“AÑO DEL DIALOGO Y LA RECONCILIACION

NACIONAL "
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO FORENSE

DE ADN DE CABELLO, TEJIDO Y HUESO
CURSO:

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

PROFESOR:

JAIME CHAMOCHUMBI MIGUEL ANGEL

TESIS
INTEGRANTES: PARA OBTENER EL TÍTULO
TORIBIO VASQUEZ,PROFESIONAL
CESAR SALAZAR
DE PALMA, DIEGO
BIÓLOGO
LEON ALAYO, ALFREDO RUMAY SALDAÑA, DIANA

VASQUEZ VILLANUEVA, KATHERINE RUIZ AGURTO, SILVANA

FLORES TORIBIO, ALEXANDRA PEREZ ALCANTARA, SEBASTIAN

SANCHEZ BOBADILLA, BEATRIZ DEL AGUILA CASTAÑEDA, YOLVI

CASTRO ALVILDO, ELSITA CACERES PEREZ, ROCIO

CICLO: 6
TRUJILLO – PERÚ- 2018
VI
 I. MARCO TEORICO:

 ADN
En 1953 Watson y Crick propusieron el modelo de doble hélice, para esto se valieron
de los patrones obtenidos por difracción de rayos X de fibras de ADN.

Este modelo describe a la molécula del ADN como una doble hélice, enrollada sobre
un eje, como si fuera una escalera de caracol y cada diez pares de nucleótidos
alcanza para dar un giro completo.

FIG 1: modelo de la doble hélice

El modelo de la doble hélice establece que las bases nitrogenadas de las

cadenas se enfrentan y establecen entre ellas uniones del tipo puente de
hidrógeno. Este enfrentamiento se realiza siempre entre una base púrica con
una pirimídica, lo que permite el mantenimiento de la distancia entre las dos
hebras.
La Adenina se une con la timina formando dos puentes de hidrógeno y la
citosina con la guanina a través de tres puentes de hidrógeno. Las hebras son
antiparalelas, pues una de ellas tiene sentido 5’--- 3’, y la otra sentido 3’--- 5’.
 FIG 2: Pares de bases del ADN: La formación específica de
enlaces de hidrógeno entre G y C y entre A y T genera los
pares de bases complementarias

 Métodos de extracción :

Las fuentes de extracción de biomoléculas pueden ser muy variadas:

Células o tejidos animales y vegetales, microorganismos, cultivos celulares,
etc.
A menos que se trate de una biomolécula extracelular (liberada al medio), las
células o tejidos deben romperse para extraer la biomolécula de interés.
Esta ruptura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar la extracción
inútil de biomoléculas contaminantes.
Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las
biomoléculas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones
secundarias por oxidación, hidrólisis (proteólisis), etc. Se han desarrollado una
amplia gama de métodos de disrupción (ruptura) celular, que se pueden
clasificar como:
a) Métodos Físicos:

Mecánicos: Homogeneización: con tubo y émbolo, por trituración o

agitación con abrasivos, a alta presión o extrusión por presión.

No mecánicos: Choque osmótico, ciclos de congelación -

descongelación, sonicación.

b) Métodos químicos:
Tratamiento con álcali, solventes orgánicos, detergentes, sustancias
caotrópicas.

c) Métodos biológicos:
Enzimáticos: Lisozima (para bacterias gram positivas, principalmente),
glucanasas, quitinasas (para levaduras y mohos).

 Lisis:

• El rompimiento o lísis celular es el primer paso para obtener el DNA

genómico.
• Varias técnicas son utilizados para provocar lísis celular.
• Entre ellas se encuentran:
– lisis hipotónica
– lisis enzimática.

 Lisis hipotónica

Se utiliza una solución hipotónica que causa la hinchazón de la célula

y el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular.

Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a

degradar los lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e.
Tween 20 y Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y
detergentes iónicos i.e. SDS para células con pared celular o
cutícula externa que la protege)

En algunos casos es necesario utilizar un poco de fuerza mecánica

(homogenizadores y nitrógeno líquido).

 Lisis enzimática. :

Parecida a la lisis hipotónica. Se utilizan las mismas soluciones y

detergentes anteriormente mencionados además de enzimas que
catalizan la reacción.
 La función principal de la enzima es la degradación de los
peptidoglicanos presentes en la pared celular (i.e. bacterias Gram
positivas). Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran
lisozima y proteinasa K.

Posterior a la lisis hipotónica y la lisis enzimática se realiza una

extracción fenólica.

Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el

DNA.

El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases

separadas cuando se tratan de mezclar. Cuando la solución acuosa
de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo las proteínas se mueven
a la fase orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el
DNA en la fase acuosa. La fase acuosa con el DNA se remueve y el
DNA es precipitado utilizando etanol y sales.

 Métodos de extracción de ADN de huesos.

1) PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro"
que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.

Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de

un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización,
apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa
termoresistente.

La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno

correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o
alineación y una de elongación.

a. Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la

mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.

b. Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para

permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio
donde encuentran una secuencia complementaria.

c. Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la

enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA.
La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena
complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar
cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente
aumenta al doble.
 Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se
encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas,
la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes
cantidades de fragmentos de ADN humano a una velocidad muy
superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se
aplica para estudios de identidad y filiación.

FIG 3: Esquema de PCR

2) ESPECTROFOTOMETRIA UV
• La espectrofotometría es usada para identificar compuestos por su
espectro de absorción y conocer la concentración de un material o
sustancia, permitiendo conocer la concentración de compuestos y
determinar enzima y proteínas o ácidos nucleicos.
• Un espectrofotómetro es un equipo de laboratorio que mide la cantidad
de luz que pasa por medio de una longitud de onda especifica. La
cantidad de luz absorbida por un medio es proporcional a la
concentración del soluto presente. Las muestras en estos equipos se
utilizan en estado liquido y se colocan en el compartimiento de las
muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y materiales.

3) ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse
sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel
o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel),
o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se
use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las
moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN
recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y
separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del
experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el
análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte
un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya
disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo,
mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como
el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera
dependiente de la masa molecular de la proteína.

FIG 4: Esquema de electroforesis

 II. EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO FORENSE DE ADN DE
CABELLO, TEJIDO Y HUESO

RESUMEN
El kit de extracción de tejido y pelo (para uso con ADN) proporciona un enfoque
simple y rápido para procesar muestras de tejido y cabello y conduce sin
problemas al protocolo del sistema de ADN para purificar y liberar de
inhibidores de la pcr en un formato manual o automático. Un protocolo y
reactivos personalizados también están disponibles para extraer rápidamente
ADN del hueso.

INTRODUCCIÓN

Recientemente se han desarrollado nuevos protocolos que utilizan el sistema

DNA IQ para la extracción y el aislamiento de ADN de muestras de cabello,
tejidos y huesos. El sistema DNA IQ, que utiliza nuevas partículas
paramagnéticas para purificar el ADN, tiene un fuerte agente desnaturalizante
que interrumpe muchos tipos de muestra en preparación para la purificación de
ADN. Este enfoque se ha aplicado a sangre líquida, a sangre sobre diversos
materiales y a otras muestras, como hisopos bucales y de saliva, y
espermatozoides y células epiteliales extraídas diferencialmente.
El tampón de lisis de ADN de ADN no lisa las células en el interior de las
masas de tejido, incluido el pelo y los huesos, por lo que se requiere un
tratamiento con proteínas K para garantizar la lisis completa. El kit de
extracción de tejido y pelo y los reactivos personalizados para la extracción de
ADN para el hueso se diseñaron para facilitar el preprocesamiento de estas
muestras difíciles antes de la purificación del ADN con el sistema DNA IQ.
Estos pasos de preprocesamiento no aumentan significativamente el tiempo
"práctico" del usuario y aún proporcionan las capacidades de extracción y
aislamiento del sistema DNA IQ para eliminar los inhibidores de la pcr y
administrar el ADN para su uso en ensayos posteriores. La figura 1 muestra el
enfoque modular de este sistema e ilustra cómo algunos pasos adicionales de
preprocesamiento para un conjunto diverso de tipos de muestras fluyen en el
protocolo estándar DNA IQ.

EXTRACCIÓN DE ADN DEL CABELLO

El pelo es un tipo de muestra común descubierto en escenas del crimen, pero

el pelo presenta un problema para los forenses porque, a medida que se
elimina el pelo, el ADN genómico sufre una degradación programada. Como
resultado, el procesamiento del ADN nuclear del cabello con frecuencia no
tiene éxito. La tasa de éxito puede aumentar ocasionalmente con los folículos
pilosos del pelo despojado si los pelos no se lavan, ya que las células
epiteliales se unen con frecuencia a los folículos y contienen ADN genómico no
degradado. Sin embargo, se puede observar la contaminación del ADN
genómico de las huellas dactilares en el tallo del cabello. El sistema de ADN IQ
elimina pequeños fragmentos de ADN, que actúan como inhibidores de la pcr,
por lo tanto, los resultados de la amplificación obtenidos usando este sistema
pueden mejorarse sobre ADN extraído mediante métodos orgánicos estándar.
La figura 2 muestra los resultados de la amplificación usando el sistema
powerplex 16 y DNA genómico extraído por el kit de extracción de tejido y pelo
seguido de purificación con el sistema DNA IQ. La figura 2A muestra las alturas
de pico equilibradas en una amplificación de ADN aislado de un folículo piloso.
La figura 2B muestra la amplificación de ADN aislado de un segundo folículo
capilar del mismo individuo procesado al mismo tiempo. Este patrón muestra la
pérdida de los loci más grandes típicos de la degradación programada.

La purificación y el análisis de la secuencia de las regiones hipervariables del

ADN mitocondrial de los tallos capilares, que en general son ricos en ADN
mitocondrial, ofrecen un enfoque alternativo pero menos discriminador. El uso
de concentraciones muy altas de proteínas K y ditiotreitol (DTT), como se
describe en el boletín técnico # TB307 del kit de extracción de tejido y cabello,
digiere efectivamente los tallos del cabello en una hora y permite la fácil
purificación del ADN mitocondrial utilizando el sistema DNA IQ en el formato
manual o automatizado. La figura 2C muestra la amplificación de la región
hipervariable 2 de la mitocondria extraída de un tallo capilar utilizando el
protocolo del kit de extracción de tejido y pelo seguido de purificación con el
sistema de ADN IQ.
 Figura 2.

PROTEINASA K
En biología molecular , Proteinasa K (proteasa K , endopeptidasa K ) es una
serina proteasa de amplio espectro.
La enzima fue descubierta en 1974 en extractos del hongo Engyodontium
album (anteriormente Tritirachium álbum ) .
La proteinasa K es capaz de digerir el cabello (QUERATINA), de ahí el nombre
“Proteinasa K ”. El sitio predominante de escisión es el enlace peptídico
adyacente al grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos y aromáticos con grupos
amino alfa bloqueados. Se usa conmumente por su amplia especificidad. Esta
enzima pertenece a la familia Peptidase S8. El peso molecular de la proteinasa
K es de 28.900(28.9 kDa).
Actividad enzimática de Proteinasa K.
Activada por el calcio, la enzima se digiere las proteínas preferentamente
después de aminoácidos hidrofobicos (aminoácidos alifáticos aromáticos y
otros hidrófobos). Aunque los iones de calcio no afectan su actividad
enzimática , si contribuyen a su estabilidad. Las proteínas son completamente
digeridas si el tiempo de incubación es largo y la concentración de proteasa lo
suficientemente alta. Tras la eliminación de los iones de calcio, la estabilidad de
la enzima se reduce , pero su actividad proteolítica permanece . La proteínasa
K tiene dos sitios de unión para 𝐶𝑎2+ , que se encuentran cerca del sitio activo,
pero no están directamente involucrados en el mecanismo catalítico. La
actividad residual es suficiente para digerir proteínas, que generalmente
contaminan las preparaciones de acido nucleico. Por lo tanto, la digestión con
proteinasa K para la purificación de acidos nucleicos generalmente se realiza
en presencia de EDTA ( inhibición de enzimas dependientes de calcio tales
como nucleasas).

Aplicaciones de la proteinasa K .
 La proteinasa K es muy útil es el aislamiento de ADN O ARN altamente
naturales y no dañados , ya que la mayoría de las ADNasas y ARNasas
microbianas o de mamíferos son inactivadas rápidamente por la enzima
particularmente en presencia de 0,5-1% de SDS. Purificacion de ADN
genómico a partir de bacterias ( minipreparacion ): las bacterias de un
cultivo liquido saturado se lisan y las proteínas se eliminan mediante un
digerido con 100 ug/ml de proteinasa K durante una hora a 37° C.

 La proteinasa K frente a proteínas nativas es estimulada por

desnaturalizante tales como SDS . Por el contrario, cuando se miden
usando usando sustratos peptídicos, los desnaturalizantes inhiben la
enzima . La razón de este resultado es que los agentes
desnaturalizantes desplieguen los sustratos proteicos y los hacen mas
accesibles a la proteasa.

Ditiotreitol (DTT).

El DTT de Thermo Scientific ( DL-Ditiotreitol, reactivo de Clelands ) ,se

usa para estabilizar enzimas y otras proteínas , que poseen grupos
sulfhidrilo libres . Se ha demostrado que restaura la actividad perdida por
la oxidación de estos grupos in vitrio. La DTT reduce cuantitativamente
los enlaces disulfuro y mantiene los monotioles en un estado reducido.
EXTRACCIÓN DE ADN DE MUESTRAS DE TEJIDO
Las muestras de tejido son bastante raras en el trabajo forense, pero se
encuentran, especialmente en casos de incendios provocados o desastres
masivos. En algunos casos, una muestra de referencia disponible es una
muestra embebida en parafina y fijada en formalina. El kit de extracción de
tejido y pelo se desarrolló para procesar estas muestras difíciles de modo que
el ADN se pueda purificar fácilmente con el sistema de ADN IQ. Pequeñas
cantidades de tejido fresco, 1 mg o menos, dan los mejores resultados y no
requieren picada antes de la digestión con proteínas K. Muestras de hasta 25
mg han sido examinadas y pueden requerir picada para ayudar a alterar el
tejido y extraer el ADN. Las muestras severamente comprometidas, tales como
las expuestas a temperaturas elevadas, presentan dificultades de acceso. Gran
parte de la ADN puede degradarse y la proteína puede alterarse hasta el punto
de ser resistente a la digestión con proteínas K. en estos casos, el mejor
enfoque es picar. La muestra para exponer la mayor cantidad de tejido posible
y para usar grandes cantidades de tejido. Además, el tiempo de digestión debe
aumentar ya que la proteína adicional competirá en grandes muestras por los
sitios de unión a ADN de la resina IQ de ADN y reducirá la recuperación de
ADN.
Debido a que el sistema de ADN IQ aísla una cantidad consistente pero
limitada de ADN, las muestras que contienen cantidades muy grandes de ADN
microbiano serán menos adecuadas, ya que el ADN microbiano competirá con
la pequeña cantidad de ADN humano por unirse a la resina ADN IQ. El uso de
tres veces la cantidad normal de resina IQ de ADN puede reducir este efecto.
La figura 3A muestra el perfil de una muestra de tejido de 1 mg extraída con el
kit de extracción de tejido y pelo, seguido de purificación de ADN con el
sistema de ADN IQ y amplificación con el sistema powerplex 16.
Se han desarrollado protocolos para el aislamiento automatizado de ADN del
tejido para la estación de trabajo de automatización de laboratorio biomek 2000
de beckman coulter y se han utilizado con éxito en laboratorios forenses. La
muestra de tejido embebida en parafina y fijada con formalina plantea
problemas adicionales, ya que el ADN y la proteína con frecuencia se
entrecruzan. las secciones delgadas de este tipo de muestra pueden
procesarse fácilmente y no necesitan ser desparafinizadas cuando se percibe
una digestión excesiva de proteínas K. la adición de dos volúmenes de tampón
de lisis de DNA IQ disolverá la muestra de tejido. La amplificación del ADN
purificado del tejido embebido en parafina y fijado a formalina es
frecuentemente exitoso, pero el éxito depende en cierta medida del tiempo de
fijación. Doblar el tiempo de extensión para cada ciclo de amplificación puede
ayudar a aumentar el equilibrio interalelico si se observa inicialmente un
desequilibrio grave. La figura 3B muestra el perfil genético del ADN purificado a
partir de una sección de 10 μm de tejido embebido en parafina fijado a
formalina.
 Figura 3.

EXTRACCIÓN DE ADN DEL HUESO

Aunque no es un tipo de muestra común en la mayoría de los laboratorios, el
hueso se encuentra con la frecuencia suficiente como para justificar un
protocolo estándar. Los científicos de promega han colaborado con un
laboratorio externo para proporcionar un protocolo y reactivos personalizados
que permiten la purificación rápida del ADN del hueso utilizando la digestión
con proteínas en un tampón descalcificador, seguido de una pequeña
modificación del protocolo del sistema DNA IQ. El tampón de incubación /
solución de proteínas K proporcionado en el kit de extracción de tejido y pelo
no extraerá eficientemente ADN de muestras de hueso. El protocolo óseo se ha
probado en restos de fosas comunes bajo diversas condiciones del suelo, lo
que puede afectar profundamente la calidad del ADN. Al igual que con otros
tipos de muestras, la resina DNA IQ elimina fragmentos de ADN muy
pequeños, que son la causa de la inhibición de la pcr, lo que lleva a mejores
resultados de amplificación. La figura 4 muestra el perfil genético del ADN
aislado del hueso encontrado en un sitio de fosas comunes. Nuestros reactivos
óseos personalizados y el sistema DNA IQ se usaron para el aislamiento de
ADN, y la amplificación se realizó utilizando el sistema powerplex 16.
CONCLUSIÓN
El kit de extracción de tejido y pelo proporciona un procedimiento para disolver
masas de tejido en tubos individuales o en placas de 96 pocillos. Para procesar
muestras óseas, se requieren los reactivos de extracción ósea personalizados
relacionados.