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SAÚDE
AUXILIAR DE LABORATÓRIO
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Portal Educação

P842a Auxiliar de laboratório / Portal Educação. - Campo Grande: Portal

Educação, 2013.

92p. : il.

Inclui bibliografia
ISBN 978-85-8241-356-5

1. Laboratório – química. 2. Profissional de laboratório. I. Portal Educação.

II. Título.

CDD 540
 SUMÁRIO

1 CONHECIMENTOS QUÍMICOS PARA USO EM LABORATÓRIO ............................................

1.1 MATERIAL DE LABORATÓRIO, SEU MANUSEIO E LAVAGEM ..............................................

2
1.2 PREPARO DE SOLUÇÕES (CÁLCULOS, MEDIÇÕES E REAGENTES) ..................................

1.3 TITULAÇÕES ..............................................................................................................................

1.4 CROMATOGRAFIAS...................................................................................................................

1.5 ESPECTROFOTOMETRIA .........................................................................................................

2 CONHECIMENTOS BIOLÓGICOS PARA USO EM LABORATÓRIO .......................................

2.1 TÉCNICAS DE COLETA DE MATERIAIS BIOLÓGICOS ............................................................

2.2 MANUTENÇÃO DE BIOTÉRIO E MANEJO DE ANIMAIS DE LABORATÓRIO ..........................

2.3 CULTIVO DE CÉLULAS ..............................................................................................................

2.4 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR ...................................................................................

2.5 MICROSCOPIA ...........................................................................................................................

3 QUALIDADE E SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS ................................................................

3.1 BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO .......................................................................................

3.2 BIOSSEGURANÇA .....................................................................................................................

REFERÊNCIAS .....................................................................................................................................
1 CONHECIMENTOS QUÍMICOS PARA USO EM LABORATÓRIO

Na rotina de trabalho como auxiliar de laboratório, para se atuar com habilidade, é

3
preciso dominar alguns conhecimentos básicos relacionados a duas áreas-chave: a Química e a
Biologia. Detendo esses conhecimentos é possível que se consiga cobrir toda a gama de
atuação de um auxiliar em qualquer tipo de laboratório, já que as técnicas utilizadas são
relativamente comuns, seja visando objetivos clínicos ou acadêmicos. Assim, este curso objetiva
contribuir com a difusão de informações primordiais sobre preparo de soluções, uso de
equipamentos, principais técnicas utilizadas em ambiente laboratorial e manutenção de padrões
de qualidade e segurança nesses ambientes.

Dessa forma, o público a quem o curso se dirige se resume a todos aqueles que
tenham interesse em atuar na rotina de um laboratório, sobretudo como auxiliar, e também
àqueles que tenham interesse em aprender mais sobre a rotina em um laboratório. Nesse
módulo serão focados os conhecimentos de natureza relacionada à área Química, necessários
para uma boa atuação em laboratório. Para um adequado acompanhamento do curso,
principalmente neste módulo sobre conhecimentos relacionados à área Química, espera-se que
o leitor disponha de conhecimentos prévios básicos sobre cálculos químicos, pois os mesmos
serão aqui retomados apenas com o intuito de relacioná-los à prática em um laboratório, já que
não dispomos de tempo e espaço para abordá-los de forma ampla, tomando os ensinamentos
dos cálculos desde o início.

1.1 MATERIAL DE LABORATÓRIO, SEU MANUSEIO E LAVAGEM

 Os materiais comumente utilizados em rotina de laboratório se resumem a
instrumentos e recipientes plásticos ou de vidro, que só devem ser utilizados em propósitos
laboratoriais, higienizados logo após o seu uso, não devem ser utilizados duas vezes para medir
ou conter o mesmo reagente ou reagentes diversos (sempre restarão alguns resíduos de
reagente no recipiente, que podem contaminar seu experimento) e, principalmente, nunca devem
ser armazenados no mesmo local dos itens de uso pessoal daqueles que trabalham em 4
laboratório (veremos no Módulo III, que é necessário haver local específico para a guarda dos
itens pessoais fora do laboratório).

Os principais cuidados no manuseio do material de laboratório se referem justamente à

prevenção da contaminação de soluções por resíduos de reagentes contidos em recipientes mal
higienizados ou ainda que não foram lavados antes de serem utilizados com outro reagente;
também devemos ter cuidado no que se refere ao uso de instrumentos ou recipientes de vidro, já
que seu mal uso pode incorrer em graves acidentes.

Para facilitar a compreensão, tem-se abaixo um quadro-resumo com os principais

materiais utilizados na rotina de laboratório, suas características e seus modos de uso.

FIGURA 1: PRINCIPAIS MATERIAIS DE USO COMUM EM LABORATÓRIO E SUAS FORMAS

DE MANUSEIO
5
6
7
8
9
10
 11

FONTE: CARMO, 2012.

No que se refere ao processo de limpeza, lavagem e esterilização dos materiais de

laboratório, todos os materiais devem ser imediatamente lavados após o uso, em água corrente
e com o uso de detergente líquido. Recomenda-se que o processo de lavagem seja realizado
com o uso de luvas, preferencialmente neoprene ou PVC, com superfície externa antiderrapante.
O cuidado durante esse processo é essencial, pois muitas peças são caras e algumas de difícil
obtenção no mercado. Assim, devemos ao máximo evitar rachaduras ou quebras, que costumam
ocorrer mais frequentemente durante o procedimento de lavagem.

12
Dependendo da aplicação ou uso do material, alguns itens do laboratório também
devem passar por processo de esterilização. Assim, após o término do uso dos itens, o auxiliar
de laboratório deve lavá-los muito bem e levá-los à autoclave (equipamento utilizado para
esterilizar itens por meio do calor úmido sob pressão), a 120º por 20 minutos.

1.2 PREPARO DE SOLUÇÕES (CÁLCULOS, MEDIÇÕES E REAGENTES)

O uso de soluções com composições e concentrações específicas é de suma

importância na prática laboratorista, principalmente no que se refere à prática de atividades
relacionadas à área Química. Antes de passarmos ao aprendizado sobre os principais cálculos
para a síntese de soluções, devemos entender alguns conceitos.

Conceitua-se solução como sendo a mistura unifásica ou homogênea de mais de um

componente e, na dissolução de uma substância em outra, a que se dissolve é o soluto e o meio
de dissolução é o solvente. As soluções são obtidas para qualquer um dos três estados da
matéria: sólido, líquido ou gasoso.

Qualquer mistura gasosa é uma solução, porque qualquer mistura de gases é

homogênea. Soluções em estado sólido são conhecidas como as ligas metálicas. Entretanto, a
maioria das soluções existe no estado líquido, constituindo-se pela dissolução de outro líquido,
sólido ou mesmo um gás em uma substância líquida. Se essa solução, em que as substâncias
se diluem, for a água, tem-se uma solução aquosa.
 Uma solução diluída é aquela que apresenta proporções relativamente pequenas de
soluto, enquanto uma solução concentrada apresenta proporção relativamente maior. Já a
concentração de uma solução se refere à quantidade de soluto presente em dado volume de
solução, e é expressa mais comumente em molaridade (expressa o número de moles de soluto
presente em dado volume de solução em litros), molalidade (relaciona o número de moles de
soluto à massa, em quilogramas, do solvente) e normalidade (expressa a relação entre o número 13
de equivalente-grama do soluto e o volume de solução em litros) (ATKINS & JONES, 2001).
Contudo, existem, ainda, outros métodos para definir a concentração de uma solução, como
veremos na tabela abaixo:

TABELA 1: SISTEMAS DE ANOTAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SOLUÇÕES

Sistemas Notação Soluções Aplicações

Percentual % Partes por 100(p/p; p/v; v/p; v/v) Geral

n(nmoles ) soluto
Molaridade mol/L Química
V ( L) solução

N eq. g ( soluto )
Normalidade eq./L Química
V ( L) solução

n (nmoles )componente
Fração Molar X Física/química
n º total(moles )componentes

FONTE: PUC Minas Gerais, 2012.

O preparo de uma solução exige atenção a alguns passos, quais sejam: o cálculo da
quantidade de soluto a ser utilizada, a medição desse soluto, a sua diluição no meio solvente e
homogeneização, seguida de armazenagem.
 Para a etapa dos cálculos, nos focaremos naquilo que é mais relevante. O cálculo da
molaridade (grandeza mais frequentemente utilizada para definir a concentração) das soluções é
definido como:

M = __m(g)___ 14

PM x V (L)

Equação 1: Cálculo da molaridade de uma solução. m = massa de soluto utilizado na

solução; PM = peso molecular do soluto utilizado; V = volume do soluto, em litros.

O cálculo mais comumente empregado para nos orientar na diluição de uma solução é
o que relaciona a molaridade e o volume das duas soluções (da solução concentrada e da
solução na concentração que queremos obter). Assim segue:

M1 x V1 = M2 x V2

Equação 2: Equação que expressa relação de concentração entre duas soluções,

utilizada como subsídio para a diluição de uma solução. M1 = molaridade da solução
concentrada; V1 = volume de solução concentrada; M2 = molaridade da solução diluída; V2 =
volume da solução diluída.

Para o preparo das soluções, os materiais mais frequentemente utilizados são: a

balança, balões volumétricos ou béqueres (itens nos quais se processa a diluição), espátula para
manipular o reagente e provetas para medição do solvente.

Os reagentes a serem utilizados irão depender da natureza das soluções preparadas.

É consenso que na rotina laboratorial não podem faltar soluções-tampão, soluções ácidas e
básicas, soluções salinas, soluções fisiológicas e corantes. Assim, para o preparo dessas
soluções os reagentes mais utilizados são: água destilada (dependendo do grau de esterilidade
requerido da solução, deve-se utilizar água deionizada1), hidróxido de sódio, ácido cítrico, cloreto
de sódio, álcool, ácido acético, ácido clorídrico, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio
bibásico e os corantes a serem diluídos.

15

1.3 TITULAÇÕES

As titulações compreendem um método químico relacionado à área de Química

Analítica. Nessa área, os métodos, instrumentos e estratégias são aplicados na obtenção de
informações acerca da composição da matéria no espaço e no tempo. Em relação a isso, dois
aspectos são primordiais: a identificação das espécies químicas presentes no conteúdo em
análise e a determinação das quantidades relativas de cada uma dessas espécies.

Em Química, os métodos ditos volumétricos são procedimentos quantitativos que se

baseiam na determinação da concentração de um dado elemento presente em uma amostra por
meio de uma reação, em solução, com outro elemento de concentração conhecida,
acompanhando-se as quantidades desse outro elemento adicionado ao primeiro. Em resumo,
trata-se de determinar a concentração de um elemento presente em uma amostra a partir do
volume (ou massa) de uma solução com concentração conhecida (solução padrão), que deve
reagir quantitativamente com a amostra de interesse (solução problema).

Esses procedimentos volumétricos vêm sendo utilizados para a realização de análises

quantitativas há mais de 200 anos e é considerado um método primário de análise, utilizado para
validar muitos outros métodos ditos secundários. Nos séculos XVIII e XIX, as análises químicas
eram quase que exclusivamente realizadas por meio de métodos volumétricos. Em Português,

1
Água que passa por processo de purificação específico, visando à remoção dos íons presentes na
mesma. É considerada água com elevado grau de pureza, daí sua preferencial utilização em rotina
laboratorial (seu uso dificulta ou inviabiliza a contaminação dos experimentos).
as análises volumétricas apresentam diversos sinônimos, como titulação, volumetria, titrimetria e
titulometria.
Conceitua-se como titulação ou titulometria o procedimento analítico por meio do qual
uma quantidade desconhecida de uma dada substância passa a ser conhecida por uma reação
produzida entre essa substância e outro reagente conhecido e padronizado. No que se refere a
esta reação, temos dois conceitos importantes: o de titulante e o de titulado. O titulado é a 16
substância, composto ou solução cuja concentração quer-se determinar, enquanto o titulante é o
reagente ou solução cuja concentração é sabida.

Em processo de titulação ácido-base, mais especificamente, ocorre uma reação de

neutralização entre um ácido e uma base.

Ácido + Base Sal + Água

Equação 3 : Equação demonstrativa dos reagentes e produtos em uma reação de neutralização.

Contudo, em outras titulações, que não envolvam um ácido e uma base, podem
também ocorrer reações de complexação, precipitação e oxidação-redução.

Para facilitar o nosso estudo, vamos nos focar no estudo das titulações, ácido-base,
mais comumente empregadas na rotina de trabalho do auxiliar de laboratório.

Na volumetria ácido-base, o titulante normalmente é uma base forte (hidróxido de

sódio, hidróxido de potássio) ou ácido forte (ácido clorídrico, ácido sulfúrico). O ponto final ou de
equivalência desta titulação, em geral é obtido por meio de indicadores visuais (método
colorimétrico) ou por métodos instrumentais, como o potenciométrico. Conceitua-se o ponto de
equivalência como sendo o momento da titulação em que a relação entre o número de moles do
titulante e o número de moles do titulado se iguala àquela prevista por meio da reação
estequiométrica (JESUS, 2012).

No caso do método colorimétrico, faz-se a adição de um indicador ácido-base ao

titulado. Esse indicador frequentemente é um ácido ou base fracos que possuem a propriedade
de alterar sua coloração em função do seu grau de dissociação (pH do meio), sendo o mais
conhecido deles a fenolftaleína. Vejamos na figura abaixo as variações de coloração para três
diferentes indicadores ácido-base, em função da modificação do pH do meio (JESUS, 2012).

FIGURA 2: VARIAÇÃO DA COLORAÇÃO DE INDICADORES ÁCIDO-BASE EM 17

DIFERENTES CONDIÇÕES DE pH

FONTE: FELIPE, 2012.

Já no método potenciométrico, durante o processo de titulação utiliza-se o eletrodo de

um medidor de pH imerso no titulado para aferir continuamente o pH da solução ao longo de
todo o processo e, com isso, construir a curva de titulação. A curva de titulação ou curva de
neutralização é uma representação gráfica dos valores de pH do titulado em função do volume
de titulante que a ele foi adicionado.

FIGURA 3: CURVA DE TITULAÇÃO

No eixo das ordenadas tem-se a variação do pH do titulado, em função da adição de titulante

(volume representado no eixo das abscissas). Tem-se em destaque o ponto de equivalência.
 FONTE: PERES, 2005.

Essa representação gráfica da curva de titulação permite-nos identificar três zonas de

variação do pH do titulado: inicialmente, uma variação suave, na região ácida da escala de pH (a
pequena variação se justifica pela capacidade tamponante da solução de ácido forte); uma
grande variação na vertical, na região de transição da zona ácida para a zona alcalina; e
18
pequena variação na região alcalina da escala de pH. Assim, observando a representação,
podemos afirmar que, graficamente, o ponto de equivalência da titulação ácido-base
corresponde ao ponto de inflexão da curva de titulação (JESUS, 2012).

A representação da Figura 3 foi aqui utilizada como representativa da curva de

titulação em uma titulação com ácido forte e base forte. Nesse caso, o ponto de equivalência
corresponderá ao pH em torno de 7,0. Entretanto, existem outros tipos de titulação ácido-base,
distinguido justamente em função do ponto de equivalência.

Assim, em uma titulação, ácido fraco – base forte, o ponto de equivalência

corresponderá a um pH maior que 7,0. Já em uma titulação envolvendo um ácido forte e uma
base fraca, tem-se o ponto de equivalência em um pH menor que 7,0 (JESUS, 2012).

Assim, para concluir, em um procedimento de titulação o objetivo principal é descobrir

a concentração do titulado, uma vez que já conhecemos o volume do qual dispomos. No início
do procedimento, deteremos o conhecimento sobre a concentração do titulante, mas não sobre o
volume desta solução que será utilizado para descobrir a concentração do titulado. Ao final do
processo, em razão da curva de titulação e do ponto de equivalência, saberemos a concentração
do titulante e o volume utilizado desta solução. Contudo, continuamos sem saber qual a
concentração do titulado. Para solucionar esse problema, utilizaremos os conhecimentos já
adquiridos no item anterior do curso (Preparo de soluções - cálculos, medições e reagentes). Na
equação 2 aprendemos como relacionar volumes e concentrações de duas soluções e por meio
dela e das informações de que dispomos poderemos, então, calcular a concentração do titulado.

1.4 CROMATOGRAFIAS
 O termo cromatografia foi utilizado pela primeira vez em 1906 por um botânico russo
no momento em que descrevia suas experiências com extratos de folhas, nas quais objetivava a
separação de componentes. Nessas experiências, o extrato das folhas foi adicionado a uma
coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio e, então, adicionado éter de petróleo que
19
deveria percorrer a coluna e, assim, separar os componentes do extrato de folhas em faixas
coloridas. Possivelmente, esse seja o motivo pelo qual a técnica foi batizada de cromatografia, já
que chrom equivale à cor e graphie significa escrita (NELSON & COX, 2006).

Desse modo, a cromatografia é um método físico-químico utilizado para separação de

componentes. Basicamente, essa separação se embasa na propriedade de migração diferencial
dos componentes que constituem uma mistura e ela irá ocorrer em razão das diferentes
interações existentes entre duas fases imiscíveis: a fase móvel e a fase estacionária. A fase
móvel (na forma de gás ou líquido) atravessa a fase estacionária, carregando a amostra (soluto).
Os componentes da amostra, então, irão se dividir conforme a sua afinidade com a fase móvel
ou estacionária. No caso da afinidade com a fase estacionária, a interação se dará por absorção
(transferindo-se para o interior da fase estacionária) ou adsorção (ficando retida na superfície
das moléculas que compõem a fase estacionária). A fase estacionária comumente é sólida, mas
no caso de ser um líquido, esse pode estar adsorvido a um suporte sólido ou imobilizado sobre o
mesmo. No caso de fases estacionárias sólidas, as mais comuns em uso são a sílica, a alumina,
parafina, poliglicóis, poliésteres e silicones. As fases estacionárias sólidas, como já
mencionadas, levam à separação dos componentes por absorção ou adsorção, enquanto fases
estacionárias líquidas permitem a separação por partição (NELSON & COX, 2006).
FIGURA 4: ILUSTRAÇÃO DO PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA
COLUNA CROMATOGRÁFICA

20

Reservatório

Fase móvel
(amostra)
Fase
estacionária
Proteínas
Efluente

Em destaque, os elementos principais da coluna cromatográfica.

FONTE: Adaptado de NELSON & COX, 2006.

A aplicação mais comum da cromatografia é a separação de componentes em uma

mistura, mas ela também pode ser uma técnica útil na identificação de compostos, por meio da
comparação com padrões já existentes, e para a purificação de compostos, separando os
componentes indesejáveis.
 Os diferentes tipos de cromatografia mais comumente utilizados podem ser
classificados conforme alguns critérios, como:

 A forma física do sistema de cromatografia (cromatografia em coluna ou planar);

a cromatografia planar corresponde aos seguintes tipos: cromatografia em papel, cromatografia
por centrifugação e cromatografia em camada delgada.
21
 A fase móvel utilizada; nesse caso, as cromatografias podem ser gasosas,
líquidas ou supercríticas (vapor pressurizado acima da temperatura crítica);
 A fase estacionária utilizada; nesse caso as cromatografias podem ser de fases
estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas;
 O modo de separação; nesse caso, as cromatografias podem se dar por
adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou mais de um desses tipos ao mesmo tempo
(DEGANI et al., 1998).

FIGURA 5: ILUSTRAÇÃO DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA

FONTE: DEGANI et. al., 1998.

 A cromatografia líquida clássica caracteriza-se pelo fato da fase móvel ser arrastada
por uma coluna apenas em consequência da força da gravidade. Já na cromatografia líquida de
alta eficiência (ou HPLC) se faz uso de fases estacionárias constituídas por partículas menores e
o uso de um instrumento que bombeie a altas pressões a amostra, fazendo com que ela percorra
a fase estacionária de modo mais rápido, o que acaba melhorando a resolução da separação. A
cromatografia líquida clássica é bastante utilizada para promover a separação de produtos 22
naturais e para a purificação de produtos de reações químicas (NELSON & COX, 2006).

A escolha do eluente, substância que irá desfazer as ligações entre componentes da

amostra e a fase estacionária, depende da natureza dos componentes da amostra. Assim, se a
amostra for constituída por duas substâncias, uma apolar e outra polar utilizam-se primeiro um
eluente apolar seguido de um polar. Dado o fato de que, invariavelmente, partículas da amostra
ficarão irreversivelmente adsorvidas à fase estacionária, é preciso, a cada etapa de separação
em cromatografia, realizar um tratamento para recuperar o adsorvente.

A cromatografia é também um instrumento muito útil no fracionamento de proteínas,

que podem ser diferenciadas em função de sua carga, tamanho, afinidade de ligação e outras
propriedades. A esse respeito, as proteínas podem migrar mais rápido ou mais devagar pela
coluna, a depender das suas propriedades. Por exemplo, na cromatografia de troca iônica, a
fase estacionária possui grupamentos carregados negativamente. Na fase móvel, as proteínas
com carga positiva irão migrar mais devagar pela fase estacionária, em razão das interações
iônicas que serão estabelecidas entre a amostra e a fase estacionária. Abaixo, alguns esquemas
ilustrativos dos diferentes tipos de cromatografia (NELSON & COX, 2006).
 FIGURA 6: ESQUEMA ILUSTRATIVO DA TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA DE TROCA
IÔNICA

Grande carga positiva

Carga positiva
Carga negativa
Grande carga negativa
23

Grupos funcionais
carregados
negativamente

Proteína (amostra)
é adicionada à
coluna

Proteínas se movem pela coluna; as mais

negativamente carregadas são eluídas
primeiro.

FONTE: Adaptado de NELSON & COX, 2006.

Na cromatografia de exclusão por tamanho, as proteínas são separadas de acordo

com o seu tamanho. Assim, as proteínas maiores são eluídas primeiro, uma vez que elas
percorrem apenas os espaços existentes entre as moléculas que constituem a fase estacionária.
Já as proteínas menores percorrem os caminhos dentro das cavidades das moléculas que
constituem a fase estacionária, daí demorarem mais para serem eluídas.
FIGURA 7: ESQUEMA ILUSTRATIVO DA TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO
POR TAMANHO

24

Polímero
poroso

Proteína (amostra) é
adicionada à coluna.

Moléculas de
proteína separadas
por tamanho (as
maiores passam
mais livremente).

FONTE: Adaptado de NELSON & COX, 2006.

A cromatografia por afinidade se baseia na ligação de proteínas à fase estacionária por

afinidade. As moléculas que compõem a fase estacionária possuem um grupamento químico
ligado covalentemente. Se a proteína da amostra apresentar afinidade por tal grupamento
químico, ela irá se ligar a ele e a sua migração pela coluna, consequentemente, será retardada.
 FIGURA 8: ESQUEMA ILUSTRATIVO DA TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Proteína de interesse

Ligante

25

Mistura
de
proteínas

A mistura é adicionada à
coluna que contém
ligante específico para a
proteína de interesse.
Outras proteínas A proteína de
(que não a de interesse é
interesse) são eluída pela
eluídas da solução do
coluna. ligante.

FONTE: Adaptado de NELSON & COX, 2006.

1.5 ESPECTROFOTOMETRIA
 A espectrofotometria se baseia nas propriedades de absorção e/ou emissão de
radiação eletromagnética pelas moléculas, quando seus elétrons se movimentam entre
diferentes níveis energéticos. Os estudos sobre essa técnica se iniciaram no século XVII, com o
início dos estudos sobre a luz, e culminaram com a invenção do espectroscópio em 1859.

O espectro eletromagnético corresponde a um conjunto de comprimentos de onda e o

26
espectro da luz visível está contido justamente entre os comprimentos 400 nm a 800 nm (desde
próximo ao ultravioleta até próximo ao infravermelho).

FIGURA 9: ILUSTRAÇÃO DO ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO E ASSOCIAÇÕES DAS

FREQUÊNCIAS COM AS RADIAÇÕES DO COTIDIANO

FONTE: Espectro Científico, 2012.

As diferentes cores no espectro da luz visível correspondem a diferentes comprimentos

de onda, como podemos observar na tabela abaixo:
TABELA 2: COMPRIMENTOS DE ONDA DENTRO DO ESPECTRO DA LUZ VISÍVEL

27

FONTE: Universidade dos Açores, 2012.

A radiação que incide em uma solução pode sofrer reflexão, refração, espalhamento ou
ser absorvida pela solução. Dessa forma, somente uma parcela da radiação incidente será
transmitida pela solução. A absorção da radiação ocorre quando a energia que é transportada
por ela é igual à diferença entre dois níveis de energia das moléculas presentes em solução.
Assim, a energia da radiação é transferida para as moléculas e ocorre a sua absorção pelas
mesmas. Isto nos permite inferir que os comprimentos de onda que certa substância absorve são
típicos e estão associados à sua estrutura molecular.

O espectrofotômetro é o instrumento que nos permite medir a quantidade de luz que foi
absorvida por uma solução, após termos submetido-a a um feixe de luz monocromática. De
forma geral, o espectrofotômetro se constitui em: uma fonte de radiação, que pode ser uma
lâmpada incandescente, a amostra e um detector. É na fonte de radiação que deve haver um
modo de controle e seleção do comprimento de onda que deve incidir na amostra, o que é feito
por meio de filtros ou monocromatizadores (prismas ou grades de difração). O prisma separa
esse feixe de luz monocromática em seus diferentes comprimentos de onda (como ocorre em
um arco-íris, por exemplo, em que se tem a separação da luz branca em seus diferentes
comprimentos de onda – coloridos) e nos permite saber a quantidade de luz absorvida pela
solução correspondente a cada comprimento de onda (Universidade dos Açores, 2012). 28

FIGURA 9: ESQUEMA DO CAMINHO DA RADIAÇÃO E DOS DADOS OBTIDOS EM UM

ESPECTROFOTÔMETRO

Fonte de
radiação

Prisma

Cubeta com
amostra

Detector

Computador

FONTE: Arquivo pessoal.

A amostra deve estar contida em um recipiente típico denominado cuvette ou cubeta.

Já o detector é um instrumento sensível à radiação e servirá para refletir uma medida da
intensidade da mesma, por meio da conversão do sinal percebido em um valor numérico
(Universidade dos Açores, 2012). Abaixo, segue figura mais detalhada do processo e do
caminho realizado pela luz.

FIGURA 10: ESQUEMA ÓPTICO DOS PRINCIPAIS COMPONENTES DO 29

ESPECTROFOTÔMETRO

As letras representam: (a) fonte de luz, (c) prisma, (e) compartimento de amostras com cubeta
contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.

FONTE: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2012.

O resultado obtido em uma análise no espectrofotômetro é o conjunto das

absorbâncias correspondentes aos vários comprimentos de onda, o que se denomina espectro
de absorção. Esse espectro varia de substância para substância ou de solução para solução, já
que depende de características inerentes às mesmas. Assim, por exemplo, no caso de uma
substância ou solução de cor verde, a luz verde será refletida e não absorvida pela substância,
que tende a absorver apenas comprimentos de onda correspondentes ao vermelho.
 FIGURA 11: ESPECTRO DE ABSORÇÃO DA CLOROFILA. OBSERVAR QUE NA FAIXA DO
ESPECTRO CORRESPONDENTE À COR VERDE NÃO HÁ ABSORÇÃO

30

FONTE: Revista Eletrônica do Vestibular, 2012.

Assim, como as diferentes substâncias apresentam diferentes padrões de absorção, a

espectrofotometria aplica-se à identificação das substâncias baseada em seu espectro de
absorção. Além disso, por meio da espectrofotometria é possível também quantificar a
substância, uma vez que a quantidade de luz absorvida por ela está diretamente relacionada à
sua concentração.

Frequentemente precisamos quantificar substâncias que se encontram presentes em

misturas complexas ou ainda que não absorvem de modo significativo a luz em nenhum
comprimento de onda. Assim, é preciso, antes de realizar a medição em espectrofotômetro,
adicionar à mistura um composto, que dará cor à mesma, e cuja concentração é diretamente
proporcional à concentração da substância de interesse na mistura original. Os métodos
colorimétricos mais comumente utilizados na rotina laboratorial são: o de biureto, de Lowry e
método de Bradford.

Previamente às análises das amostras, devemos medir as absorbâncias para o que

chamamos de branco, que é uma solução idêntica às amostras, sem, contudo, apresentar o
soluto que possa absorver a luz. Assim, utilizamos o método para descobrir a concentração de
dada proteína em solução, o branco não poderá conter a proteína. A medida de absorbância do
branco deve ser feita, para se eliminar a diferença de absorbância devido ao branco,
promovendo, então, uma leitura real das absorbâncias obtidas para as amostras.

Assim, resumidamente, o que temos até agora no procedimento da técnica de

espectrofotometria é:

 A luz emitida passa pelas cubetas; as medições são feitas seguindo a ordem 31
branco-amostras;
 Essa intensidade de luz que atravessou as amostras é medida, nos permitindo
saber os valores de absorbância.
Contudo, para realizar a quantificação espectrofotométrica de uma substância em
solução é preciso antes construir a chamada, curva padrão, que nos permite descobrir a
constante de proporcionalidade de absorção do método colorimétrico. Assim, para construir tal
curva, prepara-se uma série de soluções com um composto de concentração conhecida, como a
albumina, por exemplo. Utilizamos o método colorimétrico elegido e realizamos a medição das
absorbâncias em um dado comprimento de onda.

FIGURA 12: CALIBRAÇÃO DE UM MÉTODO COLORIMÉTRICO UTILIZANDO-SE ALBUMINA

FONTE: MARTINS et al., 2006.

 A curva padrão ou curva de calibração, como mostrado na figura acima, nos permitirá
estabelecer a relação entre absorbância e concentração por meio de uma equação de primeiro
grau, que, no futuro, permitirá relacionar as absorbâncias obtidas para a solução de interesse
com a concentração da substância que queremos determinar.

32
2 CONHECIMENTOS BIOLÓGICOS PARA USO EM LABORATÓRIO

Neste segundo módulo do curso de Auxiliar de Laboratório, pretende-se apresentar os

33
principais conhecimentos relacionados à área Biológica que costumam ser mais frequentemente
exigidos na prática laboratorial. Assim, aprenderemos sobre a manipulação de materiais
biológicos, métodos e técnicas de pesquisa e instrumentos de trabalho (como a microscopia, por
exemplo). Com isto, pretende-se disponibilizar uma visão ampla da atuação deste profissional
que deve possuir conhecimentos variados.

2.1 TÉCNICAS DE COLETA DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

O processo de realização de exames clínicos laboratoriais inicia-se com o pedido do

médico e termina somente com a interpretação dos resultados obtidos nos exames. Nesse
entremeio, contudo, tem-se a atuação da figura do auxiliar de laboratório, no que concerne à
coleta das amostras de material biológico a serem analisadas, o preparo das amostras (fase pré-
analítica), a realização dos testes e exames (fase analítica), a análise dos resultados obtidos nos
testes, exames, à liberação desses resultados e a preparação dos laudos (fase pós-analítica).

Todo o processo de coleta e análise de materiais biológicos deve ser obrigatoriamente

precedido da lavagem correta das mãos e uso de luvas. É importante lembrar também que após
o término do procedimento, a lavagem das mãos é imprescindível.

O sangue, um dos tipos de materiais biológicos mais comuns em análises, é formado

por duas fases: os elementos figurados (células e plaquetas) e o plasma (fase líquida do sangue,
na qual os elementos figurados se mantêm em suspensão). Os elementos figurados do sangue
são representados pelos eritrócitos, os leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e
os monócitos) e as plaquetas.

O sangue, quando retirado dos vasos sanguíneos, coagula. Daí a importância de se

utilizar substâncias conhecidas como anticoagulantes. Dependendo da análise, o exame poderá
ser realizado no sangue total (hemograma), no plasma ou no soro (porção do plasma obtida
34
quando os elementos de coagulação sanguínea não estão mais presentes). Quando o teste tiver
que ser realizado no soro, esse deverá ser obtido por meio de coleta em tubo sem
anticoagulante, uma vez que é do nosso interesse que, para este tipo de exame, ocorra o
processo de coagulação sanguínea. Já para que se obtenha o plasma, é de nosso interesse que
não ocorra à coagulação; portanto, a coleta deve ser realizada em tubo contendo anticoagulante.
Assim, após a coleta do sangue, em tubo apropriado, deve-se fazer o procedimento de
homogeneização por inversão, de 5 a 8 vezes, a fim de misturar o sangue colhido ao
anticoagulante, evitando, portanto, a coagulação e a hemólise sanguínea. Na tabela abaixo,
temos a descrição dos principais tipos de anticoagulantes utilizados e sua forma de identificação
por meio das tampas dos tubos, bem como suas principais aplicações (TOLEDO, 2010).
TABELA 3: QUADRO-RESUMO DOS PRINCIPAIS ANTICOAGULANTES UTILIZADOS NA
ROTINA DE EXAMES LABORATORIAIS, SUA COR DE IDENTIFICAÇÃO E PRINCIPAIS
APLICAÇÕES

35

FONTE: Secretaria Municipal de Saúde de São Paulo, 2012.

Assim, após a homogeneização da amostra, o plasma e o soro sofrerão processo de

centrifugação. O sangue total utilizado em análises não costuma ser centrifugado, justamente,
porque objetivamos ter todos os elementos do sangue presentes e não separá-los. Na figura
abaixo, segue as imagens do que se espera obter nos tubos após o processo de centrifugação.
 FIGURA 13: IMAGENS OBTIDAS NOS TUBOS DE COLETA APÓS O PROCESSO DE
CENTRIFUGAÇÃO

36

A B C

Quando se objetiva obtiver o soro sanguíneo (A), o plasma sanguíneo (B) e, no caso de sangue
total (C), que não sofreu centrifugação.

FONTE: TOLEDO, 2010.

A coleta de material microbiológico tem o objetivo de identificar os agentes infecciosos

e o perfil de sensibilidade a antimicrobianos. A coleta deve ser realizada em um sítio ou local do
corpo representativo do processo infeccioso a ser investigado. Assim, é recomendável, por
exemplo, a remoção de crostas de feridas, já que as melhores amostras microbiológicas se
encontram abaixo da mesma. Como mencionado acima, quando tratamos da coleta sanguínea,
a higiene das mãos é fundamental e os instrumentos utilizados devem ser estéreis e os frascos
de boca larga, para evitar ao máximo a contaminação com micro-organismos que não sejam
representativos do processo infeccioso. O tempo máximo entre o processo de coleta e o início
das análises é típico para cada material. Na tabela abaixo, veremos isso em mais detalhes.
TABELA 4: FORMAS DE ACONDICIONAMENTO E TEMPO MÁXIMO PARA A RECEPÇÃO DA
AMOSTRA PARA ANÁLISE

37

No que se refere às fontes de obtenção e métodos de análise destes materiais

biológicos com fins de investigação microbiológica, tem-se as seguintes recomendações:

 Hemocultura: coleta de sangue, em que são utilizados frascos com meio de

cultura com aspiração a vácuo; útil para hemocultura de leveduras, fungos ou bactérias.
 Secreção de ferida cutânea ou cirúrgica, abscesso ou fístula: o material deve ser
coletado, preferencialmente, após lavagem da lesão com soro fisiológico; a coleta pode ser feita
por aspiração da secreção ali presente ou do líquido não drenado (por meio de seringa e agulha
estéreis) ou ainda com swab.
 Fragmento de tecido: em se tratando de feridas ou lesões cutâneas é
recomendado o cultivo de pequeno fragmento do tecido (biópsia), mas ainda poderá ser utilizado
o swab.
  Urocultura: a urina na bexiga é estéril; entretanto, dependendo do modo de
coleta, pode ocorrer sua contaminação com a microbiota uretral. Para tentar minimizar essa
contaminação, o modo mais recomendado de se realizar a coleta é por meio da coleta de urina
de jato médio.
 Liquor: a punção para obtenção do liquor é feito na coluna lombar e exige
condições estritas de assepsia; a recomendação é que a coleta já seja realizada no próprio meio 38
de cultura; além disso, o liquor não deve ser armazenado sob refrigeração, uma vez que
algumas bactérias não resistem a temperaturas muito baixas.
 Fezes: devem ser coletadas, preferencialmente, no início na fase aguda da
doença, quando os agentes infecciosos costumam estarem presentes em maior número.
Havendo porções mucosas ou sanguinolentas nas fezes, deve-se dar preferência à coleta das
mesmas (DUTRA, 2002).

2.2 MANUTENÇÃO DE BIOTÉRIO E MANEJO DE ANIMAIS DE LABORATÓRIO

A experimentação animal teve início com os antigos gregos e romanos, mas somente
nos séculos XVIII e XIX progrediu, a partir de uma prática relativamente incomum até o
embasamento científico. Hipócrates traçava relações entre os órgãos humanos doentes e os de
animais. Pitágoras já acreditava que a amabilidade com todas as criaturas de origem não
humana era nosso dever. Galeno realizou vivisecções2 com propósitos experimentais,
observando variáveis em função de alterações provocadas nos animais. Admite-se que a
primeira pesquisa científica que utilizou animais de maneira sistemática ocorreu em 1638, tendo
sido realizada por William Harvey. A publicação, por Charles Darwin, do livro “A Origem das
Espécies” em 1859 estabeleceu os vínculos entre as diferentes espécies animais, o que

2
Método de experimentação animal caracterizado como o ato de dissecar um animal vivo, objetivando
a visualização de estruturas internas com propósitos de estudo e pesquisa.
possibilitou a extrapolação dos resultados obtidos em pesquisas com animais para os seres
humanos (POLITI, et al., 2008).

Paralelamente, a essa evolução no uso de animais em pesquisas científicas também

evoluíram os movimentos contra esse uso de animais. No século XVIII, principalmente na
Europa, a elite social questionava o modo como os animais eram maltratados em pesquisa
39
científica e no século XX se intensificaram ainda mais as divergências e os debates em torno da
questão da experimentação animal e o uso ético dos animais. Um marco no estabelecimento de
limites ao uso de animais na experimentação e no ensino foi aquele que envolveu Claude
Bernard.

Esse fisiologista em 1860 fez uso do cão de estimação de sua filha em uma aula.
Assim, sua esposa fundou a primeira associação de defesa de animais de laboratório. Os
processos de crítica ao uso de animais fizeram surgir, então, práticas menos exploradoras dos
animais com fins de pesquisa. Em 1959, o zoologista William Russell e o microbiologista Rex
Burch publicaram um livro no qual estabeleciam os três Rs das pesquisas com animais: replace
(substituir), reduce (reduzir) e refine (refinar). Essa pode, então, ser considerada uma das
primeiras tentativas de sensibilização dos procedimentos de experimentação animal (POLITI, et
al., 2008).

No Brasil, pode-se observar que muitas instituições, principalmente as que produzem

imunobiológicos e fármacos, também estiveram imersas nesses movimentos de manifestação
ética quanto ao uso de animais, como representado pelas campanhas contra a febre amarela e a
varíola, que culminaram na revolta da vacina em 1904.

Em nosso país, a primeira manifestação legal sobre o bem-estar dos animais

corresponde ao Decreto Federal nº 24.645, de 1934, no qual eram estabelecidas penas que
variavam desde multas a prisões para infratores que houvessem praticado atos de abuso ou
crueldade contra os animais, fossem em pesquisas científicas ou mesmo na convivência
cotidiana com os animais. Após isso, somente em 1991, o Colégio Brasileiro de Experimentação,
que agora passou a denominar-se Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório,
elaborou uma série de 12 artigos conhecidos como os Princípios Éticos na Experimentação
Animal. Em 1998, com a Lei de Crimes Ambientais (Lei nº 9605), regulamentada pelo Decreto nº
3179 de 1999, foram adotadas noções contidas nos conceitos de 3Rs acima mencionados. Mais
recentemente, tivemos a aprovação da Lei nº 11794 de 2008, regulamentada pelo Decreto nº
6899 de 2009, que estabelece a implantação do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA), das Comissões de Ético no Uso de Animais (CEUAS), e
procedimentos e responsabilidades quanto ao uso de animais de laboratório (POLITI, et al.,
2008).

40
No final dos anos 1990, o Brasil ingressou de forma definitiva no campo das pesquisas
e do desenvolvimento científico, que invariavelmente dependem do uso de animais de
laboratório. Mas, esse processo de inserção do Brasil nesse campo requer ainda sua atenção
com as questões de biossegurança, definidas como sendo o conjunto das ações voltadas para a
prevenção ou eliminação dos riscos à saúde do homem, dos animais e do ambiente associados
a essas atividades.

As instituições de pesquisa, muitas vezes, necessitam de grandes quantidades de

animais, inclusive livres de patógenos. Dessa forma, surge o biotério, que se destina à criação e
à manutenção de animais de laboratório em condições sanitárias, dentro de padrões
estabelecidos, com o objetivo de utilizá-los nas pesquisas científicas, na preparação de
imunobiológicos, em exames toxicológicos ou ainda no controle de qualidade de itens como
alimentos, medicamentos ou vacinas. Outra aplicação dos biotérios se refere também ao seu uso
em pesquisas de caráter pedagógico, tanto no nível de graduação quanto no nível de pós-
graduação. Isso porque, nas aulas práticas a atividade experimental realizada, frequentemente
com roedores, faz parte da rotina de estudos nesses cursos e fundamentam a compreensão
daquilo que é visto nas aulas teóricas. Sabe-se que os fatores ambientais influenciam de forma
direta os resultados das pesquisas e, por isso, o biotério deve ser sempre mantido dentro das
especificações e normas sanitárias.

Os biotérios podem ser classificados segundo a sua finalidade. Assim, os biotérios de

criação são aqueles nos quais são produzidas e mantidas as matrizes das linhagens, com um
rigoroso controle quanto à saúde dos animais e esquemas de cruzamentos objetivando manter
as características genéticas e assegurar os padrões de qualidade. Já os biotérios de produção
são aqueles destinados à criação de grandes quantidades de animais, a partir de matrizes
vindas dos biotérios de criação, com fins de atendimento às necessidades de pesquisa. Os
biotérios de experimentação se destinam a receber os animais provenientes dos biotérios de
produção e utilizá-los em procedimentos de experimentação.

Algumas diretrizes básicas norteiam os procedimentos de utilização de animais em

experimentação laboratorial. A generalização de que os conhecimentos obtidos em quaisquer
animais podem ser extrapolados para os seres humanos não deve servir de justificativa para
41
qualquer experimento. A pesquisa com animais de laboratório deve ser avaliada do ponto de
vista da geração do conhecimento, da sua exequibilidade e de sua relevância. Assim, os comitês
de ética em pesquisa servem justamente para realizar essa avaliação de maneira adequada.

O animal de laboratório deve ser visualizado como um reagente biológico e, como já

mencionado, os fatores ambientais podem alterar os resultados dos experimentos realizados
com os mesmos. Assim, é primordial a manutenção de condições ambientais estáveis nos
biotérios, o que irá garantir a reprodutibilidade dos resultados dos experimentos. Quanto ao
espaço físico destinado ao manejo dos animais, as gaiolas apresentam dimensões próprias para
o uso de cada animal, como demonstrado na Tabela 5. As gaiolas podem apresentar filtros
(microisoladores) para a proteção dos animais, principalmente aqueles imunodeficientes, ou
mesmo o agente operador que lida com os animais, prevenindo infecções.

TABELA 5: CAPACIDADE DE ANIMAIS POR CAIXA (RELAÇÃO ENTRE DIFERENTES

ESPÉCIES E TAMANHOS DE CAIXAS)

FONTE: PAIVA et al., 2005.

 Os animais apresentam a particularidade de captar frequências sonoras superiores ou
inferiores àquelas percebidas pelos ouvidos humanos. Sendo assim, é importante evitar
alterações bruscas na intensidade dos sons nas proximidades do biotério, uma vez que isso
pode estressar os animais e, com isso, induzir alterações imunológicas ou metabólicas que,
certamente, influenciarão os resultados experimentais obtidos.

42
A contenção física depende do corpo do animal. Em roedores, por exemplo, ela é
frequentemente realizada por meio da base da cauda, que é utilizada para suspender o animal,
retirando-o das caixas, por exemplo. Após isso, apoia-se o animal em uma superfície,
preferencialmente, onde o mesmo possa se agarrar, como a própria tampa da gaiola ou caixa.
Em animais de pequeno porte, como camundongos, é frequente se utilizar da pegada da pele da
região posterior (dorso) cervical, puxando-a com os dedos, indicador e polegar, e da fixação da
cauda com os demais dedos e a palma da mão. No caso de animais maiores, como os ratos,
prende-se o mesmo com a mão na região dorsal da caixa torácica e segurando sua cabeça com
os dedos, indicador e polegar (PAIVA et al., 2005).

Quanto às vias para administração de drogas em animais, tem-se a via oral ou

gavagem, em que se introduz a substância na cavidade oral do animal por meio de agulha
apropriada (de formato curvo e ponta arredondada) com o animal consciente. O volume máximo
introduzido em roedores é de 1 mL de solução para cada 100 g de massa corpórea, em se
tratando de solução não aquosa; no caso de solução aquosa, a relação passará a ser de 2 mL
de solução para cada 100 g de massa corpórea. A via subcutânea deve ser utilizada com o uso
de agulha hipodérmica, que transpassa a derme, normalmente produzindo pouca dor e realizada
com os animais conscientes.

Na via intramuscular, devem ser utilizadas agulhas similares àquelas empregadas na

via subcutânea e não inseridas muito além de 5 mm de profundidade no corpo do animal. No
caso da via endovenosa, a recomendação é que se evite o uso de substâncias irritantes e que o
veículo seja do tipo aquoso. Como, geralmente, se faz a aplicação na veia da cauda, para
melhorar sua visualização recomenda-se mergulhá-la em água quente (40 – 50 ºC) por alguns
segundos. Já a via intraperitoneal é, normalmente, a mais utilizada para injeção de substâncias
em roedores. Nesse caso, a imobilização é um pré-requisito básico para o sucesso da técnica
(PAIVA et al., 2005).
 A anestesia deve ser utilizada em experimentação animal sempre que o procedimento
a ser realizado implique em dor ou desconforto aos animais, como cirurgias, manipulação de
regiões de necrose, coleta sanguínea por via intracardíaca e periorbital. Em relação às técnicas
anestésicas mais comumente empregadas em animais de laboratório, tem-se: diazepan,
acepromazina, quetamina, xilazina, pentobarbital, atropina (PAIVA et al., 2005).

43
Em relação à eutanásia (forma de abreviação da vida de um ser vivo, sem dor ou
sofrimento), essa se torna uma opção em razão do término do experimento, com o intuito de
obter material biológico (tecidos) para pesquisa, quando o animal está sob estresse, dor ou
sofrimento excessivos, quando os animais não estão mais aptos à reprodução e quando passam
a apresentar características que não são mais desejáveis ao biotério. Mais especificamente em
relação ao procedimento da eutanásia, devem ser observados certos critérios para a
manutenção do bem-estar animal durante a sua realização, como:

 Utilização de um método que não preveja dor e cause um mínimo de sofrimento.

 A inconsciência e a morte do animal devem ser atingidas de forma rápida.
 Devem-se evitar contenções, para minimizar o estresse, e a excitabilidade do
animal.
 O método de eutanásia escolhido deve ser adequado à idade e ao estado de
saúde do animal, além de fácil de administrar e seguro para o operador.
 A técnica deve ser realizada distante dos demais animais.
Após um procedimento de eutanásia, é necessário realizar a confirmação da morte
antes de descartar os cadáveres. Esse procedimento de confirmação pode se dar por sangria,
evisceração, congelamento ou decapitação.

Para realizar a eutanásia muitos métodos são utilizados. Os métodos físicos,

normalmente, são aceitos com contestação e, em razão disso, só devem ser utilizados quando
não puderem ser usados os métodos químicos. Constituem métodos físicos de eutanásia: o
deslocamento cervical, decapitação, congelamento rápido (utilizando-se nitrogênio líquido) e
exsanguinação. Já os métodos químicos são mais recomendáveis por não causarem trauma
aparente ao animal. São realizados com o uso de agentes farmacológicos inalantes e não
inalantes. Consideram-se agentes inalantes os: anestésicos voláteis, halotano, enflurano e
isoflurano, dióxido de carbono e monóxido de carbono. Já os agentes não inalantes são, mais
comumente, injetáveis, como: pentobarbital sódico e quetamina (PAIVA et al., 2008).

Quanto aos animais, mais propriamente, esses, dependendo da finalidade de sua

utilização na pesquisa científica devem apresentar determinadas características genéticas e
sanitárias, que devem ser avaliadas regularmente, de modo a garantir e manter os padrões de
44
qualidade. Em relação à caracterização genética dos animais existem dois tipos de linhagens: a
inbred e a outbred. Os animais outbred se caracterizam como sendo animais de linhagens
geneticamente heterozigotas para diversos alelos, sendo mantidas no biotério em esquema de
cruzamento aleatório. Já os animais inbred são obtidos pelo acasalamento entre irmãos por mais
de 20 gerações, sendo, portanto, homozigotos para praticamente todos os pares de alelos.
Quanto aos padrões sanitários dos animais, têm-se os:

 Animais convencionais: animais criados em gaiolas abertas com fluxo liberado

de pessoas e materiais, sem a existência de qualquer barreira sanitária para impedir a
introdução de agentes externos, sendo, portanto, susceptíveis a contaminações e infecções;
 Animais SPF (animais specific pathogen free ou livres de patógenos
específicos): são aqueles animais criados em biotérios que dispõem de barreiras sanitárias ou
que são mantidos em gaiolas que impedem o contato com agentes patogênicos; apresentam
microbiota controlada.
 Animais axênicos: são aqueles criados e mantidos em estruturas isoladas
(isoladores), que os mantêm livres de micro-organismos.
 Animais gnotobióticos: são aqueles animais criados e mantidos como os animais
axênicos (em isoladores), mas que, geralmente, apresentam alguns micro-organismos não
patogênicos adicionais.
 Animais com microbiota definida associada: são aqueles animais criados como
os axênicos (em isoladores), mas que, posteriormente, são intencionalmente infectados com
micro-organismos, patogênicos ou não.
 Animais mantidos em barreiras: são aqueles animais criados como tendo uma
microbiota definida, mas que, posteriormente, serão removidos dos isoladores e mantidos em
biotério com barreiras sanitárias definidas, a fim de que possam ser monitorados quanto à
presença de micro-organismos inoculados ou adquiridos de forma acidental.
  Animais monitorados: são aqueles animais criados e mantidos em um sistema de
barreira de baixa segurança e que se mantém livres da maioria dos micro-organismos
patogênicos, sendo monitorados quanto a isso constantemente (POLITI et al., 2008).

FIGURA 14: PADRÕES SANITÁRIOS DE CRIAÇÃO DE ANIMAIS DE LABORATÓRIO

45

FONTE: POLITI et al., 2008.

2.3 CULTIVO DE CÉLULAS

Conceitua-se cultura ou cultivo celular como sendo o conjunto de técnicas que

permitem manter células, que ainda detêm características próprias, isoladas fora do organismo
original. Com a advento das técnicas de cultivo celular foi possível ampliar a pesquisa em
laboratório em relação a diversas áreas, como: nas análises de expressão gênica, nos
experimentos que avaliam o tráfego de substâncias através da membrana, mecanismos de
sinalização celular e transdução de sinal, interação célula-célula e célula-matriz extracelular,
carcinogênese, terapia gênica (células tronco), avaliação da ação de fármacos, entre outras.
 O cultivo celular apresenta muitas vantagens em pesquisa, se comparado ao uso de
organismos como um todo. Isso porque, a maioria dos tecidos de animais e plantas consiste de
uma multiplicidade de diferentes tipos celulares, enquanto que na cultura celular podem ser
crescidas células de um único tipo com propriedades específicas e podem também ser obtidos
clones celulares, o que facilita o controle das variáveis experimentais. Além disso, as condições
experimentais podem ser facilmente controladas em um cultivo celular, o que não ocorre no 46
organismo. Contudo, o processo de cultivo celular também pode apresentar desvantagens, já
que as células não se encontram em seu ambiente natural e, por isso, suas atividades não se
encontram reguladas por outras células ou tecidos, como normalmente ocorre no organismo.
Além disso, a distribuição tridimensional das células e da matriz extracelular ao redor influencia
diretamente o formato e comportamento das células (LODISH et al., 2005).

Uma cultura celular pode ser dita primária, secundária (ou diploide) e contínua, em
razão da fonte de células que a compõe. Assim, em uma cultura primária as células iniciais
foram obtidas a partir dos próprios tecidos de um dado organismo. Já a cultura secundária é
obtida por meio da remoção de células de uma cultura primária. Em uma linhagem contínua,
têm-se células que escaparam do controle exercido no ciclo celular e não sofrem senescência,
isto é, com o tempo não perderão sua capacidade proliferativa, como seria esperado em célula
em condições normais (PINTO et al., 2012).
TABELA 6: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DAS LINHAGENS CELULARES PRIMÁRIAS,
SECUNDÁRIAS E CONTÍNUAS

47

FONTE: PINTO et al., 2012.

Invariavelmente, os estudos que envolvem cultivo celular objetivam realizar

experimentos em um tipo celular específico. Com isso, para obter o tipo celular de interesse é
preciso dissociar as células dos tecidos aos quais estão associadas, procedimento denominado
isolamento celular. Nesse processo de isolamento celular, deve-se primeiro realizar a ruptura
das ligações existentes entre as células e entre essas e sua matriz extracelular envolvente, o
que pode ser obtido por meio de dissociação mecânica ou química (com o uso de enzimas).
Após isso, devemos separar as células já dissociadas dos restos do tecido, o que pode ser feito
por centrifugação. Contudo, um único tecido pode apresentar diversas populações celulares e,
se o objetivo do estudo envolver apenas uma dessas populações, devemos, então, separá-las
entre si, o que é feito por meio de centrifugação em gradiente de densidade. O gradiente pode
ser, por exemplo, de sacarose, em que cada região do tubo apresenta a solução de sacarose em
concentração específica. Assim, a amostra com células será separada, com a centrifugação, em 48
função desse gradiente e, ao final, em cada faixa do tubo teremos uma população celular
específica. Esse método de separação das populações celulares é o mais simples e comum,
mas existem outros que se baseiam no uso de anticorpos (LODISH et al., 2005).

FIGURA 15: REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DO GRADIENTE DE SACAROSE E A SEPARAÇÃO

DE DUAS POPULAÇÕES CELULARES

amostra

gradiente de
sacarose

Componente de baixa
densidade

Componente de alta
densidade

FONTE: Adaptado de LODISH et al., 2005.

 Em uma cultura celular a principal finalidade do meio em que as células são cultivadas
é fornecer às células nutrientes, íons inorgânicos e outros compostos essenciais à sua
sobrevivência e ao seu pleno desenvolvimento. Para que as células se desenvolvam bem em um
cultivo é preciso que haja condições osmóticas (pressão e pH) no ambiente em que se
encontram. Assim, frequentemente, um meio de cultivo celular é constituído por: glicose, solução
tampão (pH estável entre 7,2 e 7,4), indicador de pH (para demonstrar alterações no pH que 49
deve ser mantido estável), íons (obtidos pela adição de sais à cultura), vitaminas, aminoácidos,
antibióticos e água (destilada e deionizada). Na tabela abaixo, tem-se em detalhes os principais
componentes e mais comumente utilizados em um cultivo celular.

TABELA 7: PRINCIPAIS E MAIS COMUMENTE UTILIZADOS COMPONENTES DE MEIO DE

CULTIVO CELULAR

Proteínas (necessárias em
Aminoácidos Vitaminas Sais Outros componentes meios sem soro,
quimicamente definidos)

Arginina Biotina NaCl Glicose Insulina

Cistina Colina KCl Penicilina Transferrina

Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomicina Fatores de crescimento

Vermelho de fenol
Histidina Nicotinamida NaHCO3
(indicador de pH)

Isoleucina Pantotenato CaCl2 Soro

Leucina Piridoxal MgCl2

Lisina Tiamina

Metionina Riboflavina

Fenilalanina
 Treonina

Triptofano

Tirosina

Valina
50
FONTE: PERAZZOLO, 2012.

Células isoladas, geralmente, são plaqueadas em meio de cultivo líquido, dentro de

placas ou frascos plásticos especialmente tratados e utilizados unicamente para esse fim. Isso
porque, diferentemente de leveduras ou bactérias, que podem crescer em suspensão, as células
animais necessitam de uma superfície sólida para se fixarem. As culturas, então, são mantidas
em incubadoras nas quais a temperatura, atmosfera e umidade são controladas. Os antibióticos
são utilizados para se reduzir a probabilidade de contaminação da cultura e, com isso, morte das
células. Para diminuir ainda mais a chance de contaminação, toda a manipulação das células é,
normalmente, feita em capelas de fluxo laminar, nas quais o ar circulante é filtrado para a
remoção dos micro-organismos e outros contaminantes.

O aparato necessário ao cultivo celular resume-se a:

 Câmara de fluxo laminar: local onde devem ser manipulados os meios de cultivo
e as células (feitos os repiques), evitando contaminação.
 Estufa de CO2: apresenta as condições ideais para o crescimento celular.
 Centrífuga: para separação das populações celulares (descrito acima).
 Microscópio invertido: para visualização do crescimento celular ainda no cultivo.
Na figura abaixo, tem-se um esquema resumido de como estabelecer uma cultura
celular, chamando a atenção para os repiques que são realizados. Isto é, quando a cultura
celular cresce muito no meio, é preciso dividi-la entre outros meios para que continuem a se
desenvolver, uma vez que o contato entre as células pode induzir uma inibição do crescimento.
 FIGURA 16: ESQUEMA ILUSTRATIVO DO ESTABELECIMENTO DE CULTIVO CELULAR,
COM REPIQUES

51

FONTE: PINTO et al., 2012.

2.4 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Antes de iniciarmos o estudo das técnicas de Biologia Molecular mais comumente

empregadas nas atividades desempenhadas pelo Auxiliar de Laboratório, devemos entender o
processo histórico de evolução desse conhecimento relativamente recente. O advento da
Biologia Molecular teve início na década de 1940, com os estudos sobre a estrutura e função das
principais moléculas biológicas (o que passou a constituir as bases da biologia molecular que
conhecemos hoje). Nesse sentido, podemos citar uma das principais descobertas do período,
que foi a definição de que o DNA era a molécula que continha a informação genética. Anos mais
tarde, estudos apontaram qual seria a estrutura da molécula de DNA (modelo da dupla hélice) e
demonstraram que a distribuição dos nucleotídeos que formavam o DNA apresentava um
padrão, isto é, a quantidade de timina era igual à de adenina e a de guanina era igual à de
citosina. A partir de então, as descobertas relacionadas à natureza do DNA foram se
intensificando, passando a ser conhecido seu processo de autoduplicação, o código genético, o 52
processo de transcrição do RNA e, finalmente, o processo de tradução das proteínas.

Dentre todas as propriedades detidas pelos organismos vivos, a autorreplicação é a

mais relevante e, com o desenvolvimento tecnológico, muitos avanços têm sido obtidos quanto
ao isolamento, análise e síntese de sequências de DNA, à introdução de sequências de DNA
recombinantes em células vivas e ao controle da expressão dessas sequências. Veremos, então,
em maiores detalhes as características do DNA, do RNA e das proteínas, que constituem as
moléculas chave nos estudos que envolvem Biologia Molecular.

O DNA é formado por seis componentes básicos: uma molécula de açúcar

(desoxirribose), um grupamento fosfato, e 4 bases nitrogenadas (adenina, timina, guanina e
citosina) e se organiza na forma de uma dupla hélice. Em cada uma das fitas que compõem a
dupla hélice do DNA, temos os nucleotídeos, unidades básicas de formação da molécula de
DNA, e que consiste, cada um, em uma desoxirribose, ligada a um fosfato e uma base
nitrogenada. As ligações existentes entre os açúcares por meio dos grupamentos fosfato são
denominadas ligação fosfodiéster. Embora esse arcabouço açúcar-fosfato seja muito importante
na estruturação do DNA, é nas bases nitrogenadas que estão contidas todas as informações que
constituem o código genético. O RNA, ácido nucleico bastante semelhante ao DNA, difere desse
último por apresentar-se em fita simples (e não dupla, como o DNA) e por apresentar uma base
nitrogenada distinta: a uracila, que substitui a timina, não presente. O RNA é transcrito a partir do
DNA e servirá, posteriormente, como mensageiro para a tradução das proteínas.

A identificação de proteínas e aminoácidos é uma constante em estudos de diversas

áreas. A maior parte das soluções de proteínas ou aminoácidos é incolor. Por conseguinte, sua
identificação e quantificação não podem ser feitas diretamente, com base em radiação visível.
Dessa forma, desenvolveram-se vários métodos de quantificação e qualificação dessas
substâncias, como o método de eletroforese.
 Proteínas são substâncias de alto peso molecular, formadas a partir de estruturas
menores chamadas aminoácidos. Apesar da grande variedade de formas e funções que
desempenham, as proteínas são sintetizadas a partir de apenas 20 monômeros diferentes. A
combinação desses aminoácidos resulta em um número elevado de diferentes proteínas.
Podem-se classificar as proteínas em simples, quando apresentam apenas aminoácidos ou
proteínas conjugadas, quando apresentam um grupo prostético (não proteico). As proteínas são 53
cadeias de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Na realidade, as proteínas são
constituídas pela ligação existente entre 20 diferentes aminoácidos e o que determina a
variabilidade desta classe de moléculas e suas funções específicas é sua estrutura
tridimensional. Essa estrutura tridimensional é determinada pelas interações que ocorrem entre
os aminoácidos, quando a cadeia formada por ele se dobra sobre si mesma.
Os aminoácidos são compostos que apresentam um grupo amina (-NH2) e um grupo
carboxila (-COOH), exceto a prolina que apresenta um grupo –NH–. Sua fórmula básica é
composta por um C ligado aos grupos amina, carboxila, hidrogênio e um grupo variável chamado
cadeia lateral ou, simplesmente, grupo R. Os aminoácidos são classificados de acordo com a
polaridade do grupo R em apolares e polares. Nesses últimos, há uma subdivisão em
aminoácidos ácidos, básicos e neutros. Em pH neutro, esses aminoácidos estarão,
respectivamente, desprotonados, protonados e sem carga.

Tanto o DNA, como o RNA, quanto às proteínas são instrumentos importantes nas
análises de biologia molecular. Atualmente, há diversas técnicas de biologia molecular utilizadas
em uma ampla gama de propósitos de pesquisa, como em Genética de Populações, estudos
sobre Evolução ou Filogenia, mapeamento e expressão gênica. Assim, daremos início ao estudo
tratando da reação em cadeia da polimerase (PCR). A tecnologia de PCR, que causou uma
verdadeira revolução nos estudos na área Biológica, foi concebida por Kary Mullis na década de
1980 e vem sendo utilizada tanto em pesquisas que objetivam o entendimento de processos
biológicos, como no melhoramento genético. Esta técnica envolve a síntese enzimática in vitro
de milhões de cópias de um fragmento de DNA.

A reação em si, se baseia na associação e extensão enzimática de um par de

oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA fita simples) denominados primers, que servem
para iniciar a reação e especificar a sequência de DNA que é o alvo da amplificação. Estes
primers são fabricados artificialmente, de acordo com o objetivo do usuário, uma vez que suas
sequências de nucleotídeos devem ser complementares à sequência que se quer amplificar no
DNA alvo do estudo. Um ciclo de reação de PCR envolve três etapas: a desnaturação do DNA
alvo, o anelamento deste com os primers e a extensão ou síntese das cópias do DNA alvo. O
processo de desnaturação se dá pela elevação da temperatura entre 92-95ºC. Para que ocorra o
anelamento, esta temperatura deverá, então, ser reduzida. Posteriormente, a temperatura será
novamente elevada aproximadamente 72ºC para que a enzima DNA polimerase, responsável 54
pela síntese de DNA, possa realizar a extensão das fitas de DNA a partir do ponto em que os
primers se ligaram. Esse ciclo será repetido algumas dezenas de vezes, produzindo uma
quantidade de sequência alvo alguns milhões de vezes, maior que a inicial. Essa enorme escala
de amplificação das sequências de DNA permite iniciar os experimentos com quantidades
mínimas de DNA (que não seriam suficientes para a realização de nenhuma análise) e concluí-
los com grandes quantidades que permitem a realização de testes. Após as etapas de
amplificação, o DNA pode, então, ser detectado em géis de eletroforese corados com corantes
específicos para DNA (como o brometo de etídio, por exemplo). Abaixo, vê-se uma figura com
um resumo das principais etapas da reação de PCR (LIMA, 2008).

FIGURA 17: ESQUEMA COM RESUMO DAS PRINCIPAIS ETAPAS DA REAÇÃO EM CADEIA
DA POLIMERASE (PCR)
 55

FONTE: GRIFFITHS et al., 2008.

 Graças à denominada tecnologia do DNA recombinante, atualmente é possível isolar
genes em um tubo de ensaio e caracterizá-los como sequências específicas de nucleotídeos.
Esse conhecimento detido sobre as sequências gênicas é muito útil, na medida em que permite
sua manipulação para modificar o genótipo (conjunto de genes) de um organismo. A introdução
de um gene modificado em um dado organismo possui, inclusive, aplicações comerciais. O
conjunto das técnicas de DNA recombinante que alteram o genótipo dos organismos é chamado 56
de engenharia genética, sendo o gene transferido denominado transgene, e o produto originado,
organismo transgênico. Assim, resumidamente, o que ocorre é que, inicialmente, se detém
fragmentos de DNA contendo o gene de interesse (DNA doador); esses fragmentos são
inseridos nos cromossomos não essenciais ao organismo (plasmídeos) denominados vetores;
agora, as moléculas do chamado DNA recombinante serão inseridas em bactérias para ser
amplificado (GRIFFITHS et al., 2008).

No caso das proteínas, estas podem ser separadas e caracterizadas por eletroforese,
outra importante técnica de Biologia Molecular que se baseia na migração de proteínas
carregadas por meio de um campo elétrico. Esse procedimento, normalmente, não é utilizado
para purificar proteínas em grande quantidade, porque alternativas mais simples estão
disponíveis para a consecução desse objetivo. Além disso, o método eletroforético,
frequentemente, altera a estrutura terciária das proteínas e, com isso, modifica também suas
funções. Assim, a principal utilidade da eletroforese na rotina laboratorial é como método
analítico. Sua vantagem é que as proteínas podem ser visualizadas e separadas, permitindo ao
auxiliar de laboratório estimar rapidamente o número de proteínas diferentes em uma mistura ou
o grau de pureza de uma determinada proteína em particular. A eletroforese também permite a
determinação de propriedades das proteínas, como seu ponto isoelétrico e seu peso molecular
aproximado.

A eletroforese é realizada em géis constituídos por polímeros unidos por ligações

cruzadas, os chamados géis de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida age como uma peneira
molecular, retardando a migração das proteínas proporcionalmente à sua carga e massa. A
migração das proteínas também pode ser afetada pela sua conformação tridimensional, daí se
homogeneizar o processo de migração aquecendo todas as proteínas antes de aplicá-las no gel,
a fim de desfazer as interações entre os aminoácidos que promovem a estrutura tridimensional.
Um método eletroforético comumente empregado para estimar a pureza e o peso molecular faz
uso do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS), que se liga às proteínas de forma
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular, com cerca de uma molécula de SDS para
cada dois aminoácidos na proteína, contribuindo para um aumento das cargas negativas. Além
de modificar as cargas, a conformação nativa da proteína também é alterada quando o SDS está
ligado e, com isso, as proteínas assumem uma forma aproximadamente similar,
homogeneizando o processo de migração delas pelo gel. A eletroforese na presença de SDS 57
apenas separa as proteínas com base em sua massa (peso molecular), com os pequenos
polipeptídeos migrando mais rapidamente. Assim, para visualizar as proteínas é preciso
adicionar corante ao gel, mais comumente, o Comassie Blue, que se liga às proteínas, mas não
ao gel. Por meio desse procedimento, é possível, então que o auxiliar de laboratório possa
monitorar o progresso da migração das proteínas pelo gel e o número de bandas visíveis ao final
do processo.

FIGURA 18: FIGURA ILUSTRATIVA DO EQUIPAMENTO DE ELETROFORESE (A) E DO

RESULTADO OBTIDO, AO FINAL DO PROCESSO DE MIGRAÇÃO DAS PROTEÍNAS, COM A
COLORAÇÃO DO GEL

Amostra
Poço

Direção da
migração

FONTE: Adaptado de NELSON & COX, 2006.

 Para identificar o peso molecular de proteínas desconhecidas, é preciso correr em um
dos poços do gel um marcador de peso molecular (mistura de proteínas com peso molecular
conhecido adquirido no mercado), que servirá à comparação com as bandas obtidas na mistura
de proteínas a ser identificada (NELSON & COX, 2006).

58
FIGURA 19: GEL DA ELETROFORESE DE DUAS AMOSTRAS (A E C) CORRIDAS COM O
MARCADOR DE PESO MOLECULAR KALEIDOSCOPE

Kaleidoscope com Kaleidoscope A C

escala de pesos
moleculares.

FONTE: Arquivo pessoal do autor.

A eletroforese pode ser unidimensional ou bidimensional, se for realizada em um ou

dois planos de separação, respectivamente. Enquanto a eletroforese unidimensional é mais
utilizada nas rotinas de separação de proteínas e ácidos nucleicos, a eletroforese bidimensional
é mais utilizada para proteínas, quando se tem uma mistura mais complexa delas. A eletroforese
unidimensional se presta à separação de proteínas, por meio do gel de poliacrilamida e com a
ação do SDS, quando elas apresentam massas (pesos moleculares) bastante diferentes entre si,
mas não consegue separá-las quando elas apresentam massas (pesos moleculares) similares
(por exemplo, separar em duas bandas no gel uma proteína com 41-kDa e outra com 42-kDa). 59
Assim, a eletroforese bidimensional serve justamente para a separação dessas proteínas com
massas similares, uma vez que para separá-las, outras características físicas precisam ser
exploradas. Frequentemente, essa outra característica física é a carga elétrica, que é
determinada pelo número de resíduos ácidos e básicos presentes na proteína.

Duas proteínas não relacionadas que apresentam massas similares são diferenciadas
por suas cargas elétricas, já que suas sequências e, portanto, o número de resíduos ácidos e
básicos será diferente. Dessa forma, na eletroforese bidimensional, as proteínas serão
separadas, sequencialmente, por sua massa e sua carga.

Nesse procedimento de eletroforese bidimensional, as amostras inseridas no gel são

submetidas a um gradiente contínuo de pH. Uma proteína irá migrar pelo gradiente até atingir
seu ponto isoelétrico. O ponto isoelétrico é o pH no qual o balanço das cargas da proteína é
zero. Essa técnica é tão poderosa que pode isolar proteínas que se diferenciem apenas por uma
unidade de carga. Após terem sido submetidas ao gradiente de pH, as amostras serão, então,
submetidas a um campo elétrico (como ocorre na eletroforese unidimensional), que objetiva sua
separação em função do peso molecular. A principal aplicação prática desta técnica consiste na
possibilidade de comparação entre proteomas (conjunto de proteínas apresentadas por dada
células) em células diferenciadas e não diferenciadas ou em células normais e cancerígenas, já
que cerca de 1000 proteínas podem ser individualizadas simultaneamente.
FIGURA 20: IMAGEM DA OBTENÇÃO DE UM GEL APÓS ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(EM QUE AS PROTEÍNAS SÃO SEPARADAS POR PESO MOLECULAR E POR PONTO
ISOELÉTRICO)

60

FONTE: INFOESCOLA, 2012.

O western blotting é uma variação da técnica de eletroforese e se constitui na

identificação, com o uso de anticorpos específicos, das proteínas que foram separadas em gel
de eletroforese. O blot, em si, se refere a uma membrana, frequentemente de nitrocelulose.
Então, após a eletroforese, o gel de acrilamida é incubado juntamente à membrana e,
novamente, uma corrente elétrica é aplicada, induzindo a movimentação das proteínas do gel
para a membrana, onde elas se aderem. Assim, a membrana de nitrocelulose se torna uma
réplica do gel e será subsequentemente incubada com o anticorpo específico para identificação
das proteínas ali presentes.
FIGURA 21: ILUSTAÇÃO DO PROCEDIMENTO DE WESTERN BLOTTING, QUE COMBINA
DIFERENTES TÉCNICAS PARA DETECTAR PROTEÍNA ESPECÍFICA

Eletroforese Detecção com anticorpo Detecção

cromogênica
61

Corrente
elétrica

Gel de SDS- Membrana Incuba Reação com

poliacrilamida com Incuba com substrato da
anticorpo e anticorpo enzima
lava o ligado a enzima
excesso e lava o
excesso

FONTE: NELSON & COX, 2006.

Os microarrays ou microchips de DNA, outra importante técnica de Biologia Molecular

mais comumente utilizada em estudos envolvendo Genética, serve para uma rápida e simultânea
busca ou procura por alguns milhares de genes. Segmentos de DNA de genes conhecidos, com
dezenas a centenas de nucleotídeos de comprimento, são amplificados por PCR e colocados
sobre uma superfície, por meio de instrumentos robóticos, que acuradamente depositam
quantidades ínfimas de solução de DNA no chip. Uma vez construído, o chip é submetido a
cDNAs (DNA sintetizado a partir de RNA, por meio da enzima transcriptase reversa) de um tipo
celular particular, a fim de identificar quais daqueles genes presentes no chip também estão
presentes e expressos na célula. Essa identificação se dá por anelamento entre as sequências
nucleotídicas presentes no chip e os cDNAs submetidos a ele. Esta técnica é útil, pois permite
observar quais genes se encontram expressos em dado estágio do desenvolvimento de um
organismo. É importante mencionar que, para visualizar o processo de anelamento entre as
sequências, é preciso que os cDNAs adicionados estejam marcados fluorescentemente
(NELSON & COX, 2006).

62
FIGURA 22: IMAGEM DE UM MICROCHIP DE DNA, EM QUE AS DIFERENTES CORES
REPRESENTAM CDNAS DE DIFERENTES POPULAÇÕES CELULARES OU DE CÉLULAS EM
DIFERENTES ESTÁGIOS DO DESENVOLVIMENTO

FONTE: COLUMBIA, 2012.

O FISH (fluorescent in situ hybridization) é uma técnica de biologia molecular

amplamente utilizada em estudos de citogenética. Por meio desta técnica, o auxiliar de
laboratório poderá localizar nos cromossomos as posições em que se encontram localizadas
sequências específicas de DNA. Assim, nesta técnica, uma sequência de DNA marcada
fluorescentemente e utilizada como um probe para identificar ou quantificar sequências
complementares em uma amostra de cromossomos presentes em uma célula em particular.
FIGURA 23: CARIÓTIPO HUMANO COLORIDO COM A UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE FISH

63

FONTE: QI Educação, 2012.

2.5 MICROSCOPIA

A microscopia de luz se constitui em uma técnica indispensável para a rotina

laboratorial, pois permite o estudo de estruturas e processos biológicos tanto em células vivas,
como em células fixadas. Os microscópios são instrumentos capazes de aumentar
significativamente a imagem de uma pequena estrutura, mas a natureza da imagem produzida
depende do tipo de microscópio utilizado e do modo como o material foi preparado para a
visualização. As lentes oculares e objetivas são os principais componentes responsáveis pelo
aumento das imagens e uma melhor visualização do objeto, o aumento dependerá do contraste
e da resolução do microscópio. Para compreender melhor o funcionamento do microscópio,
passemos, então, ao estudo de seus componentes.
 O canhão, o braço e a base do microscópio formam o arcabouço de sustentação do
microscópio, que provê estabilidade e sustenta, entre outros, os componentes ópticos. A
intensidade de brilho da lâmpada que gera a iluminação para o microscópio pode ser controlada
e, acima dessa, há uma lente coletora com um diafragma de campo, que possui a função de
controlar a área que é iluminada pela lâmpada. O diafragma de campo também provê foco e
centraliza a iluminação, de modo a aproveitar melhor a luz. O condensador ou lente 64
condensadora, quando corretamente utilizada, melhora a resolução da imagem a ser obtida, seu
contraste e a profundidade do campo. O espécime a ser observado, normalmente, contido em
uma lâmina histológica, é posicionado na platina e movimentado pelo charriot. Já as lentes
objetivas apresentam a maior responsabilidade sobre o aumento da imagem obtida em um
microscópio. Além do aumento, a objetiva possui lentes que corrigem as aberrações criadas na
imagem pela luz. As lentes objetivas, em geral, possuem a capacidade aumentar a imagem em
cerca de 10 vezes (HARRIS et al., 2006).

FIGURA 24: PARTES DO MICROSCÓPIO ÓTICO

FONTE: Biologia Celular: construindo conhecimentos, 2012.

 De maneira geral, para observação de estruturas em microscopia, é necessária a
fixação do material (processo por meio do qual se mata a célula, conservando todas as
estruturas celulares como elas eram enquanto a célula ainda estava viva). Dependendo do tipo
de corante a ser utilizado posteriormente e do tipo de estrutura que se objetiva visualizar, os
processos de fixação mais comuns se darão ou com soluções de paraformaldeído a 4% (por 10
ou 20 minutos) ou com mistura de etanol-ácido acético na proporção de 3:1 (por 2 ou 5 minutos). 65
Após a fixação, se faz a inclusão do material em parafina ou resina (meio que dará suporte ao
processo de corte do material, que precisa estar enrijecido para ser cortado). O corte da
estrutura em micrótomo (aparelho que realiza o corte de seções ultrafinas de tecido) é seguido
de processamento em xilol e série alcoólica para a remoção da parafina ou resina utilizada na
inclusão. Após isso, faz-se a coloração do material, dependendo a escolha do corante do tipo de
estrutura a ser visualizada e do tipo de microscopia a ser utilizada.

O processo de magnificação das imagens depende do conjunto de lentes acima

descritas, que constituem o aparato ótico de cada microscópio. Para produzir um aumento total
de 1000 vezes na imagem, por exemplo, é preciso utilizar um microscópio com lentes objetivas
com aumento da ordem de 100 vezes e lentes oculares com aumento da ordem de 10 vezes
(ALBERTS et al., 2008).

Entretanto, a propriedade mais relevante de um microscópio não é o aumento, mas sim

seu poder de resolução. O poder de resolução de um microscópio (menor distância que o torna
capaz de individualizar dois pontos) é que define a utilização do microscópio, no sentido de que
cada microscópio é indicado para a observação de diferentes estruturas.

O microscópio ótico, o tipo mais simples e mais utilizado na rotina laboratorial possui o
poder de individualizar dois pontos que se encontrem a 0,2 μm (200 nm) de distância. Assim,
não importa quantas vezes à imagem aumentada, o microscópio ótico nunca será capaz de
individualizar dois pontos que estejam a menos de 0,2 μm entre si ou revelar detalhes menores
que essa dimensão (LODISH, et al., 2005).

Em imagens obtidas com o microscópio de contraste de fase, as estruturas celulares

são iluminadas por anéis de interferência, que são halos concêntricos de bandas claras e
escuras. Isso gera o contraste pela interferência entre a luz difratada e não difratada pela
estrutura celular. Quando a luz passa pela célula, a fase de onda luminosa varia conforme o
índice de refração da célula (a luz que passa por uma estrutura densa, como o núcleo, por
exemplo, irá se atrasar em relação à luz que passou por uma estrutura menos densa como o
citoplasma). Essa técnica de microscopia é adequada apenas à observação de células
individualizadas ou de camadas finas de células. Também tem sido bastante utilizada na
observação de movimentos das grandes organelas celulares em células vivas (ALBERTS et al.,
2008). 66

FIGURA 25: IMAGEM DE UM FIBROBLASTO OBTIDA POR MICROSCOPIA DE CONTRASTE

DE FASE

FONTE: ALBERTS et al., 2008.

O método mais comumente empregado para localizar proteínas específicas dentro de

uma célula é por meio do uso de colorações fluorescentes em microscopia de fluorescência. Um
dado componente é dito ser fluorescente se ele absorver luz em um comprimento de onda
(comprimento de excitação) e emitir luz em outro comprimento de onda. Muitos corantes
fluorescentes emitem dentro do comprimento de onda da luz visível, mas outros emitem somente
em infravermelho. O uso deste tipo de microscopia se dá, normalmente, pelo uso de anticorpo
específico contra o componente celular de interesse (alguma proteína ou o DNA, por exemplo)
associado a corante fluorescente. Esse microscópio é bastante similar ao microscópio de luz,
diferindo apenas pelo fato de que a luz que incide no material atravessa uma série de filtros (que
interceptam a luz antes de chegar a amostra e filtram a luz que é emitida a partir da amostra). Os
filtros que interceptam a luz antes de chegar à amostra servem para selecionar apenas os
comprimentos de onda que excitam os corantes fluorescentes ali presentes, enquanto que os
filtros para a luz emitida só permitem a passagem dos comprimentos de onda que o corante
excitado emitiu (ALBERTS et al., 2008).

67
FIGURA 26: IMAGEM DE UM MELANÓCITO OBTIDA EM MICROSCOPIA DE
FLUORESCÊNCIA (A MELANINA SE ENCONTRA INDICADA NA COR VERDE)

FONTE: Ciência Hoje, 2012.

Microscópio confocal se constitui em uma espécie de variante do microscópio de

fluorescência. Neste tipo de fluorescência, a luz de excitação focalizada a partir de um laser
ilumina somente uma pequena parte da amostra por um curto espaço de tempo e, então, se
desloca para outro ponto no plano focal da amostra. A luz emitida é “filtrada”, sendo a luz fora de
foco excluída do processo de formação da imagem. A intensidade de luz desta área focalizada é
captada por um fotomultiplicador e a imagem formada é, então, armazenada no computador.
Nesse tipo de microscopia, é possível obter imagens seccionadas da estrutura celular, isto é, o
microscópio obtém imagem em diferentes planos da mesma estrutura. Daí seu diferencial em
relação à microscopia de fluorescência convencional, uma vez que permite, no computador, a
observação em detalhe de diversos planos de foco da estrutura (e não apenas o plano mais
superficial, observado na microscopia de fluorescência convencional) e a reconstrução
tridimensional da estrutura observada (ALBERTS et al., 2008).

Por meio da microscopia de fluorescência confocal, por exemplo, é possível a

68
discriminação de imagens em profundidade, o que permite determinar a posição relativa de
elementos dentro de um corpo. Isso torna possível estabelecer o posicionamento de
determinadas estruturas e, com softwares especiais, até se proceder à montagem de um modelo
de estrutura tridimensional para o material em estudo. Outra grande vantagem deste tipo de
microscopia é a exclusão de fluorescência fora de foco, o que permite um seccionamento óptico
mais claro e livre de interferências. Embora a resolução de um microscópio confocal seja muito
superior à dos microscópios de fluorescência convencional, esses ainda em muito contribuem
para estudos de estrutura celular, na medida em que permitem o uso de diversos fluorocromos e
colorações combinatórias que ajudam a discriminar estruturas diferentes (ALBERTS et al., 2008).

FIGURA 27: COMPARAÇÃO DE IMAGEM DE UM EMBRIÃO DE DROSOPHILA OBTIDAS EM

A POR MEIO DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONVENCIONAL E EM B COM
MICROSCOPIA CONFOCAL

FONTE: ALBERTS et al., 2008.

 Os fundamentos que caracterizam o microscópio eletrônico são bastante semelhantes
àqueles da microscopia de luz, diferindo apenas em suas lentes eletromagnéticas, que focam
elétrons em alta velocidade. Apresenta-se em duas variantes: a microscopia eletrônica de
transmissão e a microscopia eletrônica de varredura. Na microscopia eletrônica de transmissão,
os elétrons são transmitidos a partir de um filamento e acelerados em um campo elétrico. Uma
lente condensadora irá, então, focar os elétrons para a amostra, as lentes objetivas e projetoras 69
concentram os elétrons que passam pela amostra e os direcionam para um detector. Em razão
dos elétrons serem absorvidos pelos átomos contidos no ar, o espaço entre a fonte de elétrons e
o detector deve ser mantido em vácuo.

O limite de resolução do microscópio eletrônico é cerca de 40000 vezes maior do que o

do microscópio de luz e dois milhões de vezes maiores do que o do olho humano. Já a
microscopia eletrônica de varredura, permite a visualização de superfícies do material não
seccionado e coberto com metal (normalmente ouro). Um feixe de elétrons escaneia
rapidamente a amostra, o que excita as moléculas de metal que cobrem a superfície, fazendo-as
emitir elétrons secundários que serão focalizados para um detector.

Pelo fato do número de elétrons secundários produzidos por uma dada área da
amostra, depender do ângulo de incidência do feixe de elétrons na superfície da amostra, as
imagens obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura apresentam uma aparência
tridimensional. O poder de resolução da microscopia eletrônica de varredura é, contudo, bem
inferior ao poder de resolução da microscopia eletrônica de transmissão (ALBERTS et al., 2008).
FIGURA 28: IMAGEM DE UM CONJUNTO DE CÉLULAS CULTIVADAS (EM L, INDICA-SE O
PRIMÓRDIO DE UM LÚMEN ORGANIZADO PELAS CÉLULAS)

70

FONTE: ICB – USP, 2012.

 FIGURA 29: IMAGEM DE UMA FORMIGA OBTIDA COM MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA

71

FONTE: Pion, 2012.

Assim, chegamos ao fim do segundo módulo do curso. É imprescindível que os

conhecimentos até agora adquiridos, relacionados às áreas Química e Biológica, possam ser
integrados, permitindo ao Auxiliar de Laboratório uma plena atuação no exercício de suas
tarefas. No próximo módulo, já conhecedores das ações práticas realizadas por este profissional
em laboratórios, aprenderemos como melhorar a qualidade do trabalho e zelar pela sua própria
segurança e daqueles que se relacionem ao trabalho desenvolvido nos ambientes laboratoriais.
3 QUALIDADE E SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS

Pela própria natureza do trabalho exercido em um laboratório, neste tipo de ambiente

72
sempre se estará exposto a algum tipo de risco de acidente, em razão das variadas fontes de
perigo aí existentes, como por exemplo, radiações ionizantes, agentes biológicos patogênicos,
substâncias corrosivas ou tóxicas, presença de materiais inflamáveis e explosivos, entre outros.
Dados estatísticos revelam que boa parte dos acidentes ocorridos nestes ambientes ocorre em
razão do despreparo ou imperícia dos técnicos e auxiliares de laboratório, bem como sua
imprudência ou negligência durante a rotina de trabalho.

Dessa forma, podemos perceber que existe uma grande necessidade do

estabelecimento de normas, que objetivem influenciar nos trabalhadores padrões
comportamentais mais corretos para a rotina laboratorial, garantindo assim a sua própria
segurança e a das demais pessoas neste ambiente. De maneira geral, o panorama que se tem é
que, os profissionais das mais diversas áreas atuantes em laboratórios não recebem nas
Escolas Técnicas ou Universidades um processo de formação adequado sobre a segurança no
trabalho em laboratórios. Assim, essa capacitação irá se tornar responsabilidade do futuro
empregador ou do próprio trabalhador, que irá buscar na formação complementar as
informações necessárias para melhorar a segurança no seu trabalho. Daí a importância desse
curso.

É importante salientar ainda que, segundo a Consolidação das Leis Trabalhistas, em

seu artigo 163, e a Norma Regulamentadora nº 5 (NR 5) da Secretaria de Segurança e Saúde no
Trabalho do Ministério do Trabalho e Emprego, empresas ou instituições, que se enquadrem nas
categorias definidas com base no número de empregados, devem constituir uma Comissão
Interna de Prevenção de Acidentes, a CIPA. A função básica dessa comissão diz respeito à
preservação da saúde e integridade física dos trabalhadores, por meio da observação e relato da
existência de condições de risco nos ambientes de trabalho e da prevenção de acidentes e
doenças decorrentes do trabalho. Além disso, também é função da CIPA solicitar e até elaborar
medidas que visem à redução ou mesmo à eliminação dos riscos existentes nos ambientes de
trabalho e neutralizá-los.

No ambiente de trabalho de um laboratório, seja ele de pesquisa clínica ou acadêmica,

devem ser estabelecidas determinadas rotinas, atitudes, comportamentos e ações que visem
contribuir para o aperfeiçoamento da segurança nesses ambientes, o que denominamos “Boas
73
Práticas de Laboratório” (BPLs). Além destas BPLs, que se configuram como práticas de caráter
geral, para regular as atividades em ambientes de laboratório que trabalham, principalmente,
com agentes biológicos tem-se as normas de biossegurança. Neste último módulo, abordaremos
em detalhes as BPLs mais comumente aplicadas em ambientes de laboratório e também alguns
aspectos relacionados às normas de biossegurança.

3.1 BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO

Podemos definir as BPLs como sendo um sistema de qualidade implantado no

laboratório com o intuito de planejar, organizar, monitorar e registrar a rotina dos procedimentos
ali realizados. Essas BPLs se constituem em um conjunto de princípios que irão assegurar a
confiabilidade dos resultados obtidos nas pesquisas ou testes realizados no laboratório. Em um
espectro mais amplo, também podemos considerar que as BPLs dizem respeito ao uso correto e
seguro de métodos e/ou substâncias que interfiram negativamente na saúde humana ou no meio
ambiente. (ZOCHIO, 2009).

Pode-se citar como objetivos da aplicação das BPLs:

 Promover a elevação do nível de qualidade do trabalho realizado no ambiente

de laboratório;
  Aumentar a confiabilidade nos resultados obtidos em experimentos e testes
realizados no laboratório;
 Aumentar a eficácia dos reagentes, produtos, kits e substâncias utilizados;
 Implantar um sistema de controle de qualidade interlaboratorial e definir
laboratórios de referência;
 Melhorar a qualificação dos técnicos e auxiliares de laboratório; 74
 Homogeneizar as práticas de laboratório, com fins de garantir a reprodutibilidade
dos resultados obtidos (ZOCHIO, 2009).

As BPLs podem ser divididas em dois grupos principais: as que se referem aos
cuidados pessoais daqueles que atuam em ambientes de laboratório e as que dizem respeito ao
próprio ambiente do laboratório.

Assim, em relação aos cuidados pessoais, no ambiente do laboratório devemos:

 Utilizar sempre avental ou jaleco de algodão grosso, pois esse tecido tende a
queimar mais lentamente e reagir pouco com determinadas substâncias químicas, o que diminui
o risco de lesões na pele do trabalhador. Devem possuir mangas compridas e comprimento até o
joelho, além de serem utilizados sempre fechados. Lembrando que, esses itens devem ser
despidos assim que o profissional deixar este ambiente, evitando, assim o transporte para outras
áreas de material particulado contaminado ou não presente nesta vestimenta;
 Utilizar sempre calças compridas e sapatos fechados produzidos com material
não poroso e resistente, evitando danos ao trabalhador em caso de: derramamento ou respingo
de substâncias tóxicas, ácidas, básicas ou corrosivas; acidentes com materiais perfurocortantes
ou materiais biológicos contaminados;
 Manter os cabelos sempre presos, evitando a contaminação das substâncias
que estamos manipulando com as células e a sujeira neles presentes. Dependendo da atividade
a ser realizada, como o manuseio de medicamentos a serem aplicados em pacientes, por
exemplo, é ainda obrigatório, além de manter os cabelos presos, utilizar o gorro;
 Lavar as mãos constantemente com sabão neutro antes e após todo e qualquer
procedimento;
  Utilizar protetores faciais e/ou oculares (óculos se segurança) sempre que
houver necessidade de manuseio ou armazenamento de substâncias químicas, principalmente
as voláteis;
 Utilizar respiradores (máscaras) em casos especiais, como em operações de
limpeza de almoxarifados de produtos químicos, onde não seja possível a utilização de sistemas
exaustores de ar e no local em que ainda não tiverem sido adotadas medidas de proteção 75
coletiva contra os vapores nocivos;
 Manter as unhas sempre aparadas, de preferência sem esmalte, no caso de
trabalhadores que atuam em laboratórios clínicos;
 Evitar o uso de itens de maquiagem na pele, assim como o uso de esmaltes nas
unhas, já que a maquiagem pode contribuir para o aumento da quantidade de material
particulado no ambiente, além de facilitar a aderência de alguns agentes à pele, causando
irritação;
 Evitar o uso de adereços, como joias e relógios, pois esses atuam como
depósitos de material particulado e micro-organismos;
 Manter a vacinação em dia e complementá-la com outras vacinas não previstas
no calendário básico de vacinação, principalmente no caso de profissionais que atuem em
laboratórios dentro de hospitais, por exemplo, já que nesses ambientes é frequente a presença
de agentes biológicos multirresistentes;
 Evitar o consumo de comida e bebida no ambiente de laboratório, pois o
derramamento de líquidos ou partículas sólidas atua na atração de insetos ou outros animais
para o ambiente do laboratório, além de o próprio alimento poder se contaminar com material
particulado presente no ambiente. Dessa forma, para evitar a contaminação do alimento,
também não devemos compartilhar freezers, geladeiras ou micro-ondas utilizados nos
experimentos com os alimentos;
 Evitar o fumo, já que esse não é adequado a nenhum tipo de ambiente fechado;
 Manter local adequado para a guarda de objetos pessoais, casacos e bolsas,
evitando levá-los ao ambiente do laboratório;
 Manter portas fechadas e restringir o acesso de pessoas ao recinto do
laboratório, uma vez que o número de pessoas e o nível de movimentação das mesmas
aumenta consideravelmente a quantidade de material particulado no ambiente do laboratório;
  Manter a atenção durante todo o tempo em que estiver no ambiente do
laboratório, já que distrações contribuem para a ocorrência de acidentes;
 Utilizar luvas para a realização de todo e qualquer procedimento que envolva
substâncias químicas ou qualquer outro tipo de agente, inclusive os biológicos, bem como
durante os processos de higienização do ambiente e dos utensílios ali utilizados. Quanto ao uso
das luvas, a escolha pelo tipo mais adequado de luva a ser utilizado irá depender da atividade a 76
ser realizada e do tipo de agente e/ou substância manipulado. A esse respeito, tem-se abaixo
um quadro-resumo quanto às recomendações de uso dos principais tipos de luva utilizados em
ambientes de laboratório (ZOCHIO, 2009).

TABELA 8: TIPOS DE LUVA MAIS COMUMENTE UTILIZADOS EM ROTINA DE

LABORATÓRIO E SUAS RECOMENDAÇÕES DE USO E NÃO USO

Tipo de luva Uso recomendado / Uso não recomendado

Recomendada para ácidos e bases diluídas. Não recomendada para solventes

Látex
orgânicos.

Nitrila Recomendada para ampla variedade de solventes orgânicos, ácidos e bases.

Borracha Recomendada para cetonas e ésteres. Não recomendada para os demais tipos
butílica de solventes.

Recomendada para ácidos e bases, peróxidos, hidrocarbonetos, alcoóis, fenóis.

Neopreno Não recomendada para solventes halogenados e aromáticos.

Recomendada para ácidos e bases. Não recomendada para a maioria dos

PVC
solventes orgânicos.

Recomendada para solventes aromáticos e halogenados. Não recomendada

PVA
para soluções aquosas.
 Recomendada para solventes aromáticos e halogenados por sua excepcional
Viton
resistência.

FONTE: Adaptado de Universidade Federal Fluminense, 2012.

77

Já em relação aos cuidados com o ambiente do laboratório devemos:

 Remover as luvas sempre que for necessário o contato com superfícies de

telefones, fechaduras, interruptores e torneiras, evitando a contaminação das mesmas;
 Utilizar pera para o processo de pipetagem. Nunca devemos pipetar líquidos
utilizando sucção própria (boca), em razão do enorme risco de aspiração das substâncias e
contaminação por partículas presentes na pipeta.
 Realizar o descarte de materiais de forma independente. Como veremos mais
adiante, existe a forma correta para o descarte em função da natureza do resíduo.
 Ter cuidado ao desencapar e encapar agulhas. Esses processos devem ser
realizados da seguinte maneira: para desencapar, basta puxar um pouco a capa de proteção da
haste da seringa, segurando-a em sua região mediana, e depositá-la sobre uma gaze na
bancada. Nunca remova por completo com a mão a capa protetora. Já para realizar o
encapamento da agulha, deve-se “pescar” a capa protetora com a agulha e com a mão conectá-
la à haste;
 Evitar a ingestão ou inalação de qualquer composto no ambiente do laboratório,
pois essas ações podem resultar em infecções ou lesões no trato digestivo ou respiratório;
 Evitar a formação de aerossóis ou a dispersão de material particulado no
ambiente. No caso dos aerossóis, recomenda-se que tubos ampola sejam abertos envoltos em
uma gaze, que irá realizar a absorção dos mesmos;
 Manipular substâncias químicas sempre dentro da capela, evitando a inalação
de vapores;
 Antes do início de qualquer tipo de procedimento, separar as vidrarias e
materiais a serem utilizados, preparar as soluções e tirar todas as dúvidas relativas ao processo;
  Manter todos os materiais fechados ou em uso, bem como os resíduos a serem
descartados, devidamente identificados, com rotulagem permanente e que detenha informações
básicas necessárias sobre o conteúdo do recipiente, a fim de se evitar acidentes decorrentes do
uso incorreto de substâncias;
 Afixar em local de fácil visualização as instruções básicas de BPLs, bem como a
maneira correta de proceder em casos de acidentes; 78
 Manter desobstruídos os equipamentos de proteção coletiva essenciais ao
ambiente de laboratório, como lava-olhos, por exemplo, (ZOCHIO, 2009).

Como visto acima, quando tratamos das boas práticas de laboratório, algumas
recomendações preveem o uso de determinados equipamentos, os quais podem classificar
como sendo de uso individual ou coletivo. Esses equipamentos de proteção individual (EPIs) ou
de proteção coletiva (EPCs) servem à proteção do trabalhador contra ameaças à sua saúde e
segurança presentes no ambiente de trabalho. Na figura abaixo, podemos observar alguns
exemplos de EPIs, como: protetor auricular; óculos de proteção; luvas; protetor facial; calçado
fechado (botas); respirador ou máscara.

FIGURA 30: PRINCIPAIS EQUIPAMENTOS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL (EPIS) UTILIZADOS

EM AMBIENTES DE LABORATÓRIO

FONTE: Universidade Federal Fluminense, 2012.

 Exemplos de EPCs que devem estar presentes e ser utilizados na rotina de laboratório
são: capela química; cabine de segurança biológica; luz ultravioleta; dispositivos de pipetagem;
extintores de incêndio; chuveiro; lava-olhos; kit de primeiros socorros; sinalizadores de
segurança (placas, cartazes de advertência e fitas zebradas). Na figura a seguir, podemos
visualizar cada um dos elementos citados.

79

FIGURA 31: PRINCIPAIS EQUIPAMENTOS DE PROTEÇÃO COLETIVA (EPCS) UTILIZADOS

EM AMBIENTES DE LABORATÓRIO

Adaptado de Universidade Federal Fluminense e Fundação

Oswaldo Cruz, 2012.

3.2 BIOSSEGURANÇA
 O termo biossegurança se refere ao conjunto de ações e práticas que objetivam a
prevenção, minimização e eliminação dos riscos para a saúde humana e dos animais e a
proteção ao meio ambiente.

Os laboratórios, sejam eles destinados a experimentos de natureza química ou

biológica, apresentarão sempre uma infinidade de situações, fatores e atividades que trazem
80
potenciais riscos aos trabalhadores ali presentes e também ao ambiente ao seu redor. Tais
riscos, dependendo da intensidade da exposição ao mesmo, poderão resultar em alterações
leves, moderadas ou até mesmo graves no organismo. Assim, devemos pautar nossas ações
dentro do laboratório de forma a seguir as normas de biossegurança. No Brasil, tais normas só
se encontram formatadas legalmente no que se refere ao uso de organismos geneticamente
modificados (OGMs), tendo sido definidas pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
(CTNBio). A CTNBio é uma instância colegiada multidisciplinar, cuja finalidade básica se resume
a prestar apoio técnico consultivo e assessoramento ao Governo Federal na formulação,
atualização e implementação da Política Nacional de Biossegurança relacionada aos OGMs.

Segundo especialistas, na área de Biossegurança, não importa o quanto são

desenvolvidas e eficazes as tecnologias disponíveis para minimizar ou eliminar os riscos, se o
comportamento dos profissionais atuantes nesses ambientes não for modificado, daí a
importância da realização de treinamentos e o acesso às informações no que se refere à
Biossegurança em laboratórios.

No ambiente laboratorial há diversas categorias de riscos: ergonômicos, físicos,

químicos e biológicos. Veremos agora, em detalhe, cada um deles.

Os riscos ergonômicos são aqueles que afetam a integridade física ou mental do

trabalhador, proporcionando-lhe desconforto ou doença. São exemplos de riscos ergonômicos: o
esforço físico, a postura inadequada, o levantamento de peso, a situação de estresse, o controle
rígido de produtividade, o trabalho durante o período noturno, o prolongamento da jornada de
trabalho, a monotonia e a repetitividade, bem como a imposição de uma rotina intensa de
trabalho (ODA & ÁVILA, 1998).
 Já os riscos físicos, são aqueles provenientes das diversas formas de energia, como:
umidade, ruídos, vibrações, pressões anormais, temperaturas extremas, radiações (ODA &
ÁVILA, 1998).

Os riscos químicos são aqueles oriundos da exposição a substâncias químicas e que

podem causar danos físicos ou ainda prejudicar a saúde do trabalhador. Os danos físicos
81
associados à exposição a algum tipo de substância química podem se caracterizar por: irritação
da área exposta e queimaduras. Podem ainda incluir os incêndios e explosões resultantes do
uso dessas substâncias. São considerados como agentes de risco químico todas as substâncias,
produtos ou compostos que penetrem no organismo por via respiratória (poeiras, gases,
neblinas, vapores ou aerossóis), pelo contato com a pele ou por ingestão (ODA & ÁVILA, 1998).

Os riscos biológicos decorrem do contato com micro-organismos que podem causar

doenças ao homem. São subdivididos nas seguintes categorias, definidas em função do risco
representado pelo agente biológico:

 Classe 1: agentes que não representam riscos ao manipulador, nem à

comunidade, ou ainda que representem risco baixo para ambos. Exemplo: E. coli.
 Classe 2: agentes biológicos que representam risco moderado para o
manipulador e risco baixo ou fraco para a comunidade. Caracteriza essa classe ainda o fato de
haver tratamento disponível, representado por medidas terapêuticas e profiláticas eficientes,
contra o agente em questão. Exemplo: Clostridium tetani.
 Classe 3: agentes biológicos que representam risco grave para o manipulador e
risco moderado para a comunidade, provocando lesões ou sinais clínicos graves e nem sempre
havendo tratamento disponível. Exemplo: vírus HIV.
 Classe 4: nesta classe os agentes biológicos representam risco grave para o
manipulador e para a comunidade, não havendo qualquer tratamento disponível e seriamente
preocupantes, em caso de propagação. Exemplo: vírus Ebola (ODA & ÁVILA, 1998).
Em razão do tipo de atividade desempenhada pelo profissional em cada laboratório,
esse estará mais exposto a um ou outro tipo de risco. Assim, aconselha-se que cada laboratório
desenvolva seu próprio manual de biossegurança com as ações básicas relacionadas à
prevenção dos tipos de risco mais prevalentes naquele ambiente.
 Nesse sentido, também é interessante a redação de Procedimentos Operacionais
Padrão (POPs), que são protocolos em que se descrevem detalhadamente as atividades
realizadas no laboratório, desde o preparo de amostras até a divulgação de resultados, dando
especial ênfase ao uso dos equipamentos, procedimentos técnicos e as atitudes a serem
tomadas em caso de acidentes. O objetivo principal dos POPs é padronizar todas as atividades
típicas do laboratório, no intuito de que todos os profissionais reproduzam os procedimentos do 82
modo mais semelhante possível. Isso é importante, porque traz mais confiabilidade aos
resultados obtidos nos testes e previnem o mau uso dos equipamentos e a ocorrência de erros
procedimentais, que, em geral, aumentam o risco de acidentes. Os POPs devem ser redigidos
da forma mais clara e completa possível, possibilitando a compreensão por todos os
profissionais atuantes no laboratório. Eles devem ser regularmente atualizados e ser
disponibilizados a todos os trabalhadores, bem como estarem disponíveis para consulta em local
de fácil acesso no laboratório.

Já no que se referem ao descarte dos resíduos sólidos produzidos no ambiente do

laboratório, esses podem ser classificados em diferentes categorias, conforme sua natureza:

 Grupo A: resíduos sólidos em que, possivelmente, haja a presença de agentes

biológicos, representando potencial risco de infecção.
 Grupo B: resíduos sólidos que contenham substâncias químicas que
representem risco à saúde pública ou ao meio ambiente, considerando-se características como
inflamabilidade, corrosividade, reatividade e toxicidade.
 Grupo C: resíduos sólidos que possam conter radionuclídeos.
 Grupo D: resíduos sólidos que não apresentem riscos biológicos, químicos ou
físicos. Equivalem, portanto, aos resíduos domiciliares.
 Grupo E: constituído por materiais perfurocortantes ou escarificantes, como por
exemplo, lâminas de bisturi, agulhas, ampolas, pipetas, entre outros (COELHO, 2012).
Os resíduos pertencentes ao grupo A devem ser acondicionados em sacos brancos
com indicação de risco biológico. No caso de tais resíduos terem sofrido tratamento prévio ao
descarte, objetivando a minimização ou mesmo eliminação dos micro-organismos ali presentes,
seu acondicionamento deve se dar em sacos impermeáveis e sua classificação alterada para o
grupo D (resíduos domiciliares). Os resíduos sólidos do Grupo B devem ser descartados
conforme sua natureza química, isto é, como substâncias tóxicas, corrosivas, irritantes,
inflamáveis, entre outras.

Frascos de reagentes podem ser utilizados para descarte, mas somente para o
acondicionamento da mesma substância e não de substância diversa da que inicialmente
continha. Os resíduos do grupo C devem ser mantidos em recipientes indicativos de natureza
83
radioativa até o completo decaimento de sua ação ionizante. Após isso, tais resíduos também
poderão passar a ser classificados como pertencentes ao grupo D (resíduos domiciliares).
Alguns resíduos pertencentes ao grupo D podem ser destinados à reciclagem. Para facilitação
desse processo, o ideal é já manter recipientes individuais para sua coleta seletiva. Nesse caso,
pode ser utilizado o código de cores para identificação dos recipientes: papel (azul), metal
(amarelo), vidro (verde), plástico (vermelho) e resíduos orgânicos (marrom). Os resíduos
classificados no grupo E devem ser descartados imediatamente após o uso em recipientes
rígidos, com identificação específica (inscrição de perfurocortante).

FIGURA 32: COLETA SELETIVA

Cada cor associa-se a um tipo específico de resíduo, porém, nem todos os resíduos
pertencentes à determinada classe podem ser reciclados.

FONTE: Universidade Federal de Santa Catarina, 2012.

 Assim, chegamos ao final do curso. Esperamos ter contribuído para a ampliação dos
conhecimentos sobre a prática laboratorial na rotina de um Auxiliar de Laboratório. Para
aprofundar os conhecimentos aqui obtidos, tenha como base as referências abaixo indicadas.
Até o próximo curso!

84
 REFERÊNCIAS

ALBERTS, B. et al., 2008. Molecular Biology of the Cell. Garland Publ. Inc., New York
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