Víctor Hugo García Martínez

La proteína del virus X de la hepatitis B promueve las propiedades

semejantes a las de las células cancerosas OV6 + en el carcinoma
hepatocelular

Chao Wang1,2,7, Ming-da Wang3,7, Peng Cheng4,7, Hai Huang5, Wei Dong6, Wei-wei
Zhang4, Peng-peng Li1, Chuan Lin1, Ze-ya Pan1, Meng-chao Wu3 y Wei- Ping zhou1
1. El Tercer Departamento de Cirugía Hepática, Hospital Hepatobiliar Oriental, Segunda
Universidad Médica Militar, 225 Changhai Road, Shanghai 200438, China
2. Departamento de Urología, Hospital Changhai, Segunda Universidad Médica Militar, 168
Changhai Road, Shanghai 200438, China
3. 3El Departamento de Cirugía Hepática, Hospital Hepatobiliar Oriental, Segunda Universidad
Médica Militar, 225 Changhai Road, Shanghai 200438, China
4. Hospital de 4Changhai, Segunda Universidad Médica Militar, 168 Changhai Road, Shanghai
200438, China
5. Hospital 5Changzheng, Segunda Universidad Médica Militar, Fengyang Road Shanghai
200003, China
6. Científico de 6Data, Grupo Mutual de la Libertad, 157 Berkeley Street, Boston, MA 02116,
EE.UU.
Correspondencia: W-p Zhou, El Tercer Departamento de Cirugía Hepática, Hospital
Hepatobiliar Oriental, Segunda Universidad Médica Militar, 225 Changhai Road, Shanghai
200438, China. Tel .: +86 21 81875521; Fax: +86 02181875529; E-mail: ehphwp@126.com
Estos autores contribuyeron igualmente al estudio.
Recibido el 4 de octubre de 2016; Revisado el 20 de diciembre de 2016; Aceptado el 21 de
diciembre de 2016
Editado por A Oberst
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Abstracto

La proteína X del virus de la hepatitis B (HBx) y las células semejantes al tallo

del cáncer (SCC) han sido implicadas en la aparición y desarrollo de un
carcinoma hepatocelular (HCC) relacionado con el VHB. Sin embargo, si HBx
contribuye a la raíz-como las propiedades de OV6 + CSC en HCC sigue siendo
difícil de alcanzar. En este estudio, se demostró que la expresión concomitante
de HBx y OV6 se asoció estrechamente con los resultados clínicos y el
pronóstico de los pacientes con HCC relacionados con HCC. HBx fue
necesario para el tallo de las propiedades de OV6 + hígado CSCs, incluyendo
la auto-renovación, la expresión de genes asociados a células madre,
tumorigenicity y chemoresistance. Mecanicamente, HBx aumentó la expresión
de MDM2 mediante la unión directa con MDM2 y la inhibición de su auto-
degradación dirigida ubiquitina. MDM2 translocación en el núcleo también fue
upregulated por HBx y dio lugar a una mayor actividad transcripcional y la
expresión de CXCL12 y CXCR4 independiente de p53. Este cambio en la
expresión activó la vía Wnt / β-catenina y promovió el tallo de las propiedades
de OV6 + hígado CSCs. Además, se observó que la expresión de dos
indicadores del eje HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 en las biopsias de CHC podría
predecir el pronóstico de los pacientes con HCC relacionados con HBV. En
conjunto, nuestros hallazgos indican el papel funcional de HBx en la regulación
del tallo de las propiedades de OV6 + CSC en HCC a través de la MDM2 /
CXCL12 / CXCR4 / β-catenina eje de señalización e identificar HBx, MDM2,
CXCR4 y OV6 como un nuevo pronóstico Y potenciales dianas terapéuticas
para pacientes con HCC relacionados con HCC pacientes.
El cáncer de hígado es la segunda causa principal de muerte por cáncer en
hombres en todo el mundo.1 El carcinoma hepatocelular (HCC) es el tipo más
 Víctor Hugo García Martínez

común de cáncer de hígado primario.2 La infección crónica con el virus de la

hepatitis B (VHB) Se sabe que la proteína X del virus de la hepatitis B (HBx),
codificada por el VHB, es necesaria en la aparición y desarrollo de HCC.4
Nuestro grupo ha demostrado que la HBx promueve la expansión y
tumorigenicidad de las células progenitoras hepáticas (HPC) . La evidencia de
acumulación sugiere que HBx modula las actividades transcripcionales de
muchos genes implicados en la supervivencia celular y la apoptosis mediante la
interacción con ciertos componentes de las vías de señal como Nrf2 y β-
catenina.6, 7 Además, HBx regula la degradación de varias proteínas,
incluyendo c-Myc, al interactuar con componentes del sistema ubiquitina-
proteasoma.8 Sin embargo, los mecanismos moleculares involucrados en la
asociación de HBx con la hepatocarcinogénesis relacionada con el VHB siguen
siendo esquivos.

Aunque la resección quirúrgica y el trasplante hepático son tratamientos curativos para

los pacientes con HCC, la mayoría de los HCC son propensos a invasión y metástasis,
y el pronóstico a largo plazo sigue siendo insatisfactorio. Para los pacientes en
estadios avanzados de HCC, la quimioembolización transarterial (TACE) es el
tratamiento de segunda línea, pero su efecto global es menos satisfactorio debido a la
alta quimiorresistencia del tumor.9 Por ello, Por ejemplo, la proteína angiopoyetina-1
(ANGPTL1) inhibe la resistencia al sorafenib y la stemness del cáncer en las células
HCC mediante la represión de las células tipo HCC.10, EMT.11 Por lo tanto, es
esencial para comprender a fondo el mecanismo molecular subyacente CSCs en la
progresión de HCC para desarrollar estrategias terapéuticas más eficaces.
La teoría CSC propone que CSCs se definen como una subpoblación de células en
tumores que comparten similitudes con las células madre normales, como la
capacidad de auto-renovación. La existencia de CSCs se informó por primera vez en
la leucemia mieloide aguda12 y más recientemente en varios tumores sólidos,
incluyendo los del cerebro, el hígado y el pecho13,14,15. Recientemente, CSCs en
HCC han sido identificados por antígenos de superficie celular como CD133, EpCAM
Estudios anteriores llevados a cabo por nuestro grupo y otros también identificaron
OV6 como un marcador para CSCs en HCC y demostraron que las células de cáncer
de OV6 + promovieron la progresión de HCC a través del receptor de quimioquinas
CXC de tipo 4 (CXCR4) y CXC4 Su ligando especıfico CXCL12 (SDF-1) 20. La ruta
CXCR4 / CXCL12 ha estado implicada en las propiedades invasivas y de stemness del
cáncer.21 Al activar CXCL12, CXCR4 activa diferentes vıas tales como las vıas PI3K /
AKT y Wnt / β-catenina , Ambos de los cuales contribuyen al mantenimiento de las
propiedades del tallo de CSC.22 Sin embargo, todavía hay una comprensión limitada
de los mecanismos moleculares que subyacen CSCs en la invasión y metástasis de
HCC.

En el presente estudio, hemos demostrado que concomitante HBx y OV6 expresión se

correlacionó estrechamente con las características clínico-patológicas y el pronóstico
de los pacientes con HCC relacionados con HBV. Se utilizaron microarrays de
expresión génica para demostrar que MDM2 era el gen crítico implicado en la
carcinogénesis de HCC. MDM2 es un oncogén originalmente identificado como
amplificado en cromosomas de doble minuto en fibroblastos de ratón transformados.23
MDM2 ha demostrado tener un papel importante en cánceres, células madre y células
madre de cáncer.24, 25, 26 Además, MDM2 es un Miembro de la familia de dedos
RING de E3 ubiquitina ligasas y regula negativamente la proteína supresora de
tumores p53.27 Sin embargo, estudios recientes han demostrado que MDM2 también
ejerce actividades independientes de p53.28 En nuestro modelo, se demostró que
MDM2 era necesario para que HBx regular Las características de vástago de OV6 +
hígado CSCs de una manera independiente de p53. Nuestros hallazgos también
 Víctor Hugo García Martínez

mostraron que el HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 eje podría servir como un indicador
pronóstico de HBV relacionados con HCC pacientes.

Resultados

La elevada expresión concomitante de HBx y OV6 predice un mal pronóstico para los
pacientes con HCC relacionado con HBV
Nuestros resultados anteriores han demostrado que el HBx puede promover la
expansión y la transformación maligna de los HPC, lo que contribuye a la
tumorigenicidad impulsada por HBx.5 En este estudio, investigamos más el papel
potencial de la HBx en la regulación putativo CSC hepáticos. En primer lugar, se
determinó la expresión de HBx y OV6 en 267 pacientes con HCC primario utilizando
microarrays de tejidos (TMAs) (Figuras 1a yb). En primer lugar, se determinó la
expresión de OV6 como un nuevo biomarcador de la subpoblación CSC hepático en
HCC. Se observó una correlación positiva entre la expresión de HBx y OV6 en
muestras de HCC relacionadas con HBV (coeficiente de Phi = 0,282, p <0,0001, figura
1c). Basados en la expresión de HBx y OV6, los 267 pacientes se dividieron en cuatro
grupos: I (n = 72), HBxhigh y OV6high; II (n = 63), HBxhigh y OV6low; III (n = 34),
HBxlow y OV6high; Y IV (n = 98), HBxlow y OV6low (Tabla 1). En pacientes con
HBxhigh HCC, el porcentaje con tinción alta de OV6 fue casi el doble que en el grupo
HBxlow (53,33% frente a 25,76%, Figura 1d). Además, en comparación con los otros
grupos, los pacientes HBxhigh / OV6high mostraron características clinicopatológicas
mucho más agresivas como la positividad del antígeno de la envoltura de la hepatitis B
(P = 0,021), el tamaño del tumor (P <0,001), el tumor (P = 0,004) y la invasión
microvascular (P <0,001, Tabla 1). Más importante aún, las diferencias en la
supervivencia global (OS) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS) fueron
significativas entre estos cuatro grupos (Figuras 1e yf). Además, el análisis
multivariante indicó que junto con elevación de los niveles de OV6 y el aumento del
número de tumores, upregulated HBx niveles de expresión fueron un factor de riesgo
independiente de ambos OS y DFS en pacientes con HCC (Figura 1g). En conclusión,
la sobreexpresión concomitante de HBx y OV6 puede servir como un pronóstico
pronóstico eficaz para pacientes con HCC relacionados con HBV.

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Figure 1.

La elevada expresión concomitante de HBx y OV6 predice un mal pronóstico para los
pacientes con HCC relacionado con HBV. (A) Los niveles de expresión de ARNm de
HBx en 267 especímenes primarios de HCC se evaluaron mediante qRT-PCR. Los
niveles de mRNA de β-actina se usaron como control interno. El nivel de expresión de
HBx se determinó usando el método delta-delta Ct. (B) Se aplicaron secciones de TMA
de HCC para tinción inmunohistoquímica (IHC) para la expresión de OV6 (n = 267). La
intensidad de tinción de OV6 se puntuó de 0 a 3. Se muestran imágenes
 Víctor Hugo García Martínez

representativas de IHC de tinción con OV6 en muestras de HCC (barra de escala = 50

μm). (C) Análisis de correlación de la expresión de HBx y OV6 en tejidos de CHC
(Coeficiente de Chi = 0,282; P <0,0001). D) El porcentaje de pacientes con tinción de
OV6 relativamente alta fue mucho mayor en el grupo de HBx-alto comparado con el
grupo de HBx-bajo (53,33 contra 25,76%). (Ey f) Se compararon las tasas de
supervivencia global (OS) y supervivencia libre de enfermedad (DFS) de 267 pacientes
con CHC entre diferentes grupos. G) Análisis multivariado de las razones de riesgo
(HR) para la supervivencia global y la recurrencia tumoral. Se realizaron análisis de
riesgo proporcional univariante de Cox (PH) para cada variable y covariable. Se
estableció un modelo multivariado de regresión de Cox PH, y los HR se presentaron
como los medios (intervalo de confianza del 95%). Sólo las variables que cumplieron
con la suposición de PH en el análisis univariado se incluirían en el análisis
multivariante de Cox PH

TABLA 1

DE: La proteína del virus X de la hepatitis B promueve las propiedades semejantes a

las de las células cancerosas OV6 + en el carcinoma hepatocelular Wang Chao, Ming-
da Wang, Peng Cheng, Hai Huang, Dong Wei, Wei-wei Zhang, Peng-peng Li, Chuan
Lin, Pan Ze-ya, Meng-chao Wu y Wei-ping Zhou

Tabla 1. Características clínico-patológicas de los subtipos de CHC definidos por la

expresión de OV6 y HBxFigures and tables index

OV6/HBx expression

Either high

Both high High HBx, low High OV6, low Both low P-
HCC subtypes
(n=72) OV6 (n=63) HBx (n=34) (n=98) valuea

Sex

Male 63 54 28 91 0.307

Female 9 9 6 7

Age (year)b 51.6±1.2 49.6±1.3 48.6±1.9 50.4±1 0.487

HBeAg positive

Yes 25 10 4 20 0.021
 Víctor Hugo García Martínez

OV6/HBx expression

Either high

Both high High HBx, low High OV6, low Both low P-
HCC subtypes
(n=72) OV6 (n=63) HBx (n=34) (n=98) valuea

No 47 53 30 78

AFP (ng/ml)

400 54 34 20 59 0.066

< 400 18 29 14 39

Tumor size (cm)b 7.6±0.5 5.5±0.4 7.4±0.7 4.9±0.3 <0.001

Tumor number
1.3±0.1 1.2±0.1 1.4±0.1 1.1±0.03 0.004
(count)b

Tumor differentiation grade

Well (I) 0 0 1 2 0.369

Intermediate (II–
72 63 33 96
III)

Tumor satellites

Yes 49 45 28 69 0.493

No 23 18 6 29

Microvascular Invasion

Yes 51 45 23 44 <0.001

No 21 18 11 54
 Víctor Hugo García Martínez

OV6/HBx expression

Either high

Both high High HBx, low High OV6, low Both low P-
HCC subtypes
(n=72) OV6 (n=63) HBx (n=34) (n=98) valuea

Recurrence

Yes 66 33 27 41 <0.001

No 6 30 7 57

Expired

Yes 67 24 24 16 <0.001

No 5 39 10 82

Risk-free survival
12.1±1.8 38.5±3.2 20.1±3.9 47.7±2.2 <0.001
time (mo)b

Overall survival time

20.3±2 48.8±2.7 29.1±4.2 59.4±1.3 <0.001
(mo)b

A La significación estadística se calculó mediante la prueba chi cuadrada o la prueba

exacta de Fisher para medidas categóricas / binarias y ANOVA para medidas
continuas. Los datos se presentan como media ± DP.

HBx mejora las propiedades similares a las células madre y el potencial

tumorigénico de las CSC del hígado OV6 +

A continuación, exploró si la sobreexpresión de HBx podría afectar a las

características de vástago de OV6 + hígado CSCs. Utilizando un enfoque basado en
lentivirus, se infectaron células HCC humanas con construcciones que contenían
lentivirus que expresan HBx (LV-HBx) o vectores vacíos (LV-Con) y líneas de células
HCC establecidas (SMMC-7721 y Huh7) que expresan de forma estable HBx Figura
S1). Los resultados de la citometría de flujo revelaron que la sobreexpresión de HBx
contribuyó a la expansión de la población de OV6 + dentro del conjunto de células
HCC totales (Figura 2a). Por otra parte, OV6 + células seleccionadas magnéticamente
de LV-HBx HCC líneas celulares, mostraron aumento stemness relacionados con los
genes (Figura 2b]. A continuación realizamos ensayos de formación de esferoides in
vitro para comprobar si HBx podía regular la auto-renovación de CSCs hepáticas.
 Víctor Hugo García Martínez

Como era de esperar, las células OV6 + seleccionadas magnéticamente a partir de

líneas celulares LV-HBx HCC eran propensas a formar más esferas tumorales cuando
se comparaban con células OV6 + ordenadas a partir de líneas celulares HCC LV-Con
(Figura 2c). Además, la resistencia a fármacos es otra propiedad importante de CSCs
y puede contribuir al fracaso quimioterapéutico y la recaída de tumores.29, 30 Para
probar si HBx podría manipular la quimiorresistencia de CSC hepáticas, las líneas
celulares LV-HBx HCC se trataron con agentes quimioterapéuticos comúnmente
utilizados en Tratamiento TACE, incluyendo pirarubicina, oxaliplatino e
hidroxicamptotecina (HCPT). Los resultados de la citometría de flujo revelaron que
HBx obviamente enriqueció la subpoblación OV6 + quimio-resistente (Figura 2d y
Figura 2A) y aumentó la capacidad de supervivencia celular de estas células después
de la exposición a fármacos anticancerígenos (Figura 2e y Figura 2B suplementaria),
sugiriendo la crítica Papel de HBx en la regulación de quimiorresistencia de OV6 +
hígado CSCs.

Figure 2.

El HBx mejora las propiedades de las células madre y el potencial tumorigénico

de las CSC del hígado OV6 +.

(A) El porcentaje de células OV6 + entre las células SMMC-7721 y Huh7 que
expresaban establemente LV-HBx o LV-Con se midió mediante citometría de flujo y se
presentó como un análisis de diagrama de puntos. Las imágenes representativas se
muestran en el panel izquierdo. Los experimentos se realizaron por triplicado, y todos
los datos se muestran como la media \ pm S.D. * P <0,05 y *** P <0,001. (B) Se
midieron los niveles de expresión de mRNA de múltiples genes relacionados con el
stemness en células LV-HBx OV6 + o LV-Con OV6 + clasificadas magnéticamente de
cultivos SMMC-7721 y Huh7 mediante qRT-PCR. El cambio de pliegue se determinó
usando el método delta-delta Ct. Los niveles de mRNA cuantificados se normalizaron
a β-actina y se presentaron en relación con los controles. Los datos se presentan
como la media ± DP. ** P <0,01 y *** P <0,001. (C) Se muestran imágenes
representativas de pasajes primarios y secundarios de esferas de HCC derivadas de
células HCC-LV-HBx OV6 + y LV-Con OV6 + seleccionadas magnéticamente (Barra
de escala = 50 \ mu m, panel superior) y se contó el número de esferoides tumorales
(Panel inferior). Los experimentos se realizaron por triplicado, y los resultados
muestran la media ± DP. * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001. (D) Las células HCC
infectadas con LV-HBx o LV-Con se trataron con pirarubicina 5 μM durante 4 días y el
porcentaje de células OV6 + se detectó mediante citometría de flujo. Se muestran los
resultados representativos de tres experimentos independientes. (E) Las células OV6
+ HCC se trataron con 5 μM de pirarubicina y la viabilidad celular se midió usando el
ensayo de CCK-8 en los puntos de tiempo indicados. ** P <0,05 y *** P <0,001. (Fyg)
Se inyectaron subcutáneamente ratones NOD / SCID macho con el número indicado
 Víctor Hugo García Martínez

de células OV6 + HCC infectadas con LV-HBx o LV-Con, y se evaluó la incidencia de

tumores en los xenoinjertos de ratón. Se muestran tumores subcutáneos
representativos de xenoinjerto de ratones inyectados con una serie de gradiente de
células OV6 + infectadas con lentivirus después de 6 semanas de trasplante. El
porcentaje de CSC presentes se evaluó 6 semanas después de la inyección mediante
un ensayo de dilución limitante

A continuación, realizamos ensayos de xenoinjerto utilizando una serie de gradiente de

OV6 + subpoblaciones clasificadas de HCC-LV-HBx o HCC-LV-Con células. Como se
muestra en las Figuras 2f y g, la inyección subcutánea de células OV6 + HCC que
expresan HBx dio como resultado una incidencia aumentada de tumorigenicidad, lo
que indica que la sobreexpresión de HBx podría aumentar la tumorigenicidad de las
subpoblaciones OV6 + in vivo. En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la HBx es
necesaria para la expansión y el mantenimiento de putativo OV6 + hígado CSCs.

MDM2 se identifica para ser regulado por HBx en OV6 + hígado CSCs

MDM2 se identifica para ser upregulated por HBx en OV6 + hígado CSCs Para
elucidar los mecanismos subyacentes por los que HBx regula las propiedades de
vástago de OV6 + hígado CSCs, utilizamos genes de expresión de microarrays para
diferenciar genes expresados en OV6 + / LV-HBx HCC células en comparación con los
niveles en LV-Con infectados por OV6 + células. Utilizando un límite de 2 veces con
un valor de P <0,05, se identificó un total de 544 genes que se expresaban
diferencialmente entre las células HuH7 de OV6 + que expresaban el vector vacío y
las células que expresaban HBx (163 downregulated, 381 upregulated, Figura 3a) . Se
utilizó un mapa de calor de agrupamiento jerárquico para mostrar los patrones de
expresión de mRNA distinguibles entre estas muestras (Figura 3b). A continuación,
realizó Gene Ontología (GO) y la vía de análisis para determinar los roles funcionales
de estos expresados diferencialmente genes en GO términos y vías biológicas,
respectivamente. Como se muestra en la Figura Suplementaria S3A, la mayoría de los
términos enriquecidos GO para los procesos biológicos dirigidos por genes
desregulados estaban estrechamente relacionados con la respuesta inflamatoria, la
respuesta de daño del ADN, y la proliferación celular. Un análisis detallado de la vía
reveló el enriquecimiento de las vías de señalización que corresponde principalmente
a la adhesión celular, la vía de señalización p53 y las interacciones de los receptores
de citoquinas (Figura complementaria S3B). A continuación exploramos las posibles
interacciones biológicas de estos genes regulados diferencialmente utilizando
Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Se estableció la red de transducción de señal de
mayor clasificación entre los genes desregulados en células que expresan OV6 + /
HBx. Curiosamente, el análisis de la API también identificó MDM2 como la molécula
más alta de la cadena ascendente en esta red (Figura 3c]. El aumento de la evidencia
ha demostrado que MDM2 es frecuentemente sobreexpresado en la mayoría de las
malignidades y promueve el desarrollo del tumor mediante la regulación negativa de la
vía p53.31, 32, 33 Para corroborar nuestros resultados de detección, qRT-PCR y
western blot ensayos se realizaron para verificar la expresión de MDM2 en células
OV6 + ordenadas que expresan HBx o el vector de control. Como era de esperar,
MDM2 fueron significativamente upregulated en OV6 + / LV-HBx HCC células en
comparación con las de las células de control (Figuras 3d y e). A continuación, se
verificó esta correlación en los tejidos clínicos y realizado IHC para determinar los
niveles de expresión de MDM2 en HCC TMA (Figura 3f]. Como se predijo, la expresión
de MDM2 se asoció con el contenido de HBx en las biopsias clínicas HCC
relacionadas con HCC (coeficiente de Phi = 0,595, P <0,0001, Figura complementaria
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S3C). Del mismo modo, también se observó una correlación significativa entre la
expresión de MDM2 y OV6 (coeficiente de Phi = 0,208, P = 0,001, Figura
complementaria S3D). Los datos clínicos revelaron además que los pacientes HCC
relacionados con HBV con niveles elevados de HBx y MDM2 presentaban un OS peor
y un período de supervivencia libre de enfermedad más corto que otros pacientes
(Figura 3g y Tabla Suplementaria S1). Mientras tanto, la sobreexpresión concomitante
de MDM2 y OV6 predijo una recaída tumoral rápida y un mal pronóstico para los
pacientes con HCC relacionados con VHB (Figura 3h y Tabla Suplementaria S2). En
conjunto, estos datos sugieren fuertemente que el HBx puede promover la expansión
de OV6 + hígado CSCs de un modo MDM2-dependiente.

Figure 3.

MDM2 se identifica para ser upregulated por HBx en OV6 + hígado CSCs. (A) La
expresión génica se evaluó en muestras de células HCC utilizando microarrays del
genoma (Agilent Technologies, n = 3 microarrays / grupo). Se muestra una distribución
del diagrama de dispersión de transcritos de mRNA expresados diferencialmente entre
dos grupos de muestras (OV6 + / LV-HBx frente a células OV6 + / LV-Con). Los
valores de los ejes x representan los valores promediados de la señal normalizada
(escala log2). Las líneas verdes representan el cambio de pliegue (el valor
predeterminado de cambio de pliegue dado es 2). Los ARNm marcados con "rojo"
indicaron un cambio mayor de 2 veces de expresión de mRNA entre los dos grupos de
muestras comparados. (B) El mapa de calor y el agrupamiento jerárquico muestran un
perfil de expresión de ARNm distinguible entre las muestras. 'Rojo' indica alta
expresión relativa, y 'azul' indica baja expresión relativa. X1-X3 representan muestras
de células OV6 + / LV-HBx Huh7, y P4-P6 representan muestras de células OV6 + /
LV-Con. (C) Se dibujó la red de interacción entre los transcritos expresados
diferencialmente seleccionados en los experimentos de microarrays (círculos rojos:
genes regulados de forma ascendente, círculos azules: genes regulados
negativamente). (D) Los niveles de ARNm de MDM2 en células OV6 + SMMC-7721 y
Huh7 que expresan vector vacío y HBx se detectaron mediante qRT-PCR. El cambio
de pliegue se determinó usando el método delta-delta Ct. Los niveles de mRNA
cuantificados se normalizaron a β-actina y se presentaron en relación con los
controles. Los datos se presentan como la media \ pm S.D. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;
0,01. (E) Los niveles de expresión proteica de MDM2 en las células OV6 + indicadas
que expresan vector vacío y HBx se detectaron mediante transferencia Western. Β-
actina se utilizó como control de carga interna. (F) Las secciones de TMA de
especímenes de HCC se sometieron a IHC para determinar la expresión de MDM2 (n
= 267). Se muestran niveles representativos de expresión de MDM2 en las secciones
de TMA de HCC de 267 pacientes (escala bar = 20 μm). La intensidad de tinción de
MDM2 se puntuó de 0 a 3. (gyh) Se compararon las tasas de supervivencia global
(OS) y supervivencia libre de enfermedad (DFS) de 267 pacientes con HCC entre los
cuatro grupos diferentes indicados
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MDM2 es necesario para que la HBx promueva las propiedades tipo tallo de OV6
+ hígado CSCs
Para verificar aún más el papel esencial de MDM2 en la expansión inducida por HBx
de OV6 + hígado CSCs, que derribó MDM2 expresión en LV-HBx-HCC infectadas con
células pequeñas ARN interferente (siRNA). Como se muestra en las Figuras 4a yb,
tanto la secuencia 1 como la secuencia 3 provocaron un efecto de desmontaje estable.
MDM2 ha sido reconocido como un regulador negativo del supresor tumoral p53, que
participa en la tumorigénesis y la progresión de los cánceres.31, 32 Por lo tanto, se
investigó si la participación de MDM2 en el mantenimiento de la HBx mediada por el
tallo de las propiedades OV6 + CSCs fue Dependiente de p53. Se seleccionaron tres
líneas celulares HCC con diferentes estados de expresión p53 (HepG2, p53 de tipo
salvaje, Huh7, mutante p53 y Hep3B, deleción p53) para experimentos funcionales. El
análisis de qRT-PCR reveló que los niveles de ARNm de los genes relacionados con
el stemness fueron regulados positivamente en células HCC infectadas con OV6 + /
LV-HBx, mientras que el silenciamiento con MDM2 dio como resultado una expresión
significativamente disminuida de estos genes independientemente del estado p53
(Figura 4c). Además, la expresión exógena de HBx aumentó la capacidad de
formación de la esfera tumoral en células OV6 + HCC, mientras que la regulación
negativa de MDM2 abolió este efecto (Figura 4d). A continuación, evaluamos si el
agotamiento de MDM2 podría perjudicar el potencial tumorigénico mediado por HBx de
OV6 + CSC in vivo mediante el uso de un ensayo de dilución limitante. En
comparación con las células OV6 + clasificadas a partir de células HCC transducidas
con LV-Con, un número equivalente de células OV6 + / LV-HBx HCC mostraron mayor
capacidad para formar xenoinjertos en ratones NOD / SCID. Por el contrario, MDM2
knockdown disminuyó la tumorigenicidad de OV6 + / LV-HBx células en nuestro
modelo de xenoinjerto (Figura 4e]. Por lo tanto, estos datos indican que el MDM2
promueve la expansión inducida por HBx de las CSC del hígado OV6 + de una
manera independiente de p53.

Figure 4.

HBx media la capacidad de auto-renovación y tumorigenicity de OV6 + hígado CSCs a

través de MDM2 independiente de p53. (A y b) Las células OV6 + HCC aisladas
(HepG2, Huh7 y Hep3B) que se expresaron de forma estable HBx fueron
transfectadas con siRNAs de control negativo (siCtrl) o siRNAs dirigidos a MDM2 (tres
secuencias: # 1, # 2, # 3) ARNm y la eficiencia de knockdown proteína de MDM2 se
detectó por qRT-PCR y western blotting, respectivamente. Los datos en (a) se
presentan como la media \ pm S.D. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01. (C) Se midieron los
niveles de expresión de mRNA de múltiples genes relacionados con stemness en
células que expresan OV6 + HBx transfectadas con ARNsi dirigidas a MDM2
(secuencias: # 1 y # 3) mediante qRT-PCR. El cambio de pliegue se determinó usando
el método delta-delta Ct. Los niveles de ARNm cuantificados se normalizaron a β-
actina y se presentaron en relación con el valor observado en las células que no
expresan HBx no transfectadas. Los datos se presentan como la media ± DP. * P
 Víctor Hugo García Martínez

<0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001 en comparación con células OV6 + / LV-Con HCC. (D)
Se muestran imágenes representativas de pases primarios y secundarios de esferas
de HCC derivadas de las células HCC indicadas (escala bar = 50 μm, panel superior) y
se contó el número de esferoides tumorales (panel inferior). Todos los datos se
presentan como la media ± DP. * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001. (E) se inyectaron
subcutáneamente ratones NOD / SCID con los diferentes números de células OV6 +
LV-Con y LV-HBx transfectadas con siARN de control negativo o siMDM2 # 3 y se
evaluó la incidencia de tumores en los xenoinjertos de ratón. El porcentaje de CSC se
evaluó 6 semanas después de la inyección mediante un ensayo de dilución limitante

HBx regula la expresión de MDM2 mediante la inhibición de su auto-

ubiquitinacion y degradación

Debido a que MDM2 es necesario para HBx para promover el tallo-como las
características de OV6 + hígado CSCs, examinamos los mecanismos subyacentes a
la actividad mediada por HBx MDM2. Primero, determinamos si HBx podría interactuar
directamente con MDM2. Un ensayo de tinción de inmunofluorescencia mostró la co-
localización de HBx y MDM2 en el citoplasma y los núcleos de células OV6 + HCC
(Figura 5a], lo que sugiere la interacción directa entre HBx y MDM2. Además, el
ensayo de coinmunoprecipitación reveló que HBx y MDM2 interactuaron fuertemente
entre sí en OV6 + CSCs clasificadas de células HCC que expresan HBx (Figura 5b).
Dado que MDM2 es una proteína inestable que puede ser ubiquitinated de forma
autocatalítica, a continuación examinó si HBx inhibido la auto-ubiquitination de MDM2.
Western blot se llevó a cabo para demostrar que HBx mediada upregulation de MDM2
fue potenciado por MG132 (un inhibidor de proteasoma). Mientras tanto, este
upregulation no se bloqueó en presencia de cicloheximide (CHX), el inhibidor de la
síntesis de proteínas (Figura 5c]. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que HBx
regulado MDM2 degradación a través de una vía proteasomal-dependiente en lugar de
la síntesis de proteínas. Como se muestra en la Figura 5d, la ubiquitinación de MDM2
se redujo cuando HBx se sobreexpresó en células HCC. En conjunto, HBx aumenta la
expresión de MDM2 por la unión directa con MDM2 y la inhibición de su auto-
ubiquitination y las actividades de degradación.

Figure 5.

HBx regula expresión de MDM2 mediante la inhibición de su auto-ubiquitinacion y

degradación. (A) Las células OV6 + se clasificaron magnéticamente a partir de células
HepG2 y Huh7 que expresaban de forma estable HBx, seguidas de ensayos de
inmunofluorescencia. Las localizaciones de Flag-tagged HBx (rojo) y MDM2 (verde)
fueron detectados por microscopía confocal de barrido láser. Los núcleos se tiñeron
con colorante DAPI (azul) y se muestran imágenes representativas (escala bar = 10
μm). (B) Flag-HBx y HA-MDM2 se cotransfectaron en células HCC (HepG2 y Huh7) y
las células OV6 + se clasificaron magnéticamente desde la piscina de células 48 h
después de la transfección. Los lisados de células enteras se inmunoprecipitaron con
anticuerpo anti-HA marcado con agarosa o anticuerpo anti-Flag-tag, o inmunoglobulina
G de control, y se analizaron mediante transferencia Western. (C) Se trataron células
 Víctor Hugo García Martínez

de OV6 + HCC (HepG2 y Huh7) infectadas con LV-HBx o LV-Con con 1 μg / ml de

cicloheximida (CHX) o MG132 5 μM durante 12 h antes de recoger. A continuación, los
lisados celulares fueron sometidos a Western Blot. Β-actina se utilizó como control de
carga interna. (D) La ubiquitinación de MDM2 se mejoró después de la transfección
con HBx durante 48 h. Flag-HBx, HA-MDM2 y MYC-ubiquitin se cotransfectaron en
células 293T. A las 48 h después de la transfección, los lisados de células enteras se
inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HA marcado con agarosa y se analizaron
mediante transferencia Western con anticuerpos anti-HA-tag y anticuerpos anti-MYC

El bucle autocrino CXCL12 / CXCR4 es necesario para que HBx / MDM2 medie
las propiedades tipo tallo de las CSC de hígado OV6 +

Nuestro estudio previo demostró que la activación de CXCR4 mantenía la capacidad

de auto-renovación de las células OV6 + HCC.20 La vía CXCL12 / CXCR4 ha estado
implicada en varios tipos de cáncer.34 Tanto los efectos autocrinos como parácrinos
de esta vía han demostrado mantener el cáncer Crecimiento y progresión.35 Por lo
tanto, investigamos si HBx / MDM2 regulado el stemness de OV6 + CSCs a través de
la CXCL12 / CXCR4 vía. En primer lugar, CXCR4 expresión fue upregulated por HBx
en OV6 + CSCs en HCC, mientras que MDM2 knockdown invertido HBx mediada por
CXCR4 upregulation (Figuras 6a yb). Posteriormente, el enfoque de siRNA se utilizó
para inhibir la expresión de CXCR4 en células HCC (Figura complementaria S4A). El
número de esferas fue mayor en HBx-OV6 + expresando CSC en comparación con el
control OV6 + CSCs, mientras que CXCR4 knockdown eliminado HBx mediada por
autorrevestigación (Figura 6c]. Del mismo modo, la inhibición de CXCR4 con su
antagonista específico AMD3100 también atenúa la auto-renovación mediada por HBx
de OV6 + hígado CSCs (Figura 6d]. Además, el ensayo de qRT-PCR mostró que la
expresión de CXCL12 fue regulada positivamente por HBx en CSCs de hígado OV6 +,
pero el agotamiento de MDM2 abolió este efecto (Figura 6b). Para examinar la fuente
autocrina del ligando CXCL12 en CSCs OV6 + cultivadas, se realizó un ensayo ELISA,
que mostró que la proteína CXCL12 no se encontró en medio de control (es decir, sin
células) en comparación con medios acondicionados de CSCs de hígado OV6 +
cultivadas. 6e). Estos datos indicaron que la fuente in vitro de la proteína CXCL12 es
la OV6 + CSCs. Por otra parte, los niveles de proteína de CXCL12 se incrementaron
en medios acondicionados de OV6 + CSCs overexpressing HBx y disminución en los
medios de cultivo OV6 + CSCs con HBx expresión y MDM2 knockdown (Figura 6e).
Además, CXCL12 knockdown resultó en menos esferas en HBx que expresan OV6 +
CSCs, mientras que la auto-renovación inhibida fue rescatada por la adición de
CXCL12 proteína (Figura complementaria S4B y Figura 6f]. Estos datos indican que
CXCL12 es secretada por OV6 + CSCs y se requiere en la mediación de la HBx /
MDM2 inducida por el tallo de las propiedades de OV6 + hígado CSCs. Para confirmar
aún más que el efecto de CXCL12 sobre la auto-renovación de OV6 + CSCs que
expresan HBx es dependiente de CXCR4, también se añadió CXCL12 proteína a los
medios de cultivo de CXCR4-depleted HBx-OV6 + expresar células CSC. Como era de
esperar, no encontramos ninguna diferencia significativa en el número de esferas
después de la estimulación del ligando en comparación con las células de control
(Figura 6f]. Sin embargo, la inhibición de CXCR4 por AMD3100 perjudicó
significativamente el efecto de CXCL12 en la capacidad de auto-renovación de OV6 +
que expresan HBx CSCs (Figura 6g]. En resumen, estos datos demuestran que el
bucle autocrino CXCL12 / CXCR4 es crítico en la mediación de la inducción de HBx /
MDM2 de las propiedades tipo tallo de las CSC de hígado OV6 +.
 Víctor Hugo García Martínez

Figure 6.

El bucle autocrino CXCR4 / CXCL12 es requerido en la mediación HBx / MDM2 de las

propiedades tipo tallo de OV6 + CSCs. (A) Western blotting para evaluar la expresión
de MDM2, CXCR4 y Flag-HBx en OV6 + CSCs, OV6 + CSCs que sobreexpresaron
Flag-HBx y OV6 + CSC que sobreexpresaron Flag-HBx y MDM2 siRNA, que fueron
aislados magnéticamente de HepG2, Huh7 Y células Hep3B, respectivamente. (B) Se
utilizó un análisis cuantitativo por RT-PCR para evaluar la expresión de CXCR4 y
CXCL12 en CSCs OV6 +, OV6 + CSCs que sobreexpresaron Flag-HBx y OV6 + CSC
que sobreexpresaron ARNs Flag-HBx y MDM2 que se aislaron de células HepG2 y
Huh7 P <0,05). (C y d) Primaria y secundaria pasajes de expresar HBx OV6 + CSC de
las líneas celulares HepG2 y Huh7 generado más esferoides. Cuando MDM2 fue
derribado en HBx-OV6 + expresando CSCs por siRNAs (siCXCR4, secuencia # 2 y #
3) o AMD3100 tratamiento (20 μ g / ml), el número de esferas se redujo. Los
experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos representan la media ± DP,
* P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001. (E) El ensayo ELISA se realizó para medir el nivel
de proteína CXCL12 en PBS, medio solo (DMEM) y medio condicionado de OV6 +
CSCs y OV6 + CSCs que expresan HBx transfectadas con siRNA de control o ARNsi
dirigidos a MDM2 (* P <0,05, **) P <0,01 y *** P <0,001). El ensayo de esferoides se
usó para evaluar el número de esferas de CSV OV6 + que expresan HBx
transfectadas con siRNA de control (siCtrl), ARNsi que se dirigían a CXCL12
(secuencia # 3) o tratadas con proteína CXCL12 recombinante más ARNsi dirigida a
CXCL12 o CXCL12 recombinante Proteína más ARNsi dirigida a CXCR4. (G) El
ensayo de esferoides se realizó para evaluar el número de esferas de OV6 + CSCs
que expresan HBx tratados con proteína CXCL12 recombinante sola, o proteína
CXCL12 recombinante más AMD3100 a una concentración de 20 μg / ml. En f y g, los
experimentos se realizaron por triplicado. Se muestran los resultados representativos
de tres experimentos independientes y todos los datos se presentan como la media ±
DP, * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001

HBx / MDM2 inducida por regulación de CXCL12 / CXCR4 activa la vía Wnt / β-
catenina en OV6 + hígado CSCs

A continuación, determinó cómo HBx / MDM2 mediada CXCL12 / CXCR4 expresión.

En primer lugar, tinción de inmunofluorescencia mostró que la sobreexpresión de HBx
aumentó la cantidad de MDM2 localizados en el núcleo de OV6 + hígado CSC (Figura
7a]. En segundo lugar, se demostró que la sobreexpresión de HBx mejoraba la
activación transcripcional de CXCL12 y CXCR4 a través de ensayos de reportero de
luciferasa, mientras que el knockdown de MDM2 impidió la regulación positiva de la
transcripción inducida por HBx (Figura 7b). Nuestro estudio anterior demostró que el
eje CXCL12 / CXCR4 promovido auto-renovación y la migración de células OV6 + en
HCC. Además, la β-catenina tiene un papel vital en el mantenimiento de OV6 + CSC
 Víctor Hugo García Martínez

del hígado. Por lo tanto, nos preguntó si CXCL12 / CXCR4 mejorado el tallo-como las
propiedades de OV6 + hígado CSC mediante la activación de la Wnt / β-catenina vía.
En primer lugar, la transferencia de Western mostró que CXCL12 potenció la
expresión de β-catenina y ciclina D1, mientras que la depleción de CXCR4 bloqueó la
capacidad de CXCL12 para activar la vía Wnt / β-catenina en el HBx que expresan
OV6 + hígado CSC (Figura 7c). Además, se realizó el ensayo de formación de
esferoides para demostrar que el número de esferas de CSCs hepáticas OV6 + que
expresan HBx tratadas con CXCL12 era mayor que el de CSVs OV6 + no expresadas
que expresaban HBx. Sin embargo, CXCR4 knockdown atenuado el efecto de
CXCL12 en el aumento de la formación de esferoides tumorales en HBx-OV6 + que
expresan CSC (Figura 7d]. En conjunto, HBx mejora la activación transcripcional de
CXCL12 y CXCR4, que activan la vía Wnt / β-catenina en OV6 + hígado CSCs.

Figure 7.

La regulación positiva inducida por HBx / MDM2 de CXCL12 / CXCR4 activa

la vía de Wnt / β-catenina en CSV de hígado OV6 +. (A) Los ensayos de
inmunofluorescencia se realizaron utilizando las células OV6 + HCC (HepG2
y Huh7) infectadas con LV-HBx o LV-Con. La localización intracelular de
MDM2 (rojo) se detectó por microscopía confocal de barrido láser como se
indica. El núcleo se tiñó con un colorante DAPI (azul, escala bar = 10 \ mu
m). (B) Las células HV de OV6 + LV-Con y LV-HBx transfectadas con siRNA
de control negativo o siMDM2 se transfectaron con informadores de
luciferasa CXCL12 y CXCR4, seguido por ensayo de luciferasa. Los datos
muestran la media ± DP, * P <0,05 y ** P <0,01. (C) células HCC
sobreexpresivas de HBx tratadas con vehículo de control, proteína CXCL12
recombinante sola o proteína CXCL12 recombinante más ARNsi dirigida a
CXCR4 durante 48 h antes de recoger. Los niveles de expresión de las
moléculas indicadas en lisados de células enteras se detectaron mediante
transferencia Western. Β-actina se utilizó como control de carga interna. (D)
El ensayo de esferoides se realizó para evaluar el número de esferas de OV6
+ CSCs que expresan HBx tratados con vehículo de control, proteína
CXCL12 recombinante sola o proteína CXCL12 recombinante más ARNsi
dirigida a β-catenina. Los experimentos se realizaron por triplicado y todos
los datos representan la media ± DP, * P <0,05, ** P <0,01 y *** P
<0,001

La expresión de HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 predice características

clinicopatológicas malignas y un mal pronóstico para pacientes con HCC
relacionado con HBV

También examinamos la relación clínica entre la expresión de HBx / MDM2 / CXCR4 /

OV6 en muestras de pacientes con HCC relacionados con HBV. En primer lugar, qRT-
PCR y IHC análisis se realizaron en HCC muestras de 267 pacientes (Figura 8a], que
reveló una estrecha correlación entre HBx y CXCR4, MDM2 y CXCR4 y CXCR4 y OV6
 Víctor Hugo García Martínez

(P <0,0001) (Suplementario Figuras S5A-C ). En segundo lugar, se examinó si dos

indicadores entre HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 podría predecir las características
clinicopatológicas malignas, así como el pronóstico de los pacientes con HCC. Sobre
la base de sus niveles de expresión en los tumores, se encontró que la presencia de
dos indicadores entre HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 podría predecir las características
clinicopatológicas malignas y un mal pronóstico para los pacientes con HCC
relacionados con HBV (Figuras 8b-d y Tablas suplementarias S1-3). Estos resultados
sugieren que una combinación de cualquiera de los dos parámetros entre HBx / MDM2
/ CXCR4 / OV6 podría servir como un poderoso predictor de mal pronóstico, apoyando
aún más el papel crítico de HBx / MDM2 / CXCR4 de señalización en OV6 + células
cancerosas en la progresión de HCC.

Figure 8.

La expresión de HBx / MDM2 / CXCR4 / OV6 predice características clinicopatológicas malignas

y un mal pronóstico para pacientes con HCC relacionado con VHB. (A) Se muestra coloración
IHC representativa de MDM2, CXCR4 y OV6 en especímenes de HCC relacionados con HBV
(escala bar = 20 μm). Se compararon las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia global
(OS) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS) de acuerdo con las combinaciones de HBx y
CXCR4 (b), MDM2 y CXCR4 (c) y CXCR4 y OV6 expresión (d) para evaluar su pronóstico En
pacientes con CHC (n = 267)

Discusión

El carcinoma hepatocelular (CHC) comprende la mayoría de los casos de cáncer de

hígado, y las altas tasas de HCC en China reflejan en gran medida la elevada
prevalencia de la infección crónica por el virus de la hepatitis B (HBV ).36 HBx ha
demostrado tener papeles cruciales en la recaída y metástasis de HCC.37 Nuestro
estudio anterior demostró que HBx podría promover la expansión y tumorigenicity de
HPCs en ratones tratados con DDC. Cabe destacar que también se observó una
correlación positiva entre la expresión de HBx y OV6 en muestras de pacientes con
HCC relacionados con el HCC.5 Estos hallazgos sugieren que la HBx puede regular
las propiedades de los ovarios de OV6 + CSCs en el HCC relacionado con HBV. En
consonancia con esto, otros estudios han informado de que HBx contribuye a la
hepatocarcinogénesis parcialmente mediante la promoción de cambios en la expresión
génica que son características de CSC.38, 39 Sin embargo, los mecanismos
moleculares subyacentes a la forma HBx regula el tallo-como las propiedades de CSC
siguen siendo difícil de alcanzar. En este estudio, hemos demostrado que HBx
mediado el tallo-como características de OV6 + CSCs en HCC. Un microarrays de
expresión génica demostró que MDM2 es upregulated en varios tipos de tumores y
especialmente aumentado en nuestro modelo. La evidencia creciente ha demostrado
que el MDM2 es un regulador negativo clave de la proteína supresora de tumores p53,
que promueve el crecimiento tumoral. 40 Además de la p53, se han descrito varios
socios de interacción adicionales para MDM2.41 En nuestro estudio, Hemos
 Víctor Hugo García Martínez

demostrado que HBx promovió el tallo-como las propiedades de OV6 + CSCs a través
de MDM2 independiente de p53. Otros estudios demostraron que el MDM2 tenía un
papel crucial en el stemness de CSCs del cáncer de pecho y del glioblastoma.42, 43
Está bien establecido que MDM2 es un miembro inestable de la familia del dedo del
ANILLO de E3 ubiquitin ligases que es ubiquitinated de una manera autocatalítica.
Nuestros resultados demostraron que HBx aumentó la expresión de MDM2 por la
unión directa a MDM2 y la inhibición de su auto-degradación. Posteriormente, se
presentó evidencia de que HBx promovido aumento de la translocación de MDM2 en
el núcleo, lo que mejoró la activación transcripcional y la expresión de CXCL12 y
CXCR4 en OV6 + hígado CSCs. Debido a que nuestro estudio anterior indicó que
CXCL12 / CXCR4 era necesario para mantener la stemness de OV6 + CSCs en HCC,
20 que luego evaluó si HBx / MDM2 regulado CXCL12 / CXCR4 señalización. Como
era de esperar, nuestros datos indican que la CXCL12 / CXCR4 autocrine bucle es
crítico en HBx / MDM2 mediar el tallo-como las propiedades de OV6 + CSCs. También
se demostró que HBx / MDM2 regulación de CXCL12 / CXCR4 señalización resultó en
la activación de la Wnt / β-catenina vía en OV6 + hígado CSCs. En conclusión, HBx
induce mayores características de vástago de OV6 + CSCs en HCC a través de la
MDM2 / CXCL12 / CXCR4 / β-catenina eje de señalización independiente de p53.
Además, el aumento de la expresión de cualquier dos indicadores entre HBX / MDM2 /
CXCR4 / OV6 podría predecir las características clínico-patológicas y el pronóstico de
los pacientes con HCC relacionados con HCC. El mecanismo molecular relacionado
será discutido en profundidad en nuestro trabajo futuro.

Materiales y métodos

Ensayos Clínicos de Tejidos de HCC

La aprobación ética de este estudio se obtuvo de la Junta del Comité de Ética del
Hospital de Cirugía Hepatobiliar Oriental (Shanghai, China), y se obtuvo el
consentimiento informado de cada paciente. Se construyeron y analizaron los
microarrays tisulares de HCC que contenían 267 pacientes que se sometieron a una
hepatectomía curativa para HCC en nuestro hospital.44 Las características
clinicopatológicas de los pacientes se resumieron en la Tabla Suplementaria S4.
Todos los pacientes fueron seguidos hasta septiembre de 2013, con un tiempo medio
de observación de 54 meses. La supervivencia global (OS) representó el intervalo
entre la fecha de la cirugía y la muerte. La supervivencia libre de enfermedad (DFS) se
definió como el intervalo entre las fechas de la cirugía y la recurrencia.

Líneas celulares y cultura celular

Las líneas de células HCC SMMC-7721, Huh7, HepG2, Hep3B y 293T se adquirieron
de Cell Bank of Type Culture Collection de la Academia China de Ciencias (Shanghai,
China). HCC Las líneas celulares se cultivaron rutinariamente en medio Eagle
modificado por Dulbecco (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero
bovino fetal al 10% (FBS, Gibco). Las esferas de las células OV6 + HCC se cultivaron
en DMEM / F-12 (Gibco) sin FBS, pero con suplemento de ITS Liquid Media (B27
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) , La Solución de Proteína Humana Recombinante
EGF (Gibco), FGF - Básico (AA - 1 - 566). Se añadió proteína CXCL12 recombinante
(R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) en medios condicionales para los ensayos
relacionados con CXCL12 / CXCR4. AMD3100 (Plerixafor, HY - 10046) se adquirió de
MedChem Express (Monmouth Junction, NJ, EE.UU.). MG132 (M8699) y CHX
(R750107) se obtuvieron de Sigma-Aldrich.
 Víctor Hugo García Martínez

Lentivirus, y pequeño ARN interferente

Se codificó el gen HBx humano en el vector pLentiVX-EF1A (Soluciones

biotecnológicas integradas, Co., Ltd, Shanghai, China) y los vectores lentivirales
construidos se designaron como vector lentiviral (LV) -HBx o LV-Con. A continuación,
se transfectaron las construcciones que contenían lentivirus en células HCC (líneas
celulares SMMC-7721 y Huh7) con una multiplicidad de infección (MOI) 20 en
presencia de Polybrene (Sigma-Aldrich, 8 μg / ml). A las 12 h después de la
transfección, el medio de cultivo original se reemplazó con medio nuevo. Después de
incubar durante 48 horas, las células se mantuvieron en medio de cultivo con 1,5 μg /
ml de Puromicina (Sigma-Aldrich) para seleccionar células HCC que expresan HBx
estables. Los pequeños ARNs de interferencia (siRNAs) dirigidos a MDM2, CXCR4,
CXCL12, β-catenina (tres secuencias, definidas como # 1 ~ # 3; Tabla Suplementaria
S5) y control negativo (siRNA codificado) se adquirieron de Intergrated Biotech
Solutions, Ltd, Shanghai, China. La transfección transitoria de siRNAs se realizó con
reactivos de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El sobrenadante se reemplazó con medio fresco que contenía 10% de FBS
12 h después de la transfección.

PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total de las líneas celulares HCC y los especímenes HCC humanos se
extrajeron utilizando el reactivo TRIzol (Gibco) basado en los protocolos del fabricante.
Los ensayos cuantitativos de RT-PCR se llevaron a cabo usando un sistema de PCR
Rápida en Tiempo Real ABI 7300 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) y un kit
de PCR SYBR Green (Applied TaKaRa, Shiga, Japón). Las secuencias de cebadores
enumeradas en la Tabla Suplementaria S6 se diseñaron y se adquirieron de
Intergrated Biotech Solutions, Co., Ltd. Cada medición se realizó por triplicado y los
resultados se normalizaron mediante la expresión del gen β-actina. El cambio de
plegado en relación con el valor medio se determinó mediante 2-ΔΔ.

Western blot y co-inmunoprecipitación

Se prepararon extractos de células enteras en tampón de lisis y se realizaron ensayos

de inmunotransferencia de Western como se describió anteriormente.45 En pocas
palabras, las células cultivadas o los tejidos de cáncer de hígado se lisaron en tampón
de lisis Triton (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 137%, glicerol al 10% 1% de Triton X-100, 2
mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 10 mM de fluoruro de sodio, 5 mg / ml de aprotinina, 20
mM de leupeptina y 1 mM de ortovanadato sódico) y se centrifugaron a 12.000 x g
durante 15 min. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el kit de
ensayo BCA de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los anticuerpos primarios
específicos se mostraron de la siguiente manera: anti-MDM2 y anti-β-actina (Santa
Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), anti-CXCR4 (Abcam, Cambridge, MA,
EE.UU.) HA-tag, anti-MYC-tag, ciclina D1 y anti-β-catenina (Cell Signaling Technology,
Danvers, MA, EE.UU.). Los inmunocomplejos se incubaron con el anticuerpo
secundario conjugado con fluoresceína y luego se analizaron usando un escáner de
fluorescencia Odyssey y un sistema de formación de imágenes LI-COR (Li-COR
Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.). Para experimentos de inmunoprecipitación, se
incubaron un total de 1 mg de lisados de células HCC con 2 μg de anticuerpos anti-HA
o 2 μg de anticuerpos anti-HA o inmunoglobulina G de conejo normal (Santa Cruz
Biotechnology) durante 8 h a 4ºC, seguido de adición De Proteína A / G Plus-Agarosa
(Santa Cruz Biotechnology) durante otras 3 h. Las muestras se desnaturalizaron y se
sometieron a análisis de Western blot.
 Víctor Hugo García Martínez

Análisis de ubiquitinación in vitro

Para determinar los plásmidos MDM2 endógenos conjugados con ubiquitina, HA-
MDM2 y MYC-Ub más Flag-HBx se cotransfectaron en células 293T usando jetPEI
(Polyplus, New York, NY, EE.UU.) durante 48 horas antes de recoger. Los extractos
de células enteras se prepararon en tampón de lisis, como se mencionó anteriormente.
Los lisados celulares se incubaron con perlas conjugadas con HA (Invitrogen) durante
la noche a 4ºC. Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante
transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-MYC.

Coloración por inmunofluorescencia

Las células OV6 + HCC indicadas se sembraron en cubreobjetos en placas de 12

pocillos y se tiñeron con anticuerpos primarios de ratón anti-MDM2 (Abcam) anti-
MDM2 (Santa Cruz Biotechnology), anti-MDM2 (Abcam), seguido de tinción
fluorescente Con IgG conjugada con Alexa Fluor 555 y IgG conjugada con Alexa Fluor
488 (Invitrogen). La tinción nuclear se llevó a cabo mediante 4,6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI). Se capturaron imágenes representativas con un microscopio confocal Leica
(Leica, Mannheim, Alemania).

Inmunohistoquímica

Las láminas de microarrays de tejido HCC se tiñeron con los siguientes anticuerpos
primarios a 4ºC durante la noche: anti-OV6 (R & D Systems), anti-MDM2 (Santa Cruz
Biotechnology) y anti-CXCR4 (Abcam). En el procedimiento de detección se utilizaron
anticuerpos secundarios correspondientes y reactivo de diaminobencidina (DAB)
(Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). Todas las diapositivas de TMA se observaron y
fotografiaron con un microscopio Olympus (IX-70 OLYMPUS, Shinjuku, Tokio, Japón).
Los niveles de tinción de OV6, MDM2 y CXCR4 en todas las muestras clínicas fueron
examinados por dos observadores independientes como se describió anteriormente.20
Las intensidades de tinción se puntuaron como 0 (negativo), 1 (débilmente positivo), 2
(moderadamente positivo) o 3 positivo). El bajo nivel de expresión se definió como la
puntuación 1, mientras que la alta expresión en los tejidos tumorales se identificó
como la puntuación 2.

Citometría de flujo y clasificación de células magnéticas

La clasificación de células activadas magnéticamente y el ensayo de citometría de

flujo se llevaron a cabo utilizando un clasificador de células Moflo XDP (Beckman,
Boulevard Brea, CA, EE.UU.). Las líneas de células HCC se marcaron
magnéticamente con anticuerpo OV6 conjugado con PE (IgG1 de ratón, Miltenyi
Biotec, Auburn, CA, EUA) y posteriormente se incubaron con micro-bolas de IgG1 anti-
ratón de rata, y luego se separaron en columna MS MACS (Miltenyi Biotec) . Todos los
procedimientos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las
células HCC infectadas con LV-Con o LV-HBx se incubaron con anticuerpo OV6 y los
porcentajes de células OV6 + se midieron mediante citometría de flujo. Para los
experimentos de resistencia a la quimioterapia, las células HCC que expresaron de
forma estable el vector o HBx se trataron con pirarubicina, oxaliplatino o HCPT durante
48 horas y las proporciones de células OV6 + se cuantificaron usando citometría de
flujo como se mencionó anteriormente. Para los experimentos de clasificación celular,
las poblaciones de células OV6 + se clasificaron magnéticamente a partir de células
HCC que expresaron de forma estable HBx o vectores vacíos y luego se sometieron a
estudios funcionales in vitro o experimentos de tumorigenicidad in vivo.
 Víctor Hugo García Martínez

Ensayo de formación de esferoides

Para las líneas celulares HCC, se mantuvieron suspensiones monocelulares de 3000

células OV6 + clasificadas magnéticamente en microplacas de cultivo de fijación
ultrabaja de seis pocillos (Corning, Steuben County, NY, EE.UU.) durante 14 días.
Para la segunda generación de formación de esferas, los esferoides formados se re-
tripsinizaron en suspensiones de una sola célula y el número equivalente de células
OV6 + aisladas se resuspendió en condiciones culturales de baja fijación durante otros
14 días. El número de esferoides se contó bajo una microscopía 14 días después de la
siembra y se tomaron las imágenes representativas.

Ensayo de viabilidad celular

En resumen, se sembraron 6000 células viables por triplicado en placas de 96 pocillos

y se trataron con pirarubicina, oxaliplatino o HCPT desde el inicio de la infección.
Período de cultivo durante 4 días. En los puntos de tiempo indicados, cada pocillo se
añadió con 10 μl de CCK-8 y se incubó durante 1 h más. A continuación, se
determinaron los valores de OD mediante un lector de microplacas (Synergy HT,
BioTek, Winooski, VT, USA) a una absorbancia de 450 nm. Las velocidades de
viabilidad celular se presentaron como un porcentaje del valor de control que se
registró al principio (Tiempo 0).

Ensayo de indicador de luciferasa

Se realizó un ensayo de indicador de luciferasa dual usando una construcción de tipo

TCF-luciferasa de tipo salvaje (pGL3-OT) y la construcción de indicador de luciferasa
de TCF mutante (pGL3-OF). La región promotora de CXCR4 y CXCL12 se amplificó
por PCR. Los plásmidos pGL3-CXCR4 o CXCL12-luciferasa se construyeron
insertando estos productos de PCR en el vector informador pGL3-Report Dual-
Luciferase (Ribobio Co., Guangzhou, China). Las células HCC indicadas se cultivaron
en placas de 24 pocillos. Después de incubar durante 24 h, cada pocillo se transfectó
mediante lipofectamina 2000 (Invitrogen) con plásmidos de 500 ng / pocillo de CXCR4
o CXCL12-luciferasa con reactivos jetPEI (Polyplus). Mientras tanto, todos los pocillos
se cotransfectaron con plásmidos pRL-TK que contenían los genes de luciferasa de
Renilla como control interno para normalizar la eficacia de la transfección. A
continuación, se determinó la actividad luciferasa usando el reactivo de ensayo de
luciferasa Promega y el lector de microplacas Multi-Detection Synergy 2 después de
48 h de incubación. Las actividades transcripcionales relativas de CXCL12 y CXCR4
se presentaron como la relación OT / OF.47

Microarray análisis de la expresión génica

Los perfiles de expresión génica se determinaron por Agilent cDNA humano

Microarray ensayo (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). El ARN total se
extrajo de células OV6 + / LV-Con y OV6 + / LV-HBx Huh7 que expresan utilizando un
kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Después, 10 μg de ARN total se
transcribieron inversamente para producir ARNc marcado con biotina y se
fragmentaron añadiendo agente bloqueante y tampón de fragmentación. A
continuación, la solución de hibridación se dispensó en la corredera de junta y se
ensambló a la diapositiva de microarrays de expresión de mRNA. Las placas se
incubaron durante 17 h a 65 ° C en un Horno de Hibridación Agilent. Las matrices
hibridadas se lavaron, fijaron y escanearon usando el Agilent DNA Microarray Scanner
(número de referencia G2505C). El software Agilent Feature Extraction (versión
11.0.1.1) se utilizó para analizar las imágenes de matriz adquiridas. La normalización
 Víctor Hugo García Martínez

cuantitativa y el posterior procesamiento de datos se realizaron con el paquete de

software GeneSpring GX v11.5.1 (Agilent Technologies). Después de la normalización
cuantil de los datos en bruto, se seleccionaron los ARNm identificados para el análisis
de datos adicionales. Las señales detectadas se evaluaron mediante agrupación
jerárquica de genes de valores logarítmicos. Cluster 3.0 y Java TreeView 1.0.13
software se aplicaron para generar un dendrograma para cada grupo de genes de
acuerdo a sus perfiles de expresión.

GO y el análisis del camino del ingenio

El análisis GO evaluó funcionalmente los genes expresados diferencialmente con las

categorías GO que se derivaron de la Ontología Genética. Los análisis de
enriquecimiento de la ruta ontológica para los genes expresados de forma diferente se
realizaron con especial atención a los procesos biológicos GO. Los valores de P
inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Pathway análisis se aplicó para
identificar las vías significativas sobre la base de la base de datos KEGG. El análisis
de la red de interregulación fue llevado a cabo por BioGenius Co. (Shanghai, China).
Para el análisis del camino de la ingenuidad (IPA), los genes identificados con perfiles
de expresión alterados de ensayos de arraigo se importaron en la herramienta IPA
(Ingenuity H Systems, Redwood City, CA, EE.UU.). Luego, las redes biológicas, las
funciones globales y las vías funcionales de un conjunto de datos específicos fueron
reconocidas por los análisis del IPA.In vivo xenograft assay

Se adquirieron ratones de sexo masculino no obesos de seis semanas de edad /

inmunodeficiencia combinada severa (NOD / SCID) de la Academia de Ciencias de
China (Shanghai, China). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de
acuerdo con la Segunda Universidad Médica Militar Animal Care Facility y los Institutos
Nacionales de Salud directrices. Las células OV6 + HCC que expresan el vector o HBx
se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de ratones a diferentes números
de células como se indica. La proporción de OV6 + CSCs se evaluó mediante un
ensayo de dilución limitante in vivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo ELISA

En nuestros ensayos ELISA se aplicó el kit ELISA humano CXCL12 / SDF-1

(BioVision, Milpitas, CA, EUA). Todos los procedimientos están de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Brevemente, llevar todos los reactivos y muestras a
temperatura ambiente antes de usar. Añadir 100 μl de cada estándar y muestra en los
pocillos apropiados. Cubrir bien e incubar durante 2,5 h a temperatura ambiente o
durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Deseche la solución y lave cuatro veces
con 1 × solución de lavado. Añadir 100 μl de 1 × anticuerpo biotinilado preparado a
cada pocillo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
Deseche la solución. Repita los pasos de lavado. Añadir 100 μl de solución de
estreptavidina preparada a cada pocillo. Incubar durante 45 minutos a temperatura
ambiente con agitación suave. Deseche la solución. Repita los pasos de lavado.
Añadir 100 μl de Reactivo de Sustrato TMB One-Step a cada pocillo. Incubar durante
30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave. Añadir 50 μl
de solución de parada a cada pocillo. Lea a 450 nm inmediatamente y finalmente
calcule el valor relacionado.

Análisis estadístico

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China
(81301861); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81672352);
Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai de China (13ZR1450700). Proyecto de
 Víctor Hugo García Martínez

la enfermedad de la infección dominante del estado de China (2012ZX10002010);

Shanghai Nuevo excelente plan de la juventud (XYQ2013074); Programa nacional
clave de investigación básica de China (2014CB542102); Fondo de Ciencia para
Grupos de Investigación Creativos, NSFC, China (81521091); El Programa Nacional
de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología de China (2013AA032202);
Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81372207).Topof page

Conflicto de interés
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses

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