BIL

 151  -­‐  Mechanisms  of  Mitosis  

Part  3.    Collecting  Data  –  Review  of  Procedures  
By  Dana  Krempels,  PhD,  Alesia  Sharber,  Yunqiu  Wang,  PhD,  and  Kathryn  Tosney,  PhD  
 

Quantifying  Mitotic  Cells  

  Remember  that  the  chromosome  squash  procedure  requires  practice  and  patience.    Today  you  will  
actually   perform   the   chromosome   squash   on   treatment   and   control   onions,   and   should   be   able   to  
recognize  and  quantify  the  stages  of  mitosis  in  each.      
 

A.    Equipment  
Your  lab  instructor  will  provide  you  with  root  tips  from  the  appropriate  treatment  and  control  
specimens  that  were  prepared  by  our  hard-­‐working  Lab  Manager  as  per  the  specifications  of  your  
team’s  research  protocol  (as  corrected  by  your  lab  instructor).    PLEASE  DO  NOT  HANDLE  ANY  OF  THE  
ONIONS  IN  THE  LAB!    THESE  HAVE  BEEN  CAREFULLY  PREPARED  FOR  EACH  LAB  RESEARCH  TEAM,  AND  
NO  ONE  SHOULD  BE  TOUCHING  THEM  OR  HANDLING  THEM  EXCEPT  THE  GRADUATE  LABORATORY  
INSTRUCTOR.  
 

As  before,  your  team  will  have  available  the  following  equipment  and  materials  available.      
 

compound  microscope  
dissecting  microscope  
microscope  slides  
cover  slips  
 

acetocarmine  stain  in  dropper  bottle  

1  M  hydrochloric  acid  (HCL)  in  dropper  bottle  
razor  blades  
dissecting  needles  
labeling  tape  
Sharpie  markers  
beakers  
 

supply  of  live  onions  (control  and  treatment)  

 
B.    Model  Organisms:    Treatment  and  Control  
 

Recall  that  individual  batches  of  onions  may  respond  quite  

differently   to   conditions   suitable   for   root   growth.     We   are  
using  green  onions  (scallions;  Figure  1),  and  each  individual  
onion   plant   is   a   single   sample/replicate   (why?).     Remember  
that  multiple  roots  from  the  same  onion  plant  are  NOT  true  
replicates.    To  obtain  a  statistically  meaningful  sample,  you  
must  count  cells  from  at  least  10  different  individual  control  
and  10  different  treatment  onions.  

To   get   your   samples,   first   LABEL   EACH   OF   YOUR   SLIDES  

METICULOUSLY  with  the  onion’s  individual  ID#  (e.g.,  C1,  T1,  
etc.),   date,   team   name,   etc.     Only   properly   labeled   slides    
will   be   graced   with   an   onion   root   tip   from   your   lab  
instructor,  who  will  be  doing  the  cutting.   Figure  1.    Sprouting  green  
onions  (scallions)    
 C.    Chromosome  Squash  Procedure  –  You’ve  done  this  before  
  To  examine  the  mitotic  process  in  the  cells  of  the  onion  root  tip,  you  must  soften  the  root  so  the  
cells  can  be  separated  and  flattened,  thus  making  it  possible  to  see  the  chromosomes,  nuclei,  spindles,  
and  other  cell  parts.      
  This  procedure  will  help  you  perform  a  successful  chromosome  squash.  You  will  probably  need  to  practice  
it  several  times  before  getting  a  good  squash,  so  every  group  member  should  set  up  several  squashes  (about  
10  minutes  apart)  so  that  you  can  get  enough  practice  to  become  a  Root  Squashing  Pro!  

  Before  you  begin  you  should  make  sure  that  all  of  your  materials  (beakers,  plants,  microscope  slides)  are  
properly  labeled.  Microscope  slides  should  be  labeled  as  treatment  or  control  and  with  the  treatment  start-­‐
time.    Your  team  may  have  10-­‐20  slides  out  at  any  time,  so  it  is  important  to  label  everything  properly!  
 

1.    Snap  an  entire  healthy  root  from  an  onion.    The  root  tip  is  the  most  delicate  part  of  the  root  and  it  
desiccates  very  easily.    You  will  need  healthy,  living  cells,  so  keep  your  onion  root  wet  at  all  times!      Do  not  
leave  onion  roots  out  of  the  water  or  lying  on  the  lab  bench.  

2.    Place  the  root  on  your  labeled  slide.    Using  the  dissecting  scope,  identify  the  root  tip.  In  plants,  mitotic  
division  occurs  in  the  meristem  cells,  which  can  differentiate  into  any  other  type  of  cell.    The  apical  (i.e.,  
located  at  the  apex,  or  tip)  meristem,  is  about  one  millimeter  from  the  apparent  tip  of  the  root  (the  root  cap)    
(Figure  2).    If  you  cut  off  too  much  of  the  root,  you  will  see  long,  rectangular  cells  in  your  squash.    These  cells  
are  no  longer  undergoing  mitosis,  so  you  should  not  use  or  count  them.  Carefully  cut  off  just  the  meristematic  
region  of  the  root  tip  with  a  sharp  razor  blade,  and  use  that  for  your  squash.  

   
Figure  2a.    Onion  root  tip  anatomy.    Only  the  cells  at  the   Figure   2b.     Root   tip   of   corn   (Zea   mays).     Note  
very   tip   of   the   root   (Zone   of   Cell   Division)   are   the   clear   appearance   of   the   root   cap.     Just  
undergoing  mitosis.    These  are  visually  distinct  in  a  fresh   above  it  is  the  apical  meristem  and  the  Zone  of  
root   tip,   appearing   more   round   or   square   than   the   Cell   Division.     The   darker,   longitudinal   lines  
elongated   cells   in   the   Zone   of   Elongation   above   it.     above   the   cell   division   zone   mark   the   newly  
(Campbell,  2005)   formed  vascular  cambium.      
 

3.    Place  a  drop  or  two  of  HCl  on  the  root  tip.  The  HCl  will  soften  the  connections  between  the  cell  walls  and  
allow  the  root  to  be  flattened  into  a  single  cell  layer.      

4.    After  10-­‐15  minutes,  place  a  Kimwipe  on  the  edge  of  your  HCl  puddle  to  wick  away  as  much  of  the  liquid  as  
possible.      
5.    Place  a  drop  or  two  of  acetocarmine  stain  on  the  root  tip.    Let  the  root  tip  sit  in  the  stain  for  15-­‐20  
minutes.  You  may  occasionally  prod  the  root  tip  with  a  dissecting  pin.    The  iron  in  the  pin  can  help  
darken  the  stain,  but  may  make  the  stain  too  dark  if  you  prod  too  much.    Do  not  let  the  acetocarmine  
completely  dry  up.    ((Caution!    Acetocarmine  is  caustic  and  corrosive!    Handle  with  care,  and  flush  well  
with  clean  water  if  you  get  any  on  your  skin  or  clothing.    Acetocarmine  may  stain  skin  and  permanently  
stain  clothing.)    Acetocarmine  will  allow  you  to  clearly  see  mitotic  chromosomes.    (Figure  3)  
 

 
Figure 3. Allium root tip cells undergoing mitotic division, stained with
acetocarmine stain.
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d3/Onion_root_mitosis.jpg)

6.    Now  it’s  time  to  squash  your  root.    Place  a  clean  plastic  coverslip  over  your  root.    Over  the  coverslip,  place  a  
Kimwipe  to  soak  up  excess  stain  that  leaks  out  and  to  protect  your  coverslip  from  fingerprints.      

7.    Push  down  firmly  with  your  thumb  for  a  few  seconds.    

8.    Place  the  slide  on  the  platform  of  your  compound  microscope.    

9.    Starting  at  the  lowest  objective,  focus  on  your  slide.    Examine  your  squash.    You  should  be  able  to  see  cells  
in  various  stages  of  mitosis.    (Figure  4)  

 
Figure  4.    A  well-­‐executed  squash  performed  in  lab  by  a  BIL  151  
student.   The   elongated   (non-­‐mitotic)   cells   in   the   upper   left  
quadrant   should   not   be   counted,   as   they   are   no   longer  
undergoing  mitosis.    
 

  The  cells  should  be  round  or  square  and  flattened  into  a  single  cell  layer.    The  darkened  nuclei  of  these  
cells  will  be  large  and  appear  to  take  up  most  of  the  space  inside  the  cell.    Ask  your  instructor  to  look  at  your  
slide  if  you’re  not  sure  you  have  a  good  squash.      
   At  the  highest  magnification  (400x),  you  will  be  able  to  identify  whether  the  cells  are  undergoing  mitosis.    
Look  at  an  area  that  is  properly  squashed  and  count  all  of  the  cells  you  can  see  (around  50-­‐200  cells).  From  
among  those,  count  how  many  cells  are  in  interphase,  prophase,  metaphase,  anaphase,  and  telophase.    
Record  these  numbers  and  repeat  for  3-­‐5  fields  of  view  to  obtain  a  good  sample  of  your  slide  (250-­‐600  cells  
total).      
Note  that  you  are  “sampling”  multiple  fields  of  view  on  one  slide,  but  for  the  purposes  of  your  experiment  and  
statistical  analysis,    
 

one  sample  =  all  the  cells  counted  in  one  root  from  one  onion  
 

AVOID  PSEUDOREPLICATION!    Do  not  take  multiple  roots  from  the  same  onion  and  do  not  count  multiple  fields  
of  view  as  separate  experimental  samples.  Because  those  are  all  from  a  single  individual  onion  plant,  it  would  
be  invalid  to  count  them  as  separate  samples.    All  the  cells  counted  from  a  particular  onion  plant  should  be  
considered  one  sample.  
 

10.    Count  the  number  of  cells  you  can  identify  in  each  stage  of  mitosis.    You  will  analyze  these  data  to  
determine  whether  there  is  a  difference  between  your  treatment  and  control  samples.  
 

D.    Calculations  
  Adding  the  number  of  mitotic  cells  and  dividing  by  the  total  number  of  cells  you  observed  will  give  you  the  
mitotic  index  for  that  root.    In  any  given  sample:  
 

mitotic  Index    (MI)   =     #  of  cells  in  active  mitosis  

                         total  #  of  cells  counted  
 

If  appropriate  to  your  project,  you  should  identify  the  particular  stage  of  mitosis,  and  calculate  an  index  for  
that  particular  phase  of  mitosis.    For  example,  if  you  are  trying  to  determine  whether  treated  onions  are  
unable  to  enter  metaphase,  you  could  calculate  a  metaphase  index  or  a  prophase  index  for  your  samples.    For  
example,  a  prophase  index  could  be  calculated  as:  

prophase  index  (MIprophase)  =     #  of  cells  in  prophase  

              total  #  of  mitotic  cells  
 

If  your  team  will  be  reporting  mitotic  phase  indices,  be  sure  to  also  report  an  overall  mitotic  index,  as  well,  and  
note  whether  there  is  a  significant  difference  between  your  treatment  and  control  indices.    

Consider…  
 

1.    What  are  the  (various)  mitotic  indices  of  your  treatment  and  control  groups?      
 

2.  Do  you  observe  any  polyploid  cells  (i.e.,  those  with  multiple  chromosome  sets)?    Significance?  
 

3.    What  mitotic  stages  are  most  prevalent?  Does  this  differ  between  treatment  and  control?  
 

4.  Are  any  mitotic  stages  completely  absent?    Again,  you  will  eventually  need  to  explain  this,  and  any  
  difference  between  treatment  and  control.  
 

Remember  that  you  will  be  calculating  a  mitotic  index  (and/or  mitotic  phase  indices)  for  at  least  
10  treatment  and  10  control  onions.    The  indices  are  your  raw  data  that  will  be  statistically  
analyzed  using  the  student’s  t  test  in  the  penultimate  stage  of  your  project.