Los principios básicos de la cromatografía

Arias Gamarra Jesusa 121495

Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco

Facultad de Ingeniería de Procesos
Escuela Profesional de Ingeniería en Industrias Alimentarias

Tutor:
Químico Magnolia Zúñiga Olaguibel

Quillabamba-Santa Ana-La Convención-Cusco-Perú

2017
 Contenido
1.1 Introducción ........................................................................................................4
1.2 La Extracción ......................................................................................................4
1.2.1 La extracción por lotes ................................................................................6
1.2.2 La extracción en continuo ...........................................................................6
1.2.3 La extracción a contracorriente ...................................................................7
1.3 La cromatografía .................................................................................................7
1.3.1 Una perspectiva histórica ............................................................................7
1.3.2 la terminología general ...............................................................................9
1.3.3 Los fundamentos físicos-químicos de la separación .................................10
1.3.4 Las técnicas cromatografías ......................................................................29
1.4 Resumen............................................................................................................53
Índice de tablas

Tabla 1: Un esquema para su clasificación del campo de la cromatografía ..................... 5

Tabla 2: Las características de los diferentes métodos cromatograficos .......................... 8

Tabla 3: Escala de polaridad de los compuestos, ordenados por clases ......................... 13

Tabla 4: La serie eluotropica para la alúmina................................................................. 13

Tabla 5: Los ligantes de afinidad general y sus especificaciones................................... 28

Tabla 6: Los adsorbentes para la cromatografía de capa fina y el modo de separación . 35

Índice de gráficos

Ilustración 1: l fundamente de la cromatografía de intercambio ionico ......................... 18

Ilustración 2: Estructuras químicas de las resinas de intercambia ionico basadas en el

poli estireno .................................................................................................................... 20

Ilustración 3: Perfil de elución esquemático, el cual ilustra alguno de los términos

utilizados en la cromatografía de exclusión por tamaños. .............................................. 23

Ilustración 4: Los principios de la cromatografía de afinidad biosectiva ....................... 26

Ilustración 5: sistema de cromatografía liquida a baja presión en columna ................... 36

Ilustración 6: Medida de retención cromatografica ........................................................ 39

Ilustración 7: La medida de la anchura del pico y su contribución a la resolución ........ 42

Ilustración 8: tres métodos diferentes para estimar el área de los picos ......................... 47
 1.1 Introducción

El impacto de la cromatografía ha sido muy grande en todos los análisis y, por

consiguiente, en el progreso de la ciencia en general. La cromatografía se diferencia de

otros métodos de separación (por ejemplo, la destilación fraccionada, en la cual siempre

se utilizan, más o menos, las mismas operaciones y aparatos) en que puede ser utilizada

una amplia variedad de sustancias, de equipos y de técnicas. Hemos elegido aproximarnos

a este campo, extremadamente amplio y complejo, describiendo, en primer lugar, los

principios generales de la extracción como una base para la comprensión de la

cromatografía. El presente capitulise centrara en la cromatografía liquida (LC),

subdividida tal como se muestra en la figura. La técnica emparentada de la cromatografía

con fluidos supercríticos (SFC) es descrita brevemente en la sección. A la vista de su uso

extendido, la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía liquida de alta resolución

(HPLC) son, cada una de ellas, el tema de capítulos independientes.

1.2 La Extracción

En su forma más simple, la extracción se refiere a la transferencia de un soluto desde una

fase liquida a otra. La extracción, en una miríada de formas, es inherente al análisis de los

alimentos, tanto si se utiliza para la purificación preliminar de la muestra, como si se lleva

 acabo para concentrar el componente de interés o bien como el propio método del análisis.

Las extracciones pueden ser llevadas a cabo mediante procesos por lotes, continuas o

contracorriente. (En otros capítulos se comentan en detalle diversos procedimientos de

extracción: la extracción tradicional con disolventes, en capítulo 19 y 29; la extracción

tradicional con disolventes acelerada, en los capítulos 8 y 19; la extracción en fase sólida,

en capítulos 19 y 20)

Tabla 1: Un esquema para su clasificación del campo de la cromatografía

Cromatografía

Cromatografía con fluidos

supercriticos
Cromatografía de
gases Cromatografía de
liquida

Gas/liquida Gas/solidos

De De reparto De De De afinidad
adsorción (liquido/liq intercambi exclusión
(liquido/sol uido) o ionico por tamaño
ido)
1.2.1 La extracción por lotes

En la extracción por lotes el soluto es extraído la un disolvente agitando con un

segundo disolvente, inmiscible con el primero. El soluto se reparte o distribuye entre las

dos fases y, cuando el equilibrio ha sido alcanzado, el coeficiente de reparto, k, es un

constante.

𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 1

𝑘=
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 2

Se dejan separar las fases y se retiran la capa que contiene el componente deseado; por

ejemplo, haciendo de un embudo de decantación; en la extracción por lotes es, con

frecuencia, difícil conseguir una separación nítida de las fases, debido a la formación de

emulsiones por otra parte, el reparto implica que una única extracción será, habitualmente

incompleta.

1.2.2 La extracción en continuo

La extracción líquido- líquido en continuo requiere un montaje especial, aunque es

más eficiente que la separación por lotes. Un ejemplo es la utilización de extractor de

soxhlet para la extracción (semicontinua) de sustancias a partir de los sólidos. El

disolvente es reciclado de tal modo que el sólido es extraído repetidamente con

disolventes frescos. Otros equipos han sido diseñados para la extracción en continuo de

sustancias a partir de los líquidos. Se hace uso de diferentes tipos de extractores,

dependiendo de si el disolvente no acuoso es más pesado o más ligero (más denso o menos

denso) que el agua.

1.2.3 La extracción a contracorriente

La distribución a contracorriente hace referencia a un proceso de extracción en serie.

Separa, el uno de otro, dos o más solutos con diferente coeficiente reparto, mediante una

sucesión de repartos entre dos fases liquidas inmiscibles. (La distribución en

contracorriente) fue, en tiempos, una importancia técnica de separación utilizada por los

químicos de los lípidos). La cromatografía de reparto liquido-liquido es una ampliación

directa de la extracción en concentra ion; su versión moderna se conoce como

cromatografía contracorriente.

1.3 La cromatografía

1.3.1 Una perspectiva histórica

La cromatografía moderna tuvo su origen entre finales del siglo diecinueve y

comienzos del siglo veinte, a partir de los trabajos independientes de David T. Day, un

distinguido geólogo e ingeniero de minas estadounidenses, y Nikhail Tsvet, un botánico

ruso. Day desarrollo procedimientos para el fraccionamiento del petróleo bruto,

haciéndolo pasar a través de tierra de fuller (silicato de magnesio y aluminio); Tsvet hizo

uso de una columna empaquetada con creta para separar en bandas coloreadas los

pigmentos de las hojas. Generalmente, se le reconoce| a Tsvet el mérito del

descubrimiento, puesto que observo e interpreto correctamente los procesos

cromatograficos y dio el nombre de cromatografía al fenómeno.

Después de languidecer en el olvido durante años, la cromatografía comenzó a

desarrollarse en los años 1940 gracias al desarrollo de la cromatografía de reparto en

columna, llevado acabo por Martin y Synge, y a la invención de la cromatografía en papel.

La primera publicación sobre la cromatografía GC aparece en 1960, la cromatografía GC,

a causa de su importancia para la industria de petróleo, se había convertido una sofisticada

técnica instrumental. A partir de las aplicaciones tempranas hacia la mitad de los años

1960, la cromatografía HPLC, aprovechándose de los progresos teóricos e instrumentales

de la GC, ha extendido el área de la cromatografía liquida hasta hacer a este un método

igualmente sofisticada y útil. La cromatografía SFC, presentada por primera vez en 1962,

está por fin aumentando su popularidad. Las técnicas cromatografías modernas, las cuales

incluyen los sistemas automatizados, son utilizadas ampliamente en la caracterización y

en el control de la calidad de las materias primas alimentarias y de los productos

alimentarios.

Tabla 2: Las características de los diferentes métodos cromatograficos

método Fases móviles/fase La retención depende

estacionaria
Cromatografía gas-liquido Gas/liquido Tamaño
moléculas/polaridad
Cromatografía gas-solido Gas/solido Tamaño
moléculas/polaridad
Cromatografía de fluidos Fluido supercríticos/solido Tamaño
supercríticos moléculas/polaridad
Cromatografía de la fase Liquido polar/liquido o Tamaño
inversa solido apolares moléculas/polaridad
Cromatografía de la fase Liquido menos Tamaño
normal polar/liquido o solido más moléculas/polaridad
polares
Cromatografía de Liquido polar/ solido Carga molecular
intercambio iónico iónico
Cromatografía de Liquido/solido Tamaño molecular
exclusión por tamaños
Cromatografía de Liquido polar/liquido o Tamaño
interacción hidrófoba solido apolar molecular/polaridad
Cromatografía de afinidad Agua/lugares de unión Estructura en concreto
1.3.2 La terminología general

El nombre cromatografía es un término general aplicado a una amplia variedad de

técnicas de separación basadas en el reparto o distribución de una muestra (el soluto) entre

una fase móvil, que se desplaza, y una fase estacionaria o fija. (La cromatografía puede

considerarse como una serie de equilibrados entre las fases móvil y estacionaria). La

intereaccion relativa de un soluto con estas dos fases viene descrita por el coeficiente de

reparto (k) o de distribución (D) (la proporción entre la concentración del soluto en la

fase estacionaria y la concentración del soluto en fase móvil). La fase móvil puede ser o

bien un gas (GC), o bien un líquido (LC) o bien un fluido supercrítico (SFC). La fase

estacionaria puede ser un líquido o, más habitualmente, un sólido. El campo de

cromatografía puede ser subdividido u organizado de varias maneras diferentes, de

acuerdo con los principios físicos-químicos implicados en la separación o de acuerdo con

las diversas técnicas aplicadas. La tabla 27.1 resume algunos de los procedimientos o

métodos cromatograficos fase móvil-fase estacionaria. En la media en la que difiere la

naturaleza de las interacciones entre las moléculas del soluto con la fase móvil o con la

fase estacionaria, estos métodos presentan la capacidad de separar diferentes tipos de

moléculas.

Como se ha afirmado anteriormente, el presente capitulo está dedicado principalmente

al área de cromatografía liquida (lleva acabo presión atmosférica). La cromatografía

GC se trata en el capítulo 29 y a la cromatografía HPLC es el tema del capítulo 28. La

cromatografía SFC se refiere a la cromatografía llevada a cabo a presiones y temperaturas

por encima de los valores críticos de las fases móvil; un fluido supercrítico (o gas

comprimido) no es ni un líquido ni un gas típico. En consecuencia, la SFC complementa

a ambas, la cromatografía GC y la cromatografía HPLC, y puede superar algunos de los

problemas asociados con cada una de ellas.

1.3.3 Los fundamentos físicos-químicos de la separación

Para proporcionar al lector una amplia comprensión y una mejor perspectiva de

este campo, hemos elegido describir primero los fundamentos físicos-químicos que

subyacen tras la separaciones realizadas mediante las cromatografías liquidas,

independientemente de las teorías especificas aplicadas. Aunque es más practico describir

por separado cada uno de estos fenómenos, se debe resaltar que, en un fraccionamiento

dado, puede estar involucrado más de un mecanismo. Por ejemplo, muchas cosas de

cromatografía de reparto implican también adsorción.

1.3.3.1 La cromatografía de adsorción (solido-liquido)

La cromatografía de adsorción es la forma más antigua de cromatografía, haciendo

sido utilizado por Tsvet ya en 1903, en los experimentos que engendraron la

cromatografía moderna. En esta variante de la cromatografía, la fase estacionaria es un

sólido finamente dividido (para maximizar el área superficial o superficie especifica) y la

fase móvil puede ser o bien un gas, o bien un líquido. (La cromatografía de adsorción gas-

solido se discute en el capítulo 29). La fase estacionaria (el adsorbente) se escoge de tal

modo que la diferencia en las interacciones con los distintos componentes de la muestra

permite su separación. Las principales de la absorción cromatografía, incluyen las

siguientes:

 Las fuerzas de van der Waals

 Las fuerzas de electrostáticas

 Los enlaces de hidrogeno

 Los interacciones hidrófobas

Las posiciones disponibles para la interacción con cualquier sustancia dada son

heterogéneas. Los lugares de unión con las mayores afinidades, las posiciones más

activas, tienden hacer pobladas en primer lugar, de modo que los solutos adicionales están

enlazados menos firmemente. El resultado neto es la adsorción es un proceso dependiente

de la concentración y que el coeficiente de adsorción no es una constante (en contraste

con el coeficiente de reparto). Las cargas de muestra que exceden la capacidad de

adsorción de la fase estacionaria darán como resultado una separación relativamente

pobre.

La cromatografía de adsorción clásica hace uso de la sílice (ligeramente acida), la

alúmina (ligeramente básica); el carbón activo (apolar) y unos pocos materiales más,

como la fase estacionaria. Tanto la sílice como la alúmina poseen grupos hidroxilos en la

superficie y las interacciones del tipo acido de Lemis determinan sus características de

adsorción. El orden de elución de los compuestos desde estas fases estacionarias

adsorbentes puede, frecuentemente, predicho basándose en sus polaridades relativas. Los

compuestos en los grupos funcionales más polares son retenidos más fuertemente sobre

los adsorbentes polares y, por consiguiente, son eluidos los últimos. Los solutos apolares

no son retenidos también sobre los adsorbentes polares son eluidos en primer lugar.

Un modelo propuesto para explicar el mecanismo de la cromatografía liquida-solido

supone que las moléculas del soluto y las del disolvente están compitiendo por las

posiciones activas repartidas sobre la superficie del adsorbente. Por consiguiente,

conforme aumente la adsorción del soluto. Los disolventes pueden ser ordenados según

la fortaleza de su adsorción sobre un adsorbente en particular, tal como la sílice. Tal

escala de fortaleza (o de polaridad) de los disolventes es conocida por el nombre de serie

eluotropica. (La sílice presenta una ordenación parecida). Las series eluotropicas prevén

al analista cromatografo de una manera de modular la interacción entre los solutos y la

 fase estacionaria. Una vez que ha sido escogido un adsorbente, los disolventes pueden ser

seleccionado a partir de la serie eluotropica para dicho adsorbente, la polaridad de la fase

puede ser aumentada (a menudo, por medio de la adición y mezcla con disolventes más

polares) hasta que se haya escogido la elución del compuesto (o los compuestos) de

interés.

Soluto disuelto en la
Soluto adsorbido sobre
fase liquida, la cual
la superficie de la fase
recubre la superficie
estacionaria del soporte solido

Las moléculas
grandes son
Cromatografía de reparto excluidas
Cromatografía de adsorción
Aniones móviles
mantenidos junto a los
cationes, los cuales
están ligados
covalentemente a la fase
estacionaria

Una resina de intercambio

anionico; por ello, solo los Cromatografía de exclusión
Cromatografía de intercambio aniones pueden ser atraídos a molecular
ionico ella

Un tipo de moléculas presente

s
en la mezcla compleja queda
ligada a otra molécula, la cual
esta covalentemente enlazada
a la fase estacionaria
Todas los demás moléculas
son, sencillamente
enjuagadas

Cromatografía de afinidad
La cromatografía de adsorción separa los compuestos apolares alifáticos o aromáticos,

tales como los líquidos, principalmente de acuerdo con el tipo y el número de los grupos

funcionales presentes. Los lábiles y liposolubles pigmentos clorofílicos y carotenoides

procedentes de las plantas han sido estudiados extensamente por medio de la

cromatografía de adsorción (el experimento original de Tsvet), haciendo uso de

columnas.

Tabla 3: Escala de polaridad de los compuestos, ordenados por clases

Hidrocarburos fluorados
Hidrocarburos saturados
Olefinas
Aromáticos
Compuestos halogenados
Esteres
Compuestos nitro
Esteres-cetonas-aldehídos
Alcoholes-aminas
Amidas
Ácido carboxílicos

La cromatografía de la adsorción ha sido utilizada también para el análisis de las

vitaminas liposolubles. Con frecuencia, es utilizado como un proceso por lotes para

eliminar de las muestras las impurezas, con anterioridad a otros análisis. Por ejemplo, los

cartuchos desechables de extracción en fase solida conteniendo sílice han sido utilizados

para los análisis de los alimentos, tales como el contenido de líquidos en el aceite de

semilla de soya, el de carotenoides en las frutas cítricas y el de vitamina E en los cereales.

Tabla 4: La serie eluotropica para la alúmina

Disolvente
 1- pentano
Isooctno
Ciclo hexano
Treyracloro de carbono
Xileno
Tolueno
Benceno
Éter etílico
Cloroformo
Diclorometano
Tetrahidrofurano
Acetona
Acetato de etilo
Anilina
Acetonitrilo
2-propanol
Etanol
Metanol
Ácido acético

1.3.3.2 La cromatografía de reparto (liquido-liquido)

1.3.3.2.1 Una introducción.
En 1941, Martin y synge emprendieron una investigación sobre la composición de

aminoácidos de la lana, haciendo uso de un extractor a contracorriente de 40 tubos, con

cloroformo y agua fluyendo en sentidos opuestos. La eficiencia del proceso de extracción

se vio enormemente mejorada cuando se utilizó una columna de material de relleno inerte,

finalmente dividido, para mantener inmóvil una de las fases liquidas (la fase estacionaria),

mientras que la segundo líquido, un disolvente inmiscible (la fase móvil), fluía sobre ella,

proporcionando así un contacto íntimo entre las dos fases. Los solutos se repartieron entre
las dos fases liquidas de acuerdo con sus coeficientes de reparto, de ahí el nombre de

cromatografía de reparto.

Un sistema de reparto se controla mediante la modificación de la naturaleza de las dos

fases liquidas, habitualmente por medio de la combinación de disolvente mediante el

ajuste del pH de las disoluciones amortiguadoras. A menudo, el más polar de los dos

líquidos se mantienen estacionario sobre el soporte inerte y el disolvente menos polar se

utiliza para eluir los componentes de la muestra (cromatografía de fase normal). La

inversión de esta distribución, utilizando una fase estacionaria apolar y una fase móvil

polar, ha dado en llamarse cromatografía de fase inversa.

Las sustancias hihidrofilas polares, tales como los aminoácidos, el hidrato de carbono y

los pigmentos vegetales hidrosolubles, se pueden separar por medio de la cromatografía

de reparto de fase normal. Los compuestos lipófilos, tales como los lípidos y los

pigmentos liposolubles, pueden ser resueltos con sistema de fase inversa. La

cromatografía de reparto liquida- liquida ha sido inestimable en la química de los hidratos

de carbono. La cromatografía en columna sobre celulosa finalmente dividida ha sido

utilizada extensamente en la cromatografía preparativa de los azucares y sus derivados.

La cromatografía en papel. Es un método sencillo para distinguir entre las diversas formas

de los azucares o de los componentes fenólicos presentes en los alimentos.

1.3.3.2.2 Los soportes recubiertos

Su forma más simple, la fase estacionaria para la cromatografía de reparte consiste en un

recubrimiento liquido sobre un matriz sólida. El soporte solido deberá ser tan inerte como

sea posible y presentar un área superficial grande con el fin de hacer máxima la cantidad

de líquido retenido. Algunos ejemplos de soportes solidos que han sido utilizados son la

sílice, el almidón, el polvo de celulosa y las perlas de vidrio. Todos ellos son capaces de
retener una fina película de agua, secándolos, la cual hace las veces de fase estacionaria.

Es importante que los materiales preparados para la cromatografía de adsorción deben ser

activados secándolos, para eliminar el agua superficial. A la inversa, algunos de estos

materiales, tales como el gel de sílice, pueden ser utilizados para la cromatografía de

reparto si han sido desactivados mediante la impregnación con agua o con la fase

estacionaria deseada. (Los términos gel de sílice, silicagel o ácido silico se refieren, en

realidad, a los precipitados de sílice hidratada, cuyas propiedades pueden variar

ampliamente, en función del método de preparación utilizado. Dependiendo de la

cantidad de agua retenida, el ácido silícico puede actuar como un absorbente o como un

soporte de soporte de reparto; habitualmente ambas propiedades contribuyen en diversas

proporciones a las separaciones conseguidas). Un inconveniente de los sistemas

cromatograficos liquido-liquido es que la fase estacionaria liquida es, con frecuencia,

arrancada. Este problema se puede solventar enlazando químicamente la fase estacionaria

al material de soporte, tal como se describe en la sección siguiente.

1.3.3.2.3 Los soportes enlazados

La fase estacionaria liquida puede ser unida covalentemente a un soporte, por medio de

una reacción química. Estas fases enlazadas se han vuelto muy populares para su uso en

la cromatografía HPLC y, hoy en día, hay disponible una amplia variedad de fases

estacionarias tanto polares como apolares. (Los grupos silanoles reactivos repartidos por

la superficie del gel de la sílice pueden ser derivatizados con grupos alquilaminos,

alquilnitrilos, fenilos o alquilos, tal como se describe en el capítulo 28). Una vez más, la

cromatografía llevada a cabo con una fase móvil menos polar que la fase estacionaria

enlazada se conoce como cromatografía de fase normal. La utilización de una fase

estacionaria enlazada apolar (por ejemplo, la sílice recubierta con grupos 𝑐8 𝑜𝑐18 ) con un
disolvente polar (por ejemplo, agua – acetonitrilo) se denomina cromatografía de fase

inversa. De hecho, esta última se ha convertido en el más ampliamente utilizado de ambos

métodos. (Otros mecanismos distintos del de reparto pueden estar implicados en la

separación). Las columnas para la cromatografía HPLC de fase enlazada han facilitada

sumamente el análisis de las vitaminas contenidas en los alimentos y en los piensos, tal

como se discute en el capítulo 3 de la referencia (8).

1.3.3.3 La cromatografía de intercambio iónico

El intercambio iónico es un proceso de separación o purificación que tiene lugar de

manera natural, por ejemplo, en los suelos, y que es utilizado en los ablandadores y los

desionizadores del agua. Se pueden conseguir tres tipos de separaciones: (1) las especies

iónicas de las no iónicas, (2) las especies catiónicas de las anionicas y (3) las mezclas de

especies similarmente cargadas. En los dos primeros casos, una sustancia se une al medio

de intercambio ionico mientras que la otra sustancia no lo hace. Para estas dos

separaciones se puede hacer uso de los métodos por lotes; sin embargo, parar la tercera

categoría es necesaria la cromatografía.

La cromatografía de intercambio iónico puede ser considerada como un tipo de

cromatografía de adsorción en el cual las interacciones entre el soluto y la fase

estacionaria son, principalmente, de naturaleza electrostática. La fase estacionaria (el

intercambiador de iones) contiene enlazados grupos funcionales que están cargados, bien

sea positivamente o bien negativamente (véase la figura 23-3a) .La neutralidad de carga

viene mantenida por las contra iones intercambiables. Un ion de la muestra(o bien alguna

de las posiciones cargadas, en las moléculas grandes) se puede intercambiar para pasar a

ser la pareja de la carga fijada .Se establece el equilibrio iónico, tal como se representa en

la figura 27-3b. El grupo funcional de la fase estacionaria determina si son intercambiados

los cationes o los aniones. Los intercambiadores de cationes contienen covalentemente

enlazados grupos funcionales cargados negativamente, mientras que los intercambiadores

de aniones contienen enlazados grupos cargados positivamente. La naturaleza química de

estos restos ácidos o básicos determina como se ve afectada la ionización de la fase

estacionaria por el pH de la fase móvil.

Los fragmentos del tipo ácido sulfonico (𝑅𝑆𝑂3‾ ), de carácter fuertemente acido, de los

intercambiadores catiónicos <<fuertes>> se encuentran completamente ionizados a todos

los valores del pH por encima de 2. Los fragmentos amonio cuaternario (𝑅𝑁𝑅′3⁺ ),

fuertemente básicos, en los intercambiadores catiónicos <<fuertes>> se encuentran

ionizados a todos los valores del pH por debajo de 10 .Puesto que la máxima carga

negativa o positiva se mantiene sobre un amplio rango de pH, la capacidad de intercambio

o de unión de estas fases estacionarias es, esencialmente, constante, independientemente

del pH de la fase móvil. Los intercambiadores catiónicos <<débiles>> contienen grupos

funcionales del tipo carboxílico ( 𝑅𝐶𝑂2‾ ), débilmente ácidos.

Ilustración 1: l fundamente de la cromatografía de intercambio ionico

𝑀+ + (𝑁𝑎+− 03 𝑆 − 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎) (𝑀+− 03 𝑆 − 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎) + 𝑁𝑎+

 𝑀+ = 𝐶𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛

Por consiguiente , su capacidad de intercambio varía considerablemente a lo largo del

intervalo de pH 4-10 , aproximadamente .Los intercambiadores anionicos débilmente

básicos poseen restos amonios primarios , secundarios o terciarios ( 𝑅𝑁𝐻𝑅′2⁺ ), los cuales

se encuentran desprotonados en una disolución moderadamente básica ,perdiendo de esta

manera su carga positiva y la capacidad de ligar aniones .Por consiguiente, una manera

de eluir solutos ligados a un medio de intercambio de iones es cambiar el pH de la fase

móvil. Una segunda manera de eluir solutos unidos es aumentar la fuerza iónica de la fase

móvil (por ejemplo, mediante es uso de NACI), para debilitar las interacciones

electrostáticas.

Las separaciones cromatografías por medio del intercambio iónico están basadas en las

diferencias en la afinidad de los intercambiadores por los iones (o las especies cargadas)

a separar. Los factores que gobiernan la selectividad de un intercambiador para un ion en

particular incluyen la valencia , el radio y la concentración de los iones ; la naturaleza del

intercambiador (incluyendo su contraion desplazable ); y la composición y el pH de la

fase móvil .Para resultar útil como intercambiador de iones , un material debe ser a la vez

de naturaleza iónica y altamente permeable .Los intercambiadores sintéticos de iones son

, por consiguiente , poli electrolitos de uniones cruzadas y pueden ser inorgánicos ( por

ejemplo , aluminosilicatos ) o, más comúnmente ,compuestos orgánicos . El poli estireno,

obtenido mediante la polimerización cruzada entre el estireno y el divinilbenceno (DVB),

puede ser modificado para producir tanto resinas de intercambio anionico como resinas

de intercambio catiónico. Las resinas polimeras tales como estas están disponibles

comercialmente en un amplio rango de tamaños de partícula y con diferentes grados de

entrecruzamiento (expresado como el porcentaje en peso del DVB en la mezcla) .El grado

de entrecruzamiento controla la rigidez y la porosidad de la resina, las cuales, a su vez,

determinan su utilización óptima.

Las resinas ligeramente entrecruzadas permiten el equilibrado rápido del soluto, aunque

las partículas se hinchan en agua, disminuyendo de esta manera la densidad de carga y la

selectividad (la afinidad relativa) de la resina por los diferentes iones. Las resinas con un

grupo de entrecruzamiento más elevado muestran menos hinchamiento, una capacidad de

intercambio y una selectividad mayor, aunque precisan tiempos de equilibrado más

largos. El pequeño tamaño de poro, la alta densidad de carga y el carácter hidrófobo

inherente de las resinas de intercambio ionico más antiguas ha restringido su uso a solo

las moléculas pequeñas (de un peso molecular menor que 500).

Ilustración 2: Estructuras químicas de las resinas de intercambia ionico basadas en el

poli estireno

Estructura del copolimero entrecruzado estireno-divinilbenceno

R=H, poli estireno no sustuido

𝑅 = 𝐶𝐻2 𝑁 + (𝐶𝐻3 )3𝐶𝐿− , intercambiador de iones

𝑅 = 𝑆𝑂4 − 𝐻 + , intercambiador de cationes

Los intercambiadores iónicos basados en los polisacáridos, tales como la celulosa, el

dextrano o la agarosa, han demostrado ser muy útiles para la separación y la purificación

de las moléculas grandes, tales como las proteínas y los ácidos nucleicos. Estos
materiales, denominados geles puesto que son mucho más blandos que resinas de poli

estireno, pueden ser derivatizados con grupos fuertes o débilmente ácidos o básicos, a

través de las uniones OH presentes en el esqueleto del polisacárido. Presentan tamaños

de poro muchos mayores y densidades de carga menores que las resinas sintéticas

antiguas.

Las aplicaciones de la cromatografía de intercambio ionico relacionadas con los

alimentos incluyen la separación de los aminoácidos, los azucares, los alcaloides y las

proteínas. El fraccionamiento de los aminoácidos contenidos en los hidrolizados de

proteína fue llevada a cabo, inicialmente, por medio de la cromatografía de intercambio

ionico; la automatización de este proceso condujo al desarrollo de los analizadores de

aminoácidos fabricados comercialmente. Los azucares, acomplejados con el borato para

formar especies cargadas negativamente, pueden ser separados sobre columnas de resinas

intercambiadores anionicas fuertes en la forma borato. Muchos medicamentos, los ácidos

grasos y los ácidos de la fruta, siendo compuestos ionizables, pueden ser

cromatografiados en el modo de intercambio ionico.

1.3.3.4 La cromatografía de exclusión por tamaños (SEC)

La SEC, también conocida como cromatografía de exclusión molecular, de permeacion

en gel (GPC) Y de filtración en gel (GFC), es, probablemente, el modo de cromatografía

más sencilla de llevar acabo y de comprender. Es ampliamente utilizado en las ciencias

biológicas para la resolución de las macromoléculas, tales como las proteínas y los

hidratos de carbono, y también se utiliza para el fraccionamiento y la caracterización de

los polímeros sintéticos. Desafortunadamente, la nomenclatura asociada con este modo

de separación se desarrolló independientemente en la bibliografía de las ciencias

biológicas y en el campo de la química de los polímeros, dando como resultado

inconsistencias.

𝑂𝐶𝐻2 𝐶𝑂𝑂− Carboximetil-(cm) ácido débil

𝑂𝐶𝐻2 𝐶𝐻2 𝑆𝑂3− sulfoatil-(SE) acido fuerte

En el sistema SEC ideal, las moléculas son separadas únicamente en función de su

tamaño; no tiene lugar ninguna interacción entre los solutos y la fase estacionaria. (En el

caso de que si tengan lugar interacciones soluto-soporte. El modo de separación se conoce

como SEC no ideal). La fase estacionaria en la cromatografía SEC consiste en un

material de relleno de la columna que tiene poros de un tamaño comparable al de las

moléculas a fraccionar. Los solutos demasiados grandes como para introducirse en los

poros, se desplazan con la fase móvil a través del espacio intersticial (el espacio entre

las partículas), por fuera de los poros. Por consiguiente, las moléculas más grandes son

las eluidas en primer lugar desde una columna SEC. El volumen de la fase móvil en la

columna, conocida como el volumen muerto de la columna, 𝒗𝒐′ puede ser medido

cromatografiando una especie muy grande (que sea totalmente excluida), tal como el

dextrano azul, un tinte de paso molecular (MW) igual a 2𝑥106 .

Conformen disminuyen las dimensiones del soluto, aproximadamente a las de los poros

del relleno, las moléculas comienzan a difundirse hacia el interior de las partículas del

relleno y,en consecuencias, son retardadas. Los solutos de peso molecular bajo (por

ejemplo, la gliciltirosina), los cuales tiene acceso libre a todo el volumen de poros

disponibles, son eluidos en un volumen denotado como 𝑣𝑡 este valor 𝑣𝑡 que es igual al

volumen muerto de la columna 𝑣𝑜 más el volumen de líquido contenido en el interior de

los poros absorbentes 𝑣𝑖 se conoce como volumen total de permeacion de la columna

empaquetada (𝑣𝑡 = 𝑣𝑜 + 𝑣𝑖 ). Idealmente los solutos son eluidos entre el volumen muerto

y el volumen total del líquido de la columna. Puesto que este volumen está limitada, solo
un menor relativamente pequeño de solutos diferentes (aproximadamente, 10) pueden ser

resueltos completamente por medio de la cromatografía SEC, bajo las condiciones

ordinarias.

El comportamiento de una molécula en una columna de exclusión por tamaños puede ser

caracterizado de varias maneras diferentes. Cada soluto muestra un volumen de elución,

sin embargo 𝑣𝑜 depende de las dimensiones de las columnas y de la manera en que la

columna fue empaqutada. El coeficiente de reparto disponible se utiliza para defenir el

comportamiento de soluto, independiente de dichas variables:

Ilustración 3: Perfil de elución esquemático, el cual ilustra alguno de los términos

utilizados en la cromatografía de exclusión por tamaños.

𝑘𝑎𝑣 = (𝑣𝑒 − 𝑣0 )/(𝑣𝑡 − 𝑣𝑜 )

Donde:

𝑘𝑎𝑣 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑡𝑜

𝑣𝑒 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜

𝑣0 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑚 𝑚𝑢𝑒𝑟𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎

𝑣𝑡 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎

El valor 𝑘𝑎𝑣 , calculando apartir de los datos experimentales para un soluto

cromatografiado en una columna SEC dad, define la proporción de los poros que pueden

ser ocupados por dicha molecula. Para una especie química grande, totalmente excluida,

tal como el Dextrano azul o el DNA, 𝑣𝑒 = 𝑣0 𝑦 𝑘𝑎𝑣 =0. Para una molecula pequeña, con

ecceso completo al volumen interno de los poros, tal como la gliciltirosina, 𝑣𝑒 =𝑣𝑡 y 𝑘𝑎𝑣 =

1.

Para cada material de relleno para la exclusión por tamaños, una representación gráfica

de 𝑘𝑎𝑣 frente al logaritmo del peso molecular, para una serie de solutos semejantes en su

forma molecular y densidad, dara una curva en forma “s”. (De hecho en el caso de las

proteínas, 𝑘𝑎𝑣 se correlaciona mejor con el radio de Stokes, el radio promedio de la

proteína en solución). La parte lineal, en la proporción central de la curva, describe el

rango de fraccionamiento de la matriz, en el cual se consigue el máximo de separación

entre los solutos de peso molecular similar. Esta correlación entre el comportamiento de

elución del soluto y el peso (o el tamaño) molecular constituye la base de un método

ampliamente utilizada para la caracterización de moléculas grandes tales como las

proteínas y los polisacáridos. Una columna de exclusión por tamaño se calibra con una

serie de solutos de peso molecular (o bien, de radio de stokes) conocido, para obtener una

curva semejante a la mostrada. A continuación, se determina el valor de 𝑘𝑎𝑣 para la

incognita y se lleva acabo una estimación de peso molecular (o el tamaño) de la incognita,

mediante la interpolación de la curva de calibrado.

Los materiales de relleno de la columna para la cromatografía SEC pueden ser divididos

en dar grupos: los medios hidrófobos, semirrígidos, y los geles hidrófilos, blandos. Los

primeros se obtienen, habitualmente, a partir del poli estireno y son utilizados con fases

móviles orgánicas (la cromatografía GPC, o SEC no acuosa) para la separación de

polímeros tales como los cauchos y los plásticos. Los geles blandos, los rellenos basados
en el polisacárido, son representados por el Sefadex, un dextrano entrecruzado. Estos

materiales están disponibles en un amplio rango de tamaños de poro y son útiles para la

separación de las sustancias hidrosolubles en el rango de pesos moleculares 1 − 2,5𝑥107 .

A la hora de seleccionar un relleno de columna para la SEC, se debe tener en cuenta tanto

el propósito del experimento xomo el tamaño de las partículas a separar. Por ejemplo, si

el objeto fuese la determinación del peso molecular, se elegiría un relleno tal que su rango

de fraccionamiento contenga el peso molecular previsto para el soluto.

Como ha sido discutido anteriormente, la cromatografía SEC puede ser utilizada bien sea

directamente, para fraccionar mezclas, o bien indirectamente, para obtener información

sobre una especie disuelta. Además de las estimaciones del peso molecular, la

cromatografía SEC se utiliza para determinar la distribución de pesos moleculares de los

polímeros naturales y los sintéticos, tales como preparados del dextranos y de gelatinas.

El fraccionamiento de las mezclas de biopolímeros es, probablemente, el uso más

extendido de la SEC, puesto que las suaves condiciones de elución empleados ocasionan

rara vez la desnaturalización o la perdida de la actividad biológica. Es además, una

alternativa rápida y eficiente a la diálisis, para la desalación de las disoluciones de

macromoléculas tales como la proteína.

1.3.3.5 La cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es único en el sentido de que la separación se basa en la

interacción específica y reversible entre una molécula de soluto y un ligante inmovilizado

sobre la fase cromatografía estacionaria. Aunque aquí se discute como un tipo distinto de

cromatografía, la cromatografía de afinidad podría ser considerada como una extensión

hasta límite de la cromatografía de adsorción. A pesar de que los conceptos básicos de la,

así llamada adsorción bioespecifica eran conocidos ya desde 1910, estos no fueron
apreciados como herramientas de laboratorio potencialmente útiles hasta alrededor del

año 1968.

Habitualmente, en la cromatografía de la afinidad intervienen sustancias biológicas

inmovilizadas, como la fase estacionaria. Estos ligantes pueden ser anticuerpos,

inhibidores de enzimas, lecitinas u otras moléculas que se enlacen selectiva y

reversiblemente a las moléculas analito complementarias, que se hallen presentes en la

muestra. La separación aprovecha la unión del tipo “llave o cerradura” de los sistemas

biológicos. Aunque tanto los ligantes como las especies a aislar son, habitualmente,

macromoleculasbiologicas, el termino cromatografía de afinidad también abarca otros

sistemas, tales como la separación

Analito de pequeñas

moléculas que contentan grupos cis-diol, por medio

de unidades ácido fenilboronico dispuestos sobre la fase

estacionaria.

A
Ligante

Ilustración 4: Los principios de la cromatografía de afinidad biosectiva

Los principales de la cromatografía de afinidad están en 27-8. Se inmoviliza, sobre un

material de soporte adecuado, un ligantes escogido a causa de la especificad y la fortaleza

de su interacción con la molécula a aislar (el analito). Cuando se hace pasar la muestra a

través de esta columna, las moléculas que sean complementarias a las del ligante
enlazados son adsorbidas, mientras que otros componentes de la muestra serán eluidos.

El analito unido es eluido, posteriormente, por medio de un cambio en la composición de

la fase móvil. (Por ejemplo, la modificación del pH de fase móvil disocia, a menudo, un

complejo inhibidor-enzima). Después del reequilibrado con la fase móvil inicial, la fase

estacionaria esta lista para ser utilizada nuevamente. El soporte ideal para la

cromatografía de afinidad debería ser un material poroso, estable, de gran área superficial,

el cual no adsorba nada el mismo. Por consiguiente, son utilizados polímeros tales como

la agarosa, la celulosa, el dextrano y la poliacrilamida, así como el vidrio de poro

controlado.

Habitualmente, los ligantes de afinidad son sujetados o a la matriz mediante la formación

de enlaces coeficientes y, a menudo, las condiciones de reacción óptimas deben ser

encontrados empíricamente. Generalmente, la inmovilización consta de dos etapas: la

activación y el acoplamiento. Durante la etapa de activación, un reactivo reacciona con

los grupos funcionales repartidos sobre el soporte, tales como las unidades hidroxilo, para

dar lugar a una matriz activado. Después de la eliminación del exceso de reactivo, el

ligante es acoplado a la matriz. (Los soportes pre activados se pueden adquirir de fuentes

comerciales y disponibilidad ha aumentado la utilización de la cromatografía de afinidad).

Muy frecuentemente, la reacción de acoplamiento involucra grupos aminos libres sobre

el ligante, aunque pueden ser utilizados otros grupos funcionales. Cuando son

inmovilizados moléculas pequeñas tales como el ácido borinico, se utiliza un brazo

espaciador (conteniendo, al menos, de cuatro a seis grupos metilenos) para mantener el

ligante aparato de la superficie del soporte, permitiéndole alcanzar el interior de la

posición de unión del analito.

Los ligantes para la cromatografía de afinidad pueden der o bien específicos, o en

generales (es decir, específicos para determinar grupos). Los ligantes específicos, tales
como los anticuerpos, se unen solamente a un soluto en particular. Los ligantes generales,

tales como los anticuerpos, se unen solamente a un soluto en particular. Los ligantes

generales, tales como los análogos de los nucleótidos y las lactinas, se unen a

determinadas clases de soluto. Por ejemplo la lectina concanavalina A se une a todas las

moléculas que contengan grupos glucósido mano silo terminales. Seguidamente, los

solutos ligados pueden ser separados como grupo o individualmente, dependiendo de la

técnica de elución utilizada. Algunos de los ligantes generales más comunes aparecen

enumerados en la siguiente tabla.

Tabla 5: Los ligantes de afinidad general y sus especificaciones

Ligantes Especificad
Tinte azul cibacron F3GA-A, y NADPH Determinadas deshidrogenasa, mediante
la unión a la posición de unión del
nucleótido
Concanavilina A, lectina de las lentejas, Polisacárido, glucoproteinas, glucolipidos
lectina del germen de trigo y proteínas de la membrana que contengan
restos sacáridos de determinadas
configuraciones.
Inhibidor de la tripsina de la semilla de Diversas proteasas
soya, esteres metílicos de diversos
aminoácidos, D-aminoácidos
Ácido fenilboronico Hemoglobina glucosiladas, azucares,
ácidos nucleicos y otras sustancias que
contengan cis-dioles
Proteína A Muchas clases y subclases de
inmunoglobulinas, mediante la unión a la
región Fc
DNA, RNA, nucleótidos, nucleótidos Nucleasas, polimerasas, ácidos nucleicos
(d, 1996) Reproducido en (13), con autorización. Reservados dos derechos por la

American Chemical Society. 1985

Aunque menos selectivos, los ligantes generales proporciona una comodidad mayor.

Los métodos de evaluación para la cromatografía de afinidad pueden ser clasificados en

métodos inespecíficos y (bio) específicos. La elución inespecífica implica perturbar la

unión ligante-analito mediante la modificación del PH de la fuerza iónica, de la constante

dieléctrica o de la temperatura de la fase móvil. Si se desea una selectividad adicional en

la elución bioespecifica. Se añade ligante libre a la fase móvil, bien sea idéntico o bien

diferente al ligante unido al matraz. Este ligante libre compite por las posiciones de unión

distribuidas sobre el analito. Por ejemplo, las glucopoteinas unidas a una columna de

concanavalina. A (una lectina) pueden ser eluidos mediante la utilización de una

disolución amortiguadora que contenta un exceso de lectina. En general, el ligante

eluyente debería mostrar una mayor afinidad por el analito de interés que el ligante

inmovilizado.

Además de para la purificación de las proteínas, la cromatografía de afinidad puede ser

utilizada para separar estructuras supra moléculas tales como las células, los orgánulos y

los virus; concentrar disoluciones diluidas de proteínas; investigar los mecanismos de

unió; y determinar las constes de equilibrio. La cromatografía de afinidad ha sido útil

especialmente en la separación y la purificación de los enzimas y las glucoproteinas. En

el caso de estas últimas, las adsorbentes derivas tizadas con hidratos de carbono son

utilizadas para separar lactinas concreta, tales como la concanavalina A y la lectina de las

lentejas o del germen de trigo. A continuación, la lectina puede ser acoplada a la agarosa

tal como en la concanavalina A-agarosa o en la lectina de lenteja-agarosa, para

proporcionar, así, una fase estacionaria para la purificación de glucoproteinas,

glucolipidos o polisacáridos concretos.

1.3.4 Las técnicas cromatografías

Son de aplicación los mismos principios generales de la cromatografía,

independientemente del método o la técnica cromatografico concretamente empleados.

La cromatografía SFC es una técnica analítica semejante a la LC, excepto que se utiliza

como la fase móvil un fluido supercrítico en lugar de un líquido.

1.3.4.1 La cromatografía en papel

La cromatografía en papel fue dada a conocer en 1944. Aunque se utilizado la absorción

por el propio papel, el papel, generalmente, sirve solo como un soporte para la fase

estacionaria liquida (cromatografía de reparto). Para llevar a cabo esta técnica, la muestra

disuelta se aplica en forma de un pequeño punto o trazo separado media pulgada, o más,

el borde de una tira o de un cuadrado de papel de filtro (habitualmente, de celulosa) y se

deja sacar. A continuación, se suspende la tira de un recipiente cerrado cuya atmosfera

está saturada con el disolvente de desarrollo (fase móvil), y se desarrolla el comatograma

en papel. El extremo más próximo a la muestra se dispone en contacto con el disolvente,

el cual se desplaza, seguidamente gracias a la acción capilar, hacia arriba o hacia abajo

del papel (dependiendo de si se hace del desarrollo ascendente o del descendente),

separando en este proceso los componentes de la muestra. Cuando el frente del disolvente

se ha desplazado toda la longitud del papel, se retira la tira de la cámara de desarrollo y

las zonas diferenciadas son detectadas mediante un método apropiado.

Habitualmente, en la cromatografía de reparto en papel la fase estacionaria es el agua. Es

embargo, el soporte puede ser impregnado con en disolvente orgánico apolar y ser

desarrollado con disolventes polares o con agua (cromatografía de fase inversa en papel).

En caso de las mezclas complejas, se puede hacer uso de una técnica bidimensional. Se

aplica una mancha de la muestra en una esquina de una hoja cuadrada de papel y se utiliza

un disolvente para desarrollar el papel en una dirección. A continuación, se seca el

cromatograma, se rota a 90° utilizando un segundo disolvente, de polaridad diferente.

Otro método para mejorar la resolución es la utilización de papeles de intercambio ionico.

Hay disponibles comercialmente tanto papel que ha sido impregnado con una resina de

intercambio ionico como papel en el cual los grupos hidróxidos de la celulosa han sido

deriva tizados (con fragmentos ácidos o básicos).

En las cromatografías en papel de capa fina (cromatografías planas) los componentes de

una mezcla quedan caracterizados por el valor de su movilidad relativa ( 𝑅𝑓 ), donde:

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑅𝑓=
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

Desgraciadamente, los valores de la 𝑅𝑓 no son siempre constantes para una combinación

de soluto, adsorbente y disolvente, sino que depende de muchos otros factores, tales como

la calidad de la fase estacionaria, el grosor de la capa, la humedad, la distancia del

desarrollo y la temperatura.

1.3.4.2 La Cromatografía En Capa Fina (TLC)

La cromatografía en capa fina (TLC), descrita por primera vez en 1938, ha sustituido en

gran parte a la cromatografía en papel porque es más rápida, más sensible y más

reproducible. (Se puede aludir a ambas técnicas como cromatografías planas). La

resolución en la TLC es mayor que en la cromatografía en papel, porque las partículas

distribuidas sobre la placa son más pequeñas y más regulares que las fibras del papel. Las

condiciones experimentales pueden ser variadas fácilmente para conseguir la separación

y pueden se escaladas para su utilización en la cromatografía en columna. (Los

procedimientos de capa fina y de columna no son intercambiables necesariamente, debido

a diferentes tales como el uso de aglutinantes en las placas de cromatografía TLC, el

equilibrio de la fase vapor en una cámara de TLC, etc.). Algunas claras ventajas de

cromatografía TLC incluyen el gran número de muestras y patrones simultáneamente; y

la mínima preparación de la muestra (puesto que la fase estacionaria es desechables).

Además, una placa puedes almacenada para su identificación y cuantificación posteriores.

La cromatografía TLC ha sido aplicada al análisis de lípidos, (véase el capítulo 14). La

cromatografía HPLC de los lípidos se ve complicada por la falta de cromo foros que

permitan la detección ultravioleta-visible (UV-Vis) y la mayoría de los análisis mediante

la cromatografía GC requieren la derivatizacion previa; sin embargo, hay disponibles

muchos reactivos buenos para la detección de los lípidos, para la cromatografía TLC. La

TLC se aplica en muchos campos, incluidos el medioambiental, el clínico, el forense, el

farmacéutico, el alimentario, el de los sabores y el de los cosméticos. Dentro de la

industria alimentaria, cromatografía TLC puede ser utilizada vara el control de la calidad.

Por ejemplo, el maíz y los cacahuetes son probados en busca de las aflatoxinas o las mico

toxinas, con anterioridad a su trasformación en harina de maíz o en mantequilla de

cacahuete, respectivamente. En el libro de Ried y Sherma (4) se discuten las aplicaciones

de la cromatografía TLC al análisis de una diversidad de compuestos, incluidos los

lípidos, los hidratos de carbono, las vitaminas, los aminoácidos, y los pigmentos

naturales.

1.3.4.2.1 Los procedimientos generales

La cromatografía TLC hace uso de una capa delgada (de aproximadamente, 250 un de

espesor) de adsorbente o fase estacionaria enlazada a un soporte inerte, en una

configuración plana. Con frecuencia, el soporte es una placa de vidrio (tradicionalmente,

de 20 cm x 20 cm), aunque también se utilizan las hojas de plástico y las láminas de

aluminio. Hay disponibles placas previamente recubiertas, de diferentes espesores de

capa, en una amplia variedad de adsorbentes, incluidas las sílices químicamente

modificadas. (Hoy en día rara vez se recubren las placas “a mano”). El gel de sílice, la
alúmina, la tierra de diatomeas y la celulosa son cuatros adsorbentes utilizados

frecuentemente en la cromatografía TLC. Muchas separaciones llevadas a cabo mediante

la cromatografía en papel pueden ser transferidas a la TLC sobre celulosa. Las sílices

modificadas para la TLC pueden contener grupos polares o apolares, análogos a las fases

enlazadas empleadas para la cromatografía en columna, y se pueden llevar a cabo

separaciones en capa fina tanto de fase normal como de fase inversa. El termino

cromatografía en capa fina, de alta resolución (HPLTC) se refiere, simplemente a la TLC

llevada a cabo utilizando placas recubiertas con partículas más pequeñas, mas uniformes.

Esto permite una mejor separación, en tiempos, más cortos.

Si se ha de llevar a cabo una cromatografía TLC de adsorción, el adsorbente es activado

en primer lugar mediante el secado durante un tiempo y una temperatura especificados.

La muestra (disuelta en el disolvente portador) se aplica como un punto o un trazo,

separado 1-2 cm de uno de los extremos de la placa. Después de la evaporación del

disolvente portador, la placa de TLC se coloca en una cámara de desarrollo cerrada, con

los extremos de la placa más cercana a la mancha hacia el fondo de la cámara.

Tradicionalmente, el disolvente migra hacia la parte superior de la placa (desarrollo

ascendente) gracias a la acción capilar y los componentes son separados. Después de que

la placa de TLC haya sido retirada de la cámara y se haya dejado evaporar el disolvente,

las bandas separadas se hacen visibles (se visualizan) o son detectadas mediante otros

medios. Con frecuencia, se utilizan para este propósito reacciones químicas (de

derivatizacion) específicas, las cuales pueden ser llevadas a cabo bien sea antes o bien

después de la cromatografía. Dos ejemplos son la reacción con ácido sulfúrico para dar

lugar a un área oscura carbonizada (un método químico destructivo) y la utilización de

vapor de yodo para formar un complejo coloreado (un método no destructivo, en tanto en

cuanto el complejo coloreado no es, habitualmente, permanente). Los métodos físicos de

detección comunes incluyen la medida de radiación electromagnética absorbida o emitida

(por ejemplo, la fluorescencia) y la medida de la radiación B procedente de los

compuestos marcados radioactivamente. Pueden ser utilizados métodos biológicos o

ensayos bioquímicos de inhibición para detectar las sustancias toxicológicamente activas.

Un ejemplo de estos es la medida de la inhibición de la actividad de la colinesterasa por

parte de los pesticidas organofosforados.

Puede llevarse a cabo la evaluación cuantitativa de los cromatogramas de capa fina: (1)in

situ (directamente sobre la placa) mediante la utilización de un densitómetro o (2) después

de raspar una zona de la placa, eludir el compuesto fuera del adsorbente y analizar la

disolución resultante (por ejemplo, por medio del recuento del centello liquido).

1.3.4.2.2 Los factores que afectan

A las separaciones en capa fina Tanto en la cromatografía liquida plana como en la de

columna, la naturaleza de los compuestos a separar determina qué tipo de fase

estacionaria se utiliza. La separación puede tener lugar por adsorción, por reparto, por

intercambio iónico, por exclusión por tamaños o por mecanismos múltiples como se ha

comentado anteriormente en la sección 27.3.3. La tabla 27.5 enumera los mecanismos de

separar implicados en lagunas aplicaciones típicas sobre adsorbentes comunes para la

cromatografía TLC.

Aunque la selección de ambas, la fase móvil y la fase estacionaria, determina el éxito de

una separación por cromatografía TLC dada, con frecuencia no se describe la razón

fundamental que subyace tras la elección de la fase móvil, para un fraccionamiento en

particular. Los disolventes para las separaciones por TLC deberían ser elegidos basándose

en sus características químicas y en la fuerza del disolvente (una medida de la interacción

entre el disolvente y el adsorbente; véase la sección 27.3.3.1). En la simple cromatografía

TLC de adsorción, cuanto más elevada sea la fuerza del disolvente tanto mayor será el
valor de Rf del soluto. Habitualmente, se intenta utilizar una fase móvil tal que se

obtengan valores de RF de 0,3- 0,7. (Aunque las fases móviles de disolvente único pueden

proporcionar una movilidad adecuada, a menudo no dan una separación adecuada).

Afortunadamente para el principiante, han sido desarrolladas fases móviles para la

separación de diversas clases de compuestos sobre adsorbentes concretos, véase, por

ejemplo, la tabla 7.1 en la referencia (12).

Además del adsorbente y del disolvente, algunos otros factores deben ser considerados

cuando se lleva a cabo una cromatografía en capa fina (o en papel). Estos incluyen el tipo

de cámara de desarrollo utilizado, las condiciones de la fase vapor (saturada frente a

insaturada), el modo de desarrollo (ascendente, descendente, horizontal, radical, etc.) y la

distancia de desarrollo.

Tabla 6: Los adsorbentes para la cromatografía de capa fina y el modo de

separación

Adsorbente Mecanismo cromatografico Aplicación típica

Gel de sílice Adsorción Esteroides, aminoácidos,
alcoholes, hidrocarburos,
lípidos, aflatoxinas, ácidos
biliares, vitaminas,
alcaloides
Gel de sílice RP Fase inversa Ácidos grasos, vitaminas,
esteroides, hormonas,
carotenoides
Celulosa, tierra de Reparto Hidratos de carbono,
diatomeas azucares, alcoholes, ácidos
carboxílicos, ácidos grasos
Oxido de aluminio adsorción Aminas, alcoholes,
esteroides, lípidos,
aflatoxinas, ácidos biliares,
vitaminas, alcaloides
Celulosa PEI1 Intercambio iónico Ácidos nucleicos,
nucleótidos, nucleosidos,
purines, pirimidinas
 Silicato de magnesio Adsorción Esteroides, pesticidas,
lípidos, alcaloides
(Jhon Wiley, 2012)

1.3.4.3 La Cromatografía Liquida En Columna

La cromatografía en columna es el método más útil para separar los compuestos presentes

en una mezcla. El fraccionamiento de los solutos tiene lugar como resultados de la

migración diferenciada a través de un tubo cerrado de fase estacionaria y se puede llevar

a cabo el seguimiento de los analitos al mismo tiempo que tiene lugar la separación. Esta

sección del presente capitulo abarcara los procedimientos generales, la teoría y la

cuantificación de los datos de la cromatografía liquida en columna.

1.3.4.3.1 Los procedimientos generales

En la figura 27.9 se ilustra un sistema de baja presión (es decir, llevado a cabo a la presión

atmosférica o próxima a ella) ara la cromatografía liquida en columna. (Mientras que el

procedimiento esbozado a continuación es aplicable a la cromatografía en columna en

general, se remite al lector a los capítulos posteriores para los detalles específicos de las

cromatografías HPLC o GC).

Ilustración 5: sistema de cromatografía liquida a baja presión en columna

Habiendo escogido unas fases estacionaria y móvil adecuadas de separación que tenga

entre manos, el analista debe, en primer lugar, preparar la fase estacionaria (la resina, el

gel o el material de relleno) para su uso, de acuerdo con las instrucciones del

suministrador. (Por ejemplo la fase estacionaria debe, a menudo, ser hidratada o hinchada

previamente en la fase móvil). A continuación, la fase estacionaria preparada es

empaquetada en una columna (habitualmente, de vidrio), cuya longitud y diámetro vienen

determinados por la cantidad de muestra a manejar, el modo de separación a utilizar y el

grado de resolución requerido.

Las columnas de adsorción pueden ser empaquetadas o bien en seco, o bien en húmedo;

otros topis de columnas son empaquetadas en húmedo. La técnica más común para el

empaquetado en húmedo supone preparar una suspensión espesa del adsorbente con el

disolvente y verter está en la columna.

La muestra a fraccionar, disuelta en un volumen mínimo de fase móvil, se aplica en una

capa en la parte superior (o cabeza) de la columna. La cromatografía clásica, o de baja

presión, hace uso solamente del flujo por gravedad o de una bomba peristáltica para

mantener un flujo de la fase móvil (el eluyente, o el disolvente eluyente) a través de la

columna. En el caso de un sistema alimentado por gravedad, sencillamente de si fona el

eluyente desde un deposito al interior de la columna. La velocidad de flujo está gobernada

por la presión hidrostática, medida como la distancia entre el nivel del líquido en el

depósito y del desagüe de la columna. Si el eluyente es alimentado a la columna por

medio de una bomba peristáltica (véase la figura 27.9), la velocidad de flujo viene

determinada por la velocidad de la bomba y, por consiguiente, no es necesaria la

regulación de la presión hidrostática.

El efluente de la columna puede ser conducido a través de un detector y, a continuación,

al interior de tubos para muestras, los cuales son cambiados a intervalos por medio de un
colector de fracciones. La respuesta del detector, en forma de una señal eléctrica, puede

ser registrada (dando lugar al cromatograma) y utilizada para el análisis cualitativo o

cuantitativo, tal como se discute posteriormente con más detalle. El colector de fracciones

puede ser ajustado para recoger el efluente a intervalos de tiempo prefijados, un después

de que haya recogido un cierto volumen o un determinado número de gotas. A

continuación, los componentes de la muestra que han sido separados

cromatograficamente de esta manera pueden ser analizados según sea necesario.

1.3.4.3.2 El análisis cualitativo

El volumen de líquido necesario para eludir un compuesto desde una columna de

cromatografía LC se denomina el volumen de retención VR. El tiempo asociado es el

tiempo de retención, tR. La comparación del valor VR o de tR con el de patrones

cromatografiados bajo condiciones idénticas nos permite, a menudo, identificar un

compuesto incógnita. (Se debería recordar que los compuestos diferentes pueden tener

tiempos de retención idénticos).

Con frecuencia es necesario comparar los cromatogramas obtenidos a partir de dos

sistemas o columnas diferentes. Las diferencias en las dimensiones de las columnas, la

carga, la temperatura. La velocidad de flujo, el volumen muerto del sistema y la geometría

del detector pueden conducir a discrepancias entre los datos de retención sin corregir.

Sustrayendo el tiempo requerido por la fase móvil o por una soluto no retenido (tú o t0)

para desplazarse a través de la columna hasta el detector, se obtiene un tiempo de

retención ajustado, t´ R , (o un volumen de retención ajustado V´R), como se representa en

la figura 27.10. El tiempo (o volumen) de retención ajustado tiene en cuenta en el

volumen muerto del sistema; se puede considerar como el tiempo que la muestra

permanece adsorbida sobre la fase estacionaria.

Ilustración 6: Medida de retención cromatografica

Tiempo de retención ajustado

Un método sencillo y fiable para la identificación de los picos es utilizar la retención

relativa, expresada por el factor de separación, α. Los valores de α (véase la figura 27.10)

dependen solamente de la temperatura y de la fase estacionaria y la fase móvil utilizadas.

1.3.4.3.3 La separación y la resolución

1. Una visión de conjunto. El objetivo de la cromatografía es separar los

componentes de una muestra en bandas o picos distintos, conforme estos migran

a través de la columna. La resolución de dos picos, uno de otro, se define como:

2∆𝑇
𝑅𝑆 =
𝑊2 + 𝑊1

Donde:

𝑅𝑆 = 𝑟𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛

∆= 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑝𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠1 𝑦 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 2

𝑊2 = 𝑎𝑛𝑐ℎ𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑖𝑐𝑜 #2, 𝑎 𝑙𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒

𝑊1 = 𝑎𝑛𝑐ℎ𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑖𝑐𝑜 #1, 𝑎 𝑙𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒

La figura 27.11 ilustra la medida de la anchura del pico (parte a) y los valores necesarios

para el cálculo de la resolución (parte b). (La retención y la anchura del pico o la banda

deben ser expresadas en las mismas unidades, es decir, en tiempo o en volumen).

La resolución cromatografica es una función de la eficiencia, la selectividad y el factor

de capacidad de la columna. Matemáticamente, esta relación se expresa como:

1 𝛼−1 𝑘′
𝑅𝑆 = √𝑁 ( )( ′ )
4 𝛼 𝑘 +1

a b c

Donde:

𝑎 = 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎

𝑏 = 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎

𝑐 = 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑

Estos términos, y los factores que contribuyen a ellos, serán discutidos en párrafos

siguientes.

2. La eficiencia. Cuando se enfrenta con el problema de mejorar la resolución, una

cromatografista debería, en primer lugar, examinar la eficiencia de la columna. La

columna eficiente impide que las bandas se extiendan o proporciona picos

estrechos, o produce ambos efectos. La eficiencia de la columna puede ser

cuantificada por:

2
𝑡𝑅 2 𝑡𝑅 2 𝑡𝑅
𝑁 = ( ) = 16 ( ) = 5,5 ( )
𝜎 𝑤 𝑤1⁄
2

Donde:
𝑁 = 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜𝑠

𝑡𝑅 = 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛

𝜎 = 𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑡𝑖𝑝𝑖𝑐𝑎 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝑔𝑎𝑢𝑠𝑠𝑖𝑎𝑛𝑜

𝑤 = 𝑎𝑛𝑐ℎ𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜, 𝑎 𝑙𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒 (𝑤 = 4𝜎)

𝑤1/2 = 𝑎𝑛𝑐ℎ𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜, 𝑎 𝑚𝑖𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎

La medida de tR, w y w1/2 se ilustra en la figura 27.11. (En lugar de tR, se puede emplear

el volumen de retención; en tal caso, la anchura de la banda se mide también en unidades

de volumen). Aunque pocos picos representan de verdad una forma gaussiana, la

costumbre habitual es tratarlos como si lo fuesen. En el caso de aquellos picos que estén

incompletamente resueltos o que sean asimétricos, la anchura del pico a media altura es

más exacta que la anchura del pico a la altura de la línea base.

El valor de N calculado mediante la ecuación anterior se denomina el número de platos

teóricos. El concepto de platos teóricos, tomado prestado de la teoría de la destilación,

puede ser comprendido como mejor considerando la cromatografía como una serie de

equilibrados entre las fases móvil y estacionaria, análoga a la distribución a

contracorriente. Entonces, una columna estaría formada por N segmentos (platos

teóricos), teniendo lugar un equilibrado en cada uno de ellos. Como primera paroxmiacio,

N es independiente del tiempo de retención, por consiguiente, es una medida útil del

comportamiento de la columna, un método para el seguimiento del comportamiento de la

columna a lo largo del tiempo consiste en cromatografiar un compuesto patrón

periódicamente, bajo unas condiciones constantes, y comparar los valores de N obtenidos.

Un ensanchamiento de la banda, debido al deterioro de la columna, dará como resultado

la disminución de N.
Generalmente, el número de platos teóricos es proporcional a la longitud de la columna.

Puesto que ha disponibles columnas de diversas longitudes, es útil contar con una medida

de la eficiencia de la columna que sea independiente de la longitud de la columna. Esto

puede ser expresado como:

𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 =
𝑁

Donde:

𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑏𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎 𝑢𝑛 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜

𝐿 = 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑢𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎

𝑁 = 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜

Algunas veces, la así llamada HETP es descrita, más sencillamente, como la altura de

plato (H). Si una columna estuviese formada por segmentos discretos, la HETP sería la

altura de cada segmento imaginario. Los valores pequeños de la altura de plato (un gran

número de platos, para una misma longitud de la columna) indican una buena eficiencia

en la separación.

Ilustración 7: La medida de la anchura del pico y su contribución a la resolución

Además, las columnas se comportan con frecuencia como si tuviesen un número diferente

de platos para los distintos solutos presentes en una mezcla. Una descripción más realista

del movimiento de los solutos a través de una columna de cromatografía tiene en cuenta

la velocidad finita a la cual el soluto se puede equilibrar consigo mismo, entre las fases

móvil y estacionaria. En consecuencia, la forma de las bandas depende de la velocidad de

elución y está afectada por la difusión del soluto. Cualquier mecanismo que cause que

una banda de soluto se ensanche, aumentara la HETP, disminuyendo en consecuencia la

eficiencia de la columna. Los diversos factores que contribuyen a la altura de plato vienen

expresados por la ecuación de Van Deemter:

Las constantes A, B y C son características para una columna, fase móvil y temperatura

dadas. El termino A proviene de la difusión de Eddy (o difusión de remolino), o sea,

múltiples caminos de flujo. La difusión de Eddy hace referencia a las diferentes corrientes

de flujo microscópicas que puede tomar la fase móvil por entre las partículas de la

columna (similares a las corrientes de Eddy, alrededor de las rocas de un arroyo). De esta

manera, las moléculas de la muestra pueden también tomar diferentes trayectorias,

dependiendo de cuál corriente de flujo sigan. El termino B de la ecuación de Van Deemter

(denominado algunas veces el termino de difusión longitudinal) existe porque todos los

solutos se difunden desde un área de concentración elevada hacia una de concentración

baja. En la cromatografía LC, la contribución de este término a la HETP es pequeña,

excepto a velocidades de flujo bajas. (Cuanto mayor tiempo resida un soluto en la

columna, tanto mayor será su dispersión por difusión). El termino C (de transferencia de

masas) procede del tiempo finito requerido por el soluto para equilibrarse entre las fases

móvil y estacionaria. Si la fase estacionaria está compuesta por partículas porosas (véase

el Capítulo 28, figura 28.3), una molécula de soluto que entra en un poro deja de ser

transportada por el flujo del disolvente que se desplaza solamente por difusión.
Posteriormente esta molécula puede difundirse de vuelta a la fase móvil, o bien puede

interactuar con la fase estacionaria. Las contribuciones del termino C a la HETP pueden

ser minimizadas por medio del uso de partículas porosas de pequeño diámetro o de

materiales de relleno peliculares (véase el capítulo 28 sección 28.2.3.2.2). Como se

expresa en la ecuación de Van Deemter, la velocidad de la fase móvil, u, contribuye a la

altura de plato en maneras opuestas: el aumento de flujo incrementa la difusión de Eddy

y la componente de transferencia de masas (los termino A y C), aunque disminuye la

difusión longitudinal (el termino B). Se puede hacer uno de una representación de Van

Deemter (véase figura 27.12) para determinar la velocidad de flujo de la fase móvil a la

cual se minimiza la altura de plato y se maximiza la eficiencia de la columna. (Para

disminuir el tiempo de análisis, se pueden emplear velocidades de flujo por encima del

valor óptimo, si aun así se obtiene una resolución adecuada).

3. la selectividad. La resolución cromatografica depende de la selectividad, así

como de la eficiencia. La selectividad de la columna se refiere a la distancia, o

separación relativa, entre dos picos y viene dada por:

𝑡𝑅2 − 𝑡0 𝑡′𝑅2 𝑘2
𝛼= = =
𝑡𝑅1 − 𝑡0 𝑡′𝑅1 𝑘1

Donde:

𝛼 = Factor de separación

𝑡𝑅1 𝑦 𝑡𝑅2 = tiempo de retención de los componentes número 1y 2 respectivamente

𝑡0 = tiempo de retención de los componentes no retenidos

𝑡′𝑅2 𝑦 𝑡′𝑅1 = tiempo de retención corregidos de los componentes 1 y 2

𝑘2 =coeficiente de distribución de los componentes

Los tiempos (o los volúmenes) de retención son medidos como se muestra en la figura

27.10. El tiempo t0, puede ser determinado cromatografiando un soluto que no sea

retenido bajo las condiciones de la separación (es decir, que se desplace con el frente del

disolvente). Cuando este parámetro es expresado en unidades de volumen, V0 o Vm se le

conoce como el volumen muerto del sistema. La selectividad depende de la fase

estacionaria, de la fase móvil o de ambas. Por ejemplo, la selectividad en la cromatografía

de intercambio iónico depende de la naturaleza y el número de grupos iónicos sobre la

matriz, aunque también puede ser modificado a través del pH y de la fuerza iónica de la

fase móvil. Probablemente, para una separación dada, sea más importante una buena

selectividad que una eficiencia elevada (véase la figura 27.13), puesto que la resolución

es directamente proporcional a selectividad aunque está relacionada cuadráticamente con

la eficiencia; por consiguiente, es necesario un aumento de N en cuatro veces para

duplicar el valor de Rs (ecuación [5]).

4. el factor de capacidad. El factor de capacidad o de retención, k´, es una medida

de la cantidad de tiempo que una especie cromatografía (o soluto) reside en el

interior de la fase estacionaria o sobre ella, en

comparación con la fase móvil. La relación entre los

factores de capacidad y la retención cromatografica

(que puede ser expresada o bien en unidades de

volumen, o bien de tiempo, como ya se ha comentado

anteriormente en la sección 27.3.4.3.2), se muestra a

continuación:

𝐾𝑉𝑆 𝑉𝑅 − 𝑉𝑀 𝑡𝑅 − 𝑡0
𝑘' = = =
𝑉𝑀 𝑉𝑀 𝑡𝑂
Donde:

𝑘'= factor de capacidad

K= coeficiente de distribución del soluto

𝑣𝑠= Volumen de la fase estacionaria en la columna

𝑣𝑚= Volumen de fase móvil

𝑉𝑅 = volumen de retención de soluto

𝑡𝑅 = tiempo de retención de los componentes del soluto

Los valores bajos de k´ indica una retención pequeña y los componentes serán eluidos

próximos al frente del disolvente, dando como resultado separaciones insatisfactorias.

Los valores grandes de k´ dan como resultado una separación mejorada, aunque también

pueden conducir a picos anchos y a tiempos de análisis largos. Es términos prácticos, se

utilizan generalmente, valores de k´ en el rango de 1 a 15. (En la ecuación de Rs , k´ es,

de hecho, el promedio entre k1´ y k2´ para los dos componentes a separar).

1.3.4.3.4 El análisis cuantitativo.

Suponiendo que se hayan conseguido una buena resolución e identificación

cromatograficas de los componentes de la muestra, la cuantificación supone medir la

altura, el área o la masa de los picos u comparar estos datos con aquellos obtenidos para

patrones de concentración conocida. (Se debería recordar que un pico completamente

resuelto no es necesariamente equivalente a una sustancia pura. Un pico puede representar

varios componentes que no sean resolubles bajo las condiciones cromatograficas

utilizadas).
 1) la altura del pico frente al área del pico. Hay mucho debate sobre cuál de estas

técnica es más útil.

En general, la altura del pico es menos dependiente de la velocidad de flujo, aunque el

área del pico se ve menos afectada por otras variables instrumentales o del operario. La

altura del pico se mide, sencillamente, como la distancia desde la línea base hasta el

máximo del pico (véase la figura 27.11). Se puede utilizar la interpolación de la línea base

hasta desde principio hasta el final para compensar la posible deriva de la línea base (la

cual, con frecuencia, resulta ser un problema en la elución por gradientes). La medida de

la altura del pico ofrece, generalmente, precisiones de 1-2% y no se debería utilizar con

aquellos picos que estén apreciablemente distorsionados.

Ilustración 8: tres métodos diferentes para estimar el área de los picos

Para medir el área del pico se pueden utilizar varios métodos, tal como se ilustra en la

figura 27.14. Dado que los picos cromatograficos se asemejan, a menudo, a un triángulo,

el área puede ser calculada mediante la fórmula para la superficie de un triángulo, A=

(w/2) h, (véasela figura 27.14a). Para disminuir los errores causados por la adsorción y la
formación de colas de los picos, se utiliza la anchura a media altura (w1/2). Este método

se debería utilizar solamente para los picos simétricos o aquellos que presenten formas

similares. El área medida es menor que el área verdadera, aunque proporcional al tamaño

de la muestra, a condición de que los picos no se encuentren gravemente distorsionados.

La precisión depende de la proporción h: w1/2, la cual debe quedar, preferiblemente, en

el rango de 2-10. Un segundo método para la medida del área es la triangulación, la cual

requiere el trazado de líneas tangentes a los lados del pico. La altura y la anchura del pico

se miden, a continuación, tal como se muestra en la figura 27.14b. Dado que esta técnica

no ofrece una exactitud mayor que la del método anterior y que se halla sujeta al error del

operario (al trazar las líneas tangentes), no se recomienda. Un planímetro es un artefacto

mecánico, el cual se puede utilizar para medir las áreas de los picos, recorriendo el

contorno de su perímetro (véase la figura 27.14c). La precisión y la exactitud de este

método dependen del propio artilugio y de la destreza del operario. La técnica del

planímetro puede ser más exacta que la triangulación, especialmente si los picos son

oblicuos.

El método de cuantificación de la masa de los picos por medio del “recortar y pesar”

requiere un recortado cuidadoso del pico cromatografico (o de una copia del mismo) y la

pesada del papel en una balanza analítica. La inexactitud en el recortado puede ser

minimizada manteniendo la proporción h: w1/2 entre 1-10. La homogeneidad del papel,

su contenido en humedad y el peso del papel son, todos ellos, factores importantes; pero

para los picos de forma irregular este método es superior a las técnicas de triangulación.

2) Los patrones externos frente a los internos. Habiendo cuantificado los picos de

las muestras, se deben comparar estos datos con los de patrones apropiados, de

concentración conocida, para determinar las concentraciones de las muestras. Las

comparaciones pueden ser hechas por medio de patrones externos o internos. La

comparación de la altura, el área o la masa de los picos de las muestras incógnitas

con los de patrones inyectados por separado (es decir, patrones externos) es una

práctica habitual. Se cromatografian disoluciones patrones que cubran el rango de

concentraciones deseado (preferiblemente diluidas a partir de una misma

disolución patrón de reserva) y, para obtener una curva de calibrado, se presentan

gráficamente los datos apropiados (altura, el área o masa de los picos) frente a la

concentración. A continuación, se cromatografian un volumen idéntico de la

muestra y se utiliza la altura, el área o la masa del pico de la muestra para

determinar la concentración de la muestra, por medio de la curva de calibrado

(véase la figura 27.15a). Este método absoluto de calibración requiere una técnica

analítica y precisa y exige que la sensibilidad del detector permanezca constante

de un día para otro, si la curva de calibrado ha de permanecer valida. La utilización

del método del patrón (relativo o indirecto) puede minimizar los errores

ocasionados por la preparación de la muestra, el instrumento y la habilidad técnica

del operario. En esta técnica, se utiliza un compuesto que esté relacionado

estructuralmente con los compuestos de interés contenidos en la muestra que se

esté analizando pero que se eluyan independientemente de estos. Básicamente, la

cantidad de cada componente presente en la muestra se determina mediante la

comparación de altura, el área o la masa del pico de dicho componente frente a la

altura, el área o la masa del pico interno. Sin embargo se debe tener en cuenta la

variación en la respuesta del detector entre compuestos de estructura química

diferente. Una manera de llevar esto a cabo es preparando, en primer lugar, un

conjunto de disoluciones patrones que contengan concentraciones variables del

compuesto o los compuestos de interés. Cada una de las disoluciones debe

contener una cantidad conocida y constante del patrón interno. Estas disoluciones
 patrones son cromatografiadas y se mide la altura, el área o la masa de los picos.

Se calcula las proporciones de la altura, el área o la masa de los picos (compuesto

de interés/ patrón interno) y se representan gráficamente frente a la concentración,

para obtener curvas de calibrado tales como las mostradas en la figura 27.15b.

Para cada componente de la muestra que deba ser cuantificado se debe representar

gráficamente una curva de respuesta distinta. A continuación, se adiciona una

cantidad conocida del patrón interno a la muestra incógnita y se cromatografía la

muestra. Las proporciones (compuesto de interés/ patrón interno) de la altura, el

área o la masa de los picos son calculadas y utilizadas para leer, de la curva de

calibrado apropiada, la concentración de cada uno de los componentes

importantes. Las ventajas de utilización de patrones internos son que los

volúmenes de inyección no necesitan ser medidos exactamente y que no es

necesario que la respuesta de detector permanezca constante, puesto que cualquier

variación no alterara las proporciones. El principal inconveniente de la técnica de

patrón interno radica en la dificultad de encontrar un patrón que no interfiera

cromatograficamente con los componentes de interés contenidos en la muestra.

1.3.4.4 La cromatografía con fluidos supercríticos

La técnica de la cromatografía SFC fue mostrada por primera vez hace ya más de 40

años. Sin embrago, desde los años 1960 se ha invertido más esfuerzo en el desarrollo de

la cromatografía HPLC. Ahora que la HPLC ha alcanzado la madurez, hay un interés

creciente en la cromatografía SFC un fluido supercrítico es una que se encuentra por

encima tanto de su presión critica (pc) como de su temperatura critica (tc). (La

combinación de la pc y tc se conoce como el punto crítico). Un fluido supercrítico puede

ser formado a partir de un gas convencional aumentando la presión o bien de un líquido

convencional elevando la temperatura. Los fluidos utilizados habitualmente, tales como

el dióxido de carbono, se adquieren como gases licuados. El dióxido de carbono se utiliza

con frecuencia como fase móvil para la cromatografía SFC; no obstante, no es igualmente

bueno para los compuestos polares o los de peso molecular elevado. Para aumentar la

solubilidad de los solutos, mejorar la forma de los picos y alterar la selectividad, se puede

adicionar una pequeña cantidad de un disolvente orgánico polar, tal como el metanol, a

un fluido supercrítico apolar. (Tal modificador de la fase móvil se puede denominar un

agente de suspensión, o “entrainer”). Otros fluidos supercríticos que han sido utilizados

en las aplicaciones alimentarias incluyen el óxido nitroso, el trifluoro metano, el

exafluoruro de azufre, el pentano y el amoniaco.

Cuando se emplean como fases móviles, los fluidos supercríticos confieren propiedades

cromatograficas intermedias entre las cromatografías LC y GC. La elevada difusividad y

baja viscosidad de los fluidos supercríticos supone unos tiempos de análisis reducidos y

una resolución mejorada, en comparación con la LC. La cromatografía SFC ofrece un

amplio rango de la selectividad, puesto que k´ y α (véase la sección 27.3.4.3.3) pueden

ser alterados por medio de cambios en la presión y en la temperatura, así como por

cambios en la composición de la fase móvil y en la fase estacionaria. Además, la

cromatografía SFC hace posible la comparación de compuestos no volátiles,

técnicamente lábiles, que no son tratables por la cromatografía GC. La cromatografía SFC

puede ser llevada a cabo utilizando bien sea columnas empaquetas o bien capilares (cada

una de ellas requiere una instrumentación diseñada apropiadamente). En el caso de las

primeras, los materiales de relleno de las columnas son similares a los utilizados para la

HPLC. Como fase estacionaria propiamente dicha, o simplemente como soporte para una

fase estacionaria enlazada, puede servir pequeñas partículas de sílice hidratada, porosa,

de elevada área superficial (véase el capítulo 28). Han sido utilizados rellenos basados en

polímeros, aunque son menos satisfactorios debido a los largos tiempos de retención del
soluto. Generalmente, las columnas capilares están recubiertas con una película de

polisiloxano (-Si-O-Si), el cual es seguidamente enlazado cruzada mente para formar una

fase estacionaria polímero que no puede ser arrastrada por la fase móvil. Se pueden

utilizar polisiloxanos que contengan diferentes grupos funcionales, tales como metilo,

fenilo o ciano, para modificar la polaridad de esta fase estacionaria. La instrumentación

para la cromatografía SFC (de columna empaquetada) es semejante a aquella empleada

para la HPLC, aunque con una diferencia importante. Se utiliza un restricto (regulador de

presión) para controlar la presión a la salida del sistema. (Sin este dispositivo, el fluido se

expandiría para dar lugar a un gas a baja presión y de baja densidad). Además de las

ventajas de un tiempo de análisis reducido y una resolución mejorada, la cromatografía

SFC ofrece la posibilidad de utilizar un amplio surtido de detectores que incluyen aquellos

diseños para la GC.

La cromatografía SFC ha sido utilizada primordialmente para los compuestos apolares.

Chester y colaboradores (3) han revisado las aplicaciones recientes de la SFC. Las grasas,

los aceites y otros lípidos son compuestos a los cuales se aplica cada vez más la SFC. El

sustituto sin calorías para las grasas, Olestra, fue caracterizado por medio de la técnica

SFC-MS (espectroscopia de masas). Otros investigadores han ultimado la SFC para

detectar restos de pesticidas, estudiar compuestos térmicamente lábiles de entre los

miembros del genero Allium, fraccionar los aceites esenciales de los cítricos y

caracterizar compuestos extraídos del embalaje apto para microondas (3). Boch-Jensen y

Mollerup (1) han discutido la utilización de la cromatografía SFC en columnas

empaquetadas capilares para el análisis de los productos alimentarios naturales

especialmente los ácidos grasos y sus derivados, los glicéridos, las ceras, los esteroles, las

vitaminas liposolubles, los carotenoides y los fosfolípidos. Los resultados obtenidos por
medio de la SFC son comparados con aquellos procedentes de las cromatografías GC y

HPLC.

1.4 Resumen

La cromatografía es un método de separacion basado en el reparto se un soluto entre una

fase en movimiento, o móvil, y de una fase fija, o estacionaria. La fase móvil puede ser

un líquido, un gas o un fluido supercrítico, la fase estacionaria puede ser un líquido o un

sólido.