層析法

Chromatography
 What is Chromatography?
Chromatography is a technique for separating
mixtures into their components in order to analyze,
identify, purify, and/or quantify the mixture or
components.

• Analyze
Separate • Identify
• Purify
• Quantify
Mixture Components
 Uses for Chromatography
Chromatography is used by scientists to:
• Analyze – examine a mixture, its components, and
their relations to one another
• Identify – determine the identity of a mixture or
components based on known components
• Purify – separate components in order to isolate
one of interest for further study
• Quantify – determine the amount of the a mixture
and/or the components present in the sample
 Uses for Chromatography
Real-life examples of uses for chromatography:
• Pharmaceutical Company – determine amount of each
chemical found in new product
• Hospital – detect blood or alcohol levels in a
patient’s blood stream
• Law Enforcement – to compare a sample found at
a crime scene to samples from suspects
• Environmental Agency – determine the level of
pollutants in the water supply
• Manufacturing Plant – to purify a chemical
needed to make a product
 Definition of Chromatography
Detailed Definition:
Chromatography is a laboratory technique that
separates components within a mixture by using the
differential affinities of the components for a mobile
medium and for a stationary adsorbing medium
through which they pass.
 Definition of Chromatography
Terminology:
• Differential – showing a difference,
distinctive
• Affinity – natural attraction or force
between things
• Mobile Medium – gas or liquid that carries
the components (mobile phase)
• Stationary Medium – the part of the
apparatus that does not move with the
sample (stationary phase)
Definition of Chromatography

Simplified Definition:
Chromatography separates the components of a
mixture by their distinctive attraction to the mobile
phase and the stationary phase.
Definition of Chromatography

Explanation:

• Compound is placed on stationary phase

• Mobile phase passes through the stationary phase

• Mobile phase solubilizes the components

• Mobile phase carries the individual components a

certain distance through the stationary phase,
depending on their attraction to both of the
phases
 Illustration of Chromatography
Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixture Components

Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase

Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase

Black  
Red  
Yellow          
 Types of Chromatography
• Liquid Chromatography – separates liquid samples
with a liquid solvent (mobile phase) and a column
composed of solid beads (stationary phase)

• Gas Chromatography – separates vaporized samples

with a carrier gas (mobile phase) and a column
composed of a liquid or of solid beads (stationary
phase)
 Types of Chromatography
•Paper Chromatography – separates dried liquid
samples with a liquid solvent (mobile phase) and a
paper strip (stationary phase)

• Thin-Layer Chromatography – separates dried liquid

samples with a liquid solvent (mobile phase) and a
glass plate covered with a thin layer of alumina or
silica gel (stationary phase)
 Chromatography
• 字義：chroma為色素，graphy是記錄或畫圖，
即「色彩記錄」。

• 來源：1906年，俄國生物學家Tswett最早開
始使用此法，他是用一直立的玻璃圓筒，下
有出口，內裝碳酸鈣粉，於圓筒頂端置入綠
色植物抽出液，以石油醚當展開液，則石油
醚向下移動時，其所含之色素漸分離展開，
形成一層層的色素帶，因之將其命名為
chromatography，以後此類分離法稱為色層
分析法(chromatography)，統稱層析法。
a:吸附劑
c:管柱
e:流出物
f:分液漏斗
s:沖提液
w:脫脂棉
最初在S位置處被吸附的A、
B和C三種物質的混合物通
過適當溶劑s的沖提，分離
成為各個單獨的區帶。
• 層析法定義：
• 層析法是一種有效的物理分離方法，是根據
試樣混合物中各成分在不互溶的兩相（固定相與
移動相）中的吸附能力、分配係數、或其他親合
作用之差異，使其流速不同，作為分離的依據。
層析法可以解決一般分離方法，如：蒸餾、分餾、
萃取、再結晶等，不易分離的混合物之分離分析。
固定相(Stationary phase)：可為液體或固體，
固定在原來的地方，當移動相帶著試料通過
它時，二者即開始進行多次的分配或吸附作
用。

移動相(mobile phase)：可為液體或氣體，當
它通過固定相時，即與固定相進行多次之分
配、吸附作用，而分離物質。
 吸附層析法

吸附層析法(Adsorption chromatography)是利
用同一吸附劑對混合物中各種成分吸附能力
的差異，而使各成分達到分離目的的層析方
法。此法特別適用於脂溶性中等成分的分離。
 吸附劑
• 矽膠（Silica gel）：為一多孔性物質，微顯
酸性，其吸附能力稍弱於氧化鋁。可用通式
SiO2．xH2O來表示。顆粒表面具有很多矽醇
基，由於矽醇基能和許多化合物形成氫鍵而
具有一定的吸附作用，所以矽膠吸附作用的
強弱與矽醇基的含量多少有關。矽醇基還易
藉由氫鍵吸附水分，矽膠吸附的水分愈多，
吸附其他化合物的能力愈弱。假如吸水量超
過12%，吸附力就很弱已不能作為吸附劑了。
當加熱到100～110℃時即可除去絕大多數矽
醇基吸附的水，因而矽膠重新顯示吸附活力。
 溶劑
用吸附層析法分離天然產物成分時，溶劑
的選擇對有效成分的分離關係甚大。選擇
溶劑系統應將被分離物質的極性與吸附劑
的極性結合起來加以考慮。對於極性吸附
劑，溶劑的介電常數愈大，沖提能力就愈
強。對於非極性吸附劑，溶劑的沖提能力
恰與上述情況相反。
 應用
1.薄層層析(Thin Layer Chromatography, TLC)
2.柱層析法(Column Chromatography, CC)

△、□、○表示三種不同成分。
從Ａ到Ｄ四圖表示，三成分由於各自吸附能力不同，
與填充劑的吸附和去吸附的過程有所差異
Procedure：
1.配製沖提液(eluant)
ethyl acetate 30 ml
2.垂直固定乾且淨之管柱，關閥，加入5 ml沖提液，
放置少量棉花於管柱內底部，以玻棒輕搗固定。
3.取Silica gel 一包，加入裝有沖提液50 ml之燒杯中，
以玻棒攪拌成稀泥狀並趕出所有氣泡，將稀泥狀
之Silica gel完全倒入管柱中，使之沉降。(可重複
數次)
4.開閥，以錐形瓶承接沖提液，降至吸附劑表面時
停止（勿讓Silica gel表面乾涸）；用dropper吸取
沖提液，洗淨黏於管柱壁上之Silica gel。
5.用橡皮塞輕敲管壁，使Silica gel沉降緊密（可見
到沖提液回滲），漏出回滲沖提液，且立即關閥。
（重複直至Silica gel充填紮實）
6.以dropper吸取1 ml沖提液，沿管壁小心滴
加，使上層留一層沖提液。吸取1 ml
sample solution（約0.5 g溶於1 ml乙酸乙酯）
沿管壁小心加入，使完全留在Silica gel表
面。開閥，讓溶液被silica gel吸收。
7.小心加入大量沖提液於Silica gel表面上之
管柱中，開閥，調整適當流速讓黃色band
往下移動，此時需隨時添加管柱上方的沖
提液，勿讓silica gel表面乾涸。
8.以試管收集沖提液，每5 ml收集一根。
 Thin-Layer
Chromatography
Technique
 TLC Basics
• Qualitative
– Purity and possible identity by comparison only

• Adsorbent
– Coated on plastic, glass, or aluminum
– Silica or Alumina
– Solvent and compounds travel up plate by capillary 
action

• Sample
– Microliters of solution spotted in single small spot
– Polar compounds stay near bottom; less polar at top
 Uses of TLC

• Purity
• Number of components
• Column Chromatography conditions
• Following reaction progress
• Preparative
 Advantages of TLC

• Simple
• Quick
• Inexpensive
• Sensitive
 Retention Factor, Rf value

• Distance traveled by the compound
Distance traveled by the solvent

• Mark solvent front immediately
• Outline visible spots with pencil
• Compound – measure from baseline to 
middle of spot
• Solvent – measure from baseline to solvent 
line
Compound A
 Spotting the TLC Plate

• Do not get greasy 
fingerprints on the 
plate
• Use pencil only
• Spot on baseline
• Avoid edges
 Developing Chamber

• Add solvent
• Check depth of 
solvent relative to 
baseline
• No filter paper or 
paper towel
展開液的高度0.3 cm
 Visualizing Results
• Mark solvent front
• Dry plate
• Circle visible spots
• UV light
• Circle UV spots
• Measure and 
calculate Rf values
 Apparatus

• Developing chamber 展開槽
• Capillary tube 毛細管
• TLC plate
 Reagents

• Standard solution A: p‐nitroacetanilide
• Standard solution B: p‐nitroaniline
• Sample solution: 水解實驗之產物（取少
許，約筆尖大小，以1 ml乙醇溶解）
• 展開液：ethyl acetate
 Procedure
• 取3片TLC plate
• 於距底部1 cm處，以鉛筆畫一baseline，
並標示出3點
• 如圖所示，以毛細管分別取取
standard solution A, standard solution B , 
sample solution（C）點and pure 
solution (D) 於plate上（spot 之直徑約
0.1 cm）
• 以吹風機吹乾spot（why?）
0.5 cm

x x x x x x x x x
0.6 cm

A A+C C B B+C C
A D B
 Procedure
• 於展開槽（須乾燥）中加入約5 ml乙酸乙酯，
注意高度不可高於baseline
• 將TLC plate置入展開槽
• 讓展開液向上展開
• 待展開至離上端1 cm時，則停止，取出立即
於solvent front畫記
• 於UV lamp下觀察，並以鉛筆畫出spot
• 計算standard A, B及sample之Rf值
A : 起始物

B: 產物
A : 起始物 C: 未純化的化合物

B: 產物 D: 已純化的化合物
A A+C C B B+C C A D B A D B

A : 起始物 C: 未純化的化合物

B: 產物 D: 已純化的化合物
 Homework

• 於TLC中，常見的固定相有哪些？極性大小為
何？各有何特性？

• 於TLC中，常見的移動相有哪些？極性大小為
何？各有何特性？

• 何謂Tailing？如何避免？