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MANUAL DE

INMUNOLOGÍA
VETERINARIA
INDICE

PRACTICA 1 DESARROLLO DE HABILIDADES

PRACTICA 2 DILUCIONES

PRACTICA 3 MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y OBTENCIÓN DE


MUESTRAS SANGUÍNEAS

PRACTICA 4 ELECTROFORESIS

PRACTICA 5 MECANISMO BIOQUIMICO DE RESISTENCIA PRESENTES EN EL


SUERO

PRACTICA 6 PRODUCTOS BIOLÓGICOS DE VETERINARIO

PRACTICA 7 PRECIPITACIÓN

PRACTICA 8 PRUEBA DE PRECIPITACIÓN EN SULFITO DE SODIO

PRACTICA 9 AGLUTINACIÓN

PRACTICA 10 PRUEBA DE AGLUTINACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS


GRUPOS SANGUÍNEOS DEL SISTEMA AB, Y RH

PRACTICA 11 INMUNOFLORESCENCI I. DIAGNOSTICO DE RABIA

PRACTICA 12 ELISA I

LITERATURA CITADA
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

PRACTICA No. 1

DESARROLLO DE HABILIDADES
MATERIAL EMPLEADO DURANTE EL CURSO Y FORMA ADECUADA DE
UTILIZARLO.

INTRODUCCIÓN.

El uso adecuado del material de laboratorio es fundamental para el éxito


del experimento, ya sea un ejercicio de estudiantes o de un programa de
investigación. La eficacia del trabajo exige disponer de material convenientemente
preparado e identificado, bien ordenado para poder utilizarlo inmediatamente en
cualquier momento. Toda técnica debe ser cuidadosamente planeada,
preparando todo el material que se necesite.

Durante el curso será necesario el uso apropiado de pipetas y tubos de


ensayo en la gradilla, ya que de esto depende una medición exacta y manejo
ordenado de los tubos para obtener resultados confiables.

A continuación se describen algunos tipos de pipetas:

Tipos de pipetas Características

Poseen solo una graduación que indica su


Volumétricas o de transferencias capacidad total

Con subdivisiones de su capa Terminales.


Serológicas o de medida (de vidrio y de Cantidad total en décimas o en (T)
plástico). centésimas, indicadas en el extremo
superior o bucal.

No Terminales ( N T )

Micropipetas, simples Poseen graduación que indica su


capacidad parcial y total
Micropipetas multiples Poseen graduación que indica su capacidad
parcial y total
( T ) El volumen indicado en el extremo superior de la pipeta se mide hasta la punta.
( n t ) El volumen indicado en el extremo superior de la pipeta está señalado con una línea
arriba de la punta de la pipeta.

OBJETIVO.

El alumno manejara con seguridad y eficiencia las diferentes tipos de pipetas para
utilizar en el laboratorio de inmunología veterinaria.

MATERIAL.
Pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml, 10 ml, terminales.
Pipetas serológicas de 1 ml, 5 ml, 10 ml, no terminales.
Micropipetas
Micropuntillas
Tubos de ensaye
Caja de petri
gradilla

METODO.

1.- desarrollar diversas mediciones con todas y cada una de las pipetas
transfiriendo diferentes volúmenes.
2.- Con una pipeta añadir la cantidad necesaria de Soluciones para realizar de
acuerdo a las indicaciones del profesor:

PREGUNTAS.

1.- indica dos diferencias entre pipetas terminales y no terminales


2.- tres usos de las micropipetas en la inmunología veterinaria
3.- indica tres recomendaciones en el manejo y cuidado de las micropipetas.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA Y VIROLOGIA

PRACTICA No. 2

DILUCIONES

INTRODUCCIÓN.

Diluir un líquido o un sólido significa disminuir la concentración en forma


ordenada y sistemática, denominándosele soluto a lo que pretende diluir y
diluyente a la sustancia que sirve como medio dispersor.

Cuando al diluir un soluto en un diluyente (P. Ej. sal en agua) se obtiene


una dispersión molecular homogénea con nuevas características, se le denomina
SOLUCIÓN, pero cuando en la combinación no hay una dispersión molecular y
cada elemento conserva sus características propias (P. Ej.: glóbulos rojos en
solución salina fisiológica) se denomina SUSPENSIÓN.

Las diluciones se pueden expresar en forma de proporción (1:1, 1:2, 1:5,


1:6, 1:1000, etc.). En forma de cociente (1/1, 1/2, 1/5, 1/6, 1/100, etc.) o en forma
de cociente (10°, 2-1, 5-1, 2-4, 10-2, etc.). Las diluciones expresadas en forma de
cociente son las más utilizadas en el desarrollo de técnicas inmunológicas, ésta
indicada por el numerador y las partes totales que componen la dilución (soluto
más diluyente) que son indicadas en el denominador. Por ejemplo, en la dilución
1/3 el número 1 indica una parte de soluto y el número 3 las partes totales
correspondientes al soluto más el diluyente (Figura 1).

Figura 1 Dilución expresado en forma de cociente.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 parte de soluto
1/3 - - - - - - - - - - - - - - 1 parte de soluto + 2 partes de diluyente (parte
totales de la dilución)

A continuación se enlistan una serie de pasos para la obtención de las


diluciones únicas o iniciales, diluciones dobles seriadas, decuples seriadas y
diluciones en pasos.
DILUCIÓN UNICA O INICIAL.

1) Tomando el mismo ejemplo de la dilución anterior (1/3) en la que sólo se


hace referencia a partes y no a unidades específicas de volumen
(microlitros, mililitros, litros, etc.). Para calcular las partes de soluto y
diluyente de esta dilución, primero se necesita saber en qué volumen se
requiere preparar. Pongamos por ejemplo un volumen total de 6 ml, el
cual representa las partes totales que componen la dilución o sea el
soluto más el diluyente.

2) El segundo paso consiste en calcular el volumen de soluto. Como se


señala arriba, el denominador indica las partes totales de la dilución, por
lo tanto en la dilución 1/3 una parte es de soluto, al obtener la tercera
parte del volumen total (6 ml) se está determinado la cantidad de soluto
dividiendo 6 ml/ -3 = 2 ml de soluto (Figura 2).

3) El último paso es calcular el volumen del diluyente, esto de obtiene de la


diferencia entre el volumen total y el volumen del soluto: 6–2=4
ml de diluyente (Figura 2 ).

Figura 2. Ilustración de la dilución 1/3 haciendo referencia a partes y a


volumen.

DILUCIÓN 1/3

PARTES VOLUMEN
1.- partes de soluto 2 ml.
2.- partes de diluyente 4 ml.
----- ---- --- ---------- - ---- -- ------------ -----
3 partes totales 6 ml. VOLUMEN
TOTAL

DILUCIONES SERIADAS.

Existen diferentes tipos de diluciones seriadas, pero las más utilizadas en


Inmunología y Virología son las diluciones dobles seriadas, diluciones quíntuples
seriadas y las diluciones decuples seriadas.

Se llama DILUCIÓN SERIADA cuando se disminuye la concentración de un


reactivo en una serie de pozos a partir de la dilución del pozo anterior en forma
constante. Así en las diluciones dobles seriadas la concentración se disminuye al
doble de un pozo a otro, en las triples seriadas al triple cada vez de un pozo a otro
y así sucesivamente. Siendo la dilución correspondiente en cada pozo lo doble de
lo anterior en el caso de las dobles seriadas y el triple en las triples seriadas
(Figura 3).
Figura 3. Ilustración de Diluciones Seriadas.
DILUCIÓN DOBLE SERIADA

Disminución de la concentración.

1/2 1/2

Dilución 1/5 1/10 1/20


Obtenida 1/5 x 1/2 = 1/10
1/10 x 1/2 = 1/20

DILUCIÓN TRIPLE SERIADA

Disminución de la concentración.

1/3 1/3

Dilución 1/5 1/5 1/45


Obtenida 1/5 x 1/3 = 1/15
1/15 x 1/3 = 1/45

Es común utilizar las diluciones seriadas en pruebas serológicas en las que


se desea conocer la actividad biológica de anticuerpos (mínima concentración de
anticuerpos que poseen una determinada actividad).

DILUCIONES DOBLES SERIADAS.

A continuación se enumeran los pasos a seguir para obtener una dilución


doble seriada en 4 pazos de ensaye iniciado con la dilución 1/3 en volumen inicial
de 3 ml.

1) Calcular el volumen de soluto y diluyente del primer pozo (dilución inicial).

Cálculo: 3 ml – 3 partes = 1 ml de soluto


3 m – 1 ml = 2 ml de diluyente.

1 ml SOLUTO
2 ml DILUYENTE
3 ml VOLUMEN INICIAL

2) Calcular en los siguientes pozos la cantidad de diluyente, dividiendo el


volumen inicial entre 2 (por ser doble seriada ): 3 – 2 = 1.5 ml, a este
diluyente se le denomina volumen de recepción (Figura 4).
Figura 4. Ilustración de la dilución doble seriada.

Número de pozo 1 2 3 4

Dilución en cada pozo 1/3 1/16 1/12 1/24

SOLUTO = 1 ml
DILUYENTE = 2ml
--- ---
Vol. Inicial 3 ml
1.5 ml de diluyente
(Volumen de recepción).

3) A partir de la dilución inicial 1/3 se transferirá la mitad del volumen inicial


(1.5 ml) al pozo # 2 diluyéndose así al doble (Figura 5).

Figura 5. Ilustración de la transferencia de volumen de un pozo a otro.

Número de pozo 1 2
Dilución en cada pozo 1/3 1/16
SOLUTO = 1 parte 1 parte SOLUTO
DILUYENTE = 2 partes 5 partes DILUYENTE

En el pozo # 2 quedarán por lo tanto 1 parte de soluto original y partes de


diluyente que dan una dilución 1/6.

4) A continuación del pozo # 2 se transferirán 1.5 ml al pozo # 3, del pozo #3


al pozo #4 el mismo volumen. Este volumen constante que se transfiere de
un pozo a otro se le llama volumen de transferencia. (Figura 6).

Figura 6. Esquematización de la transferencia de volumen de un pozo a


otro.

Número de pozo 1 2 3 4
Volumen de Transferencia 1.5 1.5 1.5

5) En todos los pozos deberá quedar el mismo volumen por lo que del último
pozo se desechará la misma cantidad que se ha estado transfiriendo. Al
volumen que queda en todos los pozos se le llama volumen final. (Figura 7).

Figura 7. Esquematización del volumen final.

Número de pozo 1 2 3 4

- - - - 1.5 ml de volumen final - - - -


5) El último paso es calcular que dilución se tiene en cada pozo, en nuestro
ejemplo se trata de una dilución doble (1/2) por lo que quedaría:

Pozo # 1: 1/3
Pozo # 2: 1/3 X 1/2= 1/6
Pozo # 3: 1/6 X 1/2= 1/12
Pozo # 4: 1/12 X 1/2= 1/24 (Figura 8).

Figura 8. Esquema general de la dilución doble seriada.

Número de pozo 1 2 3 4
Dilución en cada pozo 1/3 1/6 1/12 1/24
Volumen de transferencia- - - - - - - - -1.5 ml

SOLUTO 1ml
DILUYENTE 2ml
Vol. Inicial 3 ml Volumen de recepción 1.5 ml
Volumen final 1.5 ml.

Como se observa en las diluciones dobles seriadas, el volumen inicial (3 ml)


es el doble del volumen final (1.5 ml). Esto es importante porque para realizar
alguna técnica serológica se da como referencia el volumen final requerido y a
partir de éste se realizan todos los cálculos.

DILUCIONES DECUPLES SERIADAS.

En estas diluciones también se calcula el volumen de soluto y diluyente de


la dilución inicial. El volumen de transferencia será una décima parte del volumen
inicial recibiéndola en 9 partes de diluyente, ya que la concentración se disminuye
10 veces de un pozo a otro.

A continuación se enumeran los pasos a seguir para obtener una dilución


decuple seriada en 4 pozos de ensaye iniciándola con la dilución 1/3 en volumen
inicial de 3 ml.

1) Calcular el volumen de soluto y diluyente del primer pozo.


Calculo: 3 ml – 3 = 1 ml de soluto
3 ml – 1 ml = 2 ml de diluyente

2) Calcular en los siguientes pozos el volumen de transferencia (que es una


décima parte del volumen inicial) y el volumen de recepción (que son 9
partes del volumen inicial). (Figura 9).
Figura 9. Esquematización de una dilución decuple.

Número de pozo 1 2 3 4
Volumen de transferencia 0.3 ml.

SOLUTO = 1ml
DILUYENTE = 2ml
Vol. Inicial 3ml 2.7 ml de diluyente
(Vol. De recepción)

Dilución en cada pozo:


1/3 1/30 1/300 1/3000
1/3 x 1/10 =
1/30 x 1/10 =
1/300 x 1/10 =
este tipo de diluciones se emplea principalmente cuando se quiere
determinar la actividad biológica de una suspensión viral, calculándose por lo
general un 10% más del volumen inicial requerido por lo que no es importante
considerar el volumen final para realizar los cálculos como se hace en las
diluciones dobles seriales.

DILUCIONES EN PASOS.

Son diluciones que se realizan para obtener un soluto altamente diluido sin
importar las diluciones intermedias. Estas diluciones pueden por lo tanto ir o no
seriadas, p.ej.: para obtener la dilución 1/1536 se podría realizar una dilución
doble seriada comenzando con la dilución 1/3:

1/3 1/6 1/12 1/24 1/48 1/96


..................1/1536

o bien haciendo diluciones que no están seriadas:

1/16 1/48 1/192 1/1536


1/6 x 1/8 =
1/48 x 1/4=
1/192 x 1/8=
La opción a seguir sería la segunda ya que no se requieren las diluciones
intermedias y por lo tanto se emplea el menor número de pasos para llegar a la
dilución deseada 1/1536.
Se podría pensar en hacer directamente la dilución pero esto se descarta
debido a la imposibilidad de medir el volumen de soluto requerido si por ejemplo
se necesitarán 4 ml de la dilución 1/1536 donde el volumen del soluto sería
0.002604 ml (4 – 1536= 0.002604 ) y el volumen de diluyente 3.9973959 ml (4 –
0.002604 = 3.9973959 ).

El ejemplo en el que se emplean diluciones no seriadas (o diluciones


intermedias) es lo que se denomina diluciones en pasos. A continuación se enlista
el procedimiento para calcularlas, tomando como dilución requerida 1/1536 en 4
ml.

1) Calcular las diluciones intermedias obteniendo submúltiplos enteros de


1536:

192
8 1536
73
16
0
Correspondiendo el cociente (192) a una de las diluciones intermedias, y el divisor
(8) a la dilución a realizar a partir de 1/192 (Figura 10 ).

Figura 10. Esquema de las diluciones intermedias.

1/8
1/192 1/1536

2) Una vez que se han identificado las diluciones a realizar:

Diluciones a realizar 1/8 1/4 1/8


Diluciones obtenidas
En cada pozo 1/6 1/48 1/192 1/1536

Se determina el volumen en que se realizará cada una excepto la


última en la que ya está determinado el volumen que se necesita (4 ml de la
dilución 1/1536).
Para determinar el volumen de la dilución inicial se debe tomar en
cuenta el volumen de soluto del que se disponga. P. Ej.: si se tienen 0.5
ml de soluto para la primera dilución (1/6) se calcula el volumen de
diluyente multiplicado 0.5 ml x 5 = 2.5 ml de diluyente (recordar que una
dilución 1/6 = 1 parte de soluto + 5 partes de diluyente), sumando el soluto
más el diluyente hacen un volumen total de 3 ml (0.5 ml + 2.5 ml = 3 ml).

3) Las otras diluciones intermedias (1/48, 1/192) ya no dependen tanto de una


cantidad restringida de soluto, por lo tanto la dilución 1/48 se puede realizar
en 8 ml y la 1/192 en 4 ml (pueden ser otros volúmenes). (Figura 12).
Figura 12. Esquematización de la dilución 1/1536 obtenida en pasos.

Dilución a realizar 1/8 1/4 1/8

Dilución obtenida
En cada pozo 1/6 1/48 1/192 1/1536

Cantidades de:

SOLUTO 0.5ml 1ml 1ml 0.5ml

DILUYENTE 0.5ml 7ml 3ml 3.5ml

Volumen
Total 3.0ml 8 ml 4ml 4.0ml

OBJETIVO.

El alumno será capaz de esquematizar y realizar en forma práctica


diferentes tipos de diluciones seriadas y diluciones en pasos.

METRIAL.

- microplacas
- micropipetas serológicas de 5 o 50 ml. simple.
- Micropipetas serológicas de 5 o 50 ml. multicanal.
- Micropuntillas serológicas de 5 o 50 ml.
- Agua (diluyente).
- Agua con colorante (soluto).

METODO.

Después de realizar los cálculos correspondientes para la dilución a


realizar, se deberán seguir los siguientes pasos:

1.- Depositar la cantidad de diluyente correspondiente a cada pozo con micro.


2.- Con la misma depositar el soluto en el primer pozo, mezclar 7 veces el soluto
con el diluyente absorbiendo y expeliendo el líquido con la micropipeta. Es
importante que no se formen burbujas para evitarlo colocar la punta de la
micropipeta sobre la pared del pozo.
3.- Usando la misma micropipeta mezclar el contenido del siguiente pozo.
4.- Con otra micropipeta mezclar el contenido del siguiente pozo.
5.- Repetir los pasos 3 y 4 hasta llegar al último pozo.
PREGUNTAS.

1.- Defina ¿Qué es una Dilución Seriada?


2.- ¿Qué finalidad tiene el diluir una substancia en diluciones seriadas?
3.- ¿Qué finalidad tiene diluir una substancia en diluciones en pasos?
4.- Esquematizar diferentes ejercicios de diluciones seriadas y diluciones en
pasos, resolviendo los siguientes puntos:
- Volumen de soluto y diluyente de la dilución inicial.
- Volumen de recepción (cantidad de diluyente en los demás pozos).
- Volumen de transferencia.
- Dilución correspondiente para cada pozo.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

PRACTICA No. 3

MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y OBTENCIÓN DE MUESTRAS


SANGUINEAS

INTRODUCCIÓN.

En la investigación y la docencia de todas las ciencias biomédicas es


común la utilización de las diferentes especies animales. Entre los animales más
comúnmente utilizados en los laboratorios tenemos a los ratones, las ratas, los
hámsters, los conejos y los pollos. Sin embargo, cualquier especia animal puede
ser considerada como un animal de laboratorio. Así, cuando empleamos las
grandes especies domésticas (caballos. Cerdos, bovinos, etc.). Para estudiar sus
características anatomofisiológicas, sus necesidades nutricionales o su forma de
reacción hacia las enfermedades, estamos haciendo en realidad, un trabajo de
investigación con animales de laboratorio.

Es muy importante tener siempre en mente que existe una obligación por
parte del investigador, en cuanto al cuidado de los animales para experimentación.
El investigador debe reducir al mínimo el dolor y la incomodidad así como evitar el
uso innecesario de estos animales.

A continuación se enlistan algunos de los usos que se les da a los animales


para experimentación en el laboratorio de Inmunología:

 Producción de antisueros.
 Obtención de complemento.
 Obtención de glóbulos rojos.
 Preparación de antígenos.
 Diagnóstico de enfermedades virales.
 Realización de pruebas de seroneutralización, viabilidad, potencia e
inocuidad.

Los animales que son utilizados para experimentación se pueden


clasificar de la siguiente forma:

ANIMALES CONVENCIONALES: animales que se han criado bajo


requisitos mínimos de higiene, pero sin ningún cuidado especial en cuanto a
su origen genético, deficiencias metabólicas, etc. Este tipo de animales
generalmente son criados bajo condiciones de cuartos “abiertos” (sin
barreras).

ANIMALES CONDICIONADOS: son aquellos animales que se han criado


bajo condiciones más estrictas de higiene proporcionándoles una dieta
balanceada, de acuerdo a las necesidades de la especie y de su estado
fisiológico. Al igual que en los convencionales no se tiene ningún cuidado
en cuanto a su selección u origen.

ANIMALES LIBRES DE PATÓGENOS ESPECIFICOS (SPD): estos


animales poseen una microflora y una microfauna considerada como
“normal“ para la especie y no han sido infectados con microorganismos o
virus patógenos.

ANIMALES AXENICOS O LIBRES DE GERMENES: (gripe: a= sin, xenos =


extraños), animales obtenidos por cesárea dentro de un ambiente estéril en
los cuales no se puede detectar ningún microorganismo o virus.

ANIMALES DE LINEAS PURAS CONSANGUÍNEAS: son animales


resultantes de por lo menos 20 cruzas consanguíneas entre hermano y
hermana, o entre madre e hijos o padre e hijas. Estos animales son
genéticamente homogéneos en un 99 %.

En la investigación y diagnósticos que se llevan a cabo en el


laboratorio de Inmunología es necesario inocular o extraer muestras
sanguíneas de los animales en experimentación. En la siguiente tabla se
describen las principales vías parentales y para la obtención de muestras
sanguíneas de algunas de las especies animales más utilizadas en este
laboratorio.

II. obtención de muestras sanguíneas y lavado de glóbulos rojos.

La obtención de muestras sanguíneas se llevará a cabo con base a


las vías de sangrado que se describieron en la tabla siguiendo las
indicaciones del asesor.

III. Procesado de las muestras sanguíneas obtenidas.

A) La obtención de SUERO se llevará a cabo siguiendo los pasos


que a continuación se describen:

1.- Sangrar al animal. La jeringa donde se reciba la sangre no deberá


llevara anticoagulante.

2.- Inclinar el tubo dejando que la sangre coagule.


3.- Con un palillo separar cuidadosamente el coagulo de las paredes del
tubo de ensayo.

4.- Decantar el suero en tubo de ensayo limpio.

5.- Balancear los tubos perfectamente bien.


6.- Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 15 min.

7.- Decantar nuevamente el suero teniendo cuidado de no mezclar el botón


de glóbulos rojos del fondo del tubo con el suero.

b) La obtención de GLÓBULOS ROJOSM PLASMA Y LEUCOCITOS se


llevará a cabo siguiendo los pasos que a continuación se describen:
1.- Sangrar al animal. La jeringa donde se recibe la sangre deberá llevar
anticoagulante.

2.- Depositar la sangre perfectamente mezclada con el anticoagulante en


los tubos de ensayo y balancearlos antes de colocarlos en la centrífuga.

3.- Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 15 min.

4.-Después de esta primera centrifugación vamos a obtener en el fondo del


tubo un paquete de glóbulos rojos y la capa flogística. En el
sobrenadante obtendremos el plasma y el anticoagulante (líquido de
color amarillento).

c) Para el LAVADO DE GLÓBULOS ROJOS:

1.- Repetir del No.1 al 4 del inciso anterior.

2.- Tirar el sobrenadante y reconstituir el paquete de glóbulos rojos con SSF


a una proporción de 1:10, o sea una parte de soluto (glóbulos rojos) por
nueve partes de SSF. Al reconstituir se deberá mezclar
cuidadosamente para evitar la hemólisis de los glóbulos rojos.

3.- Balancear nuevamente los tubos.

4.- Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 15 min.

5.- Repetir los pasos 2, 3 y 4 hasta que el sobrenadante sea totalmente


transparente (aproximadamente 3 veces).

NOTA: Tener cuidado con la preparación de la solución salina fisiológica ya


que si es incorrecta puede afectar la integridad de los glóbulos rojos.

Preparación de diferentes suspensiones de glóbulos rojos.

A continuación se describe dos ejemplos donde se calcula la cantidad


de glóbulos rojos lavados (soluto) y la cantidad de ssf (diluente)
dependiendo del porcentaje al que se quiere preparar la suspensión.
a) Preparación de 100 ml de una suspensión de G.R. al 1.5%.

% ml
100 - - - - 100
1.5- - - - - - x = 1.5 ml del paquete de G.R. lavados mas
98.5 ml de SSF
-------
100.0 ml total
b) Preparación de 2 ml de una suspensión de G.R. al 3%

% ml
100 - - - - 2
3- - - - - - x = 0.06 ml del paquete de G.R. lavados
1.94 ml de SSF
-------
2.0 ml total

PREGUNTAS:
1.- Esquematice los resultados obtenidos al sangrar con y sin anticoagulante.

2.- ¿Con qué finalidad se añade o no anticoagulante al tomar una muestra


sanguínea?

3.- ¿Para qué muestras sanguíneas utilizadas en el laboratorio de inmunología


debemos poner anticoagulante?

4.- ¿Qué diferencias hay entre plasma y suero?

5.- ¿Cómo prepararía una solución salina fisiológica?


LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

PRACTICA No. 4

ELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN.
La electroforesis es la separación de partículas en un campo eléctrico, la
cual depende de la carga neta de las moléculas y en menor grado de su tamaño,
el grado de migración de las proteínas también se ve influenciado por la fuerza
iónica del buffer de electrólitos y la naturaleza del medio de soporte usado.
20
La mayor parte de las proteínas del suero tienen una carga neta negativa a
un pH de 8 y migran al ánodo (+).

A continuación se resumen los tipos de electroforesis, medios de soporte y


usos más comunes.
(*) Marcadores bioquímicos.- son proteínas localizadas en el plasma y en el
TIPO MEDIOS USOS
S AGAR.- Titulación de sueros, identificación de
E componentes del suero.
M GEL DE ALMIDÓN.- Pruebas de paternidad,
I consanguinidad, selección de características de
S productividad, presencia de genes indeseables, por medio
O de la detección de marcadores bioquímicos. (*)
L

I GEL DE POLOACRILAMIDA.- identificación de


D componentes moleculares de virus, bacterias células y
O parásitos, así como estudios de peso molecular.
Z S

O AGAROSA.- Diagnóstico de enfermedades virales,


N bacterianas y parasitarias.
A S TIRA DE ACETATO DE CELULOSA.- Determinación de
L O patrones electroforeticos del suero y determinación de
L gammopatías e hipogammaglobulinemias, p. Ej.: animales
I calostrados o no.
D

O PAPEL FILTRO.- Igual Que en acetatos de celulosa.


S
interior de los eritrocitos tales como las hemoglobinas, tranferrinas,
haptoglobulinas, albúminas, pre-albúminas, anhidrasa carbónica, esterasas,
fosfatasas ácidas, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

OBJETIVO.
Que el alumno realice una prueba de electroforesis, interprete el resultado
de la misma y describa sus aplicaciones prácticas en Medicina Veterinaria.

MATERIAL.
- Tiras de papel filtro.
- Tubos capilares.
- Pinzas de disección.
- Toallas de papel.
- Aplicadores.
- Imanes.
- Tinas de plástico.

Equipo:
- Cámara de electroforesis.
- Fuente de poder
- Densitómetro o espectrofotómetro.

Reactivos:
- Suero normal.
- Suero hiperinmune.
- Buffer para electroforesis pH 8.6
- Colorante de Ponceau S.
- Solución lavadora de ácido acético al 5%.

METODO.

1.- Activar las tiras de papel filtro depositándolas en el buffer unos minutos.
Manejar siempre las tiras con las pinzas de disección.

2.- Eliminar el exceso de buffer de las tiras colocándolas entre dos toallas de papel
secante sin llegar a secarlas. Es importante que las tiras se mantengan húmedas
durante toda la prueba.

3.- Llenar la cámara de electroforesis son buffer y colocar las tiras de papel filtro.
Para mantener las tiras en posición horizontal utilizar los imanes tipo flecha cuyo
vértice debe estar dirigido hacia los electrodos.

4.- Colocar con un tubo capilar la muestra en el aplicador. Aplicarla a dos


centímetros del borde más cercano de la tira al cátodo (polo negativo). Tapar la
cámara para evitar la evaporación.
5.- Conectar la fuente de poder aplicando 2.5 mA por tira y 20 volts por cada
2.5mA.

6.- Dejar correr la muestra durante 1 hr.

NOTA: PELIGRO EL ALTO VOLTAJE PUEDE SER MORTAL.

7.- Pasando el tiempo requerido se desconecta la fuente de poder y se retiran las


tiras.

8.- Depositarlas en el colorante de Ponceau durante 15 minutos.

9.-Pasando este tiempo lavar las tiras en la solución lavadora.

10.- Revisar las tiras visualmente comparándolas con un patrón (interpretación


cualitativa) o analizarlas en un densitómetro (interpretación cuantitativa). (Fig. 1)

PREGUNTAS.

1.- Defina qué es electroforesis.


2.- ¿Qué es una solución buffer?
3.- Dibuje una gráfica de un suero con agammaglobulinemia y una de un suero
hiperinmune, identificando cada una de las espigas y explicando las diferencias
encontradas al compararlas con un suero normal.
4.- Mencione por lo menos 5 usos de la prueba de electroforesis en Medicina
Veterinaria.

Figura 1.- (A) Visualización de las bandas proteicas de diferentes sueros después
de haber sido teñidas. (B) Lectura con el densitómetro que convierte las bandas
en trazos, los cuales indican porcentaje de cada componente.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

PRACTICA No. 5

MECANISMOS BIOQUIMICOS DE RESISTENCIA PRESENTES EN EL SUERO.

INTRODUCCIÓN.

Los mecanismos bioquímicos incluyen una serie de factores presentes en el


hospedador que impide la implantación y desarrollo de las bacterias, virus y
parásitos. Los factores de mayor importancia en el suero son la Lisozima y el
sistema del complemento.
La Lisozima está clasificada como una muramidasa. La acción de esta
enzima es menos eficaz con las bacterias Gram negativas, para que la Lisozima
pueda actuar contra estas bacterias se requiere de la destrucción de la capa de
lipoproteínas por el complemento.

El complemento es un grupo de proteínas que se activan mediante


reacciones enzimáticas interrelacionadas, las cuales se pueden activar por 2 vías:
Vía Alterna y Vía Clásica.

OBJETIVO.

El estudiante comprobará la presencia de dos mecanismos bioquímicos de


defensa en el suero (Lisozima y complemento). Así mismo observará in vitro el
efecto de la temperatura sobre ciertos componentes del complemento del exponer
un suero normal y un suero calentado (560, 30 min) con un cultivo de 18 hrs. De
escherichia coli.

MATERIAL.

- 1 gradilla
- Cultivo de Escherichia coli. De 18 hrs.
- Tubo de ensayo estéril.
- 3 pipetas serológicas de 1 o 2 ml (1/100) estériles.
- 1 fco. De vidrio con 15 ml de SSF estéril.
- 1 fco. De vidrio con capacidad de 10 ml, vacío y estéril.
- 1fco. De vidrio con capacidad de 5 ml, vacío y estéril.
- 3cajas de petri con agar triptosa.
- 1 tubo de ensayo con tapón de rosca con agar triptosa.
- Suero Normal (SN).
- Suero Calentado (sc).
- Cinta adhesiva para identificar.
METODO.

1.- Rotular los frascos estériles y los tubos de ensaye estériles de la siguiente
forma:

ROTULO
- Fco. con capacidad de 10ml 1/100
- Fco. con capacidad de 5 ml 1/15000
- 3 tubos de ensaye est. SC, SN y control respectivamente
- 3 cajas de petri SC, SN y control respectivamente

2.- Con una pipeta estéril añadir la cantidad necesaria de SSF estéril para realizar
las siguientes diluciones:

- Al frasco de 10 ml agregar 9.9 ml (dilución 1/100).


- Al frasco de 5 ml agregar 4.9 ml (dilución 1/5000).
- Al tubo control 0.25 ml.

3.- Con la misma pipeta añadir 0.1 ml del cultivo de Escherichia coli. Al frasco
con capacidad de 10 ml. Mezclar perfectamente bien y transferir de esta
dilución (1/100) 0.1 ml al frasco con capacidad de 5 ml para preparar una
dilución 1/5000.

4.- Mezclar perfectamente bien con la pipeta y transferir 0.25 ml de esta


dilución (1/5000) a cada uno de los tubos estériles previamente rotulados]: SN,
SC y control.

5.- Con una segunda pipeta estéril añadir al tubo de ensaye rotulado SN
0.25ml de suero normal y con una tercera pipeta estéril añadir al tubo estéril
rotulado SC, 0.25 ml de suero calentado.

6.- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

7.- Verter el contenido de los tubos rotulados SN y SC en las respectivas cajas


de petri con agar triptosa y previamente rotuladas y el contenido del tubo
control en el tubo de ensaye con agar triptosa.

8.- Incubar a 370 °C durante 24 hrs. y hacer la lectura.

RESULTADOS.

Esquematizar los resultados obtenidos. Si los resultados obtenidos por


usted no concuerdan con los esperados explique las posibles causas.
PREGUNTAS.

1.- Esquematizar los resultados esperados en las mezclas SSF y Escherichia


colo.., SN y Escherichia coli.. y SC y Escherichia coli.. Explicando en cada caso
el porqué delos mismos.

2.- Explique por qué es menos eficaz la lisozima en bacterias Gran negativas.
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

PRACTICA No. 6

PRODUCTOS BIOLÓGICOS DE USO VETERINARIO

INTRODUCCIÓN.

Los productos biológicos son aquellos agentes o sustancias que proceden d


organismos vivos y virus, que pueden estar constituidos por componentes
estructurales o productos de su metabolismo, parcial o totales.

Los biológicos se clasifican dependiendo de su uso como agente


terapéuticos, de rehabilitación, de diagnóstico e inmunizantes.

AGENTES TERAPÉUTICOS.

Como su nombre lo indica sirven para el tratamiento de alguna alteración


clínica, ejemplo de ellos son las hormonas, enzimas proteolíticas y los cultivos de
flora bacteriana.

AGENTES TERAPÉUTICOS.

Como su nombre lo indica sirven para el tratamiento de alguna alteración


clínica, ejemplo de ellos son las hormonas, enzimas proteolíticos y los cultivos de
flora bacteriana.

AGENTES DE REHABILITACIÓN.

Se utilizan para reemplazar algún órgano o tejido que presente alguna


alteración patológica, ejemplo de estos son los transplantes.

AGENTES PARA DIAGNOSTICO.

Son reactivos de valiosa ayuda en la detección de múltiples enfermedades,


ejemplo de estos tenemos el PPD bovino y PPD aviar para diagnóstico de
Tuberculosis, antígeno de Brucella para las pruebas de tarjeta ácida, en placa y en
tubo, etc.

Los agentes inmunizantes se usan como profilacticos o sea para la


prevención de enfermedades. Dentro de estos se encuentran las vacunas,
bacterinas, toxoides, sueros hiperinmunes y antitoxinas.
VACUNAS.- es una suspensión de microorganismos vicos o de virus activos
apatógenos (a virulentos de origen), inactivos (muertos) o virus activos modificado
(atenuado).
La producción de vacunas virales debe llevarse a cabo en células vivas como
embrión de pollo, animales de laboratorio y cultivo de células, debido a que este
agente infectante carece de metabolismo propio para replicarse.

BACTERINAS.- son una suspensión de bacterias patógenas muertas por medios


físicos o químicos no tóxica.
Las bacterias pueden ser:

MONOVALENTES.- cuando se elabora a partir de una sola especie y de un solo


género. P. Ej.: bacterina contra la coriza infecciosa de las aves (Haemophilus
paragallinarum).

BIVALENTE.- cuando están constituidas por dos especies de un solo género p.


Ej.: bacterina contra el carbón sintomático y el edema maligno (Cl. Chouvoei, Cl.
Septicum).

POLIVALENTES.- compuestas por más de 2 especies de un solo género. P. Ej.:


bacterina para la prevención de la leptospirosis en bovinos y porcinos (Leptospira
canicola, L. icterohaemorragiae, L. gryphotiphosa, L. hardjo y L. pomana).

MIXTAS.- compuestas de 2 o más géneros y especies. P. Ej.: bacterina para la


prevención de infecciones mixtas por pasteurelosis, salmonelosis, colibacilosis (p.
Multocida I y III, S. cholerasuis, E. Coli).

AUTOGENAS.- elaboradas apartir del aislamiento de in germen de un animal e


inoculado en la misma explotación.
Para elaborar una bacterina tienen que prepararse medios de cultivos artificiales
para ponerlos a crecer.

TOXOIDES.- es una suspensión de toxinas inactivadas por agentes químicos o


físicos que han perdido su poder tóxico conservando sus características
antigénicas. P. Ej.: toxoide tetánico que se usa para la prevención del tétanos en
los animales domésticos.

SUERO HIPERINMUNE.- es el suero sanguíneo de un animal (de especie


homóloga o no) el cual se ha inmunizado artificialmente en forma repetida contra
un antígeno determinado. Cuando el antígeno es una toxina el suero hiperinmune
recibe el nombre de antitoxina.

Cada producto debe pasar por diversas pruebas de CONTROL DE


CALIDAD para poder llegar al mercado. Estas pruebas se realizan durante las
diferentes etapas de elaboración y envasado del producto.
Las PRUEBAS mínimas de CONTROL DE CALIDAD estipuladas en el
manual de requerimientos mínimos de la Secretaría de Agricultura y Recursos
Hidráulicos son las siguientes: PUREZA, INOCUIDAD, VIABILIDAD Y POTENCIA
cuando se trata de microorganismos o de virus activos. En el caso de los demás
productos biológicos inmunizantes se realizan todas las anteriores pruebas
excepto la de VIABILIDAD y agregando otra prueba la de ESTERILIDAD.

PRUEBA DE FUERZA. Consiste en determinar que el producto esté libre de


cualquier contaminante vivo o activo demostrable. Para esto se deberá mediante
análisis bacteriológico cuantitativo usando medios para crecimiento aerobio y
anaerobio en el caso de productos vacunales vivos. En el caso de bacterinas
deben efectuarse pruebas de tinción bioquímicas antes de la inactivación.
También deben realizarse pruebas para detectar hongos, levaduras y
micoplasmas.

PRUEBA DE ESTERILIDAD. Consiste en determinar que el producto esté libre de


cualquier microorganismo vivo o activo demostrable. Se realizan análisis
bacteriológicos para demostrar que el producto esta exento de cualquier bacteria
viva, usando medios de crecimiento para gérmenes aerobios y anaerobios y
pruebas que demuestren que el producto está libre de hongos y levaduras.

PRUEBA DE INOCUIDAD. Debe mostrarse que el agente inmunizante no produce


ninguna reacción desfavorable local o sistemática atribuida al producto, aun
aplicando el doble de la dosis indicada por el elaborador en la especia animal
señalada. Esta prueba debe realizarse en animales de laboratorio.

PRUEBA D POTENCIA. Consiste en demostrar que el producto utilizado protege a


un número determinado (generalmente al 80% de la población) de animales
inoculados con el agente inmunizante. Frente a un desafío donde un lote control
de animales mueren y/o presentan signos de enfermedad.

PRUEBA DE VIABILIDAD. Debe demostrarse que el producto vacunal contiene


determinada cantidad de gérmenes viables por dosis. El procedimiento de esta
prueba se hace considerando a la vacuna reconstituida como la dilución 100 y
realizando diluciones logarítmicas seriadas, se siembra cada dilución en un medio
de cultivo artificial si se trata de bacterias o inoculado en embriones de pollo,
animales de laboratorio o cultivos de células si se trata de un agente viral activo.
Posteriormente mediante un método cuantitativo serán analizados para obtener o
determinar el punto de actividad biológica o título.

Una vez que el producto pasó las pruebas de control de calidad, se procede
a marcar el número de lote, fecha de elaboración del producto y la fecha de
caducidad en la máquina lotificadora.

Muchos productos biológicos como vacunas y bacterinas deben tener una


determinación de bacterias por ml, como uno de sus requerimientos mínimos de
control de calidad, ya que existe una estrecha relación entre la cantidad de
antígeno inoculado a un individuo y la respuesta inmune obtenida.

Entre los diferentes métodos que se han utilizados y desarrollo para


determinar la concentración bacteriana de los productos, está el de medir la
densidad óptica utilizando el NEFELOMETRO DE McFARLAND, el cual es un
estándar de densidad óptica variable y equivale a una concentración bacteriana
diferente que fluctúa entre los 300 millones de bacterias / ml para el primer tubo y
de 3000 millones de bacterias / ml para el último tubo.

PREGUNTAS.

1.- ¿Qué entiende por producto biológico?

2.- Consultando un prontuario veterinario de un ejemplo de cada tipo de producto


biológico para cada especie doméstica.
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 7

PRECIPITACIÓN

INTRODUCCIÓN

La precipitación es el método por el cual la mayoría de las moléculas de


anticuerpos establecen enlaces cruzados con antígenos solubles formando
complejos insolubles Ag- Ac que son reconocidos como un precipitado visible.

Cantidades crecientes de antígeno agregadas a cantidades constantes de


anticuerpos en una serie de tubos, determinan la cantidad de precipitado en cada
tubo, obteniéndose una curva de precipitación en la que se observa una zona de
equivalencia donde existe la máxima unión de antígenos y anticuerpos.

A la derecha e izquierda de la zona de equivalencia hay formación de pequeños


complejos, los cuales permanecen en suspensión coloidal sin observarse a simple
vista. (Ver fig. 1 y 2).

Por su sencillez y sensibilidad las técnicas que estudian las reacciones Ag-Ac en
agar y medios líquidos son las más usadas.

El antígeno debe estar en solución o en estado coloidal para que sea capaz de
difundir a través del gel de agar para reaccionar con su anticuerpo.

TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN

MEDIOS LÍQUIDOS:

- ASCOLI.- (en tubo de ensaye). Diagnóstico bacteriológico.


En esta prueba se añaden sin mezclar cantidades iguales de antígeno y antisuero
en un pequeño tubo de ensaye. Al cabo de una hora e incubación a 370°C se lleva
a cabo la lectura. Un resultado positivo sería la formación de una línea de
precipitación.

- LANCEFIELD.- (en tubo capilar). Identificación de carnes y embutidos. Esta


prueba se realiza en tubo capilar y es muy útil cuando la muestra es escasa ya
que para hacerla se requieren pequeñas cantidades de antígeno y antisuero (fig.
3).
MEDIOS SEMISÓLIDOS:

Difusión simple:

- MANCINI.- (caja de petri o placa de vidrio). Determinación cuantitativa de


antígenos. También conocida como Prueba de Inmunodifusión Radial Única. En
esta técnica se coloca una capa de la mezcla agar-antisuero específico sobre una
laminilla de vidrio o caja de petri en la que se hacen unos pozos donde se añadirá
el antígeno.
Fusión doble:

- OUCHTERLONEY.- (caja de petri). Adulteración de embutidos. Dx de


Anemia Infecciosa Equina (Pba. De Coggins). Dx de enfermedades bacterianas,
parasitarias y fungales.
Esta prueba se realiza en cajas de petri, una placa de vidrio o un portaobjetos.

En el agar ya solidificado con un sacabocados se hacen unos pozos en los que se


colocan en el antígeno y en el antisuero. Radialmente se difunden a través del
agar y si corresponden se formarán líneas de precipitado. El número de estas
líneas corresponderá a los diferentes complejos antígeno-anticuerpo existentes.
Esta es una prueba de difusión doble. Las lecturas patrón en esta prueba de
inmunodifusión doble se esquematizan en la fig. 4.

COMBINACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN Y LA SEPARACIÓN


ELECTROFORETICA EN MEDIOS SEMISÓLIDOS:

- CONTRAINMUNOELECTROFORESIS.- Dx de enfermedades virales. El


principio básico del método implica la electroforesis, simultánea y en direcciones
opuestas, en un medio semisólido (gel), del antígeno y anticuerpo a partir de
pozos separados. Al encontrarse se produce una línea de precipitación.

- ELECTROFORESIS EN COHETE.- Determinación cuantitativa de


antígenos. El antígeno es colocado en pozos numerados del 1 al 4, en cantidades
progresivamente decrecientes. Se efectúa la electroforesis y el antígeno precipita
con el antisuero que está en el agar. El patrón de precipitado formado tiene el
contorno de la estela de un cohete. La cantidad de antígeno es directamente
proporcional a la longitud de la estela.

- INMUNOELECTROFORESIS.- Separación de diferentes inmunoglobulinas


empleando un antígeno. En esta técnica se utiliza una laminilla cubierta con agar.
Se excava una depresión larga y estrecha para el antisuero y un pozo para el
antígeno y se somete a electroforesis. Una vez terminada la separación se coloca
el antisuero en la depresión o ranura. Se deja incubar en cámara húmeda durante
24 hrs. Para que se presenten las líneas de precipitación. Se formará una línea de
precipitación para cada antígeno.
OBJETIVO.

Que el alumno realice en forma práctica las pruebas de Lancefield y Ouchterloney


e interprete los posibles resultados de las mismas. Asimismo que enliste los usos
de las pruebas de precipitación en Medicina Veterinaria.

MATERIAL.

- 1 gradilla
- Tubos de ensaye
- Pipetas de 1 ml estériles (1/100)
- Caja de petri con agar y perforaciones
- Tubos capilares
- Pinzas y tijeras estériles
- Arena estéril
- Mortero y pistilo estériles
- Carnes y embutidos de diferentes especies animales (antígeno).- SSF estéril
- Antisueros específicos contra bovino, caballo, ave, cerdo, perro y ovino.
- Un trozo de plastilina.

MÉTODOS.

Prueba de Ouchterloney (Identificación de carne):

1) Pesar 0.5 gr. de la muestra y macerar en el mortero añadiendo poco a poco


SSF, hasta tener una dilución 1:10.

2) Filtrar el sobrenadante con papel filtro recibiendo el filtrado en un tubo de


ensaye estéril.

3) Rellenar el pozo central de la caja de petri con el antisuero y los pozos


externos con el filtrado (Ag) siguiendo el sentido de las manecillas del reloj.
Identificar el pozo No. 1 perforando el agar con el tubo capilar.

4) Identificar la caja con su nombre, muestras y antisueros utilizados.

5) Incubar en cámara húmeda de 24 a 48 hrs.

6) Realizar la lectura a las 24 hrs. Con un negatoscopio o lámpara de fondo


oscuro.

Prueba de Lancefield (Identificación de carne):

1) Dejar que por capilaridad ascienda el antisuero hasta 1/3 de longitud del tubo
capilar.
2) Hacer lo mismo con el filtrado preparado anteriormente (Prueba de
Ouchterloney), rellenando 1/3 más del tubo.

3) Clavar el tubo capilar en un trozo de plastilina.

4) Lectura a los 15 min. aproximadamente.

INTERPRETACIÓN.

En un resultado R (+) se observará la formación de una línea blanca, más densa


que corresponde a una reacción Ag-Ac. En el R (-) se observará el color y textura
del agar sin ningún cambio.

RESULTADOS.

Esquematice y explique los resultados obtenidos en las pruebas de Lancefield y


Ouchterloney.

PREGUNTAS.

1. Mencione las características de los antígenos utilizados en las pruebas de


precipitación.
2. explique cómo se lleva a cabo el fenómeno de precipitación.
3. dibuje los patrones de precipitación en la prueba de Ouchterloney de identidad
total, parcial y no identidad.
4. mencione 5 usos de la prueba de precipitación enfocados a la Medicina
Veterinaria.
5. Explique en forma breve la lectura de una prueba de Ouchterloney que se
esquematiza en la siguiente figura:
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 8

PRUEBA DE PRECIPITACIÓN DE SULFITO DE SODIO

INTRODUCCIÓN

Esta prueba se basa en la precipitación de las inmunoglobulinas del suero por las
sales de sulfito de sodio, al ponerse ambas en contacto; se realiza con un mínimo
de equipo y constituye un método rápido de alta precisión capaz de ser usado en
condiciones de campo.

La prueba de sulfito de sodio es útil cuando se usa sobre animales de 24 hrs. a 3


semanas de edad. Su interpretación es de tipo objetivo y tiene un porcentaje de
confiabilidad de aproximadamente 93%.

OBJETIVO

El alumno identificará en base a aspectos macroscópicos la precipitación de


gammaglobulinas en el suero.

INTERPRETACIÓN DE LOS TUBOS

A) Si la precipitación ocurre solo en el tubo de 18% el becerro solo tendrá una


concentración de menos de 5 mg de inmunoglobulinas totales por ml de
sangre, es decir que ha habido una falla en la transferencia pasiva de ig
maternas al neonato y las posibilidades de supervivencias son mínimas.

B) Si la precipitación ocurre solo en el tubo de 18% y 16% el becerro solo tendrá


una concentración de 5 mg a 15 mg de inmunoglobulinas totales por ml de
sangre, es decir que el becerro puede mantenerse sano si la exposición de
agentes patógenos es reducida.

C) Si la precipitación ocurre en el tubo de 18% y 16% 14% el becerro tendrá una


concentración de 15 mg de inmunoglobulinas totales por ml de sangre, es
decir que el b.

MATERIAL Y REACTIVOS:

- 3 tubos de ensayo de 5 a 10 ml de capacidad


- 3 pipetas serológicas de 5 ml de capacidad
- 1 pipeta de 1 ml de capacidad
- 1 ml de suero de becerro de 3 a 5 semanas
- Sulfito de sodio al 14,16 y 18%. En agua destilada
PROCEDIMIENTO

1. Coloca .1 ml de suero problema a cada uno de los tubos previamente


rotulados, utilizando la pipeta de 1 ml.
2. Coloca 1.9 ml de las soluciones de sulfito de sodio con su respectivo tubo,
utilizando pipetas diferentes.
3. Mezclar y dejar a temperatura ambiente por espacio de una hora (puede ser
inmediata la lectura).
4. Interpretación de los tubos.

PREGUNTAS

1. Interpreta y compara tus resultados con los demás equipos de laboratorio.


2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene la prueba.
3. ¿Qué valor práctico le das para animales posnatales y adultos?
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 9

AGLUTINACIÓN

INTRODUCCIÓN.

La aglutinación es la combinación de anticuerpos con sus diferentes


determinantes antigénicos localizados en células, bacterias y algunos glóbulos
rojos que comparten las características de ser particulados y no solubles, que dan
como resultado la formación de grumos observables a simple vista.

Los diferentes tipos de inmunoglobulinas difieren en su habilidad par mediar


reacciones de aglutinación, la Ig M es la que posee mayor capacidad de aglutinar.

Las reacciones de aglutinación tienen dos modalidades, directa o indirecta. En el


primer caso los antígenos presentes en la superficie de las partículas reaccionan
directamente con el anticuerpo homólogo formando los conglomerados o grumos,
por ejemplo en las pruebas como Huddleson, Tarjeta ácida, Mercaptoetanol,
Rivanol, Lenta en Tubo y para la determinación de grupos sanguíneos. En las
pruebas de aglutinación indirecta los antígenos o anticuerpos se acoplan a
partículas que funcionan como soportes, estas partículas pueden ser eritrocitos,
poliestireno (látex), bentonita o cefarosas; ejemplo de este tipo son las pruebas de
Hemoaglutinación pasiva y de Coombs.

Las aplicaciones más habituales son:

1. Diagnóstico de enfermedades infecciosas del hombre y de los animales, tales


como Brucelosis, Salmonelosis, Micoplasmosis, Leptospirosis,
Campilobacteriosis, Erisipela, Muermo, etc.
2. Determinación de grupos sanguíneos eritrocíticos.
3. Identificación y clasificación de bacterias por ejemplo: E. coli, Salmonelas,
Pasterelas, etc.
4. Determinación de la presencia de anticuerpos.

Pruebas de Aglutinación para el diagnóstico de Brucelosis.

La Brucelosis es una enferm4edad que tiene importancia en la Salud Pública. Se


diagnóstica en forma bacteriológica y serológica. Esta última se basa en la
detección de anticuerpos presentes en el suero por medio de las pruebas de
aglutinación.
Las pruebas utilizadas con este fin son (CEB, FAO/ OMS):

1. Prueba de hato - Anillo de Bang o anillo de leche


2. Pruebas individuales - Huddleson o rápida en placa.
- Lenta en tubo.
3. Pruebas complementarias - Tarjeta ácida.
- Rivanol.
- Mercapto-2-etanol
- Clorhidrato de cisteína.
- Fijación de complemento.
- Inactivación a 650 C.

Las pruebas serológicas complementarias se utilizan para eliminar dentro de lo


posible las reacciones falsas positivas debida a vacunaciones o por reacciones
cruzadas. En estas pruebas se eliminan las Ig M ya sea por reducción (Prueba del
Mercapto-2-etanol o la prueba de Clorhidrato de cisteína), inactivación (Prueba de
tarjeta ácida y prueba de inactivación a 650 C) o por su eliminación selectiva
(Prueba de rivanol).

El uso de cada una de estas pruebas se verá sujeto a diversos factores por
ejemplo, si en la zona donde está localizado el hato hay brucelosis, el tipo de
explotación, si se vacuna o no, procedencia de los animales, etc.

OBJETIVO.

El estudiante realizará por lo menos dos pruebas de aglutinación para el


diagnóstico de Brucelosis, manejará los conocimientos básicos para llevar a cabo
la interpretación de estas pruebas, así como la forma correcta de la toma y envío
de muestras al laboratorio para el diagnóstico serológico de Brucelosis.

MATERIAL Y MÉTODOS.

1. Prueba de anillo de Bang.

- Gradilla
- Tubos de ensayo.
- Pipeta serológica de 1 ml en 1/100
- Antígeno de Bang elaborado con Brucella abortus cepa 1119 S a una
concentración del 4%.
- Leche sospechosa.
PROCEDIMIENTO:

En el tubo de ensayo se agrega 1 ml de leche y a este se le agrega una gota de


Ag equivalente a 0.03 ml, se mezcla y se deja incubar a 370 C durante una hora
en el caso de leche de vaca.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

Cuando el Ag es aglutinado por los Ac’s que se encuentran en la leche se forma


una malla que es arrastrada a la superficie ya que el peso específico de la grasa
es menor, por lo tanto en una reacción positiva se observará una anillo del color
del antígeno en la superficie y el resto permanecerá blanco.

En una reacción negativa toda la muestra se observará del color del antígeno o
bien un anillo blanco en la superficie y el resto teñido.

Para determinar si los animales están o no infectados se deben de tomar una serie
de factores que pueden influenciar la prueba (ver anexo: “toma y envío de la
muestra, características de las pruebas de aglutinación y factores que pueden
influenciar las mismas”).

2. Prueba de Tarjeta Ácida.

- Una placa de vidrio.


- Pipeta serológica de 1 ml en 1/100.
- Antígeno elaborado con Brucella abortus cepa 1119 S a una concentración de
8%.
- Suero sospechoso.
- Un palillo.

PROCEDIMIENTO:

En la placa se coloca una gota de suero y se le agrega una gota de Ag, se


mezclan con un palillo y se observa durante 4 min.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

Una reacción positiva se observa cuando hay formación de grumos teñidos y el


resto del líquido permanece claro. Debido a que se trata de una prueba
complementaria y detecta únicamente la presencia de Ig G, una reacción positiva
indica que el animal se encuentra infectado y por lo tanto se da como positivo (ver
anexo: “toma y envío de la muestra, características de las pruebas de aglutinación
y factores que pueden influenciar a las mismas”).
Una reacción negativa se observa cuando la mezcla permanece sin cambios.
3. Prueba de Huddleson.

- Una placa de vidrio.


- Pipetas serológicas de 1 ml en 1/100.
- Antígeno elaborado con Brucella abortus cepa 1119 S a una concentración de
11%.
- Suero sospechoso.

PROCEDIMIENTO:

En la placa de vidrio se colocan las siguientes cantidades de suero sospechoso:


0.08 ml, 0.04 ml, 0.02 ml y 0.01 ml. A estas se le añade una gota del Ag
equivalente a 0.03 ml, se mezclan con un palillo de la dilución mayor a menor y se
observa la prueba durante 8 min.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

En una reacción positiva se observará la formación de grumos teñidos y el resto


del líquido permanecerá claro. El título del suero corresponde a la última dilución
positiva. En una reacción negativa no se observa ningún cambio.

4. Prueba lenta en tubo.

- Gradilla.
- Tubos de ensayo.
- Pipetas serológicas de 1 ml en 1/100.
- Antígeno elaborado con Brucella abortus cepa 119 S a una concentración de
0.045%.
- Suero sospechoso.

PROCEDIMIENTO:

Se realizan diluciones dobles en cuatro tubos añadiendo 0.08 ml, 0.04 ml, 0.02 ml
y 0.01 ml del suero sospechoso respectivamente y 2ml del Ag a cada uno de ellos.
Se mezclan y se dejan incubar a 370 C durante 24 a 48 hrs.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

Una reacción positiva se observa cuando en el fondo del tubo se forma una nata y
el líquido sobrenadante está claro al agitarlo la nata se puede separar en grumos
que no se solubilizan. El título del suero corresponde a la última dilución en la cual
hubo reacción positiva.

Debido a que es una prueba más sensible que la prueba de huddleson, los títulos
de esta prueba generalmente se recorren una dilución más en relación a los
obtenidos en la de Huddleson.
Una reacción negativa es aquella en la que observamos un botón en el fondo del
tubo que al agitarlo se solubiliza o bien el líquido sobrenadante se observará turbio
sin la formación del sedimento.

NOTA: En el laboratorio de Serología del Departamento de Inmunología y


Virología de la FMVZ de la UNAM, la rutina de diagnóstico para las muestras
sospechosas es la siguiente:

Pruebas a realizar

Tipo de animales 1a. Instancia 2da. Instancia

Animales vacunados Lenta en tubo Fijación de C’


Mercapto etanol
Tarjeta ácida

Animales no vacunados Huddleson Fijación de C’


Lenta en tubo

PREGUNTAS.

1. Explique cómo se lleva a cabo el fenómeno de aglutinación.


2. Para que se pueda llevar a cabo este fenómeno qué características debe de
cubrir el antígeno.
3. ¿Cuáles son los usos más comunes de las pruebas de aglutinación?
4. ¿Por qué es importante el diagnóstico de la brucelosis?
5. ¿Con qué métodos se cuenta para el diagnóstico de brucelosis?
6. ¿Qué entiende por prueba complementaria?
7. Esquematice a color cuáles fueron sus resultados en cada una de las pruebas
realizadas.
8. ¿Cómo consideraría un animal del cual se obtuvieron los siguientes resultados:
Pba de Huddleson Título 1/200
Lenta en tubo Título 1/100
Tarjeta ácida negativo

9. ¿Cómo consideraría a un bovino cuyos resultados para el diagnóstico de


brucelosis fueron los siguientes:
Pba de Huddleson Título 1/50
Anillo de Bang Título 1/100
Anillo de Bang Positivo
Tarjeta ácida Positiva
Tomando en cuenta que éste animal pertenece a un hato vacunado.
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 10

PRUEBA DE AGLUTINACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS GRUPOS


SANGUÍNEOS DEL SISTEMA AB Y RH.

INTRODUCCIÓN

El fenómeno de aglutinación se produce cuando se ponen en contacto antígenos


particulados con sus anticuerpos.

La prueba de aglutinación en placa además de ser de gran utilidad para el


diagnóstico de diversas enfermedades, también es utilizada para determinar
grupos sanguíneos eritrociticos.

La mayor parte de los grupos sanguíneos son proteínas o polisacaridos y se


localizan en la superficie de la membrana celular de los glóbulos rojos. Existen
excepciones como es el grupo J de la vaca, R de la oveja, A y O del cerdo y Tr del
perro que también lo podemos encontrar en estado libre en suero y saliva y otros
líquidos corporales llamados grupos sanguíneos secretores se encuentran saliva,
leche y otros líquidos corporales.

Landstainer en 1900 descubrió los grupos sanguíneos señalándose la presencia


de 4 grupos, designándolos como A, B, AB, O. Para demostrar la presencia de
este sistema, empleo la prueba de aglutinación en placa. Posteriormente junto con
Weiner descubrieron el sistema Rh con la misma prueba, en la cual el sistema de
aglutinación (+) indica la presencia de factor y el (-), no aglutinación de ese
antígeno, indica la ausencia de la misma.

En el sistema ABO del humano, existen también anticuerpos séricos llamados Ac


naturales o isoanticuerpos, los cuales son los responsables en cierta medida de la
compatibilidad o no de los trasplantes.
Cuadro 1.
Tipo de antígeno y anticuerpo natural que presentan los grupos sanguíneos de
humano.

Grupo sanguíneo antígeno ac natural

A A ANTI B

B B ANTI A

AB AB --------------

O H ANTI A
ANTI B

Algunos animales presentan también anticuerpos naturales como el anti j de la


vaca, anti r del borrego y anti h del cerdo.

Los grupos sanguíneos ABO y Rh al igual que los grupos sanguíneos Kell, Duffy,
Bombay, MN, en el humano están relacionados con las reacciones incompatibles
de individuos cuyo grupos sanguíneos eran “compatibles” al sistema ABO Rh., Así
mismo los Ac naturales pueden dar reacciones por transfusión sanguínea tanto en
animales como en el humano. Por esta razón es recomendable que antes de
realizar alguna transfusión se realice las pruebas cruzadas, que consta de dos
fases: a) fase mayor en la que se mezcla la sangre del donador con el suero de
receptor y una fase menor donde se mezcla el suero del donador con la sangre del
receptor. Por lo cual cualquier tipo de aglutinación que ocurre en cualquiera de las
dos fases no se debe realizar la transfusión.

Otro problema producido por los grupos sanguíneos en los humanos es la


eritroblastosis fetal o enfermedad hemolítica del recién nacido, que es causada en
el 90% de los casos por incompatibilidad del sistema Rh. En los equinos se le
llama eritrolisis neonatal y es producida principalmente por el grupo aa.

En estas dos enfermedades la madre es sensibilizada al entrar en contacto por


primera vez con el grupo sanguíneo del hijo, durante el parto quedando linfocitos
de memoria contra ese grupo sanguíneo. En una segunda gestación, si la cría
posee el grupo sanguíneo del cual fue sensibilizada a la madre, se desencadenara
una respuesta secundaria contra ese grupo sanguíneo. En los humanos las Ig
pasan por placenta mientras que en el equino por el tipo de placenta pasa por
calostro.
OBJETIVO:

El alumno interpretará los resultados para identificar grupos sanguíneos por medio
de la técnica de aglutinación en placa.
MATERIAL:

- Portaobjetos
- Lanceta estéril
- Palillos
- Antisuero, anti a, anti b, y anti rh

MÉTODO:

Para la determinación del grupo sanguíneo eritrocitico el elemento desconocido es


el antígeno (los glóbulos rojos) y el elemento conocido son los anticuerpos
específicos.

Pasos:

1. Lavar y desinfectar las manos y el dedo pulgar.


2. Con una lanceta estéril pinchar el dedo (destruir la lanceta después de
utilizarla).
3. Colocar tres gotas en el porta objetos separadamente
4. Aplicar el antisuero anti A, anti B, y anti Rh previa identificación de los mismo
en el portaobjetos.
5. Homogenizar las mezclas con los palillos.
6. Realizar la lectura.

Interpretación*:
(Nota el uso del porta es de manera universal):

Anti A* Anti B Anti Rh

*muesca del lado izquierdo

Positivo: formación de grumos


Negativo: sin cambio

Ejem: (1) AB Rh +

Grumos presentes en las tres mezclas

(2) o Rh –

Sin cambios en las tres mezclas


PREGUNTAS:

1. Realiza un esquema de tus resultados.

2. Escribe tres recomendaciones para evitar la eritrolisis neonatal.

3. Escribe tres recomendaciones para controlar un caso de eritrolisis neonatal.


LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 11

INMUNOFLORESCENCIA I
DIAGNÓSTICO DE RABIA

INTRODUCCIÓN

Es una de las enfermedades más antiguas y conocidas por el hombre data de 500
a.c., del cual su hospedador son los animales de sangre caliente, su importancia
en salud pública radica en que es una zoonosis de elevado % de mortalidad la
cual se transmite a través de la mordedura de animales infectados.

Se considera que México y Brasil son los países con mayor porcentaje de casos
de rabia urbana, en América así mismo Australia, Inglaterra, Uruguay y Hawái son
países considerados libres de esta enfermedad.

Algunas sinonimias de este padecimiento son hidrofobia, derriengue, tronchado.

Etiología: enfermedad viral producida por un virus de la familia rhabdoviridae,


género lissavirus.

Diagnósticos:

Inmunoflorescencia: es conocida también como prueba de anticuerpos


fluorescentes. El principio de esta técnica es la reacción ag-ac las
moléculas de ac se conjugan químicamente a los fluorocromos sin
destruirse su especificidad inmunológica, y cuando se ponen en
contacto con los ag homólogos se produce una reacción ag-ac. Al
observarse al microscopio de luz ultravioleta, el complejo emite un color
fluorescente.

En la actualidad es la prueba más exacta para el dx, bien ejecutada es una


prueba superior a otras por su rapidez como precisión, en la cual la lectura se
puede hacer en un máximo de 2 hr.
Los colorantes más utilizados son:

- Los derivados de la fluoresceína que da una coloración verde manzana.


- Los derivados de la rodamina.
- Dansc.
- Auramina que da una coloración.

CARACTERÍSTICAS:

Sensibilidad: usualmente baja.


Especificidad: alta.
Reproducibilidad: aceptable.
Lectura: objetiva.
Preparación del antígeno: fácil.
Conjugado: calidad estándar.
Probabilidad de establecerse en el campo: intermedio.
Automatización de la prueba: difícil.
Costo relativo de la prueba: alto.
Vida media de los reactivos larga peligro para la salud del personal de laboratorio:
mínimo.

Interpretación de la prueba:

En las improntas testigos positivas y las muestras problema con antígeno rábico,
se observan partículas de color verde manzana, o amarillo verdoso fluorescente
de tamaño diverso, algunas son como arena o polvo y otras por su dimensión
semejan a los corpúsculos de negri.

Los falsos positivos se pueden deber a:

- Rayado de las laminillas.


- Polvo.
- Cristales de la solución saturada.

Histopatología:

La base de este diagnóstico es la observación de los corpúsculos de


inclusión de virus rábico llamados corpúsculos de negri lesión
patognomónica teñidas con giemsa o seller (s.S. de fuscina básica + s.S.,
Azul de metileno en alcohol metílico).
Prueba biológica:
En esta prueba se utilizan animales de laboratorio para la inoculación y dx.

La inoculación se realiza en ratones albinos destetados (11 gr) por vía


intracerebral la cantidad inocular es de 0.03 ml.

Los signos aparecen a los 15-25 días por inoculación y son los siguientes:
hiperestesia, convulsiones, incoordinación, postración y muerte.
Después se debe hacer i.F.
Confiabilidad de las pruebas:

- Inmunoflorescencia 99 %.
- Histopatológico 60 80%
- P. Biológica 100 %

OBJETIVO:

Que el alumno interprete y evalué los resultados obtenidos de la prueba de


inmunoflorescencia, analizando la importancia que tiene la prueba diagnóstica de
rabia por ser de importancia en salud pública.

MATERIAL:

Microscopio de inmunoflorescencia
Conjugado antirrábico
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta pasteur
Glicerina buferada

PROCEDIMIENTO:

- Tomar la muestra
- Hacer la impronta
- Fijar con acetona 60 min.
- Aplicar el conjugado (suero hiperinmune)
- Incubar 60 min., a 37 grados
- Lavar con pbs
- Lavar con agua destilada
- Observar con glicerina
PREGUNTAS:

1. ¿Cuál es la importancia de la prueba I.F. en diagnóstico de rabia, al ser de


sensibilidad baja?
2. ¿Cuál es la importancia de la prueba de I.F. en diagnóstico de rabia, al ser
de especificidad alta?
3. ¿Cuál es el papel del M.V.Z. en el diagnóstico de rabia?
LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
PRACTICA No. 12

ELISA I
(ENZIME LINKED IMMUNOABSORBENT ASSAY)

INTRODUCCIÓN

Se hace necesario con el progreso en el área de las técnicas diagnósticas y el


avance en el área de informática, actualizar los sistemas de diagnóstico que
actualmente se realizan en el departamento de medicina veterinaria, utilizando la
herramienta del software, y con ellas las ventajas y versatilidad de los sistemas
computacionales para el diagnóstico de enfermedades.

El manejo de sistemas computacionales por medio de rutinas lógicas y procesos


aplicados en el desarrollo de tareas específicas en el diagnóstico de
enfermedades (profile software), por medio del uso de técnicas
inmunoenzimáticas.

El análisis de ELISA, corresponde a un sistema inmunoenzimático heterogéneo,


en donde el antígeno o anticuerpo primero se fija a un soporte inerte y luego se
hace reaccionar con el antígeno o anticuerpo correspondiente, que estará
marcado con un enzima (conjugado); se la va el conjugado que no reaccionó y se
mide la capacidad de hidrólisis de la enzima sobre su correspondiente substrato.
Generalmente se determina el grado de transformación de un substrato incoloro a
un producto coloreado por medio de un equipo computarizado.

Los datos copilados en profile son diseñados en una gran variedad de reportes,
cada uno de esos reportes han sido destinados para dar uso una vez terminada la
información proveniente de ELISA para dar el estatus inmunológico completo de
las aves (en este caso en especial).

Los niveles de anticuerpos como respuesta de vacunaciones o exposiciones a


enfermedades en la industria avícola, puede determinar la efectividad en esas
mismas o medidas sanitarias preventivas, el manejo de profile flock management
software proporciona a los productores la información sobre la respuesta
inmunológica de las parvadas.
OBJETIVO:
Que el alumno realice e interprete los resultados de la técnica de ELISA,
evaluando la importancia que tiene en el control y erradicación de las
enfermedades de los animales domésticos.

MATERIAL:
1. Placa de ELISA
2. Suero control positivo
3. Suero control negativo
4. Solución del conjugado (gota anti-chicken igg h&l)
5. Solución amortiguadora
6. Abts-peróxido de hidrógeno, sistema del substrato
7. Solución detenedora
8. Agua destilada
9-2 Micropipetas multicanales de alta precisión de 1-200 microlitro
10-2 Micropipetas de alta precisión de 1-200 microlitro
11-50 Micropuntillas puntillas desechables de 1-20 microlitros
12-50 Micropuntillas puntillas desechables de 20-200 microlitros
13- Microplaca
14- Espectrofotómetro
15- Equipo de lavado para ELISA

Importante

Nunca pipetear con la boca


MÉTODO:

Procedimiento I

Preparación de suero problema: dilución 1:50

A-adicionar 200 microlitros de la dilución buffer a cada pozo de la microplaca.


Importante “empieza por el pozo a4 y termina en el h9”.

B-adición 4 microlitros del suero problema a la microplaca, (dilución 1:50).


Importante (a) “empieza por el pozo a4 y termina en el h9”; (b) de izquierda a
derecha.

c-preparación de la solución lavadora:


Diluir 1 ml de la sol. Concentrada en 19 ml de h2od.
(400 ml para una placa)

D-solución detenedora:
Diluir 1 ml de la sol. Concentrada en 4 ml de h2od.
(15 ml para una placa)

e-controles: (1:100)
Diluir 1:100 los controles positivos y negativos respectivamente con solución
amortiguadora.
(300 ml por control para una placa)

Solución del conjugado: (1:100)


Agregar 100 microlitros del conjugado más 10 ml de solución amortiguadora.
(10 ml para una placa)

Solución de substrato: no requiere dilución posterior.

Procedimiento: II.

1. Verificar que la bolsa de la placa de ELISA no se encuentre rota o adulterada,


verificando también el indicado de humedad.

2. Agregar 50 microlitros de la “dilución amortiguadora” a todos los pozos de la


placa, exceptuando los pozos número a1, a2, a3, h10, h11 y h12.

3. Agregar 100 microlitros del “suero diluido control negativo” en los pozos a2,
h10 y h12.

4. Agregar 100 microlitros del suero “diluido control positivo” en los pozos a1, a3
y h11.
5. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 50 microlitros pro pozo de los
sueros problema diluido de la placa dilución a la placa-ELISA cubierta de un
antígeno. (Dilución final de 1:100. Realiza con rapidez y mucho cuidado).

6. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

7. Verter el total de la placa de ELISA en un contenedor con solución clorinada,


lavar con la “solución lavadora” cada uno de los pozos con aproximadamente
300 microlitros de esta; dejar la solución en reposo por dos minutos.

“o utilizar una máquina lavadora automática de microplacas”.

8. Repetir el paso 7, dos veces.

9. utilizando una micropipeta multicanal transfiere 100 microlitros del “conjugado


diluido” en todos y cada uno de los pozos de la placa de ELISA.

10. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

11. Verter el total de la placa de ELISA en un contenedor con solución clorinada,


lavar con la “solución lavadora” cada uno de los pozos con aproximadamente
300 microlitros de esta; dejar la solución en reposo por dos minutos.

“o utilizar una máquina lavadora automática de microplacas”.

12. Repetir el paso 7, dos veces.

13. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 100 microlitros del “solución-
substrato” en todos y cada uno de los pozos de la placa de ELISA.

14. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

15. Utilizando una micropipeta multicanal transfiere 100 microlitros del “solución-
detenedora” en todos y cada uno de los pozos de la placa de ELISA.

16. Una vez disipadas las burbujas leer la placa en el lector-de ELISA, a 405nm.

PREGUNTAS:

1. ¿Por la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente, y no a temperaturas


de incubación de 38 grados centígrados?
2. ¿Qué significa un sistema de ELISA competitivo y no competitivo?
3. Investiga la sensibilidad y especificidad de la técnica de ELISA.
4. Indica tres ventajas y tres desventajas de ELISA.
LITERATURA CITADA

 BATALLA, C.D.: LA RABIA, I.N.P.; D.S.R.H., MÉXICO 1982.

 COOPER, N.R.: EL SISTEMA DEL COMPLEMENTO, MANUAL MODERNO,


MÉXICO 1985.

 CUNNINHAM.: VIROLOGÍA PRÁCTICA, MÉXICO 1983.

 FRIEDMAN H., ROSE, N.: MANUAL OF CLINICAL LABORATORY


IMMUNOLOGY; THIRD EDITION. A.S.M. 1986, U.S.A.

 HERBERT, W.J.: INMUNOLOGÍA VETERINARIA. ACRIBA, 1972.

 HITCHNEZ, S.: IDENTIFICATION OF AVIAN, PATHOGENES AMERICAN


ASOCIATION OF AVIAN, PAT. U.S.A. 1989.

 MARAMOROSH.: METHODS IN VIROLOGY, ACADEMIC PRESS 1987.

 MEMORIAS DEL CURSO DE ACTUALIZACIÓN SOBRE TOXICOLOGÍA E


INMUNOLOGÍA AVIAR, ANECA, MÉXICO, D.F., 1986.

 MONTHAY.: VIROLOGÍA VETERINARIA, INTERAMERICANA, MÉXICO 1983.

 MORILLA.: MANUAL DE INMUNOLOGÍA, DIANA, MÉXICO 1986.

 ROJAS, M.: INMUNOLOGÍA, 8° EDICIÓN C.I.B. MEDELLÍN COLOMBIA.

 TIZARD.: INMUNOLOGÍA VETERINARIA, INTERAMERICANA 1984.

 WERB, Z.: CELULAS FABOCITICAS EN INMUNOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA.


MANUAL MODERNO 1985.

 WOOS, W.B.: MICROBIOLOGY. HARPER AND ROW PUBLISHERS, 1980.

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