Para nuestro estudio se utilizara el moho que se desarrolla en las plantas del limón.

El moho es
un hongo que se encuentra tanto al aire libre como en lugares húmedos y con baja
luminosidad, este forma un recubrimiento velloso o filamentoso producido por diversos tipos
de hongos sobre el limón, que provoca su descomposición; formando una capa de color azul, o
verde generalmente.

Recolección de hongos

Ya que los cuerpos fructíferos de los microhongos son de vida corta, o bien crecen en épocas
definidas. Debido a estas características, una mayor frecuencia de los viajes de recolecta, en la
misma área, podrían proveer las mejores oportunidades para encontrarlos.

Según Mata, Umaña, Chaves, & Ruíz (2009) cuando se recolectan microhongos se debe
disponer de recipientes adecuados para transportar las colecciones al laboratorio como: bolsas
de papel de varios tamaños, algunos recipientes con tapa que podrían también ser útiles para
especímenes delicados, la lupa, una cortadora, un formón, mazo pequeño, una cuchilla y un
serrucho “rabo zorro”, serán suficientes.

Para recolectar la recolección se debe seguir los siguientes pasos:

 Encontrar el habitad especifico de los microhongos

 Observar detalles de los cuerpos fructíferos de los microhongo con una lupa 10X
 Recolectar el microhongo con la totalidad del organismo que lo contiene, de ser
posible, caso contrario se toma la parte que lo contenga.
 Registrar los datos de recolecta: localización geográfica, nombre del recolector,
sustrato (identificar cuando es posible), y fecha

Los especímenes deben ser examinados lo más pronto posible. Apuntes sobre la forma, color y
textura pueden cambiar cuando el espécimen se seca. “En algunos grupos de microhongos si la
revisión debe ser postergada, los especímenes deberán mantenerse frescos en una cámara
húmeda, que consiste en un recipiente limpio que puede ser cajas de petri o cajas plásticas con
tapa, con papel toalla húmeda en el fondo del mismo, al menos por menos de 24 horas, ya que
los especímenes pueden descomponerse” (Mata, et al. 2009).

Aislamiento de hongos

Mata, et al. (2009) sugiere que antes de comenzar a aislar los hongos, se debe esterilizar todo
el material que va a utilizarse; cajas petri, tubos de ensayo, etc., mediante autoclave e
instrumentos como escarpelos, pinzas y agujas deben sumergirse en alcohol de 95% y
flamearse, sin olvidarse de limpiar el área de trabajo con cloro (hipoclorito de sodio al 5% o
alcohol).

Se considera estas tres técnicas a utilizar para aislar los microhongos del fruto del limón:

Aislamiento directo: Algunas especies con cuerpos fructífero superficiales, como los peritecios,
pueden ser transferidos directamente a un medio con agar.
Cultivo de tejido: Algunos pueden ser aislados, colocando una porción del cuerpo fructífero en
un medio de cultivo. El tejido puede ser desinfectado y removérsele una capa externa con una
cuchilla estéril.

Hongos internos (endófitos): Semillas, hojas y tallos son buenas fuentes para tales hongos,
donde se toma parte del sustrato como del hongo y son transferidos al medio de cultivo.

Medios de Cultivo

Para el estudio fisiológico se utilizara medios sintéticos, debido a que la composición del medio
puede ser conocida, para esto se utilizara el medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

Según Mata, et al. (2009) para la preparación de los medios de cultivo se deben llevar a cabo
varios requerimientos:

Esterilización de material de cristalería, que incluye cajas de petri, tubos de ensayo, pipetas,
etc., mediante calor seco (de 150 a 160 C durante una hora) o autoclave.

Es necesario que el vaciado del medio de cultivo en cajas de petri, tubos de ensayo, etc., se
lleve acabo lo más asépticamente posible, ya sea en una sala de cultivo apartada o en un lugar
limpio y libre de corrientes de aire y polvo. La mesa de trabajo debe limpiarse con una solución
de cloro, las manos de la persona deben estar limpias y el material de laboratorio, para
impedir la introducción de microorganismos contaminantes.

Los diferentes medios de cultivo, previamente ya pesados y mezclados en agua estéril, se

preparan en erlenmeyers que posteriormente se tapan con algodón y papel de aluminio, se
colocan en una autoclave a 120°C y a 15 libras de presión durante 25 minutos. Los medios de
cultivo esterilizados se dejan enfriar durante cierto tiempo y posteriormente se vierten en las
cajas de petri. En caso de que al medio se le añada agar, se deberá dejar que este último se
solidifique para que el medio de cultivo pueda entonces ser utilizado para cultivar. Para que no
se contamine con bacterias se le agrega al medio de cultivo una solución antibiótica.

Método de aislamiento

Se utilizara el método de siembra directa, el cual se lleva a cabo introduciendo fragmentos de

la muestra que contiene el moho, en la superficie de la placa en el medio de cultivo, para
posteriormente observar el crecimiento micelial de los hongos presentes en las muestras
(Mueller, Foster, & Bills, 2004).

Identificación de género y posible especie

Observación microscópica

Técnica de cinta pegante

Se realiza un doblez de una tira de cinta de 4cm, con el lado adhesivo hacia fuera y se sostuvo
con pinzas. El lado adhesivo se presiona firmemente contra la superficie de la colonia del
hongo a estudiar. El micelio aéreo se une a la superficie adhesiva por lo cual es fácilmente
separada de la colonia. La tira de cinta con micelio aéreo se coloca en una gota de azul de
lactofenol, con un portaobjetos (Arias & Piñeros, 2008).
Montaje por disección

Para el montaje por disección se utiliza una aguja de disección para tomar una parte de la
superficie de la colonia que luego se depositó sobre una gota de azul de lactofenol. Con la
ayuda de otra aguja se extiende el preparado y se cubre con una lámina cubreobjetos, para
luego ser observada al microscopio con un aumento de 40X y 100X (Arias & Piñeros, 2008).

Empleo de claves taxonómicas

Una vez realizada la observación de las características morfológicas a nivel microscópico, se

confronta con las descripciones reportadas por los autores en la literatura sobre identificación
de hongos.