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INMUNOLOGÍA
VETERINARIA
INDICE
PRACTICA 2 DILUCIONES
PRACTICA 4 ELECTROFORESIS
PRACTICA 7 PRECIPITACIÓN
PRACTICA 9 AGLUTINACIÓN
PRACTICA 12 ELISA I
LITERATURA CITADA
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA
PRACTICA No. 1
DESARROLLO DE HABILIDADES
MATERIAL EMPLEADO DURANTE EL CURSO Y FORMA ADECUADA DE
UTILIZARLO.
INTRODUCCIÓN.
No Terminales ( N T )
OBJETIVO.
El alumno manejara con seguridad y eficiencia las diferentes tipos de pipetas para
utilizar en el laboratorio de inmunología veterinaria.
MATERIAL.
Pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml, 10 ml, terminales.
Pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml, 10 ml, no terminales.
Micropipetas
Micropuntillas
Tubos de ensaye
Caja de petri
gradilla
METODO.
1.- desarrollar diversas mediciones con todas y cada una de las pipetas
transfiriendo diferentes volúmenes.
2.- Con una pipeta añadir la cantidad necesaria de Soluciones para realizar de
acuerdo a las indicaciones del profesor:
PREGUNTAS.
PRACTICA No. 2
DILUCIONES
INTRODUCCIÓN.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 parte de soluto
1/3 - - - - - - - - - - - - - - 1 parte de soluto + 2 partes de diluyente (parte
totales de la dilución)
DILUCIÓN 1/3
PARTES VOLUMEN
1.- partes de soluto 2 ml.
2.- partes de diluyente 4 ml.
----- ---- --- ---------- - ---- -- ------------ -----
3 partes totales 6 ml. VOLUMEN
TOTAL
DILUCIONES SERIADAS.
Disminución de la concentración.
1/2 1/2
Disminución de la concentración.
1/3 1/3
1 ml SOLUTO
2 ml DILUYENTE
3 ml VOLUMEN INICIAL
Número de pozo 1 2 3 4
SOLUTO = 1 ml
DILUYENTE = 2ml
--- ---
Vol. Inicial 3 ml
1.5 ml de diluyente
(Volumen de recepción).
Número de pozo 1 2
Dilución en cada pozo 1/3 1/16
SOLUTO = 1 parte 1 parte SOLUTO
DILUYENTE = 2 partes 5 partes DILUYENTE
Número de pozo 1 2 3 4
Volumen de Transferencia 1.5 1.5 1.5
5) En todos los pozos deberá quedar el mismo volumen por lo que del último
pozo se desechará la misma cantidad que se ha estado transfiriendo. Al
volumen que queda en todos los pozos se le llama volumen final. (Figura 7).
Número de pozo 1 2 3 4
Pozo # 1: 1/3
Pozo # 2: 1/3 X 1/2= 1/6
Pozo # 3: 1/6 X 1/2= 1/12
Pozo # 4: 1/12 X 1/2= 1/24 (Figura 8).
Número de pozo 1 2 3 4
Dilución en cada pozo 1/3 1/6 1/12 1/24
Volumen de transferencia- - - - - - - - -1.5 ml
SOLUTO 1ml
DILUYENTE 2ml
Vol. Inicial 3 ml Volumen de recepción 1.5 ml
Volumen final 1.5 ml.
Número de pozo 1 2 3 4
Volumen de transferencia 0.3 ml.
SOLUTO = 1ml
DILUYENTE = 2ml
Vol. Inicial 3ml 2.7 ml de diluyente
(Vol. De recepción)
DILUCIONES EN PASOS.
Son diluciones que se realizan para obtener un soluto altamente diluido sin
importar las diluciones intermedias. Estas diluciones pueden por lo tanto ir o no
seriadas, p.ej.: para obtener la dilución 1/1536 se podría realizar una dilución
doble seriada comenzando con la dilución 1/3:
192
8 1536
73
16
0
Correspondiendo el cociente (192) a una de las diluciones intermedias, y el divisor
(8) a la dilución a realizar a partir de 1/192 (Figura 10 ).
1/8
1/192 1/1536
Dilución obtenida
En cada pozo 1/6 1/48 1/192 1/1536
Cantidades de:
Volumen
Total 3.0ml 8 ml 4ml 4.0ml
OBJETIVO.
METRIAL.
- microplacas
- micropipetas serológicas de 5 o 50 ml. simple.
- Micropipetas serológicas de 5 o 50 ml. multicanal.
- Micropuntillas serológicas de 5 o 50 ml.
- Agua (diluyente).
- Agua con colorante (soluto).
METODO.
PRACTICA No. 3
INTRODUCCIÓN.
Es muy importante tener siempre en mente que existe una obligación por
parte del investigador, en cuanto al cuidado de los animales para experimentación.
El investigador debe reducir al mínimo el dolor y la incomodidad así como evitar el
uso innecesario de estos animales.
Producción de antisueros.
Obtención de complemento.
Obtención de glóbulos rojos.
Preparación de antígenos.
Diagnóstico de enfermedades virales.
Realización de pruebas de seroneutralización, viabilidad, potencia e
inocuidad.
% ml
100 - - - - 100
1.5- - - - - - x = 1.5 ml del paquete de G.R. lavados mas
98.5 ml de SSF
-------
100.0 ml total
b) Preparación de 2 ml de una suspensión de G.R. al 3%
% ml
100 - - - - 2
3- - - - - - x = 0.06 ml del paquete de G.R. lavados
1.94 ml de SSF
-------
2.0 ml total
PREGUNTAS:
1.- Esquematice los resultados obtenidos al sangrar con y sin anticoagulante.
PRACTICA No. 4
ELECTROFORESIS
INTRODUCCIÓN.
La electroforesis es la separación de partículas en un campo eléctrico, la
cual depende de la carga neta de las moléculas y en menor grado de su tamaño,
el grado de migración de las proteínas también se ve influenciado por la fuerza
iónica del buffer de electrólitos y la naturaleza del medio de soporte usado.
20
La mayor parte de las proteínas del suero tienen una carga neta negativa a
un pH de 8 y migran al ánodo (+).
OBJETIVO.
Que el alumno realice una prueba de electroforesis, interprete el resultado
de la misma y describa sus aplicaciones prácticas en Medicina Veterinaria.
MATERIAL.
- Tiras de papel filtro.
- Tubos capilares.
- Pinzas de disección.
- Toallas de papel.
- Aplicadores.
- Imanes.
- Tinas de plástico.
Equipo:
- Cámara de electroforesis.
- Fuente de poder
- Densitómetro o espectrofotómetro.
Reactivos:
- Suero normal.
- Suero hiperinmune.
- Buffer para electroforesis pH 8.6
- Colorante de Ponceau S.
- Solución lavadora de ácido acético al 5%.
METODO.
1.- Activar las tiras de papel filtro depositándolas en el buffer unos minutos.
Manejar siempre las tiras con las pinzas de disección.
2.- Eliminar el exceso de buffer de las tiras colocándolas entre dos toallas de papel
secante sin llegar a secarlas. Es importante que las tiras se mantengan húmedas
durante toda la prueba.
3.- Llenar la cámara de electroforesis son buffer y colocar las tiras de papel filtro.
Para mantener las tiras en posición horizontal utilizar los imanes tipo flecha cuyo
vértice debe estar dirigido hacia los electrodos.
PREGUNTAS.
Figura 1.- (A) Visualización de las bandas proteicas de diferentes sueros después
de haber sido teñidas. (B) Lectura con el densitómetro que convierte las bandas
en trazos, los cuales indican porcentaje de cada componente.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA
PRACTICA No. 5
INTRODUCCIÓN.
OBJETIVO.
MATERIAL.
- 1 gradilla
- Cultivo de Escherichia coli. De 18 hrs.
- Tubo de ensayo estéril.
- 3 pipetas serológicas de 1 o 2 ml (1/100) estériles.
- 1 fco. De vidrio con 15 ml de SSF estéril.
- 1 fco. De vidrio con capacidad de 10 ml, vacío y estéril.
- 1fco. De vidrio con capacidad de 5 ml, vacío y estéril.
- 3cajas de petri con agar triptosa.
- 1 tubo de ensayo con tapón de rosca con agar triptosa.
- Suero Normal (SN).
- Suero Calentado (sc).
- Cinta adhesiva para identificar.
METODO.
1.- Rotular los frascos estériles y los tubos de ensaye estériles de la siguiente
forma:
ROTULO
- Fco. con capacidad de 10ml 1/100
- Fco. con capacidad de 5 ml 1/15000
- 3 tubos de ensaye est. SC, SN y control respectivamente
- 3 cajas de petri SC, SN y control respectivamente
2.- Con una pipeta estéril añadir la cantidad necesaria de SSF estéril para realizar
las siguientes diluciones:
3.- Con la misma pipeta añadir 0.1 ml del cultivo de Escherichia coli. Al frasco
con capacidad de 10 ml. Mezclar perfectamente bien y transferir de esta
dilución (1/100) 0.1 ml al frasco con capacidad de 5 ml para preparar una
dilución 1/5000.
5.- Con una segunda pipeta estéril añadir al tubo de ensaye rotulado SN
0.25ml de suero normal y con una tercera pipeta estéril añadir al tubo estéril
rotulado SC, 0.25 ml de suero calentado.
RESULTADOS.
2.- Explique por qué es menos eficaz la lisozima en bacterias Gran negativas.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA
PRACTICA No. 6
INTRODUCCIÓN.
AGENTES TERAPÉUTICOS.
AGENTES TERAPÉUTICOS.
AGENTES DE REHABILITACIÓN.
Una vez que el producto pasó las pruebas de control de calidad, se procede
a marcar el número de lote, fecha de elaboración del producto y la fecha de
caducidad en la máquina lotificadora.
PREGUNTAS.
PRECIPITACIÓN
INTRODUCCIÓN
Por su sencillez y sensibilidad las técnicas que estudian las reacciones Ag-Ac en
agar y medios líquidos son las más usadas.
El antígeno debe estar en solución o en estado coloidal para que sea capaz de
difundir a través del gel de agar para reaccionar con su anticuerpo.
TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN
MEDIOS LÍQUIDOS:
Difusión simple:
MATERIAL.
- 1 gradilla
- Tubos de ensaye
- Pipetas de 1 ml estériles (1/100)
- Caja de petri con agar y perforaciones
- Tubos capilares
- Pinzas y tijeras estériles
- Arena estéril
- Mortero y pistilo estériles
- Carnes y embutidos de diferentes especies animales (antígeno).- SSF estéril
- Antisueros específicos contra bovino, caballo, ave, cerdo, perro y ovino.
- Un trozo de plastilina.
MÉTODOS.
1) Dejar que por capilaridad ascienda el antisuero hasta 1/3 de longitud del tubo
capilar.
2) Hacer lo mismo con el filtrado preparado anteriormente (Prueba de
Ouchterloney), rellenando 1/3 más del tubo.
INTERPRETACIÓN.
RESULTADOS.
PREGUNTAS.
INTRODUCCIÓN
Esta prueba se basa en la precipitación de las inmunoglobulinas del suero por las
sales de sulfito de sodio, al ponerse ambas en contacto; se realiza con un mínimo
de equipo y constituye un método rápido de alta precisión capaz de ser usado en
condiciones de campo.
OBJETIVO
MATERIAL Y REACTIVOS:
PREGUNTAS
AGLUTINACIÓN
INTRODUCCIÓN.
El uso de cada una de estas pruebas se verá sujeto a diversos factores por
ejemplo, si en la zona donde está localizado el hato hay brucelosis, el tipo de
explotación, si se vacuna o no, procedencia de los animales, etc.
OBJETIVO.
MATERIAL Y MÉTODOS.
- Gradilla
- Tubos de ensayo.
- Pipeta serológica de 1 ml en 1/100
- Antígeno de Bang elaborado con Brucella abortus cepa 1119 S a una
concentración del 4%.
- Leche sospechosa.
PROCEDIMIENTO:
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
En una reacción negativa toda la muestra se observará del color del antígeno o
bien un anillo blanco en la superficie y el resto teñido.
Para determinar si los animales están o no infectados se deben de tomar una serie
de factores que pueden influenciar la prueba (ver anexo: “toma y envío de la
muestra, características de las pruebas de aglutinación y factores que pueden
influenciar las mismas”).
PROCEDIMIENTO:
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
PROCEDIMIENTO:
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
- Gradilla.
- Tubos de ensayo.
- Pipetas serológicas de 1 ml en 1/100.
- Antígeno elaborado con Brucella abortus cepa 119 S a una concentración de
0.045%.
- Suero sospechoso.
PROCEDIMIENTO:
Se realizan diluciones dobles en cuatro tubos añadiendo 0.08 ml, 0.04 ml, 0.02 ml
y 0.01 ml del suero sospechoso respectivamente y 2ml del Ag a cada uno de ellos.
Se mezclan y se dejan incubar a 370 C durante 24 a 48 hrs.
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
Una reacción positiva se observa cuando en el fondo del tubo se forma una nata y
el líquido sobrenadante está claro al agitarlo la nata se puede separar en grumos
que no se solubilizan. El título del suero corresponde a la última dilución en la cual
hubo reacción positiva.
Debido a que es una prueba más sensible que la prueba de huddleson, los títulos
de esta prueba generalmente se recorren una dilución más en relación a los
obtenidos en la de Huddleson.
Una reacción negativa es aquella en la que observamos un botón en el fondo del
tubo que al agitarlo se solubiliza o bien el líquido sobrenadante se observará turbio
sin la formación del sedimento.
Pruebas a realizar
PREGUNTAS.
INTRODUCCIÓN
A A ANTI B
B B ANTI A
AB AB --------------
O H ANTI A
ANTI B
Los grupos sanguíneos ABO y Rh al igual que los grupos sanguíneos Kell, Duffy,
Bombay, MN, en el humano están relacionados con las reacciones incompatibles
de individuos cuyo grupos sanguíneos eran “compatibles” al sistema ABO Rh., Así
mismo los Ac naturales pueden dar reacciones por transfusión sanguínea tanto en
animales como en el humano. Por esta razón es recomendable que antes de
realizar alguna transfusión se realice las pruebas cruzadas, que consta de dos
fases: a) fase mayor en la que se mezcla la sangre del donador con el suero de
receptor y una fase menor donde se mezcla el suero del donador con la sangre del
receptor. Por lo cual cualquier tipo de aglutinación que ocurre en cualquiera de las
dos fases no se debe realizar la transfusión.
El alumno interpretará los resultados para identificar grupos sanguíneos por medio
de la técnica de aglutinación en placa.
MATERIAL:
- Portaobjetos
- Lanceta estéril
- Palillos
- Antisuero, anti a, anti b, y anti rh
MÉTODO:
Pasos:
Interpretación*:
(Nota el uso del porta es de manera universal):
Ejem: (1) AB Rh +
(2) o Rh –
INMUNOFLORESCENCIA I
DIAGNÓSTICO DE RABIA
INTRODUCCIÓN
Es una de las enfermedades más antiguas y conocidas por el hombre data de 500
a.c., del cual su hospedador son los animales de sangre caliente, su importancia
en salud pública radica en que es una zoonosis de elevado % de mortalidad la
cual se transmite a través de la mordedura de animales infectados.
Se considera que México y Brasil son los países con mayor porcentaje de casos
de rabia urbana, en América así mismo Australia, Inglaterra, Uruguay y Hawái son
países considerados libres de esta enfermedad.
Diagnósticos:
CARACTERÍSTICAS:
Interpretación de la prueba:
En las improntas testigos positivas y las muestras problema con antígeno rábico,
se observan partículas de color verde manzana, o amarillo verdoso fluorescente
de tamaño diverso, algunas son como arena o polvo y otras por su dimensión
semejan a los corpúsculos de negri.
Histopatología:
Los signos aparecen a los 15-25 días por inoculación y son los siguientes:
hiperestesia, convulsiones, incoordinación, postración y muerte.
Después se debe hacer i.F.
Confiabilidad de las pruebas:
- Inmunoflorescencia 99 %.
- Histopatológico 60 80%
- P. Biológica 100 %
OBJETIVO:
MATERIAL:
Microscopio de inmunoflorescencia
Conjugado antirrábico
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta pasteur
Glicerina buferada
PROCEDIMIENTO:
- Tomar la muestra
- Hacer la impronta
- Fijar con acetona 60 min.
- Aplicar el conjugado (suero hiperinmune)
- Incubar 60 min., a 37 grados
- Lavar con pbs
- Lavar con agua destilada
- Observar con glicerina
PREGUNTAS:
ELISA I
(ENZIME LINKED IMMUNOABSORBENT ASSAY)
INTRODUCCIÓN
Los datos copilados en profile son diseñados en una gran variedad de reportes,
cada uno de esos reportes han sido destinados para dar uso una vez terminada la
información proveniente de ELISA para dar el estatus inmunológico completo de
las aves (en este caso en especial).
MATERIAL:
1. Placa de ELISA
2. Suero control positivo
3. Suero control negativo
4. Solución del conjugado (gota anti-chicken igg h&l)
5. Solución amortiguadora
6. Abts-peróxido de hidrógeno, sistema del substrato
7. Solución detenedora
8. Agua destilada
9-2 Micropipetas multicanales de alta precisión de 1-200 microlitro
10-2 Micropipetas de alta precisión de 1-200 microlitro
11-50 Micropuntillas puntillas desechables de 1-20 microlitros
12-50 Micropuntillas puntillas desechables de 20-200 microlitros
13- Microplaca
14- Espectrofotómetro
15- Equipo de lavado para ELISA
Importante
Procedimiento I
D-solución detenedora:
Diluir 1 ml de la sol. Concentrada en 4 ml de h2od.
(15 ml para una placa)
e-controles: (1:100)
Diluir 1:100 los controles positivos y negativos respectivamente con solución
amortiguadora.
(300 ml por control para una placa)
Procedimiento: II.
3. Agregar 100 microlitros del “suero diluido control negativo” en los pozos a2,
h10 y h12.
4. Agregar 100 microlitros del suero “diluido control positivo” en los pozos a1, a3
y h11.
5. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 50 microlitros pro pozo de los
sueros problema diluido de la placa dilución a la placa-ELISA cubierta de un
antígeno. (Dilución final de 1:100. Realiza con rapidez y mucho cuidado).
13. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 100 microlitros del “solución-
substrato” en todos y cada uno de los pozos de la placa de ELISA.
15. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 100 microlitros del “solución-
detenedora” en todos y cada uno de los pozos de la placa de ELISA.
16. Una vez disipadas las burbujas leer la placa en el lector-de ELISA, a 405nm.
PREGUNTAS: