SPEKTROFOMETRI

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang
gelombang spesifik dengan mengguankan monokromator prisma atau kisi difraksi
dengan detector Fototube. Dalam analisis cara spektrofotometri terdapat tiga daerah
panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200-380 nm),
daerah Visible (380-700 nm), daerah Inframerah (700-3000 nm). Pengertian spektroskopi
dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi
dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau
pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya
(baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas
misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.

Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya
yaitu:

1) Sebagai gelombang

2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.

- PRINSIP KERJA
Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya. Suatu daerah
akan diabsorbsi oleh atom atau molekul dan panjang gelombang cahaya yang diabsorbsi
dapat menunjukan struktur senyawa yang diteliti. Spektrum elektromagnetik meliputi
suatu daerah panjang gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek
berenergi tinggi sampai pada panjang gelombang mikro.

Spektrum absorbsi dalam daerah-daerah ultra ungu dan sinar tampak umumnya
terdiri dari satu atau beberapa pita absorbsi yang lebar, semua molekul dapat menyerap
radiasi dalam daerah UV-tampak. Oleh karena itu mereka mengandung electron, baik
yang dipakai bersama atau tidak, yang dapat dieksitasi ke tingkat yang lebih tinggi.
Panjang gelombang pada waktu absorbsi terjadi tergantung pada bagaimana erat elektron
terikat di dalam molekul. Elektron dalam satu ikatan kovalen tunggal erat ikatannya dan
radiasi dengan energy tinggi, atau panjang gelombang pendek, diperlukan eksitasinya.

Cahaya polikromatis dari sumber cahaya masuk ke dalam monokromator dan

mengalami penguraian menjadi cahaya monokromatis. Cahaya tersebut kemudian
diteruskan memalui sel yang berisi sampel. Cahaya sebagian diserap oleh sel dan
sebagiannya lagi diteruskan ke fotosel yang berfungsi untuk mengubah energi cahaya
menjadi energi listrik. Energi listrik yang dihasilkan oleh fotosel memberikan sinyal pada
detektor yang kemudian diubah menjadi nilai serapan atau transmitans dari zat yang
dianalisis.
 Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus
dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan. Hukum Bouguer (Lambert) :
Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisan- lapisan yang sama
tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam
fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka
absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium.

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hokum Lambert-Beer, bila cahaya

monokromatik (I0),melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap
(Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah
perbandingan intensitas cahaya yang di transmisikan ketika melewati sampel (It) dengan
intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hokum Lambert-
Beer antara lain : Radiasi yang digunakan harus monokromatik, rnergi radiasi yang di
absorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang
mengabsorpsi harus homogeny, tidak terjadi flouresensi atau phosphoresensi, dan indeks
refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan harus pekat (tidak encer).

Beberapa larutan seperti larutan Timbal (Pb2+) dalam air tidak berwarna, supaya timbul
earna larutan Pb diekstraksi dengan dithizone sehinggaberubah menjadi berwarna merah.
Larutan berwarna merah akan menyerap radiasi pada daerah hijau. Dalam hal ini larutan Pb
menunjukkan absorbans maksimum pada panjang gelombang 515 nm.

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai
macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

 UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

 VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
  UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
 Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang
berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator
yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.

Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter
optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang
dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis
pemeriksaan.

Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya
pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang
mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar.
Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

– UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari
kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih
baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga
penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk
persegi panjang dengan lebar 1 cm.

– IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng
natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida.
Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang
dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi
arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

 Kepekaan yang tinggi

 Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
 Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
 Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
 Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

 Detektor foto (Photo detector)

 Photocell, misalnya CdS.
 Phototube
 Hantaran foto
 Dioda foto
 Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal
dari detektor.

- Absorpsi cahaya
Hukum Lambert - Beer
Jumlah relatif panjang gelombang cahaya yang terabsopsi ketika melewati sampel tergantung
pada :
 jarak yang ditempuh sinar ketika melewati sampel (ukuran kuvet - b)
 jumlah senyawa kimia dalam sampel yang mengabsopsi sinar (konsentrasi analit –c)
 Kemampuan sampel mengabsopsi sinar (molar absorptivity - e)
 Absorban berhubungan dengan konsentrasi analit, panjang kuvet, dan absoptivitas molar
(tetapan serapan).
 Jumlah relatif cahaya yang melewati sample (I/I) dikenal o dengan istilah transmitan
(T).
 Absorban (A) adalah jumlah relatif cahaya terabsopsi oleh sampel dan berhubungan
dengan transmitan (T).

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)

mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di
dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom
yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul
dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
 Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari
keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi
elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada
dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi).
Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada
gelombang radio.

Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu
yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya
yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan
diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.

Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai
permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0
atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses
penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat
sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati
sel sampel

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan
diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer,
berbunyi:
“jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat
dan tebal larutan”.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung

banyaknya cahaya yang hamburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah
melewati sampel.

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan
memenuhi kriteria-kriteria berikut:

1. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan
panjang gelombang tunggal (monokromatis).
2. Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh
molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang
sama.
4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang
diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel
koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.
5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan
grafik absorbansi versus konsntrasi.

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer

dalam mengukur konsentrasi suatu analit:

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu
larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet
dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
 3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau
sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran
sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

Jenis-jenis Spektrofotometri
Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasarkan sumber cahaya yang digunakan.
Diantaranya adalah sebagai berikut :

1) Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energy dalah cahaya tampak
(Visible). Cahaya visible termasuk spectrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata
manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380-750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat
dilihat oleh mata manusia, maka sinar tersebut termasuk kedalam sinar tampak (Visible).

2) Spektrofotometri UV (Ultra Violet)

Berbeda dengan spektrofotometri Visible, pada spektrofometri UV berdasarkan interaksi
sampel dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber
sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hydrogen. Dia
merupakan isotop hydrogen yang stabil tang terdapat berlimpah dilaut dan didaratan.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata manusia maka senyawa yang dapat menyerap
sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

3) Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.
Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai
sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample
tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis
atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti
menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan
inframerah (NIR)) kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung
mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik,
molekul mengalami transisi elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di
fluoresensi berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state.

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
a. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
b. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks
c. Penyerapan oleh perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :

E = hv
Dimana :
E = energy (joule/second)
h = tetapan plank
v = frekuensi foton

4) Spektrofotometri IR (Infra Red)

Spektrofotometri ini berdasar kepada penyerapan panjang gelombang Inframerah. Cahaya
Inframerah, terbagi menjadi inframerah dekat, pertengahan dan jauh. Inframerah pada
spektrofotometri adalah adalah inframerah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang
gelombang 2.5-1000 mikrometer. Hasil analisa biasanya berupa signalkromatogram hubungan
intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sampel akan dibandingkan
dengan signal standard.