Universidad Nacional Autonoma de Mexico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan

Oligoanalizer y Ejercicios.

2014
Flores Reyes Josiff Samuel
Diseño de Primers, MultiPlex,

Asesoras:
M. en C. Maritere Domínguez Rojas
p.BQD Larisa Andrea González Salcedo

Bioinformática
Grupo: 2001
 Primer-BLAST
Seleccionando la secuencia de mRNA CDS completo del gen CTLA4 en la especie
H. sapiens.

Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds

GenBank: AF414120.1
GenBank Graphics
>gi|15778585|gb|AF414120.1| Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete
cds
CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG
TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC
CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA
CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCA
GCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAA
GCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCT
ACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGT
GAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTAC
CCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAG
ATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCAC
AGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCC
CCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGA
AGAAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTT
ATTTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGT
GTACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTC
AGTGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGG
AATGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTT
ACGTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAA
TGTATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTA
TTGCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTAATTTGA
TAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTATATGGC
AGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAGGTAGAA
CACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGGAATTGT
GCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGGAAGCCA
CAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGAGACCCA
CAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATGCCATGG
ACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTGTGTTTT
TAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTGTGGTGG
TCGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Se introdujo la secuencia en aparatado de Primer-BLAST donde se mostró
primeramente el rango de la secuencia nucleotídica.

Al dar clic en Search summary se muestran los parámetros con los que se especificó
la búsqueda de cada cebador propuesto a continuación. Como se parecía se
revisaron 310,279 blast para obtener los mejores cebadores de la secuencia.

Formato Graphics de los primeros 5 primers obtenidos, la secuencia en azul es la

región que se reproducirá del gen, al selecciona uno se desliza hacia su información
específica que se mostrara a continuación.
 Primer par de primers propuestos, se aprecia su información en una tabla de fácil
lectura, estos datos se deben de analizar para determinar el de mejor elección.

Tabla de los 5 primeros Primers que proporciona Primer-BLAST, también se

muestran sus respectivas características, de rojo las secuencias que se deben de
evitar en los primers para evitar estructuras secundarias, y de verde las bases que
se deben de buscar para brindar estabilidad en este extremo.
Start Autocom Autocom Longi
Primers Secuencia 3´-5´ Caden Lon Sto Tm CG plemntari plemntari otud
a git p % dad
Homodim
dad
Heterodi
del
produ
molde ud eros meros cto

Forward TGAAGACCTGAACACCGCTC Plus 20 126 145 59.97 55 2 1 228

Reverse CGCACAGACTTCAGTCACCT Minus 20 413 394 59.97 55 6 1
Forward AGGTGACTGAAGTCTGTGCG Plus 20 394 413 59.97 55 6 2 739
Reverse GGCTGTGCCATTCCCTAACT Minus 20 1132 1113 60.03 55 3 1
Forward CTGAAGACCTGAACACCGCT Plus 20 125 144 59.97 55 2 2 303
Reverse ATCATGTAGGTTGCCGCACA Minus 20 427 408 60.04 50 5 3
Forward AGTTAGGGAATGGCACAGCC Plus 20 1113 1132 60.03 55 3 3 725
1837 1818
Reverse CTGCTGCCTTCTTCTGTCCA Minus 20 59.96 55 3 2
Forward TGTGCGGCAACCTACATGAT Plus 20 408 427 60.04 50 5 3 150
Reverse CATGAGCTCCACCTTGCAGA Minus 20 557 538 60.04 55 6 2
Para seleccionar el mejor Primer se deben de considerar aquel par que cumpla la
mayoría o las mejores condiciones, los parámetros Start y Stop nos indican la
localización de los primers forward y reverse y es importante ver si entre estos se
encuentra la región especifica del gen a amplificar; la dirección de la cadena molde
cuando es positiva nos indica que la secuencia va de 3´ a 5´ y negativo es de 5´ a
3´. Asi como la estabilidad de las cadenas en el extremo 5´ y no en 3´, recordando
que la estabilidad esta conferida por la cantidad de C y G debido a que requieren
una mayor energía para su separamiento. Este análisis es sencillo a comparación
del posterior con Oligo analyzer. Otros aspectos a considerar se resumen en la
siguiente tabla.
Longitud ideal de 20 a 25 Cualquiera de los primers mostrados en la
nucleótidos tabla cumple con las condiciones de
longitud.
Porcentaje de G/C entre 40% y Todos entran dentro del rango oscilando en
60%. un contenido del 50%
La diferencia entre la temperatura
a la que se abren las cadenas de Todos presentan Tm muy similares donde
DNA (55≤Tm≤75), de los primers su diferencia es de décimas.
forward y reverse no debe de ser
mayor a 5°C.
No se deben formar regiones 2ª Las energías libres de Gibbs de
internas Autocomplementaridad son mayores a 2
(Mientras menor sea la por lo que no se llevan a cabo reacciones
autocomplementaridad mayor espontaneas para la formación de
probabilidad de formar estructuras secundarias, al igual que la
estructuras secundarias) complementariedad en 3´ son mayores que
mientras que a mayor 1, y nos indica que no reaccionan los
complementariedad en 3´ indica primers entre sí.
la probabilidad del
emparejamiento de los primers.
Región 5´más estable Todas presentan guanina y citosinas en el
extremo 5´, confiriéndole estabilidad, sin
embargo los más estables son los pares 1
y 4.
Evitar más de 3 bases C o G En los primeres 1 y 2 se presentan 3 bases
seguidas en extremo 3´ seguidas de GC lo que no es conveniente,
al igual que en el 5 que no están l extremo
pero es un tetrámero de Gy C.

Considerando el anterior análisis podemos determinar que el mejor par de primers

es el par 4. El resumen de sus características se presenta en la tabla.

Ahora esta secuencia se analizara con oligo analyzer para poder determinar de
forma más especifica la posible formación de estructuras secundarias así como la
interacción entre los primers.
 Oligoanalizer nos muestra información
similar a Primer-BLAST indicándonos la
secuencia del primer a analizar, su
complementaria, la longitud de 20pb así
como el porcentaje de GC, peso molecular
y temperatura de fusión las cuales son
similares a lo reportado anteriormente, el
coeficiente de extinción molar es una
constante física derivada de la ley de
Lambert- Beer relacionada con la lectura
espectrofotométrica de la secuencia a
260nm. Los datos de concentraciones
sirven como referencia de estándar donde
4.95nmoles de oligonucleótido al
disolverse en 1ml de volumen resulta una
absorbancia de 260nm, sirviéndonos como
referencia de pureza del oligonucleótido, al
igual que los 30.65µ los cuales fueron
derivados del coeficiente de extinción
molar.

Debajo encontramos una sección sobre anotaciones sobre la temperatura de fusión

para que sea preciso como:

 Se deben de usar oligos de 8 a 60 pb de longitud

 Solución buffer neutra (7≥Ph≥8)

 Concentración de Sodio (1.5mM≥Na+≥1.2M)

 Concentración de Magnesio (0.01mM≥Mg++≥600mM)

 Concentración de Trifosfatos (dNTPs≥120% de la concentración de catión

divalente)

Al analizar la secuencia con la opción Hairpin (Horquilla) nos muestra las posibles
estructuras de horquilla que se pueden formar del primer forward. Indicándonos que
son 3 diferentes a temperaturas de 45-61°C.
Al analizarlo con self-dimer y Hetero-dimer podemos obtener información sobre
predicciones en la formación de estructuras secundarias posibles u oligonucleótidos
hibridados que pueden suceder a una temperatura determinada. Es importante
examinar que no se formen estructuras secundarias porque podrían causar
problemas en experimentos de hibridación como son la PCR produciendo errores
significativos. La estructura con menor energía libre es la que más predomina en
solución debido a que reacciona de manera más espontanea.

El delta G se calcula tomando en cuenta la sección de la secuencia con mayor

número de bases complementarias, representándose con una línea que las une.

El valor que corresponde a la secuencia analizada presenta un delta G, pequeño

indicándonos la posibilidad de formar estructuras homodimericas, como lo muestra
a continuación.

Sin embargo ninguna presenta estructuras

dimericas complejas, donde a lo mucho se
ven involucradas 3 bases, y no representan
mucho espontaneidad, debido a la energía
libre de Gibs tan baja.

A diferencia con Hetero-dimer se analiza la secuencia pero en comparación con otra

secuencia de primer, eligiendo preferencialmente al reverse, para evaluar la
formación de estructuras heterodimericas.

Pero este análisis también se puede realizar entre otras secuencias de primers
ajenas al par, como en el diseño de una PCR multiplex y analizar la interacción entre
cada cebado, aunque existen otras herramientas que proporcionan esta información
más sencilla para múltiples cebadores.
 Primer Forward

Primer Reverse

Debajo nos muestra cada una de las interacciones entre los primers que pueden
suceder y el Delta G correspondiente así como el número de pares de bases
involucradas.

En el apartado Mismatch podemos alterar las bases de la secuencia del

oligonucleótido y predecir la termodinámica de las moléculas de DNA que contiene
el cambio comprado con el original para estimar la discriminación y falta de
coincidencia en el diseño de sondas para detectar SNPs.
 Primer3
Para el análisis de esta herramienta, emplearemos otro tipo de secuencia debido a
que sobre esta se tienen registrados los Polimorfismo de un solo nucleótido SNPs.
Aportando la ventaja de seleccionar de forma más rápida el cambio (región roja).

Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated protein

4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2
NCBI Reference Sequence: NG_011502.1
GenBank Graphics
>gi|224809308:5003-11175 Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated
protein 4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2
CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG
TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC
CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA
CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGGTGAGTGAGACTTTTG
GAGCATGAAGATGGAGGAGGTGTTTCTCCTACCTGGGTTTCATTTGTTTCAGCAGTCAAAGGCAGTGATT
TATAGCAAAGCCAGAAGTTAAAGGTAAAACTCCAATCTGGCTTGGCTGGCTCTGTATTCCAGGGCCAGCA
GGGAGCAGTTGGGCGGCAGCAAATAAGGCAAAGAGATAGCTCAGAACAGAGCGCCAGGTATTTAGTAGGG
GCTTCATGAATGCATGTGAGTTGGTTTAGTAGAGAGACACAGGCAATTTCAGACCCTTCTATGAGACTGG
AAGTGATTTAAGAGGGAAAGGATAGCCATAGTCCTGAATACATTTGAGCTGGGTTTCAGGATGAGCTCAC
AAGTTCCTTTAAAAAAAATTGACTTAAGCAAATCCTGGGAAGAGTTTTTTTGCTATACAATTCAAGGTTT
TAAGGTCCTCGGATTCATATACTTTATAAATGAATTAGCCAGCTTGTTTAAAATGTAGGGAAATTGTGGG
AAGAATGCCTTCTTTACTTAATTCAAGGTTTTAAGGTTCTCTTAATCAATTCTACTAGCTAATTAGCCAA
TTATTTAAAAATAAAAGTTTGAAATTGCCAAAAAAAAAAGACAAGGAAAAGGAAAGAAAGAAAGCCACCA
GTCTGTTTGGCATACAATACTTAATTGTTGCCTGACCTACGTGTGGGTTTCAGATGCAGATCCTCAGTTT
TCAGCTCTTCAGAGACTGACACCAGGTTTGTTACACGGCTTAAAATGATGAGTATATCCATTGAATCTCA
ACCTTATCTCTCTCTAGACCTTCTTGGTTAAGAAACCATGTAGTTTGTATGAAGTAGGTACTCAAAAGAT
ATTTGATGATTTAATTTTTACTGGAGAAGAAATATTCATATATGTTTTCTTATTTTTACATGTTTTAAAT
ATGTAAAGATTAAATAAACACTCTTAGAAGTATTTAAATTTCCTAAAGTAAATTTATCTCAACCAGTAAC
AGGACCCTCCCAATACTGGAAAGTTGAGTGTGACCGCATTTAGTGGTGATGAGTGTGAGCTTGCTTGGGG
AGAGGGCAGGACATTTAGGATTTCTTAAGCTTAGAGTCAATACAATAAAGATTATTGAGTGCTCACTTGG
GTGGGCTATAATCACTGCTCACAGGAGTTCATGAACCACAAGTAAAAGAGTGAGGAGATATGATTAGCTC
ACAAATAACTTTAATACAGAGCAGAAAGTAATGAACTACTGCAATGGAGTTATCACAGTGCTAAGGATGC
TCAGAGGGCATCTCTGATAGGCAGAGGTGAGGGTTAGGGAAGGAAGCTGTAGTCTAGCTAGCTAGAGCTG
CTGGAATAGACATGACAATGGCTGCTGCCAAACTGTTTTCTCTTCTGAGGACAGATGTCCCGTGCAAGTG
GCTTGGTGGAAGGGACTAGTGTCTCTAATATAGGGTGATTTATAAGCAGGAAAGTGTGTCCTAGAAATTC
AGACCAGAGTGATAGATTGGAATTGGATCATGGGGGACTCATTGAATGTTATTTATTGTATTTGTTTTTG
CGATCAGTGTTAGTAAAGTGTCAAAGGGATTGAGCAGATGAGTGACATCATGCAACACAAGTTTTGAGTT
TCACTTGTCAGACTGACTGGAGAGGGGCCTGGTTAGTTACAGGAAGGTAATTTGGCATGCAGCCACTATT
TTTGAGTTGATGCAAGCCTCTCTGTATGGAGAGCTGGTCTCCTTTATCCTGTGGGAAAAGAGAACAAAGG
AGCATGGGAGTGTTCAAGGGAAGGAGAAATAAAGGGCAGAGAGGCAGCGGTGGTGTCAGGGGAAGCCCAC
AGGAGTTAACAGCAGGGTTGCCTCAACCTAGAGAGGAAGCGACCTGGTGCCCTCGGCTCTGTGGCTTCCT
TCATCTAACAACATCTTCCACTCTACAACAATGCCAGGGAAGGCGGAGGCTGGTACAGTGCATCAAGACA
CAGCTACTCCTGGGTGACAGAGGTTCAGGGCCAGCTCACTAAGTAGGCAGAAGTTTTTGACATATACTTT
GAGAGATAAAGCAAGATTCTGTACCTCAACCTTCAGAATTTCCCCTACCACTCATTATAGTTCCGGAGCT
ATATAGCTCCTATCATTCTATCATAACCTTAGAATACCAGAGAACATATCATCTCATCTAATTATCTCTT
ACTATATGTGAAAAAAATGAAGGACATGGGGGAAGTGTGACTTGCCCCAAATCACATATTTCATGGTAGA
GCCAGGTCTTCTGTTTGTCATATCAGTGTTCTTCCTGCCACAACCATCTTGAAGAATCTATTTCTCAGTA
AGAAAATATCTTTATGGAGAGTAGCTGGAAAACAGTTGAGAGATGGAGGGGAGGCTGGGGGTGTGGAGAG
GGGAAGGGGTAAGTGATAGATTCGTTGAAGGGGGGAGAAAAGGCCGTGGGGATGAAGCTAGAAGGCAGAA
GGGCTTGCCTGGGCTTGGCCATGAAGGAGCATGAGTTCACTGAGTTCCCTTTGGCTTTTCCATGCTAGCA
ATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATG
CATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGT
CTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCC
AGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGG
TGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGGTGA
GCAAAGCCATTTCACTGAGTTGACACCTGTTGCATTGCAGTCTTCTATGCACAAAAACAGTTTTGTTCCT
TAATTTCAGGAGGTTTACTTTTAGGACTGTGGACATTCTCTTTAAGAGTTCTGTACCACATGGTAGCCTT
GCTTATTGTGGGTGGCAACCTTAATAGCATTCTGACTGTAAAATAAAATGATTTGGGGAAGTTGGGGCTC
TCGCTCTGGAGTGCTAACCATCATGACGTTTGATCTGTACTTTTGATATGATATGATGCTCCTGGGGAAG
TAGTCCCAAATAGCCAAACCTATTGGTGGGCTACCCATGCAATTTAGGGGTGGACCTCAAGGCCTGGAAG
CTCTAATGTCCTTTTTTCACCAATGTTGGGGAGTAGAGCCCTAGAGTTTAAAACTGTCTCAGGGAGGCTC
TGCTTTGTTTTCTGTTGCAGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCA
GTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGGTGAGTGTGG
TGCTGATGGTGCACCATGTCTGATGGGGATACCTTTAGTGGTATCAACTGGCCAAAAGATGATGTTGAGT
TTAGTGTTCTTGAGATGAGATGAGGCAATAAATGAAGAGGAAGGACAGTGGTAAAGAACGCACTAGAACC
GTAGGCATTGGCATTTGAGGTTTCAGAATGACTAATATTTTAGATGAATTTGTTTGACATTGAATGTTCA
TGTGCTTCTGAGCAGGGTTTCAATTTGAGTAACCGTTGCAATAACATGGGGCAGCTGTTTTGCTCTTTGT
CTTCATGACAACTGTACTTAAGCTAACAGCCCTGAAACATGAGATTAGGCTGGGCAGAATGCTGCTAGAG
AGGACCACTTGGATGGTCTTTATTCTCCTTCTCCATGTCCCTCTCCATCACCTGGAAGTCACCTCTGGGT
GCCACTCTGGTGCCTTCCTTGTCGAAGCTGTAGCTGCTCACATGACACCTATCCCTGTTATCCAGTTTGC
TTGACTGGGACGTTTTGCCTTCCCCTTCAGCCAGGAAGTGAAAGTCCCAGTTTTTATTTATCACAGGTGT
TGGTATTGGTGGTAGAAGAGGTAGAATTATGGAATCAGGCCTCCTGTCAGGATTTCTTTTTGACAGTCCC
TCTCAGACACCTCTGCCTAAGGCCAGCTTTGCCATTACAAACTCTCCCTTCTCCCTCTCTCCCTTCTTCT
CTTCCTCTTCCTTCTTCTCGCTCTTTCTCTCTCTCTCTTTCTCCCTCTCTGTCTCTTATACACATACACA
AAGATATACTCTATTCCAACATCCTCTACCCAACCTGACAGAGATGTCCTTTGCTGTAGGTTCAGCAGTG
GGGATGAGAAATACAGCTCTCAAACAGGATAACTAAAGCTTATTATCTTATCAAGCTTGTTCCCTTGCAG
ACAAGATTGATCAATTATCATAGGCTTTCTGGGTGTTCTTTCTGAAGCTTTCTCAAAGTCTCTTTCTCCT
ATCTTCCATTCAAGGCAAATGATTGCCATTTAACATCAAAATCACAGTTATTTATCTAAAATAAATTTTA
ATAGCTGAATCAAGAAAATCTCCTGAGGTTTATAATTCTGTATGCTGTGAACATTCATTTTTAACCAGCT
AGGGACCCAATATGTGTTGAGTTCTATTATGGTTAGAAGTGGCTTCCGTATTCCTCAGTAGTAATTACTG
TTTCTTTTTGTGTTTGACAGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCCCC
AACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGAAG
AAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTTAT
TTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGTGT
ACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTCAG
TGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGGAA
TGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTTAC
GTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAATG
TATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTATT
GCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTA
ATTTGATAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTA
TATGGCAGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAG
GTAGAACACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGG
AATTGTGCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGG
AAGCCACAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGA
GACCCACAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATG
CCATGGACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTG
TGTTTTTAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTG
TGGTGGTCGTTTT

Para ejemplificar el uso de Primer 3, se empleó la RefSeq del cromosoma 2, debido

a que bajo esta secuencia se encuentran reportadas los SNP de interés, aunque
bien se podría analizar en el CDS del mRNA del gen CTLA4, solo que se debería
de considerar la posición, el SNP se encuentra en la posición 204, y es una cambio
de una Adenina por una Guanina, el cual está asociado al padecimiento de diabetes
tipo1 (OMIM, 2013)

Una ventaja que presenta esta herramienta a diferencia de otras es que permite
usar símbolos dentro de la secuencia para seleccionar áreas de interés, regiones
de exclusión, inicio obligado del cebador así como final.

Lo cual en opinión propia es más fácil de colocar, distinguir e interpretar, es

importante remarcar que primer 3 y primer plus son muy parecidos en cuanto a su
interfaz.
 Región de interés

left primer >

right primer <

Como podemos observar las condiciones que deben de cumplir los oligonucleotidos
son corretas ya que su longitud es de ambos de 20pb, asi como las temperaturas
de fusión son muy cercanas en ambos, el porcentaje de GC es adecuado, tampoco
hibrida consigo mismo ni con el otro primer así como tampoco forma estrcturas
secundarias según el analisis proprocionado por Primer 3, el producto es de 246pb
donde se encuentra la region de interes que es la Adenina en la posicioón 204.
Posteriormente nos porporcionanan mas opciones de oligonucleotidos, para poder
elegir el mejor.

Analizaremos el primer par de oligonucleotidos para anaizarlos con Oligo analyzer

y asi determinar si nos se forman estrcuturas secundarias.

Left primer Rigth primer

TTGGATTTCAGCGGCACAAG TGGAATACAGAGCCAGCCAA

Debido a la energia libre de Gibs reportada para cada estructura podemos decir que
no se forman estrcturas homodimericas ni heterodimericas.
 Primer3Plus
Para ejemplificar su uso se trabaja con la misma secuecnia que la anterior (Refseq
CTLA4).

Donde se selecciona la misma secuecnia donde se encuentra el Polimorfismo de

un solo nucleotido que esta relacionado con la Diabetes Mellitus tipo1, siendo la
sustitución de una Adenina por una Timina. Los cebadores propuestos por Primer
3Plus son los siguientes:

Longitud ideal de 20 a 25 Ambos miden 20 pares de bases.

nucleótidos
Porcentaje de G/C entre 40% y Ambos entran dentro del rango siendo de
60%. 50%
 La diferencia entre la temperatura
a la que se abren las cadenas de Sus temperaturas se encuentran dentro del
DNA (55≤Tm≤75), de los primers rango y su diferencia es de 0.8 grados
forward y reverse no debe de ser Celsius.
mayor a 5°C.
No se deben formar regiones 2ª No se forman estructuras secundarias
internas homodimericas de ninguno de los primers,
(Mientras menor sea la tampoco interaccionan los cebadores entre
autocomplemtaridad mayor sí.
probabilidad de formar
estructuras secundarias)
mientras que a mayor
complementariedad en 3´ indica
la probabilidad del
emparejamiento de los primers.

Debajo se observa dentro de la secuencia nucleotídica de azul el forward primer o

primer izquierdo y de verde el reverse primer o primer derecho, de verde se subraya
la secuencia de interés dentro de la cual se contiene la Adenina en la posición 204.

Posteriormente tabein muestra mas opciones de pares de primers para seleccionar

el mejor, este analisis con Oligo analyzer ya no se hara puesto que es lo mismo que
con Primer-BLAST y Primer3.
 Oligo Analyzer
La base de datos de IDT, permite aparte de hacer el uso de la herramienta de Oligo
analyzer asi como de sus otras calculadoras muy utiles en el labor técnico de la
genética, también permite proponer oligonúcleotidos a partir de la secuencia
analizada, seleccionando PCR 2 primers.

Como resultados primero nos muestra de forma grafica las secciones de los primers
para observar las regiones que se reproduciran.

Debajo se muestran los conjuntos de primers que propone oligo analyzer, donde
apreciamos que ocilan entre los 20 pares de bases, siendo la Tm de todos de 62°,
y el porcentaje de GC es en todos menor a 50, por lo que de primera instancia todos
son buenos candidatos, la diferencia aquí radica en la sección del gen a reproducir,
ya que de forma similar a Primer-BLAST, nos porporciona regiones aletorias de
amplificación.

Los conjuntos de primers se muestran sin la apreciacion de la secuencia de

oligonucleotido, pero si proporciona la longitud del producto a replicar.
Cambiando la selección de la secuecnia a replicar, se colocó que se desea que
entre la region del SNP relacionado con Diabetes mellitus (nucleotido en la posición
204), por lo que las regiones en verde indican las secciones a reproducir.

Posterioremnete el analisis de cada uno de estos indica nuevamente que cualquiera

se puede elegir, ya que la Tm es adecuada, la longitud y el porcentaje de GC igual,
por lo que solo resta hacer el analisis con Oligo analyzer.
Tomando el conjunto de primers que presentan el producto de mayor tamaño es
decir el conjunto 3, se analiza dando click en ver detalles de ensayo, donde se abre
una ventana que muestra las secuencias del primer sentido y del antisentido, asi
como sus caracteristicas que son buenas para ser primers.

Primer Forward

El primer forward si presenta reacciones de autocomplemnetaridad, a tempraturas

de fusion intermedias, sin embargo estas no son muy estables y no causan mayor
problema.

Primer Reverse

Presenta 4 posibles estrcturas pero que no se alcansan a formar debido a que no

se presentan espontaneamente.

En el analisis de Hetero dimeros mostró que no reaccionana los cebadores enttre si

no forman estrcturas secundarias.
 MP primer
Se trato de diseñar una PCR multiplex para las variantes del gen CTLA4 que son 2,
sin embargo al introducir las secuencias a MPprimer, marcaba error. Se decidio
trabjar una PCR con distintos genes que predisponen la enfermedad celiaca, tema
con el cual se incio la investigación del gen CTLA4.

Según la base OMIM estos son los genes que predisponene la enfermedad Celiaca,
donde se trabajaron solamente con aquello que a nivel clínico se han vinculado con
la enfermedad y no solo in silico.

En esta imagen se muestran los numeros de identificacion de las secuecnias

empleadas, se introdujeron las secuecnias asi como algunas caracteristicas de
MPprimer.

A continuacion se muestra el resumen de los resultadosde los conjutnos de

cebadores propuestos por MPprimer, delante se aprecia un avlor de penalizacion el
cual es similar a un error producido por trabajar con estos primers, en la sigueinte
columna se aprecian la longitud de cada producto de amplificación donde en general
oscilan entre los 397, 759, 482 y 581 pares de bases. El último apartado son las
tempraturas de fusión de cada par de cebadores, es imporatante revisar que sean
similares entre todos y que encuentren dentro del rango optimo de Tm. Todos
cumplen con las caracteristicas señaladas.
Ahora seleccionando el primer conjunto de cebadores, ya que presenta la menor
penalización y las temperaturas de fusion son muy similares entre cada par de
primers con una desviación estandar de 1.3°C.

Se pueden descragar en 2 tipos de formatos el conjunto de primers pudiendo ser en formato

FASTA o en vista de Excel

>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_fp
TGCTTCCAGACACCAAGGGCCA
>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_rp
AGTCAGCCCTGGATGAAAGATGGA
>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_fp
TGAAGACCTGAACACCGCTCCCA
>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_rp
AGAATTGCCTCAGCTCTTGGAAATTGA
>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_fp
TGGGAGGCATGCTGAAGCCA
>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_rp
TCATCAAAGTCCGCCTGCTGCC
>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_fp
TGCTACTTCACCAACGGGACGGA
>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_rp
AGCACGAAGCCTCCAATGCCAC

Debajo de cada conjunto de primers esta la opción de determinar el contenido de

GC y numero de sitios de union entre todos los cebadores, asi como su longitud,
con la herramienta submit to MFEprimer, donde tambien podemos cambiar las
condiciones termodinamicas y observar su comportamiento.
Tambien nos permite ver las reacciones entre los cebadores y las secuencias,
colocando en una tabla a cada cebador e indicando las interacciones.

Otro dato importante es que detecta 5 productos de replicación, pero como uno se
repite, podemos asegurar que cada uno pertence a la expresion del gen de estudio.

A continuación se presentan los sitios de union de cada primer a la secuencia

correspondiente.
La opción Submit to PriDimerCheck perimte la evaluacion entre de los
heterodimeros con los diferetes cebadores.
Estas son todas las relaciones que se pueden producir entre los cebadores, la
mayoria no intervienen tantos enlaces, y sí se llegan a formar debido a las energias
libres de Gibs indican que reacción espontaneamente.

Por último encontramos la opción de submit to virtual electrophoresis que permite

seleccionar los pares de primers a evalar y observar un diagrma indicatio de lo que
sucederia si se correira la electroforesis, se puede modificar la concentración del
gel de agarosa 0.5 a 2%

La imagen del electrofotograma es de mucha utilidad ya que nos permite observar

si se van a diferenciar los productos de la amplificación asi como nos ayuda a
detemrinar el marcador de peso molclar adecuado, en este caso ese paramero no
se controla debido a que el programa lo asigna.

De acuerdo a los pesos de los replicados, podemos determinar que seria mejor un
marcador de peso molecular que valla de 100 en 100 debido a la carcania en el
peso.
Electroforesis virtual de 4 genes que predisponen a la enfermedad celiaca, en la
evaluacion de personas que presenten dicha enfermedad se tiene que presentar
teoricamnete la evidencia de las 4 bandas.

Peso Gen expresado

molecular
759 pb Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds
582 pb Human MHC HLA-DQ beta mRNA, complete cds
482 pb Homo sapiens mRNA for MYO9B variant protein, complete cds
397 pb Homo sapiens major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1
(HLA-DQA1), mRNA
 Ejercicio de repaso
Los genes housekeeping empleados como estandares internos que elegí son: a la
albumina y la cycplophilin debido a que ambos se encuentran en la espcie H.
sapiens y se presentan secuecniados en forma de mRNA ambos.

Homo sapiens albumin (ALB), mRNA

NCBI Reference Sequence: NM_000477.5
GenBank Graphics
>gi|215982788|ref|NM_000477.5| Homo sapiens albumin (ALB), mRNA
AGTATATTAGTGCTAATTTCCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTTGGC
ACAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTC
GTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT
GGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAA
GTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCC
TTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGC
AAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTG
GTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACT
TATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAA
AGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTT
CGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAA
GAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTC
CAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGAT
GACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCT
GTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTT
GCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTC
TTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGAC
TTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAA
AGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTT
GAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGT
CAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA
AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAG
AAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTT
CAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA
TATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC
AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCT
GCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGC
CTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGAT
CAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATT
TCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGT
ACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTG
TTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACT
CTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Para ambos se analizaron en Primer3Plus ya que se aprecio mayor claridad de lo
que se mostraba,

Se colocaron corchetes dentro de la secuecnia para la secuencia replicada fuera la

que pertence al CDS del gen, los cebadores se posicionaron adecuadamente.

El forward primer tiene un longitud adecuada de 19 pb, y su porcentaje de C y G es

un poco elevado pero entra dentro del rango, sin embrago se aprecia mayor
estabilidad en el extremo 3´ que en el 5´ sucediendo lo mismo con el reverse primer,
según la fuente no presenta reaccion autocomplemetaria. El reverse primer
presenta una adecuada longitud de pares de bases y porcentaje de GC, la
temperatura de ambos esta dentro del rango y estan diferenciadas por 3 decimas
permitiendo que los dos se cebadores se unan al mismo tiempo al alcanzar la
temperatura de fusion optima.

EL primer forward puede presentar un acoplaminto de orquilla efecto de la

complemnetaridad de sus bases, esto es un proceso espontaneo y se produciria a
61.1°C.
Tambien se pueden presentar reaccion de homodimerizacion de forma espontanea,
con enlaces fuertes en promedio 2 pares de bases.

Homodimeros
Heterodimeros

En cuanto a la formación de heterodimeros, hay dos que presentan un valor de delta

G muy bajo indicandonos que la reacción es muy espontanea y que seguramente
se produciran estas estrcuturas secundarias que interfiran en el proceso, sin
embargo a comparacion de otras dos opciones mostradas por Primer3plus
presentan menor cantidad de estructuras secuendarias.

Para la realizacion del los primers para Cyclpphilin empleé Primer3Plus, no

selecione ningun area en particular y me selecciono el mejor par de cebadores.

Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds

GenBank: AF022115.1
GenBank Graphics
>gi|29028315|gb|AF022115.1| Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds
CCACTGTCGCTTTTCGCCGCTTGCTGCAGCCATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTCGACATCACGGCCGAT
GACGAGCCCTTGGGCCGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTGCAGACAAAGTTCCAAAGACAGCAGAAAACTTTC
GAGCTCTGAGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGCTATAAGGGTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGATT
CATGTGCCAGGGTGGTGACTTTACACGCCATAATGGCACTGGCGGCAGGTCCATCTACGGAGAGAAATTT
GAGGATGAGAACTTCATCCTAAAGCATACAGGTCCTGGCATCTTGTCCATGGCAAATGCTGGACCAAACA
CAAACGGTTCCCAGTTTTTTATCTGCACTGCCAAGACTGAATGGCTGGATGGCAAGCATGTGGTCTTTGG
GAAGGTGAAAGAAGGCATGAACATTGTGGAAGCCATGGAGCGTTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGC
AAGAAGATCACCATTTCCGACTGTGGACAGCTCTAATTTCTTTTGACTTGCGGGCATTTTACCCATCAAA
CCATTCCTTCTGTAGCTCAGGAGAGCGTCCCTACCCCATCCTGCTCGCAATGTCCTGTAATCTCTGCTCT
CACTGAAGTCTTTGGGTTCCATATTTTCCTCATTCCCCTTCAAGTCTAGCTGGATTGCAAAGTTAAGTTT
ATGATTATGAATA

Donde la longitud de los primers son ideales, la temperatuura de fusion entra en el

rango, y su diferecnia es minima, el porcentaje de G y C es bueno, aunque indican
reaccion de autocomplementaridad. En el analisis con Oligo analyzer se
encontraron 4 posibles estrcturas que se producen espontaneamente pero no son
tan significativas.

Tambein inidca la formacion de homodimeros y heterodimeros, pero su delta G

indica que no son tan importantes, podiendo ser cebadores del gen.

Homodimeros
Heterodimeros