAG Reacción de 5’RACE
GGT GGT GC
fPAL3utr TCT AAT GGT GTC TAT ACA AGG C Sonda para Northern
rPAL3utr ACT GGG TAA AGA CAC ATT TG blot
FaPALrace5c TCT CCG GTG GGA GGT AGC ACC Reacción de 5’RACE
GAA CCC G
FaPALrace5d CTC CGG TGG GAG GTA GCA CCG Reacción de 5’RACE
AAC CCG G
rPAL5utr AGC TGC TGC CAA AGA TTC CGG C PCR
FaOLP2 fFaOLP2 AGC ACG ATT CGA TAT CCG A Sonda para Northern
rFaOLP2 TGT TGA ACT GGT TAA GCC CG blot
FaChi2-1 fFaChi2-1rt TGC AGC CTT CTA ATG ATC AAC RT-PCR
rFaChi2-1rt ACC Semicuantitativa
GAT GGC AGC GAG AGT ACT GC
FaChi2-2 fFaChi2-2rt CGA GAC TTT GGT CTT CTA GGC GG RT-PCR
rfaChi2-2rt AGG GAA ACG ATG ATA AGG GTG Semicuantitativa
AG
FaChi3 fFaChi3real GCA CAA AAC TTG TAG CAA CAA RT-PCR
rFaChi3rt GGC C Semicuntitativa
GCA CGA CTT GAT CTG CGA GCT G
FaBG2-1 fFaBG2-1rt TCA ATC ATG TGA AGA CCG GGA C RT-PCR
rFaBG2-1rt ACC TGC TGT TGC ATA CTT GC Semicuantitativa
FaBG2-3 fFaBG2-3rt TCT GAA GGT AGT GAT GCT GC RT-PCR
rFaBG2-3rt AGA CGA CAA AAA CAT AGG AAC C Semicuantitativa
ARNr 18s Rib5 ACC GTA GTA ATT CTA GAG CT Sonda para Northern
Rib3 CCA CTA TCC TAC CAT CGA AA RT-PCR
Semicuantitativa
120
7.2.1. Genes que codifican proteínas de degradación de la pared celular

Los fragmentos pertenecientes a FaEXP2 (AF159563), FaEXP4 (AF226701) y
FaEXP5 (AF226702) se obtuvieron de acuerdo a Dotto y col. (2006). En el caso de FaCel1,
la sonda fue preparada por amplificación de un fragmento que abarca desde la base 4 a
la 322 del gen FaCel1 (Harpster y col. 1998). La sonda utilizada para analizar la expresión
de FaPG1 fue preparada a partir de un fragmento de 1.008 pb (bases 286 a 1.294) del gen
FaPG1 (Villarreal y col. 2007). El fragmento de FaPE1 fue amplificado desde la base 1.276
hasta la 1.767 con cebadores específicos (Tabla II), diseñados en el laboratorio a partir de
la secuencia descripta por Castillejo y col. (2004).
7.2.2. Genes relacionados a mecanismos de defensa

Las sondas específicas para FaPAL (AJ871757) y FaOLP2 (DQ325524) fueron
obtenidas por PCR utilizando cebadores específicos diseñados a partir de secuencias
presentes en el GenBank. Los fragmentos sintetizados poseen un tamaño de 248 pb en el
caso de FaPAL y 272 pb para FaOLP2. Además, se diseñaron cebadores en la región 3’ no
traducible de FaPAL1 con los que se obtuvo un fragmento de 188 pb. En todos los casos,
se utilizó como molde una biblioteca de ADNc de frutilla madura (Civello y col. 1999),
construida en un vector Uni-ZAP XR (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
7.3. Marcado radiactivo de las sondas

Las sondas se marcaron radiactivamente por el método de cebado al azar (random
priming) usando 100 ng de ADN molde (previamente calentado a 100 °C durante 5 min y
enfriado en hielo 5 min), 5 μl de buffer ADN polimerasa 10X, 2 μl de mezcla de dCTP,
dGTP y dTTP 500 μM, 0,5 μl de hexámeros al azar (500 μg ml-1), 2 μl de BSA acetilada (10
mg ml-1), 1 μl de la enzima Klenow (5 U μl-1) y 4 μl de α-32P-dATP (10 mCi ml-1) en un
volumen final de 50 μl. La reacción se llevó a cabo durante 2 h a 37 °C. Luego la mezcla de
reacción se pasó por una columna de Sephadex G-50 equilibrada en solución reguladora
TE y se centrifugó a 3.000 rpm durante 1 min para separar la sonda marcada del exceso
de nucleótido radiactivo. Las sondas marcadas se desnaturalizaron a 100 °C durante 5 min
y enfriaron inmediatamente en hielo durante 5 min. Finalmente, se agregaron a los
correspondientes tubos de hibridación.
121
7.4. Hibridación de las membranas

Luego de fabricada la sonda como se indicó en el punto 7.3, la misma se dejó en
contacto con la membrana durante toda la noche a 42 °C, manteniendo una suave
rotación del tubo de hibridación. Posteriormente, se realizaron los lavados usando una
solución de SSC 1X y SDS 0,1% p/v. El primero de los lavados se hizo a 42 °C durante 30
min y los 3 siguientes a 50 °C también durante 30 min cada uno. Las membranas se
expusieron a placas radiográficas (X-OMAT, Kodak) a -80 °C y se revelaron luego de 10
días de exposición, aproximadamente, de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante.
7.5. Hibridación de las membranas con sonda para ARNr 18S

Para obtener el correspondiente control de carga de las membranas, se les retiró
la sonda específica utilizada previamente y se las hibridizó con una sonda que reconoce
ARN ribosomal 18S de frutilla. Para esto, la sonda específica original fue eliminada
cubriendo las membranas con una solución caliente de SDS 0,5% p/v y dejándolas en
contacto, con agitación, hasta que la solución alcanzó la temperatura ambiente. Las
membranas se secaron con papel de filtro y se hibridizaron con la sonda para ARNr 18S
como se indica en 7.4. En este caso, los últimos 3 lavados se realizaron a una temperatura
de 55 °C y las membranas se expusieron de 4 h a 3 d, dependiendo de la mayor o menor
cantidad de marca incorporada en la sonda.
8. Transcripción reversa (RT)

Se obtuvo ADN complementario (ADNc) realizando una reacción de transcripción
reversa a partir de 2 μg de ARN total, 0,1 mM de dNTPs, 1 μl de enzima transcriptasa
reversa (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase; 200 U μl-1), 5 μl de buffer
5X (Tris-HCl 50 mM, KCl 75 mM, MgCl2 3mM, DTT 10 mM, pH 8,3). Además, se agregaron
a la mezcla de las RTs realizadas para analizar la expresión de PME, 10 pmol de Poli T y 10
pmol de cebador Rib 3 (cebador 3’de ribosomales de frutilla); en cambio, para analizar la
expresión de genes de defensa se usaron 335 pmol de cebadores al azar (Random
primers, Byodinamics). La mezcla se llevó a un volumen final de 25 μl, luego se incubó
durante 1:30 h a 37 °C y finalmente se la dejó 10 min a 90 °C para inactivar la enzima.
122
9. Análisis de expresión por RT-PCR semicuantitativa
9.1. Expresión de FaPE1

La amplificación por PCR se realizó con 0,5 μl de producto de la transcripción
reversa (ADNc) como molde, realizada a partir de ARN total de estadios de maduración de
la variedad Aroma, y de frutos controles y tratados con UV-C a diferentes tiempos de
almacenamiento a 20 °C. A los 0,5 μl del producto se le agregaron: buffer Taq polimerasa
1X (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, pH 9,0), dNTPs 50 μM, MgCl2 1,5 mM, 1 U
de Taq polimerasa (Promega) y 50 pmol de cada cebador específico (FaPME1 y FaPME2,
ver Tabla II), en un volumen final de 20 μl. Se realizaron curvas para determinar el
número de ciclos en los cuales la reacción de PCR era lineal; en el caso de PME se
eligieron los ciclos 24 y 27. Como control de carga, se realizaron amplificaciones con
cebadores específicos para el ARNr 18S con un número de ciclos igual a 10, en el cual la
reacción de PCR conservaba la linealidad. Las condiciones de amplificación para ambos
genes (FaPE1 y ARNr 18S) se muestran en la Tabla III.
Los productos de PCR se analizaron en un gel 0,7% p/v de agarosa. Los geles
fueron sumergidos en buffer de desnaturalización (NaCl 1,5 mM, NaOH 0,5 mM) durante
30 min y luego en buffer de neutralización (NaCl 1,5 mM, Tris-HCl 0,5 mM, pH 7,5) otros
30 min. Posteriormente, se transfirieron por capilaridad a una membrana de nailon
Hybond-N+ (Amersham-GE Helthcare) utilizando una solución de SSC 20X. Luego, las
membranas se secaron a temperatura ambiente y se fijó el ADN utilizando luz ultravioleta
para provocar el entrecruzamiento del mismo con la estructura de la membrana (UV-
Stratalinker, Stratagene). Por último, las membranas fueron hibridizadas con las sondas
específicas, expuestas a placas fotográficas y reveladas como se indica en el punto 7.5.
123
Tabla III: Programas de PCR utilizados para la amplificación de fragmentos de

genes de interés.
Desnat. Programa Principal Extensión Número

Inicial Desnat. Anillado Extensión final de ciclos
FaPME1 94 °C, 94 °C, 54 °C, 72 °C, 72 °C, 24 y 27
FaPME2 3 min 45 s 45 s 1 min 5 min
fFaPAL 94 °C, 94 °C, 65 °C, 72 °C, 72 °C, 35
rFaPAL 3 min 45 s 45 s 1 min 7 min
FaPALrace5a 94 °C, 30 s 72 °C, 3 min 5
94 °C, 70 °C, 72 °C, 5
30 s 30 s 3 min
94 °C, 68 °C, 72 °C, 25
30 s 30 s 3 min
FaPALrace5c 94 °C, 30 s 72 °C, 3 min 5
94 °C, 70 °C, 72 °C, 5
30 s 30 s 3 min
94 °C, 68 °C, 72 °C, 25
30 s 30 s 3 min
FaPALrace5d 94 °C, 30 s 72 °C, 3 min 5
94 °C, 70 °C, 72 °C, 5
30 s 30 s 3 min
94 °C, 68 °C, 72 °C, 25
30 s 30 s 3 min
fPAL3utr 94 °C, 94 °C, 60 °C, 72 °C, 72 °C, 30
rPAL3utr 4 min 45 s 45 s 30 s 7 min
rPAL5utr 94 °C, 94 °C, 70 °C, 72 °C, 72 °C, 40
7 min 50 s 50 s 45 s 7 min
fFaOLP2 94 °C, 94 °C, 57 °C, 72 °C, 72 °C, 30
rFaOLP2 4 min 50 s 50 s 1 min 7 min
fFaChi2-1rt 94 °C, 94 °C, 65 °C, 72 °C, 72 °C, 39
rFaChi2-1rt 4 min 30 s 30 s 30 s 7 min
fFaChi2-2rt 94 °C, 94 °C, 63 °C, 72 °C, 72 °C, 33
rFaChi2-2rt 4 min 30 s 30 s 30 s 7 min
fFaChi3real 94 °C, 94 °C, 65 °C, 72 °C, 72 °C, 34
rfaChi3rt 4 min 30 s 30 s 30 s 7 min
fFaBG2-1rt 94 °C, 94 °C, 63 °C, 72 °C, 72 °C, 33
rFaBG2-1rt 4 min 30 s 30 s 30 s 7 min
fFaBG2-3rt 94 °C, 94 °C, 61 °C, 72 °C, 72 °C, 33
rFaBG2-3rt 4 min 30 s 30 s 30 s 7 min
Rib5 94 °C, 94 °C, 62 °C, 72 °C, 72 °C, 30 o 10
Rib3 4 min 45 s 45 s 45 s 5 min (RT-PCR
semic.)
124
10. Visualización de ADN en geles de agarosa

En la mayoría de los casos se utilizaron geles de agarosa 1% p/v, teñidos con
bromuro de etidio (0,5 μg ml-1) y preparados en solución reguladora TBE 0,5X. Antes de la
siembra, se les agregó a las muestras el buffer de muestra (ver apéndice). Para la corrida
electroforética se utilizó solución reguladora TBE 0,5X (ver apéndice) y los geles se
corrieron manteniendo un voltaje constante igual a 70 V.
11. Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa

Las bandas de interés se aislaron y cortaron a partir de geles de agarosa para ser
purificadas usando el kit comercial GFX (GE Healthcare). La concentración de ADN
purificado se midió utilizando un minifluorómetro (Qubit Fluorometer, Invitrogen).
12. Ligación de productos de PCR

Los fragmentos de interés, previa purificación a partir de geles de agarosa, fueron
ligados a diferentes vectores de clonado. En el caso de FaPE1, FaPAL, FaChi3, y FaOLP2 se
utilizó pGEM-T easy (Promega). La relación inserto:vector usada fue de 5:1 con 25 ng de
vector, 3 U de T4 ADN ligasa, buffer de ligación rápida 1X y agua destilada hasta un
volumen final de 10 μl. Las mezclas se incubaron a 16 °C durante toda la noche. Para el
resto de los fragmentos clonados, se utilizó TOPO TA Cloning (Invitrogen). Se mezclaron
en un tubo, 4 μl de inserto, 1 μl de solución de sales (NaCl 1,2 M y MgCl 2 0,06 M), 0,1 μl
de vector (10 ng μl-1) y agua destilada hasta completar un volumen final de 6 μl. Por
último, se dejó la mezcla a temperatura ambiente (22-23 °C) durante 30 min.
13. Preparación de células competentes
Se realizó un cultivo de Escherichia coli (XL-1 blue) en medio sólido de LB-agar (ver
apéndice) con tetraciclina (12 μg ml-1) durante toda la noche a 37 °C. De este cultivo se
eligió una colonia aislada, la cual se subcultivó en 5 ml de medio líquido LB (ver apéndice)
durante toda la noche a 37 °C. Luego, este cultivo se diluyó 1/100 con LB y se dejó crecer
hasta que alcanzó una DO a 600 nm entre 0,3 y 0,4. Se colocó el cultivo en hielo y se
centrifugó 5 min a 1100 x g. Después de descartar el sobrenadante, se resuspendió el
precipitado con 10 ml de la solución TFB1 (ver apéndice) fría incubándose en hielo
durante 15 min. Se centrifugó nuevamente a 1100 x g durante 5 min y se resuspendió el
125
precipitado en 1 ml de la solución TFB2 (ver apéndice). Por último, se fraccionó en tubos

eppendorf, se congeló inmediatamente con N2(l) y se guardó a -80 °C.
14. Transformación de células competentes

A una alícuota de 200 μl de células competentes se le agregaron 6 μl de mezcla de
ligación y se incubó durante 30 min en hielo. Luego, se procedió a realizar el choque
térmico, colocándolas en un baño de agua a 42 °C durante 45 s y se pasaron nuevamente
a hielo por 2 min. Posteriormente, se agregaron 750 μl de medio líquido LB y 75 μl de
glucosa 2 M y se incubaron las células a 37 °C durante 1 h para su recuperación.
Finalmente, se sembraron en placas que contenían medio LB-agar con ampicilina (100 μg
ml-1) como antibiótico de selección. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37
°C. Al día siguiente se tomaron las colonias crecidas para hacer subcultivos y extraer ADN
plasmídico.
15. Extracción de ADN plasmídico

Se preparó un cultivo en medio LB con ampicilina (100 μg ml-1), al que se lo
inoculó con la colonia de interés y se lo incubó a 37 °C durante toda la noche. A partir de
este cultivo se realizó la extracción de ADN plasmídico mediante la técnica de lisis alcalina
seguida de precipitación con PEG. Los cultivos se centrifugaron a 16.000 x g durante 1
min, se descartaron los sobrenadantes y se resuspendieron los precipitados en 200 μl de
solución P1 (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0), luego se agregaron 200 μl de P2
(NaOH 200 mM, SDS 1% p/v) y se incubaron en hielo durante 5 min. Se agregaron 200 μl
de solución P3 (acetato de potasio 3 M, pH 5,0) y se incubó nuevamente en hielo durante
5 min. Posteriormente, se centrifugó a 16.000 x g durante 15 min. El sobrenadante
obtenido se incubó con 20 μg ml-1 de ARNasa A a 37 °C durante 30 min. Luego, se
agregaron 400 μl de cloroformo, se mezclaron ambas fases durante 30 s y se centrifugó a
16.000 x g durante 1 min. Este paso se realizó dos veces, se tomó la fase acuosa y se le
agregó un volumen de isopropanol, dejando precipitar el ADN a -20 °C durante 2 h. Luego
se centrifugó a 16.000 x g durante 25 min, se lavó el precipitado con etanol 70% v/v y se
volvió a centrifugar. El precipitado se resuspendió en 32 μl de agua destilada y se le
agregó 8 μl de NaCl 4 M y 40 μl de PEG 8000 al 13% p/v. Las mezclas se dejaron durante
toda la noche a 4 °C. Por último, se centrifugaron a 16.000 x g durante 30 min, se lavó el
126
precipitado con etanol 70% v/v y se volvió a centrifugar. Los precipitados se secaron a
temperatura ambiente y se resuspendieron en 20 μl de agua destilada. Las muestras se
cuantificaron como se indica en el punto 11.
16. Análisis de plásmidos por restricción

Se tomaron 2 μl del ADN plasmídico obtenido según se indicó en el punto 15 y se
mezcló con 0,2 μl de BSA acetilada (10 μg μl-1), 2 μl de buffer 10X, 5 U de enzima y agua
destilada hasta obtener un volumen final de 20 μl. De acuerdo a las características de los
vectores usados, en todos los casos se usó la enzima de restricción EcoRI (Promega) para
liberar el fragmento de ADN clonado. Las restricciones se analizaron en geles de agarosa y
los plásmidos que liberaron los fragmentos del tamaño esperado se enviaron a
secuenciar.
17. Obtención de ADNc completo de PAL
17.1. Búsqueda en una biblioteca de ADNc

Se realizó una búsqueda en una biblioteca de ADNc proveniente de frutillas en
estadios de 25% y 75% rojo, construida en el vector Uni-ZAP XP (Stratagene, La Jolla, CA,
USA) (Civello y col. 1999). Se infectaron células de E. coli XL1-Blue XMF’ con un volumen
correspondiente a 2,5 x 104 ufp (unidades formadoras de placa de lisis). La mezcla de
infección se incubó a 37 °C durante 15 min y posteriormente se le agregaron 9 ml de NZY
top agar (ver apéndice) precalentado a 48 °C. El contenido de los tubos se extendió sobre
placas de petri de 15 cm de diámetro con medio NZY sólido (ver apéndice). Las placas se
incubaron a 37 °C durante aproximadamente 6 h.
Previo enfriamiento de las placas a 4 °C, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa. Para esto, se colocaron las membranas sobre la superficie de la placa
durante 2 min. El ADN transferido se desnaturalizó poniendo las membranas en contacto
con una solución de NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 5 min. Luego, se neutralizaron
durante 8 min con una solución de NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 8,0. Finalmente, se
enjuagaron las membranas durante 1 min en una solución de Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5; SSC
2X. Las membranas se secaron sobre papel de filtro y se unió el ADN a las mismas
127
mediante la exposición a radiación UV utilizando un UV-crosslinker (Amersham-

Pharmacia).
Para la búsqueda de genes de PAL se procedió a la hibridización de las membranas
con una sonda marcada radiactivamente (Tabla II), de igual manera a lo indicado en 7.4.
Las placas de lisis que dieron señal positiva, se separaron de las correspondientes placas
de petri y se utilizaron para realizar una segunda búsqueda. Por último, se provocó la
liberación de los fagémidos siguiendo el protocolo de escisión del kit usado para la
fabricación de la biblioteca de ADNc (λ-ZAPcDNA synthesis kit; Stratagene, la Jolla, CA).
Los fagémidos, ahora contenidos en el plásmido pBluescript SK(-), se secuenciaron
utilizando los cebadores T3 y T7, cuyas secuencias anillan con el vector.
17.2. Reacciónes de 5’RACE

Para obtener la región 5’ no traducible de FaPAL1 se utilizó un kit (SMART RACE
cDNA Amplification kit; Clontech). Se partió de ARN total de dos variedades distintas de
frutilla, Camarosa y Toyonoka, a partir del cual se obtuvieron las mezclas de ADNc 5’RACE
Ready de ambas variedades. El 5’RACE Ready se utilizó como molde para realizar las
reacciones de PCR usando reactivos pertenecientes al kit Advantage 2 Polymerase Mix
(Clontech). Los cebadores utilizados fueron el UPM (Universal Primer Mix) provisto con el
kit y el cebador específico diseñado a partir de la secuencia conocida (tabla II). La mezcla
de PCR utilizada contenía: Advantage SA buffer 1X, dNTPs 0,2 mM, 10 μM del cebador
específico, UPM 1X, Advantage 2 Polymerase Mix 1X y 1 μl de 5’RACE Ready cDNA. Para la
amplificación se utilizó el programa con temperatura decreciente provisto en el catálogo
del kit (Tabla III).
18. Actividades enzimáticas
18.1. Enzimas de degradación de la pared celular
18.1.1. Endo-β-1,4-glucanasa
Para medir actividad endo-β-1,4-glucanasa se homogeneizaron en Omnimixer 10 g
de frutos con 30 ml de buffer de extracción (buffer acetato de sodio/acido acético 0,05 M,
PVPP 1% p/v, pH 6,0). La mezcla se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min y se descartó
128
el sobrenadante. El precipitado se lavó dos veces con 30 ml de buffer acetato de

sodio/acido acético 0,05 M (pH 6,0) y se centrifugó durante 20 min a 12.000 x g.
Posteriormente, el precipitado fue extraído con 20 ml de la misma solución reguladora
conteniendo 1 M de NaCl y se mantuvo en agitación durante 4 h. Luego, se centrifugó 20
min a 12.000 x g y el sobrenadante fue usado para los ensayos de actividad (Vicente y col.
2005a) usando la siguiente mezcla de reacción: 500 μl de carboximetilcelulosa 2% p/v en
buffer acetato de sodio /acido acético 0,05 M (pH 6,0) y 1.500 μl de extracto. La mezcla
de reacción fue incubada a 37 °C, se tomaron 400 μl de la misma luego de 0, 8,5, 24 y 28 h
y se detuvo la reacción inmediatamente sumergiendo el tubo en N2(l). Los residuos
reductores se determinaron de acuerdo a (Miller 1959) y la actividad de la enzima se
expresó como μmol de glucosa liberados por segundo y por kilogramo de fruto.
18.1.2. Poligalacturonasa
La metodología para medir actividad PG total fue adaptada de Nogata y col.
(1993). Los extractos de las enzimas fueron preparados en las mismas condiciones que
para endo-β-1,4-glucanasa (punto 18.1.1), pero en este caso el sobrenadante fue
dializado contra una solución reguladora de acetato de sodio/acido acético 0,05 M (pH
6,0) a 4 °C durante toda la noche. El extracto dializado fue usado para determinar
actividad PG, usando ácido poligalacturónico como sustrato. Un volumen de 700 μl de
extracto enzimático se incubó a 37 °C con 700 μl de ácido poligalacturónico 0,3% p/v en
solución reguladora de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0). Se tomaron 300 μl
de la mezcla de reacción a los tiempos 0, 6, 12, y 24 h. La cantidad de ácido galacturónico
liberado fue determinada con el método de la 2-cianoacetamida (Gross 1982), y la
actividad PG se expresó como micromoles de ácido galacturónico liberados por segundo y
por kilogramo de fruto.
18.1.3. Pectinmetilesterasa
En un Omnimixer se homogeneizaron 10 g de frutos con 30 ml de solución NaCl 1
M, PVPP 1% p/v. La mezcla se mantuvo en agitación a 4 °C durante 4 h y luego se
centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. Se tomó el sobrenadante y se ajustó su pH a 7,5
con NaOH 2 M. El extracto resultante se utilizó para la determinación
espectrofotométrica de actividad PME (Hagerman y Austin 1986). Un volumen de 100 μl
129
de extracto fue mezclado con 600 μl de pectinas de frutos cítricos (Sigma) 1% p/v pH 7,5;
150 μl de azul de bromotimol 0,01% p/v en solución reguladora de K3PO4 0,003 M (pH
7,5). El ensayo de actividad fue llevado a cabo a 37 °C y se midió la densidad óptica (DO) a
620 nm cada 20 s durante 5 min. La actividad PME fue expresada en micromoles de ácido
galacturónico liberados por segundo y por kilogramo de fruto.
18.2. Enzimas relacionadas a mecanismos de defensa
18.2.1. Fenilalanina amonio liasa (PAL)

Se midió la actividad PAL de acuerdo a Civello y col. (1997) con algunas
modificaciones. Se utilizó un Omnimixer para homogeneizar 10 g de frutillas congeladas
con 40 ml de solución reguladora de extracción (Na2B4O7.10H2O 0,1 M; 2-mercaptoetanol
5 mM; EDTA 2 mM; PVPP 3% p/v; pH 8,8). Después de 1 h de agitación a 4 °C, la mezcla
fue centrifugada durante 20 min a 10.000 x g y se descartó el precipitado. El
sobrenadante fue utilizado para medir actividad PAL usando la siguiente mezcla de
reacción: 2.550 μl de Na2B4O7.10H2O 0,03 M, pH 8,8; 450 μl de L-fenilalanina 0,01 M en
solución reguladora Na2B4O7.H2O 0,03 M (pH 8,8); y 1.500 μl de extracto. La mezcla de
reacción se incubó a 37 °C y 500 μl fueron tomados después de los siguientes tiempos: 0;
0,5; 1,5; 2 y 3 h. Inmediatamente, a cada una de las alícuotas se les midió la DO a 290 nm.
La actividad de la enzima se expresó como la variación de DO por segundo y por
kilogramo de fruto.
18.2.2. Quitinasa
Se homogeneizaron 10 g de frutillas congeladas en un Omnimixer con 30 ml de
solución reguladora de acetato de sodio 10 mM, PVP 2% p/v. La mezcla se mantuvo en
agitación a 4 °C por 3 h y luego se centrifugó 30 min a 12.000 x g. El sobrenadante se
utilizó para la medida de actividad quitinasa en la siguiente mezcla de reacción: 739,5 μl
de Chitin azure (Sigma) 2 mg ml-1 y 2.210,5 μl de extracto. Esta mezcla de reacción se
incubó a 37 °C con agitación y 710 μl se tomaron a las 0, 2, 4 y 6 h. Inmediatamente, se
detuvo la reacción con el agregado de 178 μl de HCl 2 N y se congelaron en N2(l). A todas
las alícuotas se les midió la absorbancia a 575 nm y la actividad de la enzima se expresó
como variación de DO por segundo y por kilogramo de fruto.
130
18.2.3. β-1,3 glucanasa

Los extractos enzimáticos se prepararon en las mismas condiciones que las
utilizadas en la medición de actividad quitinasa (punto 18.2.2). Para la medición de la
actividad β-1,3 glucanasa se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 350 μl de Laminarin
azure (Sigma) 1% p/v y 1.050 μl de extracto, la cual se incubó a 37 °C con agitación. Se
tomaron alícuotas a 0, 7, 15 y 22 h e inmediatamente se detuvo la reacción por el
agregado de 750 μl de etanol 100% y posterior congelado con N2(l). Se midió la
absorbancia a 575 nm y la actividad se expresó como variación de DO por segundo y por
kilogramo de fruto.
18.2.4. Polifenoloxidasa (PPO)

Se prepararon extractos de acuerdo a Serradel y col. (2000) con el siguiente buffer
de extracción: Na2HPO4 0,02 M; NaH2PO4 0,08 M; Triton X-100 0,1% v/v; NaCl 1 M; PVPP
30 g l-1, pH 6,0. Se homogeneizaron 10 g de frutos con el buffer de extracción en un
Omnimixer y luego se dejó la mezcla en agitación durante 1 h. Posteriormente, se
centrifugó 20 min a 12.000 x g y se tomó el sobrenadante para realizar los ensayos de
medición de actividad enzimática. Se mezclaron 950 μl de solución reguladora Na 2HPO4
0,02 M/NaH2PO4 0,08 M; 150 μl de pirocatecol 20 mM y 400 μl de extracto y se incubaron
a 30 °C. La actividad enzimática se evaluó midiendo el incremento de DO a 410 nm. Los
resultados se expresaron como variación de la DO por segundo y por kilogramo de fruto.
18.2.5. Peroxidasa
La metodología utilizada para medir actividad peroxidasa se adaptó de Civello y
col. (1995). Se prepararon los extractos del mismo modo que en el caso de
polifenoloxidasa (punto 18.2.4). Se utilizó la siguiente mezcla de reacción: solución
reguladora Na2HPO4 0,02 M/NaH2PO4 0,08 M pH 6,0; pirogalol 20 mM; H2O2 4 mM y 100
μl de extracto de enzima. La mezcla se incubó a 30 °C y la actividad enzimática se evaluó
midiendo el incremento de DO a 470 nm. Los datos se expresaron como variación de DO
por segundo y por kilogramo de fruto.
131
APÉNDICE
MOPS 10X Colorante de muestra ADN/ARN (10 X)

MOPS 200 mM EDTA 1 mM
Acetato de sodio 50 mM Glicerol 50% v/v
EDTA 10 mM Azul de bromofenol 0,4% p/v
pH 7,0
NZY top agar
SSC 20X NaCl 5 g l-1
Citrato de sodio 0,3 M MgSO4.7H2O 2 g l-1
NaCl 3 M Extracto de levadura 5 g l-1
pH 7,0 NZ amina 10 g l-1
Agar 0,7% p/v
SSPE 5X pH 7,5
NaCl 3 M
NaH2PO4 0,2 M NZY sólido
EDTA 20 mM NaCl 5 g l-1
MgSO4.7H2O 2 g l-1
Denhart 50X Extracto de levadura 5 g l-1
Ficoll 1% p/v NZ amina 10 g l-1
PVP 1% p/v Agar 15 g l-1
BSA 1% p/v pH 7,5
TBE 5X Dextrosa papa agar (PDA)

Tris 450 mM Jugo de papa 37,5% v/v
Acido bórico 450 mM Dextrosa 10 g l-1
EDTA 100 mM Agar 20 g l-1
pH 8,0
TFB1
LB Acetato de potasio 30 mM
NaCl 5 g l-1 KCl 100 mM
Triptona 10 g l-1 CaCl2 10 mM
Extracto de levadura 5 g l-1 MgCl2 50 mM
pH 7,0 Glicerol 15% v/v
LB-agar TFB2
NaCl 5 g l-1 MOPS 10 mM
Triptona 10 g l-1 CaCl2 75 mM
Extracto de levadura 5 g l-1 KCl 10 mM
Agar 15 g l-1 Glicerol 15% v/v
pH 7
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Irradiación de frutillas con UV-C: efecto sobre

Marina Pombo Pedro M. Civello

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Gustavo Adolfo Martínez

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Irradiación de frutillas con UV-C: efecto sobre la

Director: Dr. Pedro Marcos Civello

Laboratorio de Bioquímica y Fisiología de la

A. Revistas internacionales con referato:

 “Effect of UV-C treatment on defense gene expression and activity in strawberry

 “Cloning of FaPAL1 gene from strawberry fruit and characterization of its

B. Actas de congresos y reuniones científicas con referato:

 “Influence of UV-C irradiation on expansin and pectin-methylesterase gene

 “Efecto del tratamiento UV-C sobre el ablandamiento y la expresión de

 “La expresión de genes involucrados en la degradación de la pared celular en

 “Induction of Phenylalanine ammonia lyase in strawberry fruit by UV-C treatment”.

 “Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

 “Expression of phenylalanine ammonia lyase during ripening of different

 “UV-C treatment on strawberry fruit: effect on gene expresion in different tissues”.

 “Infuencia de la irradiación con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

 “FaPAL expression in fruit tissue of strawberry cultivars with contrasting

A. Introducción general .................................................................................................1

1. Generalidades de los frutos .............................................................................................. 2

1.3.4. Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207) ............................................ 40

D. Capítulo II Efecto del tratamiento con UV-C sobre la defensa contra

E. Capítulo III Caracterización de fenilalanina amonio liasa (PAL) en variedades con

F. Consideraciones finales .......................................................................................... 112

G. Materiales y Métodos ........................................................................................... 115

1. Material Vegetal ........................................................................................................... 116

17.2. Reacciónes de 5’RACE............................................................................................... 128

H. Bibliografía ........................................................................................................... 133

1. Generalidades de los frutos

Figura 1: Fases del desarrollo del fruto de tomate Adaptado de

En la segunda fase, el crecimiento del fruto se debe principalmente a la división

productos de almacenamiento, la supresión de la germinación precoz, y la adquisición de

Figura 2: Cambios que ocurren durante el desarrollo y maduración de

Existen dos grupos principales en la clasificación de la maduración de los frutos

compartidos tempranamente entre ambas especies, climatéricas y no-climatéricas

españoles. La introducción de esta planta intentaba contribuir a la obtención de frutos de

2.2. Morfología de la planta

Figura 3: Morfología de la planta de frutilla (Fragaria x ananassa,

Las flores se reúnen en racimos de color blanco, con 9 a 12 flores por

Figura 4: Morfología de la flor de frutilla (Fragaria

2.3. El fruto y su maduración

VP VG BL 25%R 50%R 75%R 100%R SM

Figura 5: Clasificación en los diferentes estadios de madurez de

La frutilla es clasificada desde el punto de vista fisiológico como un fruto no-

antocianinas, aumento en la actividad fenilalanina amonio liasa (PAL), disminución de la

2.4. Cultivo y Productividad

Tabla I: Principales productores mundiales de frutilla. Datos

Figura 6: Producción mundial de frutillas en los últimos 20 años. Datos

En la Argentina se produjeron 8.850 Tn de frutilla en el año 2007 (FAOSTAT, 2009).

3. Tratamientos postcosecha de los frutos

ventajas, se conocen numerosos efectos nocivos de estos compuestos sobre la salud

3.1. Tratamientos físicos

3.1.2. Atmósferas modificadas y controladas

cuya conservación depende fundamentalmente del uso de atmósferas controladas es la

3.1.3. Aplicaciones de Ozono

en bandeja de muchos frutos y vegetales (Artés y col. 2009). Principalmente, dos

3.1.4. Tratamientos térmicos de alta temperatura

4. Irradiación con UV-C

“Effect of UV-C treatment on defense gene expression and activity in strawberry

“Cloning of FaPAL1 gene from strawberry fruit and characterization of its

“Influence of UV-C irradiation on expansin and pectin-methylesterase gene

“Efecto del tratamiento UV-C sobre el ablandamiento y la expresión de

“La expresión de genes involucrados en la degradación de la pared celular en

“Induction of Phenylalanine ammonia lyase in strawberry fruit by UV-C treatment”.

“Efecto del tratamiento con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

“Expression of phenylalanine ammonia lyase during ripening of different

“UV-C treatment on strawberry fruit: effect on gene expresion in different tissues”.

“Infuencia de la irradiación con UV-C sobre la expresión y actividad de enzimas de

“FaPAL expression in fruit tissue of strawberry cultivars with contrasting