PRACTICA No.

ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA

(Lactuca sativa L.)

1. INTRODUCCIÓN

El efecto tóxico o la respuesta tóxica es cualquier cambio en el funcionamiento normal del organismo
que ha sido producido por la exposición a una sustancia tóxica, para este efecto se consideran
solamente los cambios irreversibles o que permanecen un periodo prolongado después de la
exposición. Para el efecto de toxicología ambiental las exposiciones se clasifican en exposiciones
crónicas, subcrónicas y agudas. Las exposiciones crónicas duran entre el 10 % y el 100% de la vida
del organismo, las exposiciones crónicas son menores al 10% del periodo vital y las exposiciones
agudas suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de 24 a 120 horas (1). El objetivo
de realizar pruebas de toxicidad aguda es identificar el potencial toxicológico de compuestos químicos
ya sean comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de pruebas son más factibles de hacer
debido a que el tiempo de exposición es corto.

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática de
toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de
compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el
desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la
evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la
elongación de la radícula y del hipocotilo (Figura 1). Es importante destacar que durante el período de
germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos
en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el
desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores
externos adversos. Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales
para la gran mayoría de las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a
partir de la aplicación de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o
plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente determinado
es de gran importancia para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluación del desarrollo de
la radícula y del hipocotilo, constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de
establecimiento y desarrollo de la planta.

A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la

elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de
compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes para
inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de
elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto.
De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo constituyen indicadores
subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información
complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación. Este ensayo puede ser
aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales
(lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e
industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al,
1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas
o plantas acuáticas sumergidas como organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite
evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin
necesidad de filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento y
simplificando el procedimiento de prueba.

Figura 1. Proceso de germinación y morfología de la semilla y la plántula de lechuga Lactuca sativa L.

2. OBJETIVO

Los alumnos evaluarán los efectos fitotóxicos de una solución que contiene un elemento contaminante,
en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas de lechuga (Lactuca
sativa L.) durante los primeros días de crecimiento.

3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

*Semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad mantecosa

Cajas Petri de 100 mm de diámetro
Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Regla u otro elemento de medición
Pinzas
Toallas de papel
Bolsas plásticas
 **Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro.

*Las semillas de lechuga se adquieren en establecimientos locales, procurando que sean

semillas sin ningún tratamiento (sin fungicidas o plaguicidas), con buen poder germinativo y baja
variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo.

**El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes
características: trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de
líquido; resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie sin
atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas; ausencia de
residuos tóxicos (por ejemplo, blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de hongos (no
asociados a las semillas).

4. METODOLOGÍA

De acuerdo al esquema de la figura 2, el procedimiento del ensayo de toxicidad que realizarás,

deberá seguir los pasos enlistados:
 Colocar en cada una de 6 cajas Petri numeradas (C1 …..C6) un disco de papel filtro.
 Colocar en las cajas 5ml de las siguientes diluciones:
 (evitando que se formen bolsas de aire).
C1. Control negativo1: agua dura reconstituida
C2. Control negativo 2: agua de crecimiento.
C3. Control positivo: 15 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C4. Solución problema 1: 2,5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C5. Solución problema 2: 5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C6. Solución problema 3: 10 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
 Etiquetar cada caja con los siguientes datos: solución, fecha y hora de inicio y término,
materia, grupo y equipo.
 Con la ayuda de una pinza colocar 20 semillas en cada caja, uniformemente distribuidas en
toda la caja. Tapar las cajas.
 Colocar las cajas en bolsas de plástico negras, para evitar la pérdida de agua por
evaporación y para no inhibir la germinación, debido a que las semillas son fotoblásticas
negativas.
 Incubar a 22 °C durante 120 horas.
 Realizar 3 repeticiones para cada ensayo.
 Figura 2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad
con semillas de lechuga Lactuca sativa L.

5. RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la inhibición de la elongación de la radícula, hipocotilo y de la
germinación (Figura 2). Como resultado final se espera obtener la CE50 o CI50 o % de inhibición. Los
valores serán aceptados si el porcentaje de germinación es superior al 90% en el control negativo.
I. Observar cuidadosamente cada caja y anotar cualquier indicador de fitotoxicidad como
necrosis, pelos poco desarrollados, radículas con crecimiento ensortijado. La necrosis
se manifiesta como manchas de color pardas, blancas o marrones.
II. Utilizando una regla medir la longitud de la radícula y del hipocotilo de casa plántula.
III. La medida de la elongación de la radícula se considera desde el nudo hasta el ápice
radicular.
Antes de cada medición se recomienda congelar las cajas y descongelarlas conforme se van
midiendo, el objetivo de la congelación y la descongelación es obtener las plántulas menos rígidas.
La medida de elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción de los
dos cotiledones.

6. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Para la expresión de resultados se realizarán los siguientes cálculos:
I. Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de
las plántulas de cada repetición.
II. Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el
promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación
del control negativo
III. Porcentaje de inhibición de la germinación
IV. Con los datos anteriores realizar una gráfica dosis-respuesta, colocando en el eje de
las ordenadas el porcentaje de inhibición y en el eje de las abscisas la
concentración.

Bibliografía:
Peña E. Carlos, Dean E. Carter y Ayala-Fierro Felix. 2001. Toxicología Ambiental:
Evaluación de Riesgos y Restauración Ambiental. Distribuido en internet vía Southwest
Hazardous Waste Program website http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/.
 PRACTICA No. 7

BIOENSAYO DE TOXICIDAD POR CONTACTO DE LOMBRIZ DE TIERRA (Eisenia foetida)

EN PAPEL FILTRO CONTAMINADO CON Cr

INTRODUCCIÓN

Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la toxicidad
de suelos contaminados (Dorn et al., 1998; Wilson et al., 2002). La lombriz más utilizada en México
ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei, las cuales pertenecen a la familia Lumbricidae. Estas
especies de lombriz son exógenas en México, pero de amplia distribución, fácil manejo y cultivo
(Fragoso, 2002). Su principal característica morfológica es la presencia de segmentos externos e
internos en su cuerpo, son hermafroditas y cuando son adultas se observa una protuberancia
epidérmica denominada clitelo, en el que se forman los capullos en los cuales son depositados los
huevos (Santamaría, 1996).

Esta especie se desarrolla bien a pH de 5 a 7 y a temperaturas de 20 a 28 ºC (Ramírez- Romero,

2008). El ensayo completo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: 1) prueba por contacto con
papel filtro y 2) prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado. En éste caso por
limitaciones de tiempo sólo se efectuará la primera parte. La prueba por contacto en papel filtro puede
ser utilizada como preliminar para determinar las concentraciones correspondientes a las que se tiene
que llevar a cabo la prueba con suelo, es fácil de realizar y da resultados reproducibles.

El presente ensayo se basa en la guía 207 de la OECD para la evaluación de sustancias (OCDE,
1984). La prueba por contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a sustancias de
prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial tóxico del compuesto
presente en el suelo. Esta prueba tiene una duración de 48 horas pero puede ampliarse hasta 72
horas.

Figura 1. Prueba con papel filtro con lombriz de tierra

OBJETIVO

Los alumnos evaluarán los efectos tóxicos de una solución de cromo hexavalente en papel filtro por
contacto con lombriz de tierra (Eisenia andrei) durante 48 horas.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

 * lombriz de tierra (Eisenia andrei)
Frascos de boca ancha tipo Gerber
Balanza
Pinzas, tijeras
Papel aluminio, tela, ligas
Tiras de papel de filtro de paso intermedio de 4.5 cm x 7 cm.
K2Cr2O7 grado reactivo Merck

*Las lombrices de tierra (Eisenia foetida) utilizadas en ésta práctica fueron una donación del
proyecto de la Dra. M Olivia Franco Hernández de la UPIBI-IPN

METODOLOGÍA

Para esta prueba se deben lavar los contenedores de vidrio con agua caliente y detergente, se deben enjuagar
y dejar secar. Cortar papel filtro con 4.5 cm de ancho por 7 cm de longitud depositarlo en el frasco. No debe
exceder del borde del frasco.

Se prepara la solución de K2Cr2O7 de trabajo. Se deposita 1 mL de diferentes concentraciones de esta solución

en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya homogéneamente, y se seca por rotación del
frasco con papel filtro. Después de secado el papel filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 mL de agua
desionizada o destilada (de acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro explicado previamente), cada
vial es tapado con tela (tipo organza) y con papel aluminio que se ha perforado para obtener orificios que
permitan preservar la humedad y facilitar el intercambio de aire.

Los controles son: papel filtro con agua desionizada.

Las concentraciones a emplear serán tres. Para cada tratamiento o nivel de concentración se preparan 10
replicas. Una lombriz se coloca en cada frasco, depositándola sobre el papel filtro húmedo. Antes de ser
colocadas en los viales, las lombrices son depositadas por tres horas en papel filtro humedecido, con la finalidad
de vaciar sus intestinos; después son lavadas y secadas. Los viales son colocados en forma horizontal en la
oscuridad, a una temperatura de 20 o 22± 2 C, durante un periodo de 48 horas. Las lombrices se consideran
muertas cuando no responden a ningún estimulo mecánico. Cualquier síntoma patológico se reporta.

RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la mortalidad y como resultado final se espera obtener la
CL50. Sin embargo, de no obtener dicha respuesta, cualquier cambio en el estado general de las
lombrices deberá ser reportado y concluir sobre los hallazgos de este efecto tóxico.

REPORTE DE LA PRUEBA
En el reporte del ensayo debe incluirse la siguiente información:
Los datos del compuesto que se probó
Las características del organismo de prueba, incluyendo la especie, condiciones de cultivo,
número de lombrices utilizadas por réplica
Las condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las condiciones de la misma.
 Los resultados del peso promedio de los organismos al inicio y final de la prueba. Así como
una descripción de cambios físicos o patológicos observados en los organismos

Los resultados del bioensayo deberán plasmarse en una gráfica en donde se comparen los datos de
todos los equipos que trabajaron con diferentes concentraciones del tóxico y se discutirá acerca de
los resultados y de la utilidad, ventajas y desventajas del bioensayo como prueba toxicológica.

Bibliografía:
 Dorn, P. B., T. E. Vipond J. P. Salanitro y H. L. Wisniewksi. 1998. Assessment of the acute toxicity of
crude oils in soil using earthworms, microtox and plants. Chemosphere 37(5):845-860.
 Fragoso, G. C. 2002. Las lombrices de tierra en México: diversidad, distribución y manejo. II
Simposium Internacional y Reunión Nacional Lombricultura y abonos orgánicos.
 Ramírez-Romero Patricia, Mendoza-Cantú Ania, 2008. Ensayos toxicológicos para la evaluación de
sustancias químicas en agua y suelo. La experiencia en México. SEMARNAT. Tercera parte:
ensayos en suelo. Ensayo de toxicidad aguda con la lombriz de tierra Eisenia andrei. Cuevas-Diaz
Maria del Carmen, Ferrera- Cerrato Ronald, Roldan-Martin Adriana, Rodriguez-Vazquez Refugio. pp:
209- 224.
 Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxicity
tests. Guideline for testing of chemicals N° 207 (consultado en abril de 1984). OCDE, París, 9 pp.