Nama kelompok

Mastika MU
Fahrun Nisa
Elfi Nur aini
Isolasi DNA Total Jaringan Tumbuhan

Pada dasarnya isolasi DNA total dari jaringan tumbuahn sama dengan isolasi DNA total
dari jaringan hewan. Meskipun demikian terdapat beberapa perbedaan pada tahap-tahap
kerjanya, karena karakter fisik dan kimia jaringan tumbuhan yang berbeda dengan
jaringan jaringan hewan gengan adanya dinding sel dan metabolisme sekunder.
Dinding sel tumbuhan mudah dihancurkan dalam kondisi beku, sehingga tahap ini
dilakukan didalam nitrogen cair untuk menjaga jaringan tetap beku beku selama proses
penghancuran. Serpihan dinding sel yang terbentuk masih terlalu besar untuk saringan,
maka dilakukan pemisahan dari susupensi sel dengan caraspindown atau penyaringan.
Spin-down akan mengendapkan serpihan dinding sel, sedangkan penyaringan akan
menhan serpihan dinding sel pada saringan. Dengan demikian supernatan pada cara
pertama atau flow-through pada acar kedua lebih bersih dan mudah diproses pada
tahap-tahap berikutnya.

Bahan :

Isolasi metode Saghai-maroof

 buffer CTAB

 dH2O; 1 M

 Tris-HCl pH 9; 5 M

 NaCl; 0,5

 M EDTA pH 8; 14 M

 β-mercaptoetanol; 2 % CTAB.

 PVP 0,1 gram.

 1 volume klorofom

 1 volume isopropanol

 TE (pH 8) 500 μl
 Etanol 70% 500μl

Isolasi DNA metode DNAeasy plant mini kit

 buffer AP1 400 μl.

 nitrogen cair.

 buffer P3 130 μl

 buffer AW1.

 buffer AW2

 buffer AE 100 μl

Elektroforesis

 1,2 % gel agarosa.

 Buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0).

 Etidium bromida 5 μl g/ml

Cara Kerja :

Isolasi metode Saghai-maroof et al. (1894),

1. sampel daun sebanyak 1 gram dipotong halus dan digerus menggunakan nitrogen
cair didalam mortar.

2. Hasil gerusan dimasukkan ke tabung mikro steril ukuran 50 ml. Ditambahkan 1

volume buffer CTAB (dH2O; 1 M Tris-HCl pH 9; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA pH 8;
14 M β-mercaptoetanol; 2 % CTAB) yang telah dipanaskan pada suhu 650 ℃
dan PVP sebanyak 0,1 gram.

3. Tabung yang berisi campuran dibolak-balik agar homogen.

4. Tabung dimasukkan ke waterbath lalu dilakukan inkubasi selama 60-90 menit

pada suhu 650 ℃
5. Disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Hasil sentrifus
menghasilkan dua lapisan, lapisan atas yang disebut dengan supernatan (fase cair)
dan lapisan bawah yang disebut pelet (fase padat).

6. Supernatan dipindahkan dengan pipet mikro 1000 μl ke tabung mikro baru steril
yang berukuran 1,5 ml.

7. Tabung steril yang berisi supernatan, ditambahkan 1 volume klorofom dan

disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.

8. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru steril berukuran 1,5 ml.

9. Ditambahkan 1 volume isopropanol lalu dibolakbalik hingga terbentuk

benang-benang DNA.

10. Tabung selanjutnya disentrifus kembali selama 10 menit dengan kecepatan 4000
rpm.

11. Bagian supernatan dari hasil sentrifus ini dibuang. Pelet dikeringkan pada suhu
370 C. Selanjutnya pelet yang mengandung DNA ditambahkan 500 μl TE (pH
8) lalu dibiarkan selama semalam untuk memaksimalkan pelarutan DNA.

12. Perbesar volume DNA dengan cara ditambahkan 200 μl TE, lalu ditambahkan
dengan 700 μl fenol disentrifuse selama 10 menit dengan 4000 rpm

13. Supernatan dari sentrifuse diambil lalu dipindahkan ketabung baru yang steril
yang berukuran 1,5 ml.

14. Ditambahkan dengan 1 volume isopropanol dan disentrifuse kembali dengan

4000 rpm selama 10 menit.

15. Supernatan dari hasil sentrifuse dibuat dan pelet dikeringkan pada suhu 37 C.

16. Pelet dibilas dengan 500μl etanol 70% dan dikeringkan.

17. Larutan yang diperoleh dilarutkan kembali dengan TE 100 μl.

18. DNA stok disimpan pada suhu -20 ℃ (freezer) dan DNA kerja disimpan didalam
kulkas dengan suhu 4 ℃.

Isolasi DNA metode DNAeasy plant mini kit (Qiagen 2012).

1. Sampel daun sebanyak 0,1 gram dipotong kecil-kecil,

2. selanjutnya digerus hingga berbentuk serbuk dengan menggunakan nitrogen cair.

3. Serbuk daun dimasukkan kedalam tabung steril berukuran 1,5 ml, ditambahkan
buffer AP1 sebanyak 400 μl.

4. Divortex selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 650C.

5. Tabung steril dibolak-balik agar homogen.

6. Ditambahkan buffer P3 sebanyak 130 μl dan diinkubasi selama 5 menit di dalam

es.

7. Tabung disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan hasil
sentrifus dipindahkan ke dalam QIAshredder mini spin column, kembali
dilakukan disentrifus selama 5 menit pada kecepatan 4000 rpm.

8. Supernatan dipindahkan ke tabung 1,5 ml dan ditambahkan 1,5 volume buffer

AW1.

9. Supernatan dipindahkan ketabung DNAeasy mini spin column dan disentrifus

selama 5 menit pada kecepatan 400 rpm.

10. Supernatan didalam collection tube dibuang, langkah ini kembali diulangi pada
larutan hasil isolasi DNA E.floribundus yang tersisa. Kemudian DNAeasy
mini spin column dipindahkan ke collection tube 2 ml, ditambahkan dengan
buffer AW2 sebanyak 500 μl dan

11. disentrifus selama 3 menit pada kecepatan 4000 rpm. Selanjutnya DNAeasy mini
spin column dipindahkan ke tabung 1,5 ml,lalu ditambahkan dengan buffer AE
sebanyak 100 μl dan diinkubasi selama 6 menit.

12. Kemudian tabung disentrifus selama 5 menit pada kecepatan 4000 rpm. Larutan
hasil sentrifus merupakan DNA total E.floribundus elusi 1. Penambahan buffer
AE kembali dilakukan untuk memperoleh elusi 2.

13. DNA total E.floribundus yang diperoleh disimpan pada suhu -200 C dan DNA
kerja disimpan pada suhu 40C.
 Elektroforesis.

Keberhasilan proses isolasi dan keutuhan DNA total dideteksi dan dicek melalui
elektroforesis (Fisons model fec 360, large horizontal gel system) pada 1,2 % gel
agarosa dalam 1x buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), tegangan 65 volt. Gel hasil
elektroforesis diwarnai dengan 5 μl g/ml etidium bromida, visualisasi dibawah sinar
UV transilluminator. Keberhasilan dari isolasi DNA total ditunjukkan dengan adanya
pita (band) yang jelas dan utuh.

Isolasi protein pada tanaman

Sifat-sifat protein :
a) Protein sukar larut dalam air Karena ukuran molekulnya yang sangat besar.

b) Dapat mengalami koagulasi oleh pemanasan, penambahan asam atau basa.

c) Bersifat amfoter karena membentuk zwitter ion, pada titik isoelektriknya protein
mengalami koagulasi sehingga dapat dipisahkan dari pelarutnya.

d) Protein dapat mengalami kerusakan (terdenaturasi) oleh pemanasan. Pada denaturasi

protein dapat mengalami kerusakan mulai dari kerusakan struktur primernya sampai
pada struktur tersiernya.

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen.

Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk
mempertahankan fungsinya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika
diekstraksi dari normal biological milie. Protein yang diekstraksi hendaknya
dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.

Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur
fraksinasi sel yaitu :

 Memisahkan sel dari jaringannya.

 Menghancurkan membrane sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan
organelnya.
 Memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.

Isolasi protein yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau
memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain lain yang tidak
 diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus
mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian
rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi,
biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan
dengan ammonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara lain
jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan.

ALAT DAN BAHAN

Bahan:
- Hati (ayam,mencit, dan sapi),limpa dan jantung mencit
- Daun muda, daun tengah, dan daun tua, serta batang tumbuhan
- Buffer ekstrak (Tris HCL 0,1 M pH 7,2 dan mercaptoehanol
- Larutan Bradford
- Akuades
- Es
- Etanol dingin

Alat
- Mortal dan pestle
- Tabung Eppendorf
- Refrigerator
- Micro pippet
- Shaker
- Tip: blue tip, yellow tip, white tip.
- Sentrifus
- Microcuvet
- Spektrofotometer
- Kulkas

Isolasi Protein Tumbuhan

1. Menghancurkan daun sebanyak 0,1 gram dengan mortal dan pestle.
 2. Memindahkan homogenate yang dihasilkan ke tabung Eppendorf dan menambahkan
sebanyak 300- 500 μl buffer ekstrak dalam keadaan dingin.
3. Menginkubasikan homogenate dalam refrigerator selama 30 menit dengan dishaker
sekali selama 10 menit.
4. Mensentrifugasi homogenat pada 7.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC.
Supernatan yang didapatkan dipindahkan ke tabung Eppendorf baru. Supernatan yang
didapatkan sudah mengandung protein kasar.
5. Mengukur konsentrasi protein hasil ekstraksi dengan cara yang sama pada
pengukuran konsentrasi protein hewan (langkah 7-9)
6. Menyimpan supernatan dalam refrigerator -20o C sampai dilakukan elektroforesis
Fungsi larutan
Buffer untuk digunakan untuk melisiskan sistem membran dan organel
NLS berfungsi untuk Melisiskan sel dan nukleus.
Elution buffer digunakan sebagai larutan isotonis untuk menjaga DNA selama penyimpanan
Etanol absolut digunakan untuk mengendapkan DNA. Proteinese K digunakan untuk
mendegradasi protein
Untuk memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau
buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14 M NaCl) steril,
Fenol: Chloroform: IsoamylAlkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform: Isoamilalkohol (PCI)
= 24 : 1, 7.5 M Ammonium acetate,Etanol Absolut, Etanol 70 %, TE Buffer pH 8. EDTA
merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-
positif seperti Ca2+ dan Mg2+ sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan
terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat
CTAB memiliki fungsi yang sama seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari
membran sel. SDS adalah sejenis deterjen yang mampu mengemulsi lipid.
Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol absolut dan amonium nitrat dan diketahui
filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali untuk mendapatkan pelet DNA.
Setelah supernatan dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol 70% untuk presipitasi lanjutan.
Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai didapatkan pelet DNA
Sumber :
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood
Cliffs: xvi + 779 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company,
Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill Companies, Inc., New
York: xxiv + 1238 hlm.