Biotecnologia 1

Proibição aos transgênicos pode levar

o Brasil ao retrocesso
O engenheiro agrônomo, Alberto Duque Portugal, diretor-presidente
da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), é formado pela
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, com doutorado na área de
Sistemas Agrícolas, pela Universidade de Reading, Inglaterra. Especializou-se
em Gestão de Pesquisa e Desenvolvimento Rural em instituições brasileiras e
do exterior. Foi diretor de Operações Técnicas da EPAMIG, de onde seguiu
para integrar a diretoria da Embrapa.
Nesta entrevista, Portugal afirma que o Brasil precisa da Biotecnologia
agropecuária para competir internacionalmente, e a sociedade deve ser infor-
mada sobre os avanços nesta área, através de dados confiáveis.

IA - A chegada dos organismos transgênicos benefícios consideráveis para a sociedade, como meio ambiente, de organismos modificados por
na agricultura tem sido acompanhada por garantir o abastecimento alimentar, competir essa técnica. No Brasil, essas normas estão regu-
uma grande polêmica, despertando mui- nos mercados interno e externo e ajudar no ladas pela Lei no 8.974, sancionada pelo presi-
tas dúvidas e questionamentos em toda a combate a doenças e à subnutrição. dente Fernando Henrique Cardoso, em 5 de
sociedade. Para o senhor, há motivos para janeiro de 1995. O vice-presidente da Repú-
tanta preocupação? IA - Nos últimos anos, tem sido observado um blica, senador Marco Maciel, no exercício da
intenso processo de fusão de empresas Presidência, sancionou no dia 20 de dezembro
Alberto Portugal- Creio que não, desde
multinacionais do setor de agroquímicos, de 1995 o Decreto no 1.752, que regulamenta a
que a liberação ambiental das plantas trans-
que, por sua vez, estão adquirindo a maio- Lei no 8.974. O Decreto citado, além de regula-
gênicas continue a ser realizada com os cuida-
ria das empresas produtoras de sementes mentar a Lei de Biossegurança, dispõe sobre
dos de biossegurança que têm pautado os testes
instaladas no Brasil. No seu modo de ver, a vinculação, competência e composição da
experimentais, iniciados em 1985. A comer-
há uma estratégia de monopólio de mer- CTNBio, que integra a estrutura do Ministério
cialização de plantas transgênicas começou em
cado por parte dessas multinacionais? da Ciência e Tecnologia. A CTNBio é compos-
1995 com o tomate geneticamente modificado
Alberto Portugal - Há de fato uma ten- ta por 16 cientistas da mais alta competência,
para maturação lenta, produzido pela Calgene,
dência, que começou no exterior, de aquisição representantes do Executivo, do setor empresa-
e a soja resistente ao herbicida Roundup, da
de empresas de sementes por multinacionais rial que atua em Biotecnologia, de representan-
empresa Monsanto. Atualmente, algumas espé-
da área química e fusão de empresas, que não tes dos interesses dos consumidores e de órgãos
cies de plantas transgênicas como soja, milho e
é um fenômeno particular da Biotecnologia, mas legalmente constituídos de proteção à saúde do
canola já têm participação relevante na agri-
conseqüência dos efeitos da globalização. No trabalhador. Os membros da CTNBio foram no-
cultura dos Estados Unidos, Canadá e Argenti-
Brasil, onde também se observa essa tendência, meados pelo Presidente da República em
na. A soja transgênica tolerante ao glifosate já
as cultivares da Embrapa, com forte presença Decreto de 2 de abril de 1996, e a Comissão
ocupa 54% do plantio total desta cultura e qua-
no mercado de sementes, atuam em mão con- instalada em junho de 1996. Nos últimos cinco
se toda a área cultivada com soja nos Estados
trária. A estratégia da Embrapa é a de preservar anos, a CTNBio deu parecer favorável à libe-
Unidos e Argentina. O milho transgênico ocupa
seu germoplasma, protegendo-o intelectual- ração ambiental de 800 experimentos e a uma
igualmente área relevante na agricultura desses
mente com exclusividade e disponibilizando-o liberação comercial, que foi a da soja RR. Esta
países. Outras espécies tendem a popularizar-
para os seus parceiros em regime de competição última será monitorada comercialmente por
se, tais como: canola, fumo, tomate, batata e
aberta e, quando o faz com exclusividade, não cinco anos. É a primeira ação nesse sentido que
algodão. A área cultivada com plantas transgê-
privilegia qualquer grupo. O setor de sementes se realiza em nível mundial. Outrossim, creden-
nicas aumentou em nível mundial de 1,7 milhão
é competitivo e a presença no Brasil de um nú- ciou, como determina a Lei, instituições e labo-
de hectares, em 1996, para 40,0 milhões de
mero grande de empresas nacionais e multina- ratórios públicos e privados para atuarem em
hectares, em 1999. As plantas citadas têm como
cionais dificultará o monopólio. diversos campos da Engenharia genética. Ape-
características a resistência a insetos, vírus e
nas laboratórios que atuam em Engenharia
herbicidas e a melhor qualidade nutricional,
IA - Devido à necessidade de uma regulamen- genética credenciados pela CTNBio podem
como no caso da canola, cuja composição lipí-
tação específica para o setor, foi criada a receber financiamento de órgãos oficiais. A
dica foi alterada no sentido de diminuir o efeito
Comissão Técnica Nacional de Biossegu- CTNBio tem competência, atua com efetividade
do óleo no nível de colesterol no organismo hu-
rança (CTNBio), em 1995. A CTNBio tem e não fica nada a dever a qualquer organismo
mano, e o golden rice, rico em caroteno. Até
cumprido de forma eficiente o seu papel? desta natureza, em outros países.
o presente não foi constatado nenhum caso
comprovado de prejuízo ao homem ou ao am- Alberto Portugal - Para possibilitar o de- IA - O senhor é a favor da criação de comis-
biente como decorrência do uso dessas plantas. senvolvimento da Biotecnologia com segurança, sões estaduais de biossegurança? E qual
As dúvidas e questionamentos da sociedade o Brasil estabeleceu, por meio de legislação es- é a sua opinião sobre a necessidade da
devem ser esclarecidos com comprovações cien- pecífica, normas de biossegurança para regular moratória de cinco anos para produtos
tíficas de que plantas transgênicas podem trazer o uso da Engenharia genética e a liberação, no transgênicos?

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.1-2, maio/jun. 2000

2 Biotecnologia
Alberto Portugal - Comissões estaduais
são, a meu ver, menos importantes do que a
presença de Secretarias Estaduais de Agri-
cultura somando esforços com o Ministério da
Agricultura e do Abastecimento, para garantir
uma fiscalização de excelência de transgênicos
em níveis experimental e comercial, mormente
quando o desenvolvimento desta área crescer
no Brasil, como ocorreu no mundo, onde já se
realizaram 25 mil testes de campo com trans-
gênicos e cultivam-se mais de 40 milhões de
hectares com estas plantas. Leis estaduais de
Biossegurança, se criadas, não podem contrariar
conceitualmente a Lei Federal sob pena de im-
pedir o exercício legal da Biossegurança no
Brasil. Sobre a moratória de cinco anos para
produtos transgênicos, temos nos posicionado
contra. Precisamos, isto sim, intensificar as pes-
quisas de laboratório e de campo com esses
produtos, com o objetivo de conhecer mais pro-
fundamente seus potenciais efeitos sobre o
homem e o meio ambiente, dirimindo dúvidas
e questionamentos ainda existentes. Uma proi-
bição, ainda que temporária, de trabalhos com
transgênicos seria condenar o país a ficar à mar-
gem dos progressos científicos e tecnológicos
que se operam atualmente no mundo.
IA - Há alguns anos atrás criou-se a expecta-
tiva de que os avanços obtidos pela Biolo-
gia molecular e Biologia celular seriam
responsáveis por uma nova fase do melho-
ramento genético de plantas. Esta nova
fase irá substituir o melhoramento gené-
tico tradicional?
Alberto Portugal - De forma alguma, são
duas áreas complementares e fundamentais para
o desenvolvimento da agropecuária em todo o
mundo. O advento da Engenharia genética nos
Estados Unidos afastou, no início, esta área da
genética convencional porque os biologistas
moleculares, ingenuamente, imaginaram que
o melhoramento genético e o negócio de se-
mentes seria substituído por esta nova tecnologia.
O futuro mostrou o oposto. Ambos os setores
saíram fortalecidos. A tecnologia na verdade é
levada ao agricultor por meio da semente,
depois que o melhoramento genético faz a sua
parte.
IA - Que tipo de postura o Brasil tem assumi-
do com relação ao desenvolvimento de
pesquisas na área de Biotecnologia?
Alberto Portugal- A Biotecnologia é uma
prioridade no Brasil desde o início da década
de 80, apoiada que foi por programas como
o PADCT e pelas Fundações de Amparo à Pes-
quisa. A Embrapa iniciou suas ações nesta área
em 1981. Existem cerca de 8.500 grupos de pes-
quisa registrados no Diretório Nacional dos
Grupos de Pesquisa no Brasil (MCT/CNPq). Des-
ses, 1.164 (cerca de 14%) relacionaram linhas
de pesquisa na área de Biotecnologia. Esses
grupos mobilizam cerca de cinco mil pesquisa-
dores (aproximadamente 10% dos pesquisadores
citados nos indicadores nacionais de C&T) e
11.515 estudantes e estagiários a eles associados.
Essas estatísticas, certamente, não correspondem
ao universo da competência biotecnológica bra-
sileira que, embora não comparável em escala
aos países do G-8, nos permitiu internalizar satis-
fatoriamente as tecnologias mais avançadas por
meio da cooperação científica em nível interna-
cional. O Brasil desenvolveu massa crítica com
competência científica em praticamente todos
os setores da Biotecnologia de ponta e em alguns
setores específicos. Na Engenharia genética de
leguminosas, por exemplo, a Embrapa desen-
volveu e protegeu intelectualmente tecnologias
que estão sendo procuradas por instituições de
países do Primeiro Mundo. A Biotecnologia
surge como ferramenta importante na medida
em que, com a intensificação da competição
por um mercado globalizado na agricultura,
será imperioso cortar custos de produção, bem
como produzir em condições adversas de clima
e solo com cultivares tolerantes com a seca,
alumínio tóxico e mais eficientes na absorção
de fósforo. A chamada gene revolution caminha
no sentido oposto à green revolution, que de-
pendia fortemente da utilização de insumos.
Estes temas, que são verdadeiramente
os que vão mudar a oferta de alimentos em ní-
vel mundial, têm sido evitados até o momento
pelas empresas que atuam em Biotecnologia,
porque são projetos de longo prazo. O Brasil
tem competência em Genética e Melhoramento
Genético Vegetal. Necessita interagir com países
desenvolvidos, o que a Embrapa tem feito, para
ter acesso rápido às tecnologias mais avançadas
e aplicá-las aos seus Programas de Melhora-
mento Genético, com vistas a atingir os objetivos
citados. Precisa, igualmente, aumentar sua com-
petência e massa crítica na área Genômica e
em outras áreas estratégicas, como Cristalo-
grafia de Proteínas e Química Combinatória.
O país tem um mercado interno significativo e
em expansão, alta competência em tecnologia
agrícola para a produção nos trópicos e genes,
atualmente uma das maiores limitações à
expansão da Biotecnologia moderna, mas que
certamente se constituirá em uma das principais
matérias-primas da Biotecnologia do próximo
século. Conta o Brasil, neste particular, com a
maior biodiversidade do planeta. Existem cer-
ca de 250 mil espécies de plantas conhecidas,
30% das quais, potencialmente comestíveis. O
homem, através dos séculos, não utilizou mais
do que 1% destas plantas para sua alimentação.
Na verdade, a base da alimentação humana é
constituída por cerca de 0,2% destas espécies.
A floresta tropical úmida – que cobre cerca de
7% do planeta – contém, segundo estimativas,
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.1-2, maio/jun. 2000
cerca de 50% da biodiversidade mundial. Outros
ecossistemas e regiões como a caatinga e a mata
atlântica são igualmente importantes, como fon-
te de genes.
IA - Se o governo brasileiro colocar-se con-
trário à adoção desta nova tecnologia, isto
pode ocasionar algum reflexo negativo
para o mercado agrícola?
Alberto Portugal - Certamente seria um
erro histórico como já cometemos outros no pas-
sado. O mais recente que me vem à lembrança
é a reserva de mercado na área de Informática.
Essa opinião eu compartilho com o ministro
Pratini de Morais, um entusiástico defensor da
Biotecnologia e das tecnologias de ponta a ela
relacionadas. O governo brasileiro tem cons-
ciência do caminho correto a ser percorrido e
já se posicionou em reunião interministerial,
realizada recentemente sob a coordenação do
ministro chefe da Casa Civil Pedro Parente, no
sentido de apoiar a Biotecnologia e as áreas de
ponta como Genoma e Proteoma que se
desenvolvem vertiginosamente em todo o
mundo. Da mesma forma, é necessário realizar
esta tarefa com respeito à biossegurança, atra-
vés da CTNBio, que merece do governo toda a
credibilidade e apoio por sua demonstrada com-
petência nesta área.
IA - Como a sociedade e as instituições de
pesquisa devem atuar nesta questão?
Alberto Portugal - A sociedade precisa
ser informada sobre os avanços da Biotecnologia
por meio de dados confiáveis, com base na me-
lhor evidência científica. O Brasil, através da
CTNBio e de instituições como a Embrapa, tem
procurado fazê-lo, fugindo de especulações en-
ganosas e mistificadores desta área. Pensamos
que o Brasil precisa da Biotecnologia agro-
pecuária para competir internacionalmente. A
sociedade pode confiar em suas instituições
científicas, como a Empresa de Pesquisa Agro-
pecuária de Minas Gerais (EPAMIG), as univer-
sidades e a Embrapa, e nas organizações
reguladoras como a CTNBio. O Brasil, através
de seus órgãos do Executivo e com o assessora-
mento científico devido, possibilitará que o con-
sumidor tenha a melhor informação e exercite
o direito de escolha entre transgênicos e pro-
dutos não-transgênicos.
Gostaria de acrescentar que a EPAMIG,
a qual tive a honra de dirigir, tem papel funda-
mental na elucidação de questões polêmicas
sobre produtos transgênicos, além dos que ve-
nham a ser criados pela Ciência e Tecnologia.
No nível estadual são necessários testes de
produtos e a avaliação dos seus impactos sobre
o meio ambiente, além da ajuda na construção,
junto à opinião pública, de um posicionamento
correto sobre os novos produtos da Biologia
moderna.
Biotecnologia 3

REVISTA BIMESTRAL
ISSN 0100-3364
INPI: 1231/0650500

COMISSÃO EDITORIAL
A era da Biotecnologia
Márcio Amaral
Marcos Reis Araújo O mundo começa a entrar numa nova era com o
Marcelo Franco
Antônio M. S. Andrade mapeamento do genoma humano. Inúmeras doenças de
Luthero Rios Alvarenga
José Braz Façanha origem genética poderão ser melhor compreendidas e
Eustáquio da Abadia Amaral
Vânia Lúcia Alves Lacerda tratadas precocemente, propiciando mais qualidade de
EDITOR vida para a humanidade. Este avanço da genética terá
Vânia Lúcia Alves Lacerda
profundo impacto nos padrões de pesquisa e tecnologia
COORDENAÇÃO TÉCNICA
Geraldo Magela de Almeida Cançado, em diversas áreas de estudo. Há expectativa diante dessa
Clóvis Maurílio de Souza e Luís Eduardo Corrêa Antunes
descoberta tão fabulosa.
COORDENAÇÃO EDITORIAL
Marlene A. Ribeiro Gomide Em todo o mundo, a humanidade começa a experi-
AUTORIA DOS ARTIGOS mentar os resultados da evolução das técnicas biotecnoló-
Acelino Couto Alfenas, Ademir de Moraes Ferreira, Adilson Leite, Aluízio
Borém, Ana Cristina Miranda Brasileiro, Andréa Almeida Carneiro, Cláu- gicas e, especificamente na agropecuária, já são inúmeros
dia Teixeira Guimarães, Clóvis Maurílio de Souza, Edilson Paiva, Edna
Froeder Arcuri, Eneida Abreu Parizotto, Everaldo Gonçalves de Barros, os resultados aplicados. A produção de alimentos mais
Francisco Murilo Zerbini, Geraldo Magela de Almeida Cançado, Ivan
Schuster, Luciana P. Ambrozevícius, Luis Artur Costa do Vale, Marcelo saudáveis e de melhor qualidade, que promovem menor
Abreu Lanza, Márcio de Assis, Marco Antônio Machado, Marcos Paiva,
Marcos Paiva Del Giúdice, Maria Eugênia Lisei de Sá, Mario Luiz Marti-
impacto sobre o meio ambiente e que são capazes de
nez, Maurilio Alves Moreira, Newton Portilho Carneiro, Otávio Carlos
Armani, Paulo César De Lucca, Pedro Braga Arcuri, Sérgio Hermínio
prevenir ou mesmo curar doenças, já é uma realidade.
Brommonschenkel, Waldênia de Melo Moura. Recentemente, foi anunciado com grande destaque pela
REVISÃO LINGÜÍSTICA E GRÁFICA mídia nacional o seqüenciamento do código genético da
Marlene A. Ribeiro Gomide, Rosely A. Ribeiro Battista Pereira e
Giovanna Alves Santana Couto (estagiária) Xylella fastidiosa, bactéria causadora do "amarelinho dos
NORMALIZAÇÃO laranjais", por pesquisadores brasileiros, criando condições
Fátima Rocha Gomes e Maria Lúcia de Melo Silveira
para um controle mais efetivo desta doença, o que colocou
PRODUÇÃO E ARTE o Brasil dentro do seleto grupo de países que domina a
Digitação: Maria Alice Vieira e Rosangela Maria Mota Ennes
Formatação: Maria Alice Vieira e Rosangela Maria Mota Ennes tecnologia de seqüenciamento genômico. O salto da Bio-
Capa: Lamounier Lucas Pereira Júnior
tecnologia, nos últimos anos, é fantástico e todos devem
Programação visual: Lamounier Lucas Pereira Júnior

IMPRESSÃO
estar preparados para acompanhar as inúmeras mudanças
Gráfica e Editora Cultura - Rua Magnólia, 505 - Bonfim que ainda estão por vir.
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Miguel Talini Marques Filho
Os transgênicos começam a ganhar importância no
Assessoria de Marketing
setor produtivo e aproxima-se o momento em que a pes-
Av. Amazonas, 115 - CEP 30180-902 - Belo Horizonte-MG
Fone: (31) 273-3544 e 274-8194 - Fax: (31) 273-3884 quisa deverá elucidar todos os questionamentos sobre tais
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É proibida a reprodução total ou parcial, por quaisquer meios,
sem autorização escrita do editor. Todos os direitos são nocivos que eles possam causar.
reservados à EPAMIG.
Diante de novas informações e tecnologias, o Informe
Informe Agropecuário. - v.3, n.25 - (jan. 1977) - .- Agropecuário traz, nesta edição, artigos que podem contri-
Belo Horizonte: EPAMIG, 1977 - .
v.: il. buir para um melhor entedimento destas questões e apoiar
Bimestral estudos e pesquisas nesta área, na busca constante do de-
Cont. de Informe Agropecuário: conjuntura e estatística. -
v.1, n.1 - (abr.1975). senvolvimento aliado à qualidade de vida da sociedade.
ISSN 0100-3364

1. Agropecuária - Periódico. 2. Agricultura - Aspecto

Econômico - Periódico. I. EPAMIG. Márcio Amaral
CDD 630.5
ASSINATURAS: SETA/EPAMIG Presidente da EPAMIG
Amazonas, 115 - 6o andar - Caixa Postal 515 - Fone: (031) 273-3544 Ramais 137/149
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Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, maio/jun. 2000

Biotecnologia 5

Biotecnologia: um breve histórico

Everaldo Gonçalves de Barros 1
Maurílio Alves Moreira 2

Resumo - A biotecnologia pode ser entendida como qualquer técnica que utilize
organismos vivos (ou partes deles) para produzir ou modificar produtos, melhorar
plantas e animais ou desenvolver microorganismos para usos específicos. Portanto,
pode-se concluir que a humanidade vem utilizando a biotecnologia há milhares de
anos. O uso de microorganismos na fabricação do pão, de bebidas fermentadas e do
queijo é exemplo de atividades biotecnológicas. Várias foram as descobertas que
ajudaram a consolidar a biotecnologia, dentre elas a dos organismos vivos que são
formados por unidades estruturais e funcionais, hoje denominadas células, a do
desenvolvimento das primeiras vacinas, a dos antibióticos e a da elucidação de como
as características genéticas são herdadas. O reconhecimento do DNA como material
genético, o entendimento da sua estrutura e funcionamento, a elucidação do código
genético e a possibilidade da manipulação consciente do DNA por meio da Engenharia
genética deram um novo impulso à biotecnologia. A cada dia organismos geneticamente
modificados (OGMs), com uso potencial na agricultura, na indústria de medicamentos,
no controle da poluição, estão sendo criados. A informação é a melhor maneira de
nos posicionarmos perante essa nova face da biotecnologia que, certamente, estará
presente em nossas vidas no século XXI.
Palavras-chave: Engenharia genética; Genes; Microbiologia; Melhoramento;
Alimentos; População mundial.

O QUE É BIOTECNOLOGIA
Biotecnologia é um daqueles jargões
que, de tanto ser utilizados, acaba perdendo
o seu significado original. O termo foi ini-
cialmente usado pelo engenheiro húngaro
Karl Ereky, em 1919, para se referir a “todas
as linhas de trabalho, cujos produtos eram
produzidos a partir de matéria bruta com o
auxílio de organismos vivos”.
Nos dias atuais, pode-se definir bio-
tecnologia de dois modos: um mais amplo
e outro mais restrito. De um modo mais
amplo, biotecnologia refere-se a qualquer
técnica que utilize organismos vivos (ou par-
te deles), para produzir ou modificar pro-
dutos, para melhorar plantas e animais ou
para desenvolver microorganismos para
usos específicos. Nesse sentido, o homem
vem utilizando a biotecnologia desde os
primórdios da humanidade. A partir do mo-
mento em que começou a domesticar ani-
mais e plantas, a utilizar plantas medicinais
para curar seus males, microorganismos
para fabricar bebidas e alimentos e a produ-
zir vacinas para se imunizar contra doenças,
o homem estava dessa forma praticando
a biotecnologia. Há evidências arqueoló-
gicas de que o uso consciente de orga-
nismos vivos pelo homem data de 5.000 a
10.000 anos a.C. Portanto, a biotecnologia
é tão antiga quanto a própria humanidade.
De um modo mais restrito, o termo bio-
tecnologia vem sendo mais recentemente
utilizado para designar as técnicas advin-
das da Bioquímica e Biologia molecular que
podem trazer benefícios aos seres huma-
nos. Os grandes avanços na área de Biolo-
gia molecular a partir da década de 70, com
a capacidade de manipulação e transfe-
rência da informação genética entre seres
vivos de espécies diferentes por vias não-
sexuais, abriram novas possibilidades na
área de Biotecnologia, culminando no de-
senvolvimento de organismos genetica-
mente modificados (OGMs) ou organismos
transgênicos. O termo “Engenharia gené-
tica”, que se refere a essas técnicas de ma-
nipulação genética, tem sido utilizado por
muitos como sinônimo de biotecnologia.
Mesmo no sentido restrito, biotecnologia
é bem mais do que simplesmente Engenha-
ria genética. Há, nesse caso, uma simpli-
ficação exagerada do que vem a ser bio-
tecnologia. Os avanços da Genética, Bio-
logia molecular, Bioquímica e Microbio-
logia colocaram uma série de ferramentas
à disposição do homem, permitindo o de-
senvolvimento de metodologias que têm
um impacto direto no bem-estar da huma-
nidade, mesmo não envolvendo a mani-
pulação direta do material genético, isto
é, a Engenharia genética. São exemplos
desses avanços: as vacinas, os antibióti-

1
Biólogo, Ph.D. Biologia Molecular de Plantas, Prof. Tit. UFV - Depto Biologia Geral, Pesq. UFV - BIOAGRO, CEP 36571-000 Viçosa, MG.
E-mail: ebarros@mail.ufv.br
2
Engo Agro, Ph.D. Bioquímica Genética de Plantas, Prof. Tit. UFV - Depto Bioquímica e Biologia Molecular, Pesq. UFV - BIOAGRO, CEP 36571-000
Viçosa, MG. E-mail: mmoreira@mail.ufv.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000

6 Biotecnologia
cos, como a penicilina, a cultura de teci-
dos e, até mesmo, a clonagem de plantas e
de animais. Nenhum desses exemplos de-
pende diretamente da Engenharia genética
e nem por isso deixam de ser avanços bio-
tecnológicos.
MARCOS HISTÓRICOS DA
BIOTECNOLOGIA
Há, aproximadamente, 10.000 anos os
nossos ancestrais já utilizavam o processo
de fermentação microbiana para a produ-
ção de vinho, cerveja e pão. Na fermenta-
ção, microorganismos como bactérias e
fungos digerem os alimentos e produzem
dois subprodutos de interesse para o ho-
mem - o gás carbônico e o álcool. Na fa-
bricação de cerveja, leveduras quebram o
amido e açúcares presentes em cereais,
como a cevada, e produzem energia para a
sua sobrevivência e também o álcool e o
gás carbônico como subprodutos. O álcool
é um dos responsáveis pelo aroma da
bebida e o gás carbônico, pela espuma que
ela forma. Na fabrição do pão, o processo é
semelhante. No entanto, neste caso, nor-
malmente utiliza-se o trigo como fonte de
amido e açúcares. O álcool é responsável
pelo aroma do pão, e o gás carbônico pro-
move o aumento do volume da massa pela
formação de bolsões de ar no seu interior.
No campo da Biologia celular, Robert
Hooke, em 1665, observou pela primeira
vez, em um microscópio, a estrutura celular
da cortiça. Percebeu que esse tecido ve-
getal é formado por estruturas regulares
parecidas com as células presentes em um
favo de mel. No entanto, somente quase
200 anos mais tarde foi que outros cien-
tistas, utilizando melhores microscópios,
concluíram que todos nós somos dividi-
dos nesses pequenos compartimentos que
hoje denominamos “células”. Anton van
Leeuwenhoek (1632 - 1723), um mercante
holandês que tinha como hobby polir as
suas próprias lentes de vidro, fez várias
descobertas em Microbiologia. Foi o pri-
meiro cientista a descrever seres unice-
lulares como protozoários e bactérias, e
a reconhecer que esses microorganismos
poderiam desempenhar algum papel no
processo de fermentação.
No campo da Microbiologia e Imuno-
logia, Giacomo Pylarini, em Constantinopla,
em 1701, praticava a “inoculação”, que con-
sistia na exposição intencional de crianças
à varíola para evitar problemas mais sérios
na fase adulta. Em 1798, Edward Jenner
publicou um livro comparando a vacinação
com a inoculação. Na vacinação as pes-
soas eram expostas à varíola bovina para
induzir a resistência à varíola humana.
Louis Pasteur (1822 - 1895) afirmou que
os micróbios eram responsáveis pelo pro-
cesso de fermentação. Em 1863, inventou
o processo de pasteurização, que consistia,
inicialmente, em aquecer o vinho sufi-
cientemente para matar os micróbios, mas
não o suficiente para alterar o seu aroma.
Em 1880, estudando a cólera em aves, con-
cluiu que cepas atenuadas ou enfraque-
cidas de microorganismos não conseguiam
causar doenças, mas protegiam contra
formas severas dessa mesma doença. Em
1881, usou a atenuação para desenvolver
vacinas contra a cólera em aves e antraz.
Esse foi um marco expressivo na área de
Imunologia, abrindo novas fronteiras no
campo da Medicina preventiva.
Entre 1873 e 1876, Robert Koch de-
senvolveu técnicas para visualizar, crescer
e corar microorganismos. Em 1881, des-
creveu colônias de bactérias crescendo em
fatias de batata, em meio contendo gelatina
e em ágar. Este último tornou-se um meio pa-
drão para a obtenção e crescimento de cul-
turas puras e a identificação de microorga-
nismos mutantes. Alguns consideram ter
sido esta a principal descoberta que ala-
vancou o desenvolvimento da Microbiolo-
gia. Robert Koch, em 1882, usando o por-
quinho-da-índia como hospedeiro alter-
nativo, descreveu a bactéria que causa a
tuberculose em humanos. Ele foi o primeiro
a desvendar a causa de uma doença huma-
na de origem microbiana.
Em 1896, Ronald Ross descobriu o
protozoário Plasmodium, que causa a
malária em humanos. Demonstrou também
que o mosquito Anopheles transmite a
doença de uma pessoa para outra. Em 1909,
Carlos Chagas identificou o agente cau-
sador da doença de Chagas, o protozoário
Trypanosoma cruzi. Na realidade, seu
trabalho abrangeu todos os aspectos da
doença: anatomia patológica, epidemio-
logia, etiologia, formas clínicas, meios de
transmissão, patogenia, profilaxia e sin-
tomatologia.
Em 1928, Alexander Fleming observou
a formação de um halo em uma placa de
Petri, onde havia bactérias em crescimento.
Nesse halo, as bactérias não cresciam. No
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000
centro dele constatou a presença de um
fungo que produzia uma substância, mais
tarde denominada de penicilina, que mata-
va as bactérias. Decorreram quase 15 anos
para que o antibiótico penicilina, em plena
Segunda Guerra Mundial, se tornasse dis-
ponível à comunidade para uso médico,
salvando inúmeras vidas.
No campo da Genética e Biologia mo-
lecular, em 1865, o monge agostiniano
Gregor Mendel (1822 – 1884), com base nos
seus trabalhos com ervilhas, apresentou à
Sociedade de Ciência Natural da Áustria,
suas leis da hereditariedade. Mendel pro-
pôs que unidades internas invisíveis eram
responsáveis pelas características obser-
váveis, e que esses “fatores”, os quais cha-
mamos hoje de genes, eram passados de
uma geração para outra. Os achados de
Mendel, no entanto, não foram devida-
mente apreciados até 1900, quando Hugo
de Vries, Erich von Tschermak e Carl Cor-
rens publicaram os resultados de suas
pesquisas que confirmaram os mecanismos
da hereditariedade propostos por Mendel.
Hoje ele é considerado o “pai da Genética”
e o seu trabalho é a base desta Ciência e de
outras áreas do conhecimento que dela de-
rivaram, como é o caso da Biologia mole-
cular.
Em 1902, Walter Stanborough Sutton
afirmou que os cromossomos ocorrem aos
pares e sugeriu que os fatores de Mendel
estavam localizados nos cromossomos.
Após observar os movimentos dos cromos-
somos durante a meiose, Sutton desen-
volveu a teoria da hereditariedade, a qual
ia ao encontro das idéias de Mendel a res-
peito da segregação dos fatores genéticos.
Em 1907, Thomas Hunt Morgan iniciou
seus trabalhos com a mosca-das-frutas
Drosophila e demonstrou que os cromos-
somos têm um papel definitivo na heredi-
tariedade. Formulou a teoria da mutação e
estabeleceu as bases para o entendimento
dos mecanismos da hereditariedade.
Em 1926, Hermann Muller descobriu
que os raios X poderiam induzir mutações
na mosca-das-frutas cerca de 1.500 vezes
mais rápido do que em condições normais.
Essa descoberta forneceu uma ferramenta
poderosa aos pesquisadores para induzir
mutações e, dessa forma, determinar as fun-
ções específicas de diversos genes.
Em 1928, Fredrick Griffith observou que
bactérias com paredes celulares rugosas
podiam ser transformadas em células com
Biotecnologia
paredes lisas, quando estas eram mortas
pelo calor e depois misturadas às primeiras.
Ou seja, um princípio transformante, pro-
veniente das bactérias com paredes lisas,
era capaz de modificar o aspecto daquelas
com paredes rugosas. Em 1944, Oswald
Theodore Avery, Colin MacLeod e Maclyn
McCarty determinaram que o princípio
transformante, primeiramente observado
por Griffith, era na realidade o DNA (ácido
desoxirribonucléico). Portanto, o DNA, que
está contido nos cromossomos, seria o
material genético da célula, o responsável
pela transmissão dos caracteres here-
ditários. Inicialmente, uma boa parte da co-
munidade científica da época não acreditou
que o DNA, uma molécula de composição
tão simples e, aparentemente, monótona,
pudesse ser o material genético. Seria mais
lógico que as proteínas, com a sua composi-
ção e estrutura mais complexas, contives-
sem a informação genética. Aos poucos
essa dúvida foi sendo dissipada. Em 1952,
Alfred Hershey e Martha Chase, utilizando
um tipo de vírus que infecta bactérias
(bacteriófagos), marcaram radioativamente
o DNA do vírus e confirmaram que era o
DNA que era injetado na bactéria, pro-
movendo o aparecimento de novas partí-
culas virais. Este resultado confirmou o
papel do DNA como material genético e re-
futou a idéia de que as proteínas teriam
essa função.
Em 1953, James Watson e Francis Crick,
com base em dados de seus antecessores
e de contemporâneos como Maurice
Wilkens e Rosalind Franklin, propuseram
o modelo que explicava a estrutura da
molécula de DNA. Esse foi um verdadeiro
marco na história da Genética e Biologia
molecular, pois reuniu, de um modo in-
teligente em um único modelo, uma série
de conceitos que havia sido desenvolvida
ao longo de vários anos. De acordo com o
modelo, a molécula de DNA seria formada
por duas fitas de nucleotídeos (unidades
estruturais), que se complementariam e se
enrolariam na forma de uma escada em
espiral. O modelo não só explicou a estru-
tura da molécula, mas também sugeriu o
modo pelo qual ela seria capaz de se auto-
duplicar e de transferir a informação gené-
tica nela contida.
Em 1957, Matthew Meselson e Frank
Stahl demonstraram o mecanismo de re-
plicação do DNA, ou seja, como a célula
pode produzir duas novas moléculas de
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000
DNA a partir de uma molécula de DNA
preexistente. Na década de 60, Nirenberg,
Leder e Khorana elucidaram o código ge-
nético, isto é, a correspondência precisa
entre a seqüência de nucleotídeos do DNA
e a de aminoácidos nas proteínas. Sabemos
hoje que as proteínas são codificadas por
genes específicos que determinam as se-
qüências dos seus aminoácidos. Essas se-
qüências irão contribuir diretamente para a
determinação das estruturas e conseqüen-
tes funções das proteínas.
Em 1972, Paul Berg isolou e empregou
uma enzima de restrição para cortar uma
molécula de DNA e a enzima DNA ligase
para ligar dois fragmentos de DNA, pro-
duzindo uma molécula circular híbrida, a
primeira molécula de DNA recombinante.
Nesse mesmo ano, os primeiros experi-
mentos bem-sucedidos sobre clonagem de
fragmentos de DNA em bactérias foram
feitos na Califórnia (EUA). Neste caso, a
clonagem envolve o isolamento de um
fragmento de DNA, sua ligação a uma mo-
lécula de DNA circular denominada plas-
mídeo e a sua inserção (transformação) e
multiplicação na bactéria.
Em 1973, Stanley Cohen, Annie Chang
e Herbert Boyer produziram um plasmídeo
recombinante que continha pedaços de
DNA de bactéria e de vírus e o introduziram
em uma bactéria, produzindo o primeiro or-
ganismo recombinante feito, de modo cons-
ciente, pelo homem. Em 1976, Herbert Boyer
e Robert Swanson fundaram a Genentech,
primeira empresa de biotecnologia dedica-
da a desenvolver e a comercializar produtos
com base na tecnologia do DNA recom-
binante recém-desenvolvida. Em 1977, a Ge-
nentech anunciou a produção da primeira
proteína humana a ser fabricada por bacté-
rias, a somatostatina. Muitos consideram
esse como o advento da era da moderna
biotecnologia. Em 1978, foi anunciada a pro-
dução, em laboratório, da insulina humana
obtida pela técnica do DNA recombinante.
Nesse mesmo ano, David Botstein e
colaboradores descobriram que, quando o
DNA de diferentes pessoas era cortado
com enzimas de restrição, os fragmentos
obtidos, quando separados por ordem de
tamanho, geravam padrões que diferiam de
pessoa para pessoa. Esses padrões podem
ser utilizados para identificar, de modo
preciso, pessoas, animais, plantas e micro-
organismos. Têm sido utilizados, por exem-
plo, nos testes de paternidade, tão comuns
7
nos dias atuais. Os fragmentos obtidos
também podem ser utilizados como mar-
cadores moleculares, ou seja, marcadores
de características de interesse, como re-
sistência a doenças, como produtividade,
desde que seja demonstrada a sua asso-
ciação com essas características. Nesse
caso, passam a ter uma importância muito
grande como ferramenta auxiliar no pro-
cesso de melhoramento de plantas e ani-
mais na seleção de indivíduos.
Em 1980, a Corte Suprema dos Estados
Unidos admitiu que os OGMs poderiam ser
patenteados, quando autorizou a empresa
de petróleo Exxon a patentear uma bactéria
especialmente desenvolvida para degradar
petróleo. Essa decisão foi o aval necessário
para que as grandes corporações inicias-
sem a grande corrida que vemos hoje em
busca do desenvolvimento e patentea-
mento dos OGMs.
Nesse mesmo ano, Kary Mullis e cola-
boradores inventaram uma técnica mole-
cular revolucionária que permite produ-
zir milhões de cópias de um fragmento de
DNA em um pequeno tubo no laboratório.
Essa técnica, denominada Reação em Ca-
deia da Polimerase (PCR), é atualmente uti-
lizada em várias aplicações em Biologia mo-
lecular, desde a amplificação de fragmentos
de DNA de múmias de 4.000 anos de idade,
até os testes de paternidade.
Em 1981, pesquisadores da Universida-
de de Ohio, nos Estados Unidos, produzi-
ram os primeiros animais transgênicos,
transferindo genes de outros animais para
óvulos de fêmeas de camundongo.
Em 1982, a Agência de Controle de Ali-
mentos e Drogas (FDA), norte-americana,
autorizou a comercialização do primeiro
produto farmacêutico para consumo hu-
mano derivado da Engenharia genética,
uma forma de insulina humana produzida
por bactérias. Em 1986, a Agência de Pro-
teção ao Ambiente (EPA), norte-americana,
liberou a primeira planta geneticamente
modificada, o tabaco. Em 1990, a empresa
Calgene Inc. conduziu em campos experi-
mentais os primeiros ensaios bem-sucedidos
de variedades de algodoeiro geneticamente
modificadas para tolerar o herbicida bro-
moxinil.
Também, no ano de 1990, o pesquisa-
dor Michael Fromm comunicou que havia
transformado o milho de modo estável, in-
troduzindo em suas células fragmentos de
DNA de outra espécie por meio da técnica
8 Biotecnologia
de biobalística. Esse método consiste no
bombardeamento de células com frag-
mentos de DNA embebidos em partículas
de metais pesados como o ouro ou o tun-
gstênio. O bombardeamento é feito sob
alta pressão, com ar comprimido, e permite
que o DNA atravesse o sistema de mem-
branas das células, indo alojar-se no núcleo,
onde pode, eventualmente, integrar-se ao
material genético da célula. Esse método
tornou-se rotineiro para a obtenção de
organismos transgênicos.
Ainda nesse mesmo ano, foi iniciado o
projeto do genoma humano, com o obje-
tico de seqüenciar todo o material gené-
tico humano, isto é, desvendar a ordem dos
aproximadamente três bilhões de nucleo-
tídeos que constituem a base estrutural
do DNA humano. Uma vez conhecida a
ordem dos nucleotídeos do DNA, é possí-
vel deduzir as seqüências dos aminoácidos
que compõem as nossas proteínas e, even-
tualmente, as suas funções. O projeto de-
verá estar concluído nos próximos três a
cinco anos.
Em 1993, o FDA norte-americano decla-
rou que os alimentos feitos a partir de
OGMs não são perigosos em si e que, por-
tanto, não necessitam de regulamentação
especial. Em 1994, o FDA aprovou o pri-
meiro alimento derivado de OGMs, o to-
mate Flavr Savr. Neste tomate havia sido
introduzido um segmento de DNA que ini-
bia a expressão de enzimas que normal-
mente promovem o amolecimento do fruto,
de tal forma que o tomate transgênico
apresentava uma “vida de prateleira” mais
longa do que o tomate normal.
Nesse mesmo ano, foram identificados
vários genes (segmentos de DNA) relacio-
nados com diversas anomalias e outras
características de interesse para o homem,
tais como: câncer de mama, câncer da tireói-
de, câncer de próstata, melanoma, surdez,
dislexia, predisposição à obesidade, morte
celular programada, diferenciação celular,
reprodução do vírus que causa a AIDS,
entre outras.
Em 1995, foi anunciada a conclusão do
primeiro seqüenciamento completo do
genoma de uma bactéria, a Haemophilus
influenzae. Em 1996, um grupo de cientistas
anunciou a conclusão do seqüenciamento
do genoma de um organismo complexo, a
levedura Saccharomyces cerevisae. Em
1997, pesquisadores escoceses anunciaram
a clonagem da ovelha Dolly. O processo
consistiu na remoção do núcleo (que con-
tém o DNA) de um óvulo e a introdução,
no seu lugar, do núcleo de uma célula
adulta. O óvulo foi então implantado no
útero de uma outra ovelha, uma mãe de alu-
guel, e a ovelha Dolly foi concebida, com
toda a bagagem genética da ovelha-mãe
que forneceu o núcleo. Esse experimento
abriu a possibilidade da clonagem de ani-
mais. No entanto, deve-se salientar que,
na época, a clonagem de plantas já era um
conceito consolidado na área vegetal.
Todos esses eventos e outros ajudaram
a consolidar a biotecnologia. As pesqui-
sas continuam. Atualmente, existem mais
de 1.200 companhias de biotecnologia so-
mente nos Estados Unidos. Centenas de
novos remédios, kits-diagnóstico, biopes-
ticidas, plantas transgênicas e vacinas estão
em teste e muitos já estão sendo comer-
cializados.
BIOTECNOLOGIA NA
AGRICULTURA
Crescimento populacional
versus demanda por
alimentos e fibras
Em 1998, ocorreu o bicentenário da
famosa publicação de Malthus An Essay
on the Principle of Population que argu-
mentava não ser a agricultura capaz de
aumentar a produção de alimentos de forma
suficientemente rápida para atender às
necessidades do crescimento populacional
do planeta e que, portanto, os seres hu-
manos seriam condenados à pobreza, à
fome, e a vários tipos de pestes e de vícios.
As preocupações Malthusianas têm sido
avaliadas por muitos cientistas de várias
áreas do conhecimento desde aquela épo-
ca. Atualmente, as discussões a respeito
do crescimento da população mundial e do
suprimento de alimentos estão recheadas
de preocupações, cada vez mais crescentes,
a respeito das conseqüências ecológicas e
ambientais provocadas pela expansão da
produção de alimentos, que visa alimentar
um número cada vez maior de seres hu-
manos.
Em 1968, um biólogo da Universidade
de Stanford chamado Paul Elrlich publi-
cou um pequeno livro denominado The
Population Bomb. Esta publicação enfatiza
os perigos do rápido e contínuo crescimen-
to da população mundial, especialmente
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000
nos países menos desenvolvidos. Naquele
mesmo ano, J. George Harrar, presidente da
Fundação Rockfeller, proferiu uma palestra
no Primeiro Encontro Internacional de
Fitopatologia, ocorrido em Londres, em que
enfatizou a necessidade de os cientistas
auxiliarem na solução dos problemas per-
sistentes da humanidade, tais como guer-
ras, fome, pobreza, doenças, ignorância,
diferenças socioculturais e a superpopu-
lação. Harrar mencionou que havia naque-
le ano 3,5 bilhões de pessoas no planeta
e antecipou que esse número seria de 6
bilhões no ano 2000 (marca esta registrada
no dia 12 de outubro de 1999). Harrar tam-
bém apontou para a urgente necessidade
de aplicação das novas descobertas das
Biologias molecular e celular para aumen-
tar a produção de alimentos.
Desde 1968, grandes mudanças ocor-
reram no complexo de variedades cultiva-
das, dentre elas a educação do fazendeiro,
as técnicas de manejo e uso do solo, o
sistema de crédito agrícola, a extensão agrí-
cola, os sistemas de irrigação e o uso de
agrotóxicos e fertilizantes. Dessa forma, a
produção, distribuição e acesso a alimentos
têm reduzido a porcentagem estimada da
população cronicamente desnutrida em
várias regiões do mundo, exceto ainda em
algumas regiões da África. No entanto,
mesmo com toda essa tecnologia, estima-
se que cerca de um bilhão de pessoas ainda
sofram de desnutrição no mundo atual.
Atualmente, a população mundial é de
6 bilhões de pessoas e está aumentando
em, aproximadamente, 80 milhões ao ano.
Se este crescimento anual continuar com
uma taxa de cerca de 1,4%, a população
mundial dobrará em 50 anos. Contudo, a
maioria dos demógrafos não acredita nessa
predição, tendo em vista que a taxa de cres-
cimento da população tem caído nos últimos
anos. Mesmo assim, é plausível predizer
uma população entre nove a dez bilhões de
pessoas no ano 2050.
Vários estudos e simpósios interna-
cionais têm sido realizados para discutir
questões relacionadas com a produção de
alimentos de forma sustentável no mundo.
No entanto, muitas questões permanecem
sem respostas satisfatórias, tais como:
a) veracidade das estatísticas sobre a
extensão da fome no mundo;
b) extensão da desertificação e da quan-
tidade de terra que é usada para a
agricultura;
Biotecnologia
c) tamanho e efeito da erosão do solo
na agricultura em várias partes do
mundo;
d) quantidades de carbono e nitro-
gênio que devem ser restituídas ao
solo para manter sua fertilidade;
e) tempo de persistência e eficiência
de proteínas pesticidas, tais como a
endotoxina do Bacillus thuringiensis,
no controle de insetos-praga;
f) uso dos direitos de propriedade
intelectual, de forma que venha a
otimizar os interesses das grandes
firmas de biotecnologia dos países
desenvolvidos com as necessida-
des dos pequenos agricultores dos
países em desenvolvimento;
g) eficácia no fluxo de informações a
respeito de novas práticas agrícolas
e de distribuição de sementes me-
lhoradas aos agricultores, em países
com diferentes níveis de educação
e de sofisticação tecnológica.
Biotecnologia na produção
de alimentos e fibras
A biotecnologia vegetal apresenta pre-
dições otimistas a respeito de vários aspec-
tos da produção e distribuição de alimentos
no mundo. Entre estas predições têm sido
citadas: melhoria genética da qualidade dos
alimentos, a fim de atingir os requerimentos
nutricionais do homem e de animais domés-
ticos, e criação de variedades tolerantes a
deficiências de nutrientes e a estresses do
ambiente.
Tem sido apontado que uma das prin-
cipais vantagens da biotecnologia de
plantas é que ela pode gerar estratégias de
melhoramento que são aplicáveis a diferen-
tes culturas. Nesse sentido, as estratégias
da Engenharia genética que conferem
resistência a vírus, proteção contra insetos
e amadurecimento retardado de frutos são
bons exemplos, que podem beneficiar di-
ferentes culturas. Plantas transgênicas de
mais de 20 espécies já foram produzidas
com resistência a mais de 30 diferentes
viroses. Variedades de plantas protegidas
contra insetos, com o uso da endotoxina
de Bacillus thuringiensis já foram produzi-
das para diversas espécies vegetais de im-
portância, incluindo tabaco, tomate, batata,
algodão, milho, cana-de-açúcar e arroz. Des-
tas, as culturas de milho, de algodão e de ba-
tata transgênicas, protegidas contra insetos,
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000
9
já estão sendo comercializadas. Essas es- mundo em desenvolvimento e introduzidas
tratégias podem ser usadas para muitas ou- em outras culturas e variedades locais.
tras plantas de importância para países em Os dados do Quadro 1 mostram que as
desenvolvimento. Em particular, a estraté- características comerciais de interesse
gia de Engenharia genética que promove o estão mudando rapidamente da primeira
amadurecimento retardado de frutos apre- para a segunda geração de plantas trans-
senta enorme potencial para uso em fru- gênicas. Na primeira geração, a maioria das
tos tropicais, que estão sujeitos a perdas características envolvia um único gene, tais
consideráveis em virtude de seu amadu- como tolerância a herbicidas e proteção a
recimento rápido e da falta de condições insetos-praga. Na segunda geração de plan-
apropriadas de armazenamento e transpor- tas transgênicas, a grande ênfase tem sido
te que permitam distribuição e comerciali- dada para características de qualidade do
zação eficientes. produto, o que implica na transferência si-
Até o momento, a maioria das tecno- multânea de mais de um gene.
logias de transferência de genes em plantas A fim de atender às necessidades da
e as diferentes estratégias usadas para pro- crescente população mundial, sem destruir,
duzir variedades de plantas transgênicas cada vez mais, a frágil ecologia do nosso
têm sido direcionadas pelo valor econô- planeta, temos que encontrar meios e
mico das espécies e das características. O métodos mais eficientes para aumentarmos
valor econômico é, por sua vez, determi- a produção de alimentos e fibras.
nado pela importância da espécie e da ca- As metodologias do melhoramento
racterística para a agricultura do mundo tradicional foram e ainda continuarão a ser
desenvolvido, isto é, Estados Unidos e usadas com este propósito, mesmo com o
países da Europa Ocidental. A ênfase advento de plantas transgênicas. As varie-
econômica é entendida, uma vez que in- dades transgênicas terão de ser adaptadas
vestimentos vultosos são necessários para aos seus ambientes de cultivo por métodos
desenvolver, testar em campos experimen- tradicionais de melhoramento. Porém, a fim
tais e comercializar as novas variedades de de criar um nível de produção requerido
plantas transgênicas. No entanto, em ter- para alimentarmos um número cada vez
mos de produção global de alimentos, é maior de pessoas, teremos que utilizar ferra-
necessário assegurar que essas tecnologias mentas da biotecnologia moderna, tais co-
sejam efetivamente transferidas para o mo a Engenharia genética de plantas.
QUADRO 1 - Histórico de dados de solicitações para realização de testes de campo nos Estados
Unidos, em intervalos de três anos, no período 1987-1999, subdivididos de acordo
com a categoria do material transgênico (valores expressos em porcentagens)
Ano
Categoria
1987 1990 1993 1996 1999
Tolerância a herbicidas 67 22 33 24 24
Proteção contra insetos 22 21 22 23 9
Resistência a vírus 11 29 16 16 _
Resistência a bactérias _ 5 2 1 _
Resistência a fungos _ 4 4 8 6
Características agronômicas _ 3 2 3 6
Qualidade do produto _ 8 18 17 52
Genes marcadores _ 3 1 3 _
Resistência a nematóides _ _ <1 _ _
Outros _ 6 2 5 3
FONTE: Dunwell (1999).
10 Biotecnologia

Tipos de plantas godão. Nos Estados Unidos, as varieda- dicionam:

transgênicas já existentes
Um dos primeiros caracteres introdu-
zidos em plantas por Engenharia genética foi
a resistência a insetos, utilizando o gene que
codifica a toxina de Bacillus thuringiensis (Bt).
O gene Bt, que foi transferido para o milho,
confere resistência ao “European corn borer”
(importante praga do milho nos Estados
Unidos).
Outra característica introduzida no mi-
lho e na soja foi a tolerância ao herbicida
glifosato, criando as cultivares Round-up
Ready. O uso dessa nova tecnologia tem
mostrado ser altamente eficiente no con-
trole de plantas daninhas. Além disso,
criou-se a oportunidade de intensificar o
uso das técnicas de plantio direto na
agricultura, com todos os seus já conhe-
cidos benefícios (controle da erosão do
solo, melhoria da qualidade do solo e da
água, e menor perda de matéria orgânica).
Os genes de Bt e de tolerância ao gli-
fosato foram também introduzidos em al-
des de algodão Bt e Bt/Round-up Ready
têm-se mostrado mais produtivas e de me-
nor custo de produção. No entanto, a fim
de tirar o máximo proveito destes genes, a
cultura deve ser bem manuseada. Por exem-
plo, a aplicação do herbicida glifosato em
algodão deve ser antes do quarto estádio
foliar. Se aplicado depois, promove uma re-
dução drástica no número de maçãs florais.
Outra característica que tem demons-
trado ser de grande valia é a transfoma-
ção genética de plantas, visando à macho-
esterilidade, o que viabiliza a obtenção de
sementes híbridas. Por exemplo, já estão
disponíveis linhagens de canola com gene
indutor da macho-esterilidade (gene barna-
se) e restaurador da fertilidade (gene barstar)
e, ao mesmo tempo, tolerantes ao herbicida
glufosinato. Os híbridos transgênicos pro-
duzem de 10% a 20% a mais do que os con-
troles.
Existem muitos genes sendo testados
para transformação de plantas que con-
a) resistência a doenças causadas por
vírus, fungos, bactérias e nema-
tóides;
b) mudanças na composição do amido,
de proteínas e de óleos;
c) produção de anticorpos e de pro-
dutos farmacológicos.
A grande utilidade da tecnologia de plan-
tas transgênicas, ainda em desenvolvimen-
to, consiste em transformar plantas com ge-
nes que controlam caracteres complexos, co-
mo aqueles que afetam a adaptação de uma
determinada cultura a diversos ambientes,
o desenvolvimento e a morfogênese, a re-
gulação do florescimento e, por último, a
produtividade como um todo.
O Quadro 2 apresenta, de forma suscin-
ta, um histórico da introdução das princi-
pais características de plantas transgênicas
comercializadas no mundo e as empresas de-
tentoras dessas novas variedades/tecnolo-
gias, no período de 1994 até o início de 1999.

QUADRO 2 - Histórico da introdução das principais variedades de plantas transgênicas, fontes dos genes e detentores das variedades e tecnologias
(empresas), no período de 1994 ao início de 1999

Empresa Variedade transgênica Caráter/Gene e fonte

(continua)

1994

Asgrow Seed Co. Abóbora resistente a vírus Genes das proteínas das capas do mosaico da melancia
e do mosaico amarelo da abobrinha

Calgene Tomate Flavr Savr Gene anti-senso da poligalacturonase de tomate

Algodão tolerante ao bromoxinil Gene de nitrilase isolado de Klebsiella azaenae

DNA Plant Technology Corp. Tomate com amadurecimento retardado Fragmento do gene da sintase do ácido aminociclo-
propano carboxílico de tomate

Monsanto Soja tolerante ao glifosato Gene de EPSP sintase de Agrobacterium estirpe CP4

Tomate com amadurecimento retardado Gene da deaminase do ácido aminociclopropano car-

boxílico de Pseudomonas chloraphis estirpe 6G5

Zeneca Plant Science Batata protegida contra insetos Gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis sp. tenebrionis

Tomate com amadurecimento retardado

Fragmento do gene de poligacturonase de tomate
1995
AgrEvo Inc. Canola tolerante ao glufosinato Gene de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces
viridochromogenes

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000

Biotecnologia 11

Empresa Variedade transgênica Caráter/Gene e fonte

(continua)

1995

ArgEvo Inc. Milho tolerante ao glufosinato Gene de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces
viridochromogenes

Ciba – Geigy Corp. Milho protegido contra insetos Gene cryIA (b) de B. thuringiensis subsp. kurstaki

Monsanto Algodão tolerante ao glifosato Gene da EPSP sintase de Agrobacterium estirpe CP4

Canola tolerante ao glifosato Gene da EPSP sintase de Agrobacterium estirpe CP4

Milho protegido contra insetos

Gene cryIA (c) de B. thuringiensis subsp. kurstaki
1996

Agritop Tomate com amadurecimento retardado Gene de S-adenosilmetionina hidrolase do bacteriófago

T3 de Escherichia coli

DeKalb Genetics Corp. Milho tolerante ao glufosinato Gene de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces
hygroscopicus

DuPont Algodão tolerante à sulfoniluréia Gene de acetolactato sintase de tabaco (N. tabacum cv
xanthi)

Monsanto Batata protegida contra insetos Gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis

Milho protegido contra insetos Gene cryIA(b) de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki

Milho tolerante ao glifosato e protegido contra
insetos
Gene de EPSP sintase de Agrobacterium estirpe CP4 e o
gene de glifosato oxidoredutase de Ochrobactrum
anthropi nas linhagens tolerantes ao glifosato e o gene
cryIA(b) de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki nas
linhagens protegidas contra insetos

Northrup King Co. Milho protegido contra insetos Gene cryIA(b) de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki

Plant Genetic Systems Linhagens de canola macho estéril e restauradora As linhagens macho estéril contêm o gene barnase de
da fertilidade Bacillus amyloliquefaciens e as linhagens restaurado-
ras da fertilidade contêm o gene barstar de Bacillus
amiloliquefaciens

Milho macho estéril Gene barnase de Bacillus amyloliquefaciens

1997
AgrEvo Inc. Canola tolerante a glufosinato Gene de fosfinotricina de Streptomyces viridochromogenes

Bejo Zaden BV Radicchio rosso macho estéril Gene barnase de Bacillus amyloliquefaciens

DeKalb Genetics Corp. Milho protegido contra insetos Gene cryIA(c) de Bacillus thuringiensis

DuPont Soja com alto teor de ácido oléico Supressão do gene GmFad2-1 que codifica a enzima
delta-12 dessaturase

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000

12 Biotecnologia

Empresa Variedade transgênica Caráter/Gene e fonte

(conclusão)

1997

Seminis Vegetable Seeds Abóbora resistente a vírus Genes das proteínas da capa do vírus do mosaico da
abóbora, do vírus do mosaico amarelo de abobrinha e
do vírus 2 do mosaico da melancia

Universidades do Havaí/Cornell Mamão resistente a vírus Gene da proteína da capa do vírus que causa mancha-
anelar no mamoeiro

1998

AgrEvo Inc. Soja tolerante ao glufosinato Gene de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces
viridochromogenes

Beterraba açucareira tolerante ao glufosinato Gene de fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces

viridochromogenes

Milho protegido contra insetos e tolerante ao glu- Gene cry9C de B. thuringiensis subsp. tolworthi e o
fosinato gene bar de Streptomyces hygroscopicus

Canola macho estéril ou restauradora da fertilida-
de e tolerante ao glufosinato
Canola macho estéril contém o gene barnase e canola
restauradora da fertilidade contém o gene barstar de
Bacillus amyloliquefaciens. Ambas contêm o gene
fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces
viridochromogenes

Calgene Algodão protegido contra insetos e tolerante ao Gene de nitrilase de Klebsiella pneumoniae e o gene
bromoxinil cryIA(c) de B. thuringiensis subsp. kurstaki

Tomate protegido contra insetos Gene cryIA(c) de B. thuringiensis subsp. kurstaki

Monsanto Milho tolerante ao glifosato Gene modificado de EPSP sintase do milho

Batata protegida contra vírus e insetos Gene cryIIIA de B. thuringiensis sp. tenebrionis e o
gene da proteína da capa do vírus Y

Monsanto/Novartis Beterraba açucareira tolerante ao glifosato Gene da EPSP sintase de Agrobacterium estirpe CP4 e
gene de glifosato oxidoredutase de Ochrobactrum
anthropi

Pioneer Hi-Bred Milho macho estéril Gene da metilase de adenina do DNA de E. coli

Universidade de Saskatchewan Linho tolerante à sulfoniluréia Gene de acetolactato sintase de Arabidopsis

1999

BASF AG Canola com sementes sem ácido fítico Gene de fitase de Aspergilus niger var. van Tieghem

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000

Biotecnologia
GLOSSÁRIO DE TERMOS
BIOTECNOLÓGICOS
Agrobacterium tumefaciens: bactéria de
ocorrência natural no solo que é muito
usada como veículo de transformação
de plantas.
Baccillus thuringiensis (Bt): bactéria de
ocorrência natural no solo e usada com
sucesso na agricultura orgânica para
controlar certos insetos da ordem
Lepdotera por mais de 30 anos. Quando
ingerida pelo inseto-alvo, a proteína
produzida pelo Bt mata o inseto pro-
movendo distúrbios no sistema diges-
tivo dele. A proteína do Bt não é tóxica
para outros insetos e muito menos para
seres humanos e animais.
Caráter: característica fenotípica que é
conferida pelo inserto transgênico ao
organismo recipiente.
Construção: fragmento de DNA mani-
pulado por Engenharia genética, que
contém a seqüência de DNA para ser
integrada no genoma do organismo
recipiente.
Cromossomos: elementos microscópicos
com o formato de bastonetes que ocor-
rem no núcleo da célula eucariótica. Os
cromossomos contêm as moléculas de
DNA e conseqüentemente a informa-
ção genética do organismo.
DNA (ácido desoxirribonucléico): com-
posto de desoxirribose (açúcar), fosfato
e bases nitrogenadas. Cada molécula
de DNA consiste de duas fitas com-
plementares no formato de uma hélice
dupla. O DNA é responsável pela trans-
ferência da infomação genética de uma
geração para outra.
Engenharia genética: tecnologia que per-
mite remover, adicionar ou modificar
genes em organismos vivos, também
chamada de tecnologia do DNA
recombinante ou modificação genética.
Enzimas: são proteínas que catalisam rea-
ções químicas na célula, resultando na
produção de compostos necessários à
sobrevivência da célula.
EPSP sintase: enzima que catalisa a reação
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.5-13, maio/jun. 2000
de uma via metabólica de plantas que
leva a produção de aminoácidos aro-
máticos (fenilalanina, tirosina e tripto-
fano), necessários para a síntese de
proteínas e outros compostos essen-
ciais para o crescimento vegetal. Essa
enzima é inibida pelo herbicida gli-
fosato.
Estabilidade: habilidade de um caráter
transgênico de ser expresso na linha-
gem do organismo geneticamente
modificado e nas linhagens derivadas
subseqüentes, de forma consistente,
reprodutível e de maneira predita.
Gene: uma porção do cromossomo que
contém a informação genética para a
produção de uma proteína.
Herbicida: composto químico usado para
matar plantas, especialmente, as da-
ninhas.
Híbrido: planta resultante do cruzamento
entre genitores relacionados, mas não
geneticamente idênticos.
Inserto: parte da construção que é inte-
grada no genoma do organismo re-
cipiente.
Inseticida: composto químico usado para
controlar populações de insetos. Na
agricultura, inseticidas são usados pa-
ra controlar insetos-praga que se ali-
mentam das culturas ou transmitem
doenças.
Pesticidas: substâncias que são usadas para
controlar pragas, tais como, insetos ou
microorganismos.
Plasmídeo: pequeno fragmento de DNA,
normalmente circular, encontrado fora
do cromossomo principal da bactéria.
Os plasmídeos são usados como vetores
para inserir novos materiais genéticos
em microorganismos ou em plantas.
Proteína: polímero formado por unidades
denominadas aminoácidos. A indivi-
dualidade de uma proteína é função do
seu tamanho, configuração do políme-
ro e da seqüência de aminoácidos den-
tro do polímero.
Tecnologia do DNA recombinante: técni-
ca de isolamento de um gene de um
13
organismo e de inserção dele no DNA
de outro organismo, também chamada
de Engenharia genética ou de modifi-
cação genética.
Vetor: molécula de DNA na qual é inserido
o DNA exógeno permitindo a sua mul-
tiplicação na célula hospedeira.
Vírus: partícula constituída de um ácido
nucléico e de proteínas (capa). Um vírus
só consegue replicar dentro de uma
célula de um organismo vivo (bactéria,
planta ou animal).
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14 Biotecnologia

Variedades transgênicas: solução ou ameaça

Aluízio Borém 1
Marcos Paiva Del Giúdice 2

Resumo - Acredita-se que o mundo esteja adentrando a era da revolução gênica,

quando o melhoramento genético será realizado de forma mais precisa e pontual com
os recursos da biotecnologia. Acredita-se também que a resistência aos organismos
geneticamente modificados vá diminuir, à medida que a segunda onda de variedades
transgênicas atingir o mercado. Esta segunda onda será pautada pela incorporação de
características de qualidade nutricional ou de processamento dos alimentos, a exemplo
das variedades de soja com maior teor de ácidos oléicos, com grandes benefícios para
a saúde humana, especialmente para pessoas com propensão a doenças car-
diovasculares. As variedades transgênicas em breve contribuirão para melhorar o ní-
vel de vida e bem-estar da humanidade.
Palavras-chave: Biotecnologia; Engenharia genética; DNA; Melhoramento; Bios-
segurança.

INTRODUÇÃO
A molécula que programa o potencial
biológico de todos os seres vivos, o ácido
desoxirribonucléico (DNA) está come-
çando a mostrar seus segredos. À medida
que os cientistas mapeiam os genes nos
cromossomos, a promessa de cura de doen-
ças, a solução dos mistérios da evolução e
a transformação de plantas em biorreato-
res começam a tornar-se mais concretos. O
progresso alcançado pelos cientistas tem
recebido o estímulo e apoio das agências
governamentais de fomento à pesquisa e
da iniciativa privada, mas também tem le-
vantado questionamentos éticos jamais
considerados pela sociedade. Por exemplo,
hoje a tecnologia da seleção de espermas
para fecundação in vitro permite aos pais
a escolha do sexo da criança. Amanhã, per-
mitirá a escolha da cor dos olhos, estatura,
nível de inteligência, cor da pele etc. Estas
novas possibilidades acendem questões de
fundo moral e ético em nossa sociedade.
Os questionamentos éticos também se
fazem presentes em relação às variedades
transgênicas.
Mais do que alterar o modo de vida do
homem, a tecnologia tem mudado a so-
ciedade em que vivemos de forma radical. invenção da caneta esferográfica e seu de-
Diante destas mudanças, o homem se de- senvolvimento foi de cerca de 50 anos e,
para com uma encruzilhada de três vias: no caso da televisão, foi de aproximada-
rechaçar as tecnologias e tentar ficar fo- mente 29 anos (Quadro 1). Percebe-se que
ra do processo; apropriar-se da técnica e as tecnologias desenvolvidas nos últimos
transformar a vida em uma corrida atrás do anos têm-se tornado acessíveis à sociedade
novo; ou apropriar-se dos processos, de- muito mais rápido. Embora a redução deste
senvolvendo habilidades que permitam o lapso de tempo seja positiva para a so-
acesso e controle das tecnologias para seu ciedade, ela tem um custo: o medo do des-
bem-estar. conhecido. Hoje, esta é a situação pela qual
O lapso de tempo entre a criação de uma a biotecnologia passa. A maioria da po-
nova tecnologia e sua efetiva utilização prá- pulação ainda desconhece o que ela é, para
tica vem diminuindo consideravelmente ao que serve e quais suas possíveis contri-
longo da história. O tempo gasto entre a buições para a sociedade. Não obstante,
QUADRO 1 - Lapso de tempo para o desenvolvimento de novas tecnologias
Início da Tempo para o
Tecnologia Invenção produção comercial desenvolvimento
(anos)
Caneta esferográfica 1888 1938 50
Zíper 1891 1923 32
Helicóptero 1904 1936 32
Televisão 1907 1936 29
Transgênicos 1983 1996 13

1
Engo Agro, Ph.D., Prof. UFV - Depto Fitotecnia, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: borem@mail.ufv.br
2
Engo Agro, D.S., UFV - Depto Fitotecnia, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: mgiudice@mail.ufv.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000

Biotecnologia
os produtos desta tecnologia já estão dis-
poníveis para a sociedade. Diante deste
cenário, muitos que consideram o novo
melhor passam a tomar a via que leva a ele.
A visão de que tudo que é novo é automati-
camente melhor, é característica típica do
pensamento consumista, regido pelo im-
perialismo capitalista. Por outro lado, os
conservadores avessos a mudanças re-
chaçam qualquer nova tecnologia, sob a
alegação de que a antiga e tradicional ma-
neira de fazer as coisas é a melhor. Nesse
caso, desenvolve-se um bloqueio que os
distanciam cada vez mais do mundo mo-
derno. O computador passou e ainda passa
por esta fase em algumas sociedades.
TRANSGÊNICOS - NOVA ERA
DE SOLUÇÕES
Diga adeus à era da Física, ciência que
dividiu o átomo e transformou o silício em
poder de computação. É hora de saudar a
era da Biotecnologia. Como a descoberta
do elétron, em 1897, foi um evento que
marcou o século XX, as primeiras sementes
para o próximo século foram plantadas em
1953, quando James Watson e Francis Crick
descobriram como os ácidos desoxirri-
bonucléicos formam a molécula de DNA.
Passado quase meio século da descoberta
de Watson e Crick, a Biotecnologia é o
assunto favorito tanto de seus defensores
quanto de seus opositores. No caso da Fí-
sica, as pesquisas científicas e os desen-
volvimentos tecnológicos ocorreram, de
certa forma, centralizados, pois não era
possível alguém montar seu laboratório e
manipular livremente um material radioati-
vo. A Biotecnologia é altamente descentra-
lizada. Ela é desenvolvida tanto em peque-
nos laboratórios dos países em desenvolvi-
mento, quanto em grandes universidades
e empresas do Primeiro Mundo.
A população mundial passa por um
crescimento explosivo. O número de habi-
tantes do planeta deve dobrar nos pró-
ximos 40 anos, gerando uma demanda por
alimentos 250% superior à produção atual.
Ao mesmo tempo, ocorrerá redução dos
recursos para a produção agrícola. O de-
safio à frente é imenso. O homem irá sentir-
se pressionado a desenvolver e a aplicar
novas tecnologias para atender à deman-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000
da por alimentos.
O alimento que consumimos, as roupas
que usamos e o ar que respiramos dependem
do reino vegetal - as plantas. A Biotecno-
logia vegetal é uma extensão do melho-
ramento convencional de plantas. Ela pode
ser considerada como uma nova maneira
de fazer, de forma mais precisa, uma ativi-
dade que o homem iniciou há, aproxima-
damente, 10 mil anos - selecionar tipos com
características superiores (Borém, 1998).
A década de 80 foi marcada por debates
sobre os possíveis benefícios da Bio-
tecnologia para a agricultura. O entusiasmo
com o assunto, naquela época, levou tanto
leigos quanto letrados a discorrerem sobre
o assunto na mídia. O resultado foi a forma-
ção da expectativa de que a Biotecnologia
resolveria todos os problemas da agri-
cultura, como um toque de mágica. O tempo
passou e as frustrações marcaram o início
da década de 90. Hoje, a Biotecnologia já
mostra os seus resultados iniciais. Os pri-
meiros produtos comerciais gerados pela
Engenharia genética chegaram às prate-
leiras dos supermercados em 1996, nos
Estados Unidos (Borém et al., 1999). Desde
então, vêm sendo colocados no mercado
organismos (produtos) geneticamente
modificados (OGMs) de várias espécies,
como soja, batata, milho, cana-de-açúcar,
algodão, mamão, canola, fumo, dentre ou-
tros.
Hoje, o que se observa, na mídia na-
cional, é o debate e o questionamento dos
riscos de utilização dos alimentos trans-
gênicos para a saúde humana e animal e
para o meio ambiente. A celeuma atual é se
os transgênicos são solução ou ameaça.
Inicialmente, precisa-se entender o que
são as variedades transgênicas. Os trans-
gênicos, como são freqüentemente cha-
mados, são variedades desenvolvidas pela
introdução de genes de outras espécies,
por meio das técnicas da Engenharia genéti-
ca. Por exemplo, uma variedade transgênica
de milho pode ser obtida pela introdução
de genes de bactérias, fungos, ou de outras
espécies, como arroz ou feijão, visando ao
desenvolvimento de uma variedade com
maior valor nutricional ou, ainda, mais resis-
tente a uma praga.
A questão dos transgênicos deve ser
analisada sob uma ótica não tendenciosa,
15
isto é, sob uma perspectiva holística e de
interesse do país, conforme se segue:
a) soberania tecnológica: durante mui-
tos anos, sob a fachada de que a re-
serva de mercado na área da Infor-
mática era estratégica para o Brasil,
nossos melhores cientistas foram
privados de equipamentos que via-
bilizassem o desenvolvimento de
softwares - área em que o país é re-
conhecido. Foram feitos pesados
investimentos no treinamento de
pessoal e em infra-estrutura em Bio-
tecnologia, durante os últimos 20
anos. O Brasil não deve fechar as
portas para uma tecnologia que pode
aumentar a competitividade de seus
produtos agrícolas, podendo torná-
los de melhor valor nutritivo, ou mes-
mo contribuir para a redução da polui-
ção ambiental. Embora as variedades
transgênicas, que estão em fase de
discussão quanto ao plantio no Bra-
sil, tenham sido desenvolvidas no
exterior, no caso das espécies de im-
portância exclusiva para o país, teriam
que ser desenvolvidas aqui. Todos
estes possíveis benefícios devem, en-
tretanto, ser avaliados à luz da bios-
segurança;
b) moral: muitas das críticas feitas aos
transgênicos baseiam-se apenas em
aspectos morais. Alguns simples-
mente acham imoral remover frag-
mentos de DNA de um organismo e
introduzi-lo em outro organismo.
Não se pode ignorar os benefícios
da Biotecnologia para o bem-estar
do homem. Na área da saúde hu-
mana, são as bactérias transgênicas
que produzem a insulina utilizada por
diabéticos, tanto no Brasil quanto em
outros países;
c) interesses econômicos: o comércio
internacional encontra-se segmen-
tado em dois mercados. Em um, o
mercado está disposto a pagar ágio
pelos produtos não-transgênicos,
em outro, não faz acepção quanto a
este aspecto. Alguns importadores
europeus não compram soja de paí-
ses que plantam variedades transgê-
nicas. Sob a alegação de estratégia
16
comercial, alguns advogam que o
Brasil deveria banir os transgênicos,
para conquistar os clientes dispos-
tos a pagar ágio pela soja não-trans-
gênica. Esta estratégia deve ser cui-
dadosamente analisada uma vez que
o custo de produção da soja não-
transgênica é maior, o que pode sig-
nificar menor lucratividade para o
agricultor brasileiro;
d) rotulagem: a Food and Agriculture
Organization (FAO), organismo da
ONU que se dedica à agricultura,
reconhece a obrigatoriedade de ro-
tulagem apenas para os produtos
transgênicos que não forem simila-
res aos convencionais. Mais impor-
tante do que a discriminação dos
alimentos transgênicos por meio da
rotulagem, é a questão da sua bios-
segurança para o consumidor. Há
mais de 20 anos, o brasileiro conso-
me, sem saber, queijo produzido com
bactérias (coalho) transgênicas, que
produzem uma enzima típica de
bovinos. Como o queijo não oferece
risco para a saúde humana, sua rotu-
lagem tornou-se dispensável;
e) biossegurança: ela avalia os riscos
de um produto para a saúde huma-
na e animal, e para o meio ambien-
te. Criada em 1995 no Ministério da
Ciência e Tecnologia, a Comissão
Técnica Nacional de Biosseguran-
ça (CTNBio) tem o propósito de ava-
liar os riscos da utilização de trans-
gênicos no Brasil (Borém et al., 1998).
Constituída por vários representan-
tes da sociedade, a CTNBio possui
cientistas brasileiros de renome in-
ternacional, altamente comprome-
tidos com uma postura ética e volta-
da para os interesses do país. O ri-
gor e a completa independência da
CTNBio resultaram no adiamento,
para 1998, da recomendação de auto-
rização de comercialização e plantio
das variedades transgênicas de soja
Round-up ReadyÓ , tolerante ao her-
bicida Roundup. Entretanto, a jus-
tiça concedeu liminar suspenden-
do o seu plantio comercial no país.
O momento pelo qual o Brasil passa
é de certa forma semelhante ao de
outros países, quando os primeiros
OGMs foram lançados. A experiên-
cia destes países sugere que, ven-
cida a resistência inicial, os transgê-
nicos logo estarão fazendo parte
da mesa do consumidor brasileiro.
A CTNBio está cientificamente qua-
lificada para avaliar os riscos dos
transgênicos para a nossa socie-
dade.
A Biotecnologia abre novas perspec-
tivas para tornar as espécies vegetais mais
úteis ao homem. Dentro de várias poten-
cialidades criadas por ela, a primeira vislum-
brada pelos cientistas foi a alteração gené-
tica, visando ao aumento ou à estabilização
da produção. Nesta linha surgiram as va-
riedades resistentes aos insetos, a exemplo
do algodão BollgardÓ , da batata NewLeefÓ
e do milho Bt. Estas variedades, por ser
menos atacadas por insetos, apresentam
maior estabilidade de produção e maior pro-
dutividade em situações de intenso ataque
de lagartas. Não obstante, estas variedades
transgênicas apresentam menor custo de
produção, uma vez que a aplicação de in-
seticida, dentro do manejo de pragas, é re-
duzida. Surgiram também as variedades
tolerantes a herbicidas, como a soja, a canola,
o algodão, o milho e a beterraba Round-up
ReadyÓ . No caso destas variedades, o cus-
to de produção é menor, decorrente da
possibilidade de uso de um único produto
de ação total, não-seletivo, e de menor cus-
to (Callow, 1997 e Kubicek, 1997).
As principais culturas para as quais as
variedades transgênicas estão disponíveis
no mundo incluem soja, milho, algodão,
batata, cana-de-açúcar, tomate, dentre
outras. Estas variedades normalmente apre-
sentam uma ou mais das seguintes caracte-
rísticas introduzidas pela Engenharia ge-
nética: tolerância a herbicidas, resistência
a insetos e maior vida de prateleira. O inte-
resse dos agricultores em plantar estas va-
riedades decorre do seu menor custo de
produção, uma vez que a aplicação de her-
bicidas, inseticidas e fungicidas é menor.
Uma segunda perspectiva aberta pela
Engenharia genética é a melhoria da quali-
dade do produto ou introdução de caracte-
rísticas que facilitem seu processamento.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000
Biotecnologia
Neste sentido, algumas pesquisas encon-
tram-se em andamento, com o objetivo de
desenvolver variedades de soja com baixos
teores de ácidos graxos saturados e eleva-
dos teores de insaturados, importantes
especialmente em dietas para cardíacos. No
caso de produtos com maior facilidade de
processamento, pode-se citar o caso das
variedades de batata com maior conteú-
do de sólidos solúveis. Estas variedades
absorvem menor quantidade de óleo du-
rante a fritura, resultando em um alimento
mais saudável sob o ponto de vista cardio-
vascular.
A terceira potencialidade das varieda-
des transgênicas é a produção de fárma-
cos. Estas variedades funcionarão como
biorreatores na produção destas substân-
cias. Esta possibilidade traz uma perspec-
tiva muito grande para a obtenção destas
substâncias, de forma renovável e não com-
prometedora com a biodiversidade do pla-
neta.
Pesquisas preliminares sobre a pro-
dução de proteínas exóticas, vacinas e fár-
macos em plantas estão em andamento.
Nestas circunstâncias, plantas transgêni-
cas poderiam assumir uma nova e impor-
tante função no bem-estar da sociedade.
A quarta potencialidade vislumbrada
de uso das variedades transgênicas deve-
se concretizar mais no final da primeira dé-
cada do próximo milênio (Gráfico 1). Acre-
dita-se que as plantas serão transformadas
com genes para produzir monômeros e po-
límeros, que poderão substituir derivados
de petróleo.
O futuro desponta-se otimista com as
atuais contribuições da Biotecnologia.
Acredita-se que ela dará importante contri-
buição aos melhoristas, no seu propósi-
to de suprir a demanda de alimento, fibras
etc. da população mundial, estimada em
8,7 bilhões para 2010. O Gráfico 1 resume as
expectativas de contribuições das varie-
dades transgênicas para o bem-estar da
sociedade, em diferentes períodos. Confir-
madas essas expectativas, as culturas tor-
nar-se-ão, além de produtoras de alimentos,
biorreatores naturais.
A genética, por meio do melhoramento
de plantas, tem contribuído, até o presente
momento, para afastar as nefastas previ-
Biotecnologia
Produtos
Processamento
de alimentos
Características
agronômicas
1995 2000
Gráfico 1 - Expectativas de contribuições das variedades transgênicas para a sociedade
sões de Thomas Malthus, de que o cres-
cimento da produção mundial de alimentos
não acompanharia o aumento populacio-
nal. Atualmente, a Biotecnologia vegetal
começa a dar sua contribuição para o bem-
estar da humanidade. Com ela será mais fácil
operar o milagre da multiplicação dos grãos.
TRANSGÊNICOS - AMEAÇA?
Existe uma ansiedade muito grande da
sociedade brasileira sobre os riscos dos
alimentos transgênicos para a saúde hu-
mana. O tema tem sido foco de debates e
questionamentos na mídia nacional, nos
últimos meses, de forma bastante intensa.
É importante que a população conheça to-
dos os aspectos inerentes à produção e ao
consumo dos produtos geneticamente
modificados. Um alimento é seguro à saúde
humana se ele não causa nenhum mal aos
que o ingerem em quantidades conside-
radas normais e após o seu devido proces-
samento. Os alimentos têm sido conside-
rados seguros à saúde humana, com base
na experiência do seu consumo a longo
prazo. A perspectiva de segurança ali-
mentar é, entretanto, um aspecto dinâmico.
Por exemplo, alimentos com elevado teor
de gordura não eram considerados nocivos
à saúde. Todavia, hoje, alimentos ricos em
gorduras saturadas são comprovadamente
prejudiciais à saúde humana. Mesmo assim,
muitos ainda os utilizam sem qualquer res-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000
Químicos
Fármacos
Anos
2005 2010
trição.
Normalmente, os seguintes aspectos
são considerados, quando se pensa em se-
gurança alimentar: potencial alergênico,
digestibilidade, toxicidade, risco teratogê-
nico, dentre outros.
A Engenharia genética permitiu expan-
dir as alterações genéticas no desenvolvi-
mento das novas variedades, viabilizando
a introdução de características específicas,
muitas das quais impossíveis de ser incor-
poradas pelos procedimentos tradicionais
do melhoramento de plantas. A avaliação
de produtos derivados da moderna Biotec-
nologia não requer mudanças substantivas
nos princípios estabelecidos de segurança
alimentar para os produtos convencionais.
As variedades não-geneticamente modifi-
cadas que hoje cultivamos, e cujos pro-
dutos consumimos, são o resultado de um
trabalho de seleção, realizado ao longo de
milhares de anos, pela ação da natureza e
pelo homem. A seleção artificial conduzida
pelos melhoristas possibilitou o desenvol-
vimento de variedades com maior produti-
vidade, resistentes a pragas, além de várias
outras caraterísticas agronômicas impor-
tantes. Nestes casos, quando o melhorista
introduz, em uma nova variedade, novos
genes de resistência a uma doença, por
exemplo, vários outros genes ligados aos
primeiros são incorporados à nova varie-
dade, sem maior controle. No caso das
variedades transgênicas, a introdução de
17
genes é mais precisa, e é possível controlar
a incorporação de outros genes além dos
de interesse, pois o processo é praticamen-
te pontual.
O novo e o incompreendido geram des-
conforto e desconfiança, principalmente
para os leigos. A história pode nos ensinar
grandes lições. Vale a pena relembrar os
tempos da descoberta da vacina contra a
varíola, em 1778, por Edward Jenner. Esta
vacina só passou a ser utilizada pela so-
ciedade mais de 50 anos depois de sua
descoberta, após a quebra de tabus éticos
e de biossegurança no seu uso. Este atraso
resultou em muitas mortes que poderiam
ter sido evitadas, se esta tecnologia tivesse
sido adotada mais cedo. Com a adoção da
vacina de Jenner, a varíola foi eliminada do
mundo.
Os transgênicos já são plantados nos
Estados Unidos, Canadá, China e Argen-
tina, além de vários outros países. Não se
podem excluir os agricultores brasileiros do
acesso às tecnologias, que lhes permitirão
produzir alimentos mais nutritivos e com
preços mais competitivos para o mercado
nacional e internacional.
Alguns pesquisadores questionam se
os genes para resistência a antibióticos in-
seridos em variedades transgênicas, como
marcadores, poderiam ser naturalmente
transferidos para as bactérias causadoras
de doenças nos homens, nas quais eles
poderiam ser ativados a produzir enzimas
que as protegessem dos antibióticos. Esta
transferência poderia ter conseqüências
indesejáveis, como a bactéria resistente não
ser mais combatida por aquele anti-biótico
específico.Até a presente data, não foi
encontrada nenhuma evidência de troca de
material genético das plantas com as
bactérias do ar ou aquelas em contato com
o sistema radicular. Embora a troca de ge-
nes nunca tenha sido observada, isto não
quer dizer que ela seja impossível, mas sim
que provavelmente não ocorra. O mesmo
se aplica às bactérias do trato digestivo
dos indivíduos que ingerirem alimentos ge-
neticamente modificados.
Mesmo que esta transferência ocorresse
e a bactéria do solo ou do intestino adqui-
risse resistência, isto não representaria ris-
co à saúde do homem. Muitas bactérias já
apresentam resistência a antibióticos como
18
a ampicilina.
A própria história da relação inseto-
inseticidas é uma corrida contra o tempo,
em que os inseticidas são cada vez mais
poderosos e os insetos mais resistentes.
Para contornar este problema, o manejo in-
tegrado de pragas preconiza a utilização
de uma série de medidas de controle. As
variedades transgênicas resistentes a in-
setos são mais uma das estratégias a serem
incorporadas ao manejo de pragas.
Outra preocupação, às vezes levantada
por ambientalistas, é a de que variedades
transgênicas tolerantes a herbicidas po-
deriam resultar em plantas daninhas tole-
rantes aos herbicidas, ou seja, superplantas
daninhas. Vargas et al. (1999) discorrem so-
bre a resistência de plantas daninhas a
herbicidas e concluem que uma população
delas pode ter, naturalmente, diferentes ní-
veis de tolerância a diferentes herbicidas.
O risco de um gene específico de um OGM
tolerante à herbicida ser transferido para
uma planta daninha é extremamente remoto,
em muitos casos, como já observado por
Conner & Dale (1996). O fluxo gênico entre
diferentes espécies é extremamente com-
plexo e requer a quebra de várias barreiras
de isolamento reprodutivo (Klinger et al.
1991). Algumas das mais freqüentes bar-
reiras são:
a) espécies com habitats distintos;
b) espécies com maturidade sexual em
épocas distintas;
c) incompatibilidade genética;
d) fraqueza do híbrido;
e) esterilidade híbrida;
f) dreno metabólico.
No caso específico da soja transgênica
tolerante ao Roundup, o risco de escape
do transgene para espécies silvestres no
Brasil é extremamente pequeno. As prin-
cipais barreiras a este fluxo gênico são as
baixas taxas de cruzamento natural na soja,
por causa da cleistogamia, fenômeno que
se caracteriza pela ocorrência da fecun-
dação antes da abertura do botão floral. A
taxa de fecundação cruzada entre plantas
de soja da mesma espécie (Glycine max) e
com ciclo vegetativo de mesma duração é
inferior a 1%.
Outro fator que contribui para a re-
duzida chance de escape gênico é a ausên-
cia de parentes silvestres sexualmente
compatíveis com a soja no Brasil. A soja
pertence à classe Dicotyledoneae, à sub-
classe Archichlamydae, à ordem Rosales,
à subordem Leguminosinae, à família
Leguminosae, à subfamília Papilionaceae,
à tribo Phaseoleae, ao gênero Glycine L.,
ao subgênero Glycine subg. soja (Moench)
e à espécie Glycine max (L.) Merrill (Gaz-
zoni,1994).
As espécies Glycine max e Glycine soja
possuem o número de cromossomos di-
plóides igual a 40. Pode-se efetuar o cruza-
mento entre estas duas espécies com re-
lativa facilidade, uma vez que os híbridos
F1 são férteis. Entretanto, G. soja não ocorre
naturalmente no Brasil (Hymowitz & Singh,
1987).
O germoplasma de Glycine max contém
grande número de tipos morfológicos de
plantas. Com exceção da Glycine tomentella,
o número de cromossomos diplóides para
espécies dentro do subgênero Glycine po-
de ser de 40 ou 80 (Gazzoni, 1994).
O Quadro 2 contém as espécies afins, o
número de cromossomos e a distribuição
das espécies dos gêneros Glycine willd e
Bracteata Verdc no mundo. Conforme fica
evidente, estas espécies não ocorrem no
Brasil, o que contribui para reduzir a proba-
bilidade de escape gênico.
A Glycine wightti, subgênero Bracteata
Verdc, conhecida inicialmente como Glycine
javanica, apresenta o número de cromos-
somos diplóides 22 ou 44. A planta é trepa-
deira, perene, do tipo parreira, e endêmica
na África e no Sudoeste da Ásia.
O risco de fluxo gênico em outras espé-
cies pode, entretanto, ser elevado, ao con-
trário do que ocorre com a soja no Brasil,
conforme discutido.
A alergia é um distúrbio do sistema imu-
nológico, normalmente causado por alguns
tipos de proteínas. Por exemplo, alguns
indivíduos são alérgicos ao leite de vaca,
gema de ovo, glúten, peixes, mariscos etc.,
podendo esta alergia manifestar-se com
irritação da pele, tosse, distúrbio gastro-
intestinal etc. Cerca de 5% das crianças e 2%
dos adultos da população mundial sofrem
de alguma forma de alergia a alimentos.
Como os OGMs apresentam genes de
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000
Biotecnologia
outras espécies, um dos receios do público
é que a ingestão de alimentos destes or-
ganismos possa resultar em aumento das
reações alérgicas. Um exemplo freqüente-
mente utilizado para justificar este receio é
o caso da introdução de um gene de peixe
em morango, visando à resistência ao frio.
Se porventura um indivíduo alérgico a peixe
ingerir este morango transgênico, ele po-
deria manifestar reação alérgica.
Nutricionistas e cientistas da área da
saúde catalogaram um grande número de
substâncias alergênicas. Uma comparação
destas substâncias evidenciou grande
grau de similaridade entre elas, o que tem
permitido estabelecer padrões típicos de
substâncias alergênicas.
A Organização Mundial da Saúde
(OMS) desenvolveu testes e padrões inter-
nacionais para detectar substâncias com
potencial alergênico. Estes testes são bas-
tante rigorosos e os OGMs são submetidos
a eles antes de ser liberados no mercado.
A Engenharia genética eventualmente
contribuirá para a eliminação de substân-
cias alergênicas que ocorrem naturalmen-
te nos alimentos não-geneticamente modi-
ficados. Por exemplo, os cientistas conse-
guiram desativar um gene no arroz que
codifica a produção de uma proteína que
causa alergia em uma parcela da popula-
ção.
A Engenharia genética tem sido es-
tudada nos últimos 26 anos sem ter sido
detectado qualquer efeito prejudicial à
saúde humana, animal ou ao meio ambiente.
As pesquisas têm sido conduzidas, se-
gundo critérios rígidos de controle de
qualidade. Entretanto, novas tecnologias
envolvem certos riscos. Se estes riscos são
aceitáveis ou não, vai depender de uma
avaliação global dos benefícios destas tec-
nologias.
Finalmente, os cientistas acreditam que
o risco de alergia com os transgênicos não
é maior do que com aqueles desenvolvidos
pelo melhoramento convencional.
Mesmo que as variedades transgê-
nicas apresentem algum risco, elas devem
ser consideradas como parte da solução
dos problemas que desafiam os cientistas
na questão da alimentação e do vestuário
para a humanidade.
Biotecnologia 19

QUADRO 2 - Espécies, número de cromossomos e distribuição do gênero Glycine willd

Espécie 2n Distribuição

Subgênero Glycine
G. arenaria Tind. 40 Austrália
G. argyrea Tind. 40 Austrália
G. canascens F. J. Herm. 40 Austrália
G. clandestina Wendl. 40 Austrália
G. curvata Tind. 40 Austrália
G. cyrtoloba Tind. 40 Austrália
G. falcata Benth. 40 Austrália
G. latifolio (Benth) Newell and Himowitz 40 Austrália
G. latrobeana (Weissn.) Benth. 40 Austrália
G. microphylla (Benth) Tind. 40 Austrália
G. tabacina (Labil.) Benth. 40,80 Austrália, Sul da China, Taiwan, Ilhas do Ryukyu e Ilhas
do Pacífico Sul
G. tomentella Hayata 38,40,78,80 Austrália, Sul da China, Taiwan, Filipinas, Papua Nova
Guiné

Subgênero Soja (Moench) F.J. Herm.

G. soja Sieb. and Zucc 40 China, Taiwan, Japão, Coréia e Rússia
G. max (L.) Merr. 40 gene cultivado

Subgênero Bracteata Verdc

G. wightii subsp. wightii var. wightii 22,44 Índia, Ceilão, Java
G. wightii subsp. wightii var. longuisuda 22,44 Arábia, Etiópia, Congo, Angola
G. wightii subsp. petitiana var. petitiana 22,44 Quênia, Tanzânia, Etiópia
G. wightii subsp. petitiana var. mearnsii 22,44 Quênia, Tanzânia, Zâmbia
G. wightii subsp. pseudojavanica (Taub.) verdc. 22,44 Leste e Oeste da África, Congo
FONTE: Hymowitz (1970), Singh et al. (1988) e Sediyama et al. (1999).

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Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.14-19, maio/jun. 2000

20 Biotecnologia

Decifrando o genoma
Newton Portilho Carneiro 1
Andréa Almeida Carneiro 2
Cláudia Teixeira Guimarães 3
Edilson Paiva 4

Resumo - Os genes, unidades biológicas que determinam as características de um

organismo, estão contidos em moléculas de DNA presentes no núcleo das células.
Portanto, o estudo do DNA é de fundamental importância para o entendimento
de como as características de um organismo são formadas. Com o grande avanço
alcançado pelas técnicas de Biologia molecular nas últimas décadas, hoje, somos
capazes de isolar e seqüenciar moléculas de DNA de maneira rotineira. A partir da
otimização das técnicas de seqüenciamento, surgiram programas com o objetivo de
seqüenciar genomas inteiros. Atualmente, estão depositados em bancos de dados
mais de 3 milhões de seqüências de DNA e, grande parte delas ainda não tem sua
função conhecida. O processo de caracterização da função gênica envolve um volume
muito maior de pesquisas e conhecimentos do que as etapas de isolamento e
seqüenciamento. A função de um gene pode ser desvendada por meio de técnicas de
genética direta ou reversa. Descrevem-se algumas das metodologias usadas para a
caracterização da função gênica, bem como o potencial dos programas de seqüen-
ciamento de genomas.
Palavras-chave: Genoma; Seqüenciamento; cDNA; Microarrays; Transposons; T-DNA.

INTRODUÇÃO
A estrutura tridimensional do DNA,
definida por Watson e Crick em 1953, é
similar para todos os seres vivos. Basica-
mente, uma molécula de DNA consiste de
duas cadeias de nucleotídeos mantidas
juntas por pontes de hidrogênio. Existem
quatro nucleotídeos diferentes, cada um
contendo uma desoxirribose, um grupo
fosfato, e uma base púrica (adenina e gua-
nina) ou pirimídica (timina e citosina). Na
cadeia polinucleotídica, a desoxirribose e
o fosfato estão sempre unidos por uma li-
gação fosfodiester. Portanto, esta parte da
molécula é muito regular. Em contraste, a
ordem e a quantidade das bases púricas e
pirimídicas, que formam uma cadeia de
DNA, são altamente irregulares, variando
de um organismo para outro. É exatamente
essa variação das bases que constitui o
DNA, que produz as diferenças existentes
entre os diversos genes.
SEQÜENCIAMENTO
DE FRAGMENTOS DE DNA
Nos anos 70, foram desenvolvidos
protocolos que permitiram o seqüencia-
mento das bases que compõem qualquer
fragmento de DNA purificado. No entanto,
as técnicas de seqüenciamento têm-se tor-
nado cada vez mais avançadas e automa-
tizadas, o que tem viabilizado os progra-
mas de cooperação internacional com o
objetivo de seqüenciar os genes expres-
sos, Expressed Sequencing Tags (ESTs),
ou mesmo genomas inteiros, como são
os casos do genoma humano, da bactéria
Shigella e de Arabidopsis. Com isso, a
quantidade de seqüências de DNA, atual-
mente disponíveis, é tão grande que são
necessários bancos de dados e programas
de computador específicos para armazenar
e analisar todas elas. Os projetos de se-
qüenciamentos, tanto de genomas comple-
tos quanto apenas de ESTs, apresentam
vantagens e desvantagens. No caso do
seqüenciamento de todo o genoma, são
geradas informações sobre regiões que
correspondem a genes e aquelas que, em-
bora não sejam transcritas, podem possuir
funções importantes na regulação gênica
e manutenção da integridade do genoma.
Nesse caso, o projeto envolve muito mais
trabalho, uma vez que as regiões não-trans-
critas podem atingir 90% do genoma.
Assim, mesmo considerando todas as in-
formações obtidas com o seqüenciamento

1
Biólogo, Ph.D., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: newtonc@cnpms.embrapa.br
2
Bióloga, Ph.D., Pesq. CNPq/EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: andreac@cnpms.embrapa.br
3
Enga Agra, D.Sc., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: claudia@cnpms.embrapa.br
4
Engo Agro, Ph.D., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: edilson@cnpms.embrapa.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000

Biotecnologia 21

de todo o genoma, o projeto tem sido viá- QUADRO 1 - Sumário do número de seqüências de diferentes organismos depositados em ban-
vel apenas para organismos com genomas cos de dados
pequenos. Aqueles organismos cujos ge- Organismo Nome científico ESTs seqüenciados
nomas são grandes, como é o caso da maio-
Homem Homo sapiens 1.631.323
ria das plantas cultivadas, a melhor opção
é seqüenciar apenas os ESTs e tentar obter Camundongo Mus musculus + domesticus 786.324
o máximo de informações com relação às Rato Rattus sp. 128.948
suas funções. Um sumário do número de Mosca-das-frutas Drosophila melanogaster 86.121
seqüências de DNA ou ESTs disponíveis
Nematóide Caenorhabditis elegans 72.567
em bancos de dados de domínio público é
Arroz Oryza sativa 47.141
mostrado no Quadro 1.
Com o seqüenciamento massivo de Arabidopsis Arabidopsis thaliana 45.752
DNAs, o isolamento de um gene passou Milho Zea mays 41.848
a não ser mais um problema. O grande Tomate Lycopersicon esculentum 43.436
desafio agora é saber qual a função desses
Soja Glycine max 27.158
genes seqüenciados. Várias seqüências
de DNA, inicialmente incorporadas em Levedura Saccharomyces cerevisiae 3.041
bancos de dados, tiveram suas funções Pinus Pinus taeda 7.554
determinadas a partir de estudos deta- Canola Brassica napus 1.702
lhados de Biologia molecular. Atualmente, Algodão Gossypium hirsutum 8.025
com o grande número de seqüências já (1) _
Total 3.203.327
depositado nos bancos de dados, muitas
vezes, a função de uma seqüência gênica FONTE: List... (1999).
pode ser deduzida em comparações por ho- (1) Inclui o resultado do seqüenciamento de todos os organismos depositados no banco de dados.
mologia com aquelas já existentes (Fig. 1).
Entretanto, grande parte das seqüências
de DNA, incorporadas aos bancos de da- Milho ATG GGT AAG GAG AAG TCC CAC ATC AAC ATT GTG GTT ATT GGC
dos, não apresenta homologia significativa
com as seqüências, cujas funções já são Arroz ATG GGT AAG GAG AAG ACG CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC
conhecidas. Assim, torna-se necessário um
grande investimento em pesquisas para Trigo ATG GGT AAA GAG AAG TTT CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC
desvendar a função dos vários genes res-
Rato ATG GGC AAG GAG AAG ACA CAC ATC AAC ATT GTG GTC ATT GGC
ponsáveis pelas funções vitais de um
organismo.
Homem ATG GGC AAG GAG AAG ACC CAC ATC AAC ATC GTG GTC ATC GGC
A função de um gene pode ser estudada
através da genética direta ou da genética Galinha ATG GGC AAG GAG AAG ATC CAT ATT AAC ATT GTG GTC ATT GGC
reversa. Genética direta é um processo que
envolve inicialmente a análise do fenótipo Figura 1 - Alinhamento da seqüência do gene fator de elongamento 1A de vários
de um organismo e, em seguida, o isola- organismos
mento e a identificação do gene respon-
sável pela característica estudada. Já a
genética reversa, como o próprio nome
indica, é o processo inverso à genética Genética direta
direta, inicia-se mutando um gene, intro- Fenótipo Gene
duzindo-o no organismo de interesse e
estudando o fenótipo resultante (Fig. 2).
Os processos de genética direta foram Genética reversa
muito usados na década de 80. Com o de- Gene Fenótipo
senvolvimento dos projetos de genomas e
a disponibilidade de genes com seqüências Figura 2 - Genética direta e reversa
caracterizadas, a genética reversa tomou NOTA: Genética direta é a identificação do gene a partir de um fenótipo. Genética
um grande impulso. reversa é a identificação de um fenótipo a partir de um gene.

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000

22
TÉCNICAS
DE GENÉTICA REVERSA
USADAS PARA MANIPULAR
GENES E PRODUZIR
ORGANISMOS MUTANTES
As técnicas de recombinação homó-
loga, anti-senso e co-supressão podem ser
usadas para alterar um gene conhecido,
fazendo com que ele se torne não-funcio-
nal. As plantas transgênicas são impor-
tantes ferramentas científicas para auxiliar
na identificação da função gênica.
Recombinação homóloga
A recombinação homóloga é a alteração
de uma pequena parte da seqüência de um
gene de interesse que, geralmente, é feita
com a incorporação de um gene marcador
e a reintrodução desse gene mutado no
organismo de origem. Uma vez dentro do
organismo de interesse, o gene mutado tem
a capacidade de substituir o gene nativo
pela recombinação homóloga criando um
organismo mutante. Um gene marcador
pode ser o gene bar de seleção para o her-
bicida PPT. As plantas contendo o gene
modificado com o marcador são seleciona-
das na presença do herbicida e, após ficar
demonstrada a incorporação do gene mo-
dificado no genoma da planta transfor-
mada, essa é autofecundada. Por estudos
moleculares é possível identificar a planta
que tenha apenas o alelo modificado em
homozigose (Fig. 3, p.63). A planta homo-
zigota para o gene modificado de interesse
pode ou não demonstrar um fenótipo apa-
rente. No entanto, aquelas cujos fenótipos
são evidentes podem constituir uma forma
rápida de correlacionar o fenótipo com o
gene modificado. Métodos de disrupção
da função gênica via recombinação homó-
loga têm sido descritos para leveduras e
ratos (Melton, 1994 e Goffeau et al., 1996),
sendo que poucos casos têm sido descri-
tos em plantas. Uma aplicação com suces-
so da recombinação homóloga em plan-
tas foi demonstrada para o gene AGL
MADS-box em Arabidopsis (Kempim et al.,
1997).
Anti-senso
A metodologia de anti-senso envolve
a introdução na célula de moléculas de
RNA ou de DNA, construídas artificial-
mente, que sejam complementares (anti-
senso) ao RNA mensageiro (mRNA) do
gene de interesse. Uma das explicações
para o RNA anti-senso causar mutação no
organismo transformado é o fato de que
estas moléculas de RNA ou de DNA artifi-
ciais se ligam ao mRNA celular inativan-
do-o (Fig. 4, p.63). Usando esta tecnologia
o anti-senso do gene da chalcone sintase
(chs), responsável pela pigmentação das
flores, foi introduzido em plantas de petúnia
e de tabaco, resultando em plantas com
alteração na pigmentação das suas flores
(fenótipo mutante) (Krol et al., 1988).
Sheehy et al. (1988) também utilizaram
a tecnologia do anti-senso para inibir a
produção de enzimas responsáveis pelo
desenvolvimento do fruto do tomate, pro-
duzindo assim um tomate mutante com o
amadurecimento retardado.
Co-supressão
Na técnica de co-supressão, um gene
de interesse é engenheirado, por meio de
técnicas de Biologia molecular, para super-
expressar uma proteína de interesse. Uma
vez que a célula possui uma maquinaria
minuciosamente ajustada, qualquer alte-
ração nos níveis de expressão de uma pro-
teína produz uma grande confusão nos
mecanismos de regulação celular. Como
conseqüência, na maioria das vezes, a su-
perexpressão de uma proteína na célula faz
com que a produção dessa proteína seja
desligada e, ao contrário do que seria espe-
rado, o organismo mutante não produz a
proteína de interesse. Embora seja difícil
compreender como a superexpressão de
um gene possa ocasionar a diminuição da
síntese de sua proteína, vários experimen-
tos têm sido realizados demonstrando a
ocorrência desse fato. O primeiro resultado
de co-supressão foi obtido por meio de um
estudo envolvendo a variação da coloração
das flores de petúnia pela introdução do
gene chs sob o controle do promotor 35S
(Napoli et al., 1990). No entanto, o mecanis-
mo que impede a expressão de genes endó-
genos por meio da co-supressão ainda não
é totalmente entendido.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000
Biotecnologia
Mutação por inserção
de transposon
Transposons são elementos de DNA
que têm a capacidade de sair de uma região
do genoma e incorporar em outra. Sendo o
movimento dos transposons um processo
aleatório, quando estes elementos “pulam”
em um genoma podem inserir no meio de
um gene tornando-o inativo. Em plantas,
uma série de transposons tem sido usada
como ferramentas, tanto na genética dire-
ta quanto na reversa, para isolamento e
caracterização de genes ou fenótipos. O
princípio da técnica está descrito na Fi-
gura 5, p.63. O primeiro gene de planta
clonado por transposons via genética di-
reta foi o gene “bronze” de milho que co-
difica UDP-glucose:flavonóide3-O-gluco-
siltransferase, uma enzima da via metabó-
lica das antocianinas (Fedoroff et al., 1984).
A genética reversa usando mutantes
por inserção de transposons foi descrita
inicialmente em Drosophila melanogaster
(Ballinger & Benzer, 1989 e O’Hare, 1990).
Essa metodologia baseia-se em uma reação
de Polimerase Chain Reaction (PCR), uti-
lizando um primer complementar ao final
dos transposons e outro complementar ao
final do gene (Rosenzweig et al., 1983 e
Emmons & Yesner, 1984). Desta forma, os
produtos de PCR só serão obtidos se um
transposon estiver inserido no gene de
interesse. Genes que tiveram sua expressão
alterada pela inserção do transposon serão
recuperados por meio da amplificação do
DNA extraído do indivíduo com fenótipo
mutante, utilizando um par de primer espe-
cífico (Zwaal et al., 1993). Esse processo
tem sido utilizado na identificação de genes
em Caenorhabditis elegans (Rushforth
et al., 1993 e Plasterk, 1993) e milho (Bensen
et al., 1995).
A família dos transposons Mutator
(Mu) apresenta alta taxa de mutação e tem
alto grau de conservação nas extremidades
das seqüências invertidas (Walbot, 1992).
Essas duas características são bastante
interessantes, pois ajudam a selecionar
alelos que contenham os elementos Mu,
cuja seqüência é previamente conhecida.
Inserções dos elementos Mu podem ser
identificadas pela amplificação por PCR.
Biotecnologia 23

O gene mutado pode então ser recupe-

rado e propagado em sementes F2. Outros
aspectos importantes desse processo é que
o número de transposições e o número de
cópias do transposon Mu na planta são
fatores essenciais para a análise de um
menor número de plantas. A tecnologia de
caracterização de funções gênicas através
do Mu foi utilizada pela primeira vez em
milho pela Pioneer Hi-Bred Co., e foi de-
nominada Trait Utility System (TUSC)
(Fig. 6). Bensen et al. (1995) utilizaram a
técnica do TUSC para caracterizar o mu-
tante Anther ear1 (An1), cujo produto gê-
nico está envolvido na síntese do primeiro
intermediário tetracíclico na via da biossín-
tese de giberelina (GA). A mutação An1
resultou em um fenótipo responsivo a GA,
caracterizado por uma altura reduzida de
planta, atraso na maturidade e o desenvol-
vimento de flores perfeitas em espigas nor-
malmente pestiladas.
Um projeto financiado pela National
Science Foundation (NSF), coordenado
pela Dra. Virginia Walbot da Universida-
de de Stanford, Estados Unidos, tem por
objetivo demonstrar a funcionalidade de
genes de milho, usando dois métodos com-
plementares, o seqüenciamento de DNA
genômico flanqueando as inserções do
transposon Mu e a identificação e caracte-
rização dos indivíduos mutantes contendo
esses transposons. Um banco de mutantes
está sendo criado, utilizando-se plantas
transformadas com os elementos Mu
contendo o plasmídeo Bluescript (Fig. 7).
A nova inserção contendo o transposon
poderá ser seletivamente clonada em E.
coli, gerando uma biblioteca de mutação
insercional para análise de DNA. Cada
planta F2 será autofecundada e as semen-
tes serão estocadas no Maize Genetics
Cooperative Stock Center, um órgão es-
pecialmente criado para armazenar os esto-
ques de sementes mutadas. Os usuários
poderão utilizar a técnica de PCR para
seleção de uma coleção de plasmídeos que
foi inserida em genes de interesse. A esti-
mativa é de que 50 mil ESTs, flanqueados
pelo transposon Mu, sejam completamente
seqüenciados durante o primeiro ano do
projeto. Sendo que o objetivo final é se-
Planta contendo Transposon
Transposon
Transposon ativo
Multiplicação da planta
Autofecundação
Coleção de 40.000 mutantes para manter
estoques
Agrupamento de folhas das
plantas mutantes
Extração de DNA
PCR
Primers
Gene
Transposon
Transposon
Hibridização e Identificação das plantas mutadas
Figura 6 - Trait Utility System in Corn (TUSC)
NOTA: Plantas contendo transposons ativos são multiplicadas para a montagem de uma biblioteca
de mutantes. Conhecendo a freqüência com que o transposon se multiplica e insere em
regiões codantes, pode-se calcular teoricamente o número necessário de plantas, para ter
um transposon em cada gene. Cada planta mutante é autofecundada e as sementes
estocadas. Uma reação de PCR é feita com DNA extraído de folhas de grupos de plantas
dessa biblioteca de mutantes, usando um primer do transposon e um primer do gene (a
seqüência de ambos é conhecida). A hibridização é feita para auxiliar no escrutínio de um
grande número de plantas. Os grupos de plantas ,cujo sinal foi positivo são subdivididos até
que seja encontrada a planta que contenha o transposon inserido no gene. Para aumentar
a chance de encontrar a planta mutante, testa-se uma série de primers de um único gene,
simultaneamente.
qüenciar cerca de 150 mil segmentos de uma bactéria de solo que causa tumores,
DNA genômico. quando infecta plantas. O tumor é causado
pela capacidade da bactéria em transfe-
Mutação por inserção rir seu T-DNA para as células vegetais. O
de T-DNA T-DNA contém genes que codificam hor-
O T-DNA é um segmento de DNA pre- mônios e aminoácidos necessários para a
sente no plasmídeo Ti (DNA não-cromos- sobrevivência da agrobactéria dentro das
sômico) de Agrobacterium tumefaciens, plantas. Cientistas descobriram que podiam

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000

24 Biotecnologia

alterar este fragmento de DNA substituin-

do os genes nativos por qualquer gene de
interesse, e que esses novos genes continua-
riam sendo transferidos para as plantas pe- Coleção de mutantes
lo sistema mediado pela bactéria. A partir transgênicos contendo
dessa descoberta, o T-DNA passou a ser transposon Mu
usado como uma ferramenta nas genéticas
direta e reversa de maneira semelhante aos
transposons. O T-DNA insere-se aleatoria-
mente no meio de genes tornando-os não- Bibliotecas genômicas
funcionais e produzindo um organismo mu- de colunas e linhas Autofecundação
tante (Fig. 8). A função do gene Agamous
de Arabidopsis foi caracterizada como sen-
do um regulador transcricional necessário
Seqüenciamento
para o desenvolvimento floral, utilizando
essa metodologia (Yanofsky et al., 1990). Primer
Primer Primer
Primer

USO DE MICROARRAYS
DE DNA PARA ESTUDAR A
EXPRESSÃO DE GENES
EM TODO O GENOMA DE
UM ORGANISMO
O microarray é uma metodologia uti-
lizada para comparar a expressão de um
grande número de genes simultaneamente.
Este sistema baseia-se na impressão de
milhares de clones de cDNAs em placas de
pBluescript Análises
TIR TIR de
mutantes
Gene
Figura 7 - Projeto NSF coordenado pela Dra. Virginia Walbot (University of Stanford)
NOTA: O transposon contendo uma marca de seleção para resistência à ampicilina em bactéria é
transferido para o milho por transformação. As plantas são multiplicadas e as bibliotecas
genômicas são feitas a partir de colunas e fileiras de plantas que contêm esses transposons
engenheirados inseridos aleatoriamente no genoma. Os plasmídeos originados da biblioteca
genômica contendo esses cassetes são seqüênciados e as plantas contendo os transposons
inseridos nos genes de interesse são identificadas.

vidro através de um robô e, subseqüen-

temente, de uma hibridização com duas
sondas marcadas com fluorescências di-
ferentes, em geral uma que emite uma cor T-DNA
vermelha e outra verde. As sondas são con-
juntos de cDNAs gerados a partir de célu-
las ou tecidos em duas situações diferen- Transformação da planta
tes que se deseja comparar (resistência e
suscetibilidade ao alumínio, por exemplo). Autofecundação
Os resultados são produzidos sob forma
de diferentes intensidades de fluorescên-
cia que são captadas por microscopia de Plantas mutantes
fluorescência a laser, em função dos dife-
rentes níveis de expressão de cada gene.
A imagem dos pontos fluorescentes é pro- Ligação Biblioteca genômica
cessada por computadores e programas
específicos, sendo gerada uma grande
quantidade de informação simultaneamen- PCR inverso Isolamento de clones
te (Fig. 9, p.63).
Um robô é capaz de colocar 16 amostras Seqüenciamento
em 48 placas de vidro, lavar e secar a son-
da para o próximo grupo de cDNA em 70 Figura 8 - T-DNA na produção de uma biblioteca de mutantes
segundos. Assim, cerca de 10 mil amostras NOTA: Plantas de Arabidopsis são transformadas por agrobactéria contendo o T-DNA. Essas plantas
são autofecundadas e os mutantes analisados. O T-DNA contendo uma marca de seleção é usa-
podem ser impressas em aproximadamen- do para criar bibliotecas genômicas. Os plasmídeos provenientes dessa biblioteca são se-
te 12 horas (Schena et al., 1995). Vários sis- qüenciados ou mesmo usados em reação de PCR com primers específicos do gene e do T-DNA.

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000

Biotecnologia 25

temas robotizados mais rápidos e eficientes
para a impressão e processamento dos
cDNAs nas placas de vidro, além de meto-
dologias cada vez mais sensíveis e precisas
para a detecção e análise dos resultados,
têm sido desenvolvidos e disponibilizados
para os pesquisadores.
A tecnologia de microarrays não for-
nece apenas informações sobre a função
de genes anônimos, o que favorecerá bas-
tante os processos de genética reversa, mas
também constitui uma ferramenta indis-
pensável para estudos globais de expres-
são gênica, com grandes aplicações nos
estudos de Biologia molecular e Fisiologia
vegetal.
PROTEOMICS - ESTUDO DO
PERFIL PROTÉICO DE UM
ORGANISMO
Cientistas têm utilizado o termo proteomics
para descrever as análises do perfil protéico
de um organismo. O comportamento de
muitas proteínas em um proteoma pode ser
monitorado por meio de géis de eletroforese
em duas dimensões. Nesse processo, pro-
teínas provenientes de células ou tecidos
em duas condições fisiológicas diferentes
(por exemplo, plantas resistentes e sensí-
veis a uma determinada doença ou condi-
ção de estresse) são extraídas, aplicadas
em géis e comparadas qualitativa e quanti-
tativamente. As proteínas presentes em
apenas um dos géis ou que tenham a sua
quantidade alterada são fortes candidatas
para atuarem no controle do processo em
estudo. A partir da identificação das pro-
teínas de interesse pode-se isolar sua se-
qüência gênica e caracterizá-la, utilizando
as técnicas de Biologia molecular.
LOCALIZAÇÃO CELULAR
DE UM mRNA OU PROTEÍNA
PARA INFERIR SOBRE SUA
FUNÇÃO
Os genes são transcritos em moléculas
mRNA que são traduzidas em proteínas.
Essas são transportadas para locais espe-
cíficos dentro da célula de um determina-
do tecido ou organismo. Enquanto alguns
genes codificam para proteínas que são
expressas em todas as células de um in-
divíduo durante toda a sua vida (genes
constitutivos), outros codificam para pro-
teínas que são expressas apenas em algu-
mas células, ou em um determinado período
de desenvolvimento, ou em resposta a
algum estímulo externo (genes tecidos-
específicos). A localização de uma proteína
ou de seu mRNA nas células ou tecidos
onde são produzidos é uma importante
fonte de informação que pode auxiliar na
determinação da função de um gene ou
proteína. Um dos princípios dessa meto-
dologia é a identificação do mRNA ou da
proteína de interesse por meio de sondas
específicas. As sondas, após se ligarem à
proteína ou ao mRNA em estudo, são de-
tectadas com o auxílio de técnicas de mi-
croscopia. Uma vez conhecida a localização
da molécula dentro de um organismo,
podem ser programados experimentos mais
refinados para a definição de sua função.
Técnicas de hibridizações in situ têm sido
amplamente utilizadas para localizar genes
em cromossomos, tecidos e células de
diversos organismos.
INTERAÇÃO
PROTEÍNA-PROTEÍNA
A caracterização da função gênica pode
ser auxiliada por meio de estudos de inte-
ração proteína-proteína in vitro e in vivo.
A determinação de que uma proteína, cuja
função desconhecida interage com uma
que é conhecida, pode sugerir que as duas
proteínas fazem parte do mesmo processo
ou podem estar localizadas no mesmo
compartimento celular. Estes testes podem
ser usados para verificar a existência de
interação entre duas proteínas conhecidas,
identificar tanto as novas proteínas que
interagem com uma proteína em estudo
quanto as regiões dentro de uma proteí-
na que são importantes no processo de
reconhecimento e da interação. Existe um
grande número de alternativas e variações
para estudar as interações entre proteínas
(Fig. 10). Apesar de bastante informativas,

Produção da proteína “X” Produção da proteína “Y”

Produção da proteína “X” Extrato de em E. coli (GSTTag)
em E. coli (HisTag)
em E. coli (HisTag) proteínas

Mistura Mistura

Purificação em coluna Purificação em coluna

Purificação e caracterização das proteínas Western Blot

) *

Figura 10 - Identificação de interação proteína-proteína (in vitro)

NOTA: A - A proteína de interesse é clonada em um vetor de expressão em bactéria que permite a sua purificação em uma coluna de afinidade. Um extrato de
proteínas produzido nas células vegetais é também submetido à coluna que já contém fixada a proteína de interesse. A coluna é lavada e as proteínas que
interagirem com a proteína de interesse podem ser seqüenciadas ou usadas para produzir anticorpos que serão utilizados em uma biblioteca de expressão
de cDNA; B - Proteínas “X” e “Y” produzidas em E. coli são misturadas e passadas através de uma coluna de niquel. Se a proteína “Y” interagir com a “X”,
ambas ficarão retidas na coluna. O processo pode ser visualizado por anticorpos ou raios X, caso a proteína “Y” esteja marcada com radioatividade.

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26
as reações in vitro podem mascarar os
resultados reais, devido à impossibilidade
de reproduzir in vitro todas as condições
existentes nas células in vivo. Por esse
motivo foram desenvolvidos protocolos
que estudam a interação entre proteínas
in vivo.
Uma maneira efetiva para detecção de
interação in vivo é utilizar o sistema híbrido
de levedura. Esse processo constitui na
construção de duas proteínas de fusão por
Engenharia genética. Uma delas gera um
híbrido entre seqüências para um domínio
que se liga ao DNA do fator de transcrição
Gal4 (aminoácidos 1-147) (Keegan et al.,
1986) e a proteína de interesse. Um se-
gundo plasmídeo de expressão contém uma
seqüência que ativa o fator de transcrição
Gal4 (aminoácidos 768-881) (Ma & Ptashne,
1987), fundida com cDNAs. Estes são pro-
venientes de bibliotecas de onde possam
existir genes candidatos. Desta forma, se
as duas proteínas expressas na levedura
são capazes de interagir, o complexo resul-
tante ativará a transcrição dos promotores
contendo sítios de ligação para o Gal4,
gerando uma colônia azul em meio con-
tendo um substrato apropriado (X-GAL).
O sucesso dessa metodologia foi primeira-
mente demonstrado pela interação Gal4-
Gal80 (Ma & Ptashne, 1988), sendo mais
tarde generalizado por Fields & Song
(1989) (Fig. 11).
CONCLUSÃO
Desde a redescoberta das leis de Gregor
Mendel, cientistas começaram a questionar
a natureza do gene. Que tipo de molécula
seria o gene? Como a informação contida
em uma molécula poderia ser transmitida
para as próximas gerações? Por que e como
apareceriam indivíduos mutantes?
Apenas em meados do século XX, com
a descoberta da estrutura do DNA por
Watson e Crick, essas e muitas outras ques-
tões começaram a ser respondidas. Nas
primeiras três décadas após a compreensão
da estrutura do DNA, o conhecimento a
respeito de sua biologia cresceu fantas-
ticamente. Dentro desse período ficou
entendida a natureza química dos genes,
como a informação genética era armazenada,
Biotecnologia
Domínio de ligação do DNA Domínio de ativação do DNA )
Domínio de ligação do DNA Proteína conhecida *
Domínio de ativação do DNA Proteína desconhecida +
Interação entre as proteínas
Lac Z
Complexo RNA pol
,
Figura 11 - Interação proteína-proteína in vivo
NOTA: A - O ativador de transcrição GAL4 possui dois domínios: um que se liga ao DNA e outro
que ativa a transcrição; B e C - Os dois domínios foram separados: o primeiro pode ser
fundido à proteína de interesse (B) e, o segundo, à proteína desconhecida (C); D - As
colônias de levedura contendo os dois plasmídeos, cujas proteínas interagem serão azuis
em meio contendo X-GAL (substrato para a enzima), devido à reconstituição do fator de
transcrição GAL4 e à ativação do gene da beta-galactosidase (lac Z).
como as células respondiam a essa infor- de análise gênica, tanto individual quanto
mação e como ela era transmitida de uma em larga escala, fornecerão um acesso a
geração para outra. informações sem precedentes para todas
A partir dos anos 70, cientistas come- as áreas da Biologia. Dentre elas, a agro-
çaram a aprender como manipular a molé- pecuária será amplamente beneficiada, uma
cula de DNA utilizando as técnicas de vez que existe uma grande necessidade
Biologia molecular. Inaugurou-se a era da de identificar e estudar genes que são
tecnologia do DNA recombinante, também responsáveis por conferir resistência a
denominada de Engenharia genética. Desde doenças, tolerância a estresses bióticos e
então, a Biologia molecular tem experi- abióticos, aumento da qualidade nutricional
mentado grandes avanços tecnológicos dentre outras características de interesse
que têm culminado em importantes fontes econômico.
de conhecimento sobre a função, expres-
são e regulação de genes em diferentes REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
organismos. Neste artigo foram mencio- BALLINGER, D.G.; BENZER, S. Target gene
nadas metodologias que têm por objetivo mutation in Drosophila. Proceedings of
auxiliar a identificação gênica. Dentre elas, the National Academy of Sciences, Wa-
os microarrays têm revolucionado a aná- shington, v.86, p.9402-9406, 1989.
lise funcional de seqüências gênicas, uma BENSEN, R.J.; JOHAL, G.S.; CRANE, V.C.;
vez que, diferenças nos níveis de expressão TOSSBERG, J.T.; SCHNABLE, P.S.;
de milhares de genes, podem ser detecta- MEELEY, R.B.; BRIGGS, S.P. Cloning and
das simultaneamente. Desta forma, vários characterization of the maize An1 gene.
genes ainda desconhecidos poderão ter Plant Cell, Rockville, v.7, p.75-84, 1995.
suas funções biológicas desvendadas EMMONS, S. ; YESNER, L. High frequency
utilizando esse processo. As metodologias excision of transposon element Tc1 in the
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.20-27, maio/jun. 2000
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28 Biotecnologia

Plantas transgênicas
Ana Cristina Miranda Brasileiro 1
Geraldo Magela de Almeida Cançado 2

Resumo - Com o advento da Engenharia genética e os avanços da Biologia molecular,

já é possível, hoje, introduzir novas características genéticas em um determinado
organismo pela manipulação direta dos genes. A transformação genética permite a
troca de genes entre organismos filogeneticamente distantes e que não cruzam entre
si, ampliando de forma espantosa a variabilidade genética disponível para os pro-
gramas de melhoramento. Os métodos de transformação mais utilizados no momento,
para a obtenção de plantas transgênicas, são a transformação via Agrobacterium, que
faz uso de uma bactéria de solo capaz de promover naturalmente a transferência de
genes exógenos para o genoma de plantas, a transformação via biobalística, que se
baseia na transferência de genes para as células vegetais por intermédio de micro-
projéteis disparados diretamente para o interior da célula, e a transformação via
eletroporação, que gera poros na membrana de protoplastos por pulsos elétricos,
permitindo que o gene exógeno penetre no interior da célula e integre-se ao geno-
ma. Existem, ainda, outros métodos de transformação de plantas utilizados em me-
nor escala. De maneira geral, não há um método de transformação melhor que o
outro, visto que a eficiência de um determinado método está relacionada principal-
mente com o objetivo, o custo, a operacionalidade técnica e a espécie trabalhada.
Palavras-chave: Transformação de plantas; Construção gênica; Agrobacterium; Bio-
balística; Eletroporação.

INTRODUÇÃO
Há muitos anos, plantas cultivadas vêm
sendo manipuladas geneticamente pelo
homem, por meio de melhoramento clássico,
em que características fenotípicas de in-
teresse, determinadas por genes, são trans-
feridas à progênie através de cruzamentos.
No entanto, esses métodos de melhora-
mento esbarram em uma série de proble-
mas, como redução da variabilidade gené-
tica, ligação gênica, seleção de característi-
cas poligênicas, mutações espontâneas e
incompatibilidade sexual, além do longo
tempo necessário para se transferirem ca-
racterísticas desejáveis para genótipos já
melhorados. Atualmente, o melhoramento
de plantas pode recorrer às modernas técni-
cas de Engenharia genética para auxiliar
na resolução de algumas dessas limitações.
A combinação de técnicas de Biologia
molecular, de cultura de tecidos e de trans-
ferência de genes resultou no desenvol-
vimento da transformação genética de
plantas. Prática que consiste na introdução
controlada de um gene no genoma de uma
planta e sua posterior expressão, confe-
rindo a esta planta uma nova característica.
Como esse gene pode ser oriundo de di-
ferentes organismos (vegetais, animais,
bactérias, vírus, fungos etc.), daí a deno-
minação de transgene ou gene exógeno.
A introdução do transgene no genoma ve-
getal receptor é feita de forma controlada e
de modo independente da fecundação.
Uma vez incorporado no genoma e expres-
so de maneira estável, o transgene passa a
fazer parte do patrimônio genético da plan-
ta, não alterando sua constituição genéti-
ca global. Assim, as plantas transgênicas
constituem-se, hoje, em fonte adicional de
variabilidade genética para ser incorporada
aos programas de melhoramento.
COMO SÃO OBTIDAS AS
PLANTAS TRANSGÊNICAS
Para se obter uma planta transgênica
são necessárias três etapas básicas. A pri-
meira delas e, geralmente, a mais limitante,
é a identificação do gene que irá conferir a
nova característica de interesse para a plan-
ta em estudo. A variabilidade genética exis-
tente na natureza torna-se potencialmente
a fonte desses genes. Entretanto, para po-
der ser manipulado, o gene responsável
pela característica de interesse deve ser lo-
calizado e isolado dos demais genes no
genoma do organismo doador. De posse
do gene, ele será caracterizado, introdu-
zido em vetores para transformação e, só
então, transferido para o genoma da plan-

1
Enga Florestal, Ph.D., Pesq. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, CEP 70770-900 Brasília-DF. E-mail: anacmb@cenargen.embrapa.br
2
Engo Agro, M.Sc., Pesq. EPAMIG-CTSM-FECD, CEP 37780-000 Caldas-MG. E-mail: cancado@epamigcaldas.gov.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.28-35, maio/jun. 2000

Biotecnologia 29

ta em estudo (Aragão & Rech, 1998).
A segunda etapa consiste no desen-
volvimento de uma metodologia eficiente
de transformação da espécie vegetal de
interesse. Atualmente, diferentes estra-
tégias para a transferência de genes em
plantas estão disponíveis, sendo que as
mais utilizadas são as transformações via
Agrobacterium, biobalística e eletropo-
ração.
A última etapa para a transformação de
uma planta é o estabelecimento de um sis-
tema eficiente, simples e, principalmente,
reproduzível de regeneração in vitro da es-
pécie vegetal. Durante o processo de rege-
neração, a célula inicialmente transformada
multiplica-se e dá origem a uma planta in-
teira, onde todas as células vão conter a
nova informação introduzida. A regene-
ração desta planta baseia-se no princípio
da totipotência, isto é, a potencialidade que
as células vegetais têm de diferenciar-se,
originando um novo indivíduo. Cada es-
pécie vegetal, ou mesmo diferentes genó-
tipos dentro de uma mesma espécie, tem
diferentes exigências nutricionais e hor-
monais para a sua regeneração. Alguns
apontam a dificuldade em se cultivar deter-
minadas espécies vegetais in vitro como o
principal limitante à transformação de
plantas no momento. No entanto, os grandes
avanços obtidos na pesquisa com regu-
ladores de crescimento de vegetais e cultura
de tecidos fazem com que um número cres-
cente de plantas possa ser regenerado via
cultivo in vitro, permitindo a obtenção de
um maior número de espécies vegetais capaz
de ser transformado.
Uma vez identificado o gene de inte-
resse no genoma do organismo doador, a
seqüência codificadora dele, traduzida em
uma proteína, deverá ser isolada e transfe-
rida para um cassete, onde será flanqueada
por um promotor, que permite que o gene
seja reconhecido por enzimas específicas
e expresso corretamente em plantas, e um
sinal de terminação, que promove o final
da leitura do gene. Esse cassete contendo
o gene quimérico é então transferido para
um plasmídeo que será utilizado como ve-
tor de transformação de plantas (Fig. 12).
Desta forma, um vetor de transformação
contém basicamente o gene de interesse
quimérico, um gene de seleção e um gene
repórter, necessários para a identificação
das plantas que foram efetivamente trans-
formadas. A este conjunto de genes é da-
do o nome de cassete de transformação,
pois todo esse conjunto é que será trans-
ferido para o genoma da planta (Delú Filho
et al., 1999).
GENES MARCADORES DE
SELEÇÃO E REPÓRTERES
Genes marcadores de seleção são aque-
les que codificam para uma proteína com
uma atividade enzimática, ou para um pro-
duto, que irá conferir às células transfor-
madas da planta resistência a um determi-
nado substrato. A finalidade do uso de um
gene marcador de seleção é permitir que
apenas as células transformadas cresçam
em detrimento às células não-transforma-
das. Assim, as plantas que foram trans-
formadas com o cassete de transformação
deverão possuir, além do gene de interes-
se, um gene marcador de seleção que irá
conferir resistência a uma determinada
substância tóxica ao desenvolvimento das
plantas, geralmente um antibiótico ou um
herbicida. Uma eficiente seleção é de grande
importância para a obtenção de plantas
transformadas, pois na presença do agente
seletivo, somente aquelas que apresentam
o cassete de transformação inserido em seu
genoma conseguem desenvolver-se, de-
vido à resistência conferida pelo gene de
seleção.
Por outro lado, genes repórteres são
aqueles que codificam para uma proteína,
geralmente com atividade enzimática, cujo
produto é facilmente detectável. Esses ge-
nes possibilitam a identificação ou mar-
cação das células transformadas sem con-
tudo eliminar as células não-transformadas.
Assim, o gene repórter funciona de maneira

VETORES PARA A
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
Os vetores utilizados para a transforma-
ção genética de plantas são, geralmente,
plasmídeos bacterianos onde o gene de in-
teresse foi clonado. E o que vem a ser um
plasmídeo? As bactérias são conhecidas por
possuírem uma molécula de DNA dupla
hélice, de maior tamanho, definida como
DNA cromossômico, e moléculas de DNA
circular, de menor tamanho (2.000 a 15.000
pares de base), denominadas de plasmídeos
(Aragão & Rech, 1998). Estes são indepen- Figura 12 - DNA plasmidial contendo o cassete de transformação (plasmídeo Ti)
dentes do DNA cromossômico, com replica-
NOTA: O cassete de transformação é composto pelo gene de interesse e suas seqüências regulató-
ção autônoma no interior da célula. Vários rias (promotor e região de terminação), associados aos genes marcadores e suas seqüên-
plasmídeos de bactérias foram manipulados cias regulatórias. As setas indicam os sítios de reconhecimento pelas enzimas de restrição
pelo homem para ser utilizados como veto- (onde ocorre a clivagem do DNA) e que flanqueiam o cassete de transformação, em que,
res para transformação de plantas (Fig. 12). BD = borda direita e BE - borda esquerda.

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.28-35, maio/jun. 2000

30
complementar ao gene de seleção. Sua
principal função na planta é indicar, por
meio da expressão de um gene, a presen-
ça de células ou tecidos transformados, de
uma maneira simples e rápida. O produto
da expressão do gene repórter, assim como
do gene de seleção, não pode estar pre-
sente nas células de plantas não-trans-
formadas. Entretanto, muitas vezes, plantas
não-transformadas podem desenvolver-se
na presença do agente seletivo por motivos
que vão desde concentrações insuficientes
ou degradação dos agentes de seleção, até
o surgimento de variações somaclonais
(mutações) resistentes a eles. Esses even-
tos são conhecidos como “escapes”.
Após o evento da transformação, as cé-
lulas transformadas e não-transformadas do
explante são cultivadas em meios contendo
o agente seletivo. Como pode haver escapes
nesta fase, faz-se necessária a presença do
outro gene repórter para confirmação do
estado transgênico do material. O gene re-
pórter seria então uma segunda confirma-
ção indireta da transformação, pois a priori,
apenas as plantas que apresentam o cas-
sete de transformação inserido em seu ge-
noma seriam capazes de expressar o gene
repórter.
O gene repórter mais utilizado no mo-
mento é o gene gus que codifica para a
enzima β-glucuronidase (GUS). Na presen-
ça da enzima GUS, um substrato cromogê-
nico, o X-Glu, forma um precipitado de
cor azul intensa no tecido transformado
(Jefferson, 1987). Assim, com apenas um
pequeno pedaço de tecido metabolicamen-
te ativo pode-se confirmar a transforma-
ção de uma forma rápida e simples. No
entanto, quando a transformação ocorre via
Agrobacterium, podem ocorrer falsos po-
sitivos para o teste do GUS, devido à con-
taminação endógena das plantas com a
própria bactéria utilizada para a transfor-
mação. Mesmo estando o gene gus sob
o controle de seqüências regulatórias de
plantas, pode haver expressão de GUS em
Agrobacterium. Como a eliminação comple-
ta da bactéria nos explantes transforma-
dos pode ser difícil e demorada, é comum o
aparecimento de falsos positivos. Este pro-
blema foi resolvido pelo desenvolvimento
de vetores contendo um gene gus alterado,
cuja expressão é nula ou não-detectável
em Agrobacterium. Uma outra limitação do
gene gus como repórter reside no fato de
algumas plantas possuírem uma ativida-
de endógena similar a de GUS, o que tam-
bém pode gerar falsos positivos. Este pro-
blema pode ser contornado utilizando-se
outras classes de genes repórteres, tais co-
mo o gene gfp (proteína verde fluores-
cente), que é traduzido em uma proteína
fluorescente no comprimento de luz azul e
que não existe naturalmente em plantas
(Chalfie et al., 1994). A maior vantagem da
utilização do gene gfp sobre outros genes
repórteres é que a GFP não necessita de
cofatores para fluorescer, podendo assim
ser visualizada em células vivas.
E por que não se poderia utilizar o pro-
duto do gene de interesse introduzido
(proteína ou enzima), ou o fenótipo da plan-
ta, para selecionar as plantas transfor-
madas? Isso sem dúvida é feito, só que
numa etapa final do trabalho. Nos está-
dios iniciais de transformação, o número
de explantes utilizados é bastante elevado.
O uso de genes de seleção e genes repórte-
res permite o descarte precoce de todas as
plantas que não foram efetivamente trans-
formadas, evitando-se gastos desneces-
sários de espaço, tempo e recurso. Além
do mais, na maioria dos casos, o produto
do gene de interesse pode ser uma proteína
ou enzima de difícil detecção ou que só po-
de ser detectada em estádios avançados
do desenvolvimento das plantas.
MÉTODOS DE
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
Vários métodos de obtenção de plantas
transgênicas vêm sendo desenvolvidos e
alguns deles já estão bem estabelecidos,
sendo utilizados de forma rotineira em la-
boratórios de transformação de plantas.
Apesar de existir inúmeros métodos de
transformação, nos restringiremos àqueles
via Agrobacterium, eletroporação de pro-
toplastos e biobalística, por serem os mais
usuais. Outros métodos de transformação
descritos na literatura, tais como macroin-
jeção, microinjeção, lipossoma e polietileno-
glicol (PEG), são utilizados para propostas
mais específicas, devido a sua maior com-
plexidade (Brasileiro & Dusi, 1999).
Deve ter-se em mente que não existe
um método de transformação ótimo ou ideal
para todo o tipo de planta. Em função da
espécie vegetal e do propósito do trabalho,
pode optar-se por um método ou outro, se-
gundo as vantagens que ele possa apre-
sentar.
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Biotecnologia
Transformação por
Agrobacterium
As agrobactérias são microorganismos
tipicamente do solo e possuem forma de
bacilo, movendo-se no solo por meio de
um a seis flagelos. O gênero Agrobacterium
(do grego agros = campo e bakterion =
bastonete) pertence à mesma família das
bactérias fixadoras de nitrogênio e está
subdividido em cinco espécies que diferem
entre si pela sintomatologia em diferentes
plantas (Kersters & Ley, 1984). Agrobacterium
tumefaciens é o agente etiológico da galha-
da-coroa (crown gall), A. rhizogenes causa
a raiz-em-cabeleira (hairy root), A. rubi
induz tumores especificamente em Rubus
spp. (cane gall), A. vitis induz tumores
especificamente em videiras (Vitis spp.) e
A. radiobacter é saprófita, isto é, não-
patogênica (Brasileiro, 1998).
Mais de 600 espécies vegetais são co-
nhecidamente susceptíveis à infecção por
A. tumefaciens e A. rhizogenes, pertencen-
do a maioria delas à classe das Angios-
permas dicotiledôneas e Gymnospermas e,
mais raramente, das Angiospermas mono-
cotiledôneas (Brasileiro, 1998). Apesar de
as doenças causadas por agrobactérias,
principalmente a galha-da-coroa, serem
muito sérias para algumas culturas, estas
raramente têm causado danos econômicos
para a agricultura no Brasil.
A infecção de uma planta por
Agrobacterium inicia-se pela penetração
da bactéria no tecido vegetal através de
uma lesão sofrida pela planta por tratos
culturais, geadas, insetos ou outro agente.
A lesão na planta exsuda moléculas, como
compostos fenólicos, açúcares ou aminoá-
cidos, que atraem as agrobactérias. Essas
moléculas exsudadas são responsáveis
por ativar genes presentes na agrobactéria
e que são responsáveis pela transferência
de parte do plasmídeo de virulência destas
bactérias, conhecido como plasmídeo Ti,
para o genoma da planta. Os genes pre-
sentes no fragmento do plasmídeo Ti da
agrobactéria, que é transferido para a plan-
ta, conhecido como T-DNA, serão expres-
sos nas células vegetais, produzindo en-
zimas que estão envolvidas com a síntese
de hormônios vegetais e com a síntese de
opinas (compostos sintetizados para a nu-
trição da bactéria). Desta forma, as células
vegetais que recebem o T-DNA proliferam
desordenadamente, devido à síntese de
hormônios, levando à formação de um tu-
Biotecnologia 31

mor (Brasileiro & Lacorte, 1998). Este tu- Numa etapa final, as plantas transformadas de botões florais com a solução contendo
mor é o principal sintoma da doença galha- são regeneradas in vitro e transferidas para Agrobacterium. A taxa de sementes po-
da-coroa, causado por A. tumefaciens. Em ambientes de aclimatação da mesma forma sitivamente transformadas por este método
A. rhizogenes a expressão dos genes do que se faz para outros trabalhos com cul- pode alcançar até 5%.3
T-DNA induz à produção de raízes no local tura de tecidos (Fig. 13). Atualmente, pa- Desta forma, as agrobactérias têm sido
do ferimento, provocando a doença deno- ra algumas espécies de plantas, tais co- utilizadas como um eficiente vetor natural
minada de raiz-em-cabeleira. mo Arabidopsis thaliana, a transforma- para a transformação genética de plantas,
Por achar que se tratava de uma forma ção pode ser feita através do contato direto principalmente, de Angiospermas dicotile-
vegetal de câncer, as agrobactérias foram
intensamente estudadas nos anos 80 na
esperança de que o modelo da doença ve-
getal fosse semelhante ao câncer que ocor-
Explante inicial
re em células animais, auxiliando desta
forma na descoberta da cura. Apesar de os (folha) Discos foliares
pesquisadores terem-se frustrado em seu
objetivo inicial, pois não havia nenhuma
relação entre os tumores em vegetais e a
doença em animais, logo se percebeu que
o sistema de transferência de genes das
agrobactérias para as plantas poderia ser
um método extremamente eficaz para a
Co-cultura com a
transferência de genes de interesse para
Agrobacterium desarmada
plantas. Assim, os plasmídeos Ti das agro- em meio líquido
bactérias foram intensamente estudados e
manipulados, permitindo a troca de genes Planta transgênica
do T-DNA, não-essenciais para a trans- regenerada

formação, por genes de interesse, ou seja,

transformaram o plasmídeo Ti de agro-
bactérias em um vetor natural de trans-
formação de plantas. As linhagens de
Agrobacterium que perderam todo, ou
parte do seu T-DNA, são denominadas li-
nhagens desarmadas, pois são incapazes
de produzir tumores nas plantas hospe-
deiras (Zambryski et al., 1983).
Para transformar plantas utilizando li-
nhagens desarmadas de Agrobacterium,
utilizam-se explantes com potencial rege-
nerativo, como segmentos de folhas jo-
vens (discos foliares), embriões zigóticos,
entrenós, cotilédones etc. O explante é co-
locado na presença de meio líquido con-
tendo as bactérias desarmadas com o vetor
de transformação que contém o gene de
interesse, em um processo denominado
de co-cultura (Fig. 13). Durante este conta-
to, as bactérias infectam o tecido vegetal
e iniciam o processo de transferência do
cassete de transformação para o genoma
da planta. Após a co-cultura, o tecido é
cultivado em um meio de regeneração na
presença de antibiótico, para eliminação
da Agrobacterium, e de um agente seletivo,
para a seleção das células transformadas.
Co-cultura em meio sólido com
antibiótico tóxico apenas para
Agrobacterium
Plantas não
Plantas transformadas transformadas
(vivas) (mortas)
Meio de indução de brotos
Enraizamento in vitro
com antibiótico e agente
de seleção das plantas
transformadas
Figura 13 - Transformação de plantas por Agrobacterium
NOTA: Discos foliares são retirados da folha da planta, a qual se quer transformar e são submersos
em solução na presença da bactéria que contém o vetor de transformação (plasmídeo Ti
contendo o cassete de transformação). Algumas horas após, os discos foliares são transferi-
dos para meio nutritivo sólido na presença de um antibiótico para a eliminação da bactéria
e de um agente seletivo (antibiótico ou herbicida) para a seleção das células transformadas.
Após regeneração das plântulas, estas são transferidas para novo meio, quando se faz a
seleção das plântulas positivas, com auxílio do agente seletivo. As plantas que crescerem no
meio com agente seletivo, são submetidas a novos testes para confirmação (testes
histoquímicos para expressão do gene repórter, PCR, Southern, northern e western blots),
e as plantas transformadas positivamente são enraizadas in vitro e transferidas para vasos
com solo em casa de vegetação.

3
Informação obtida a partir de Rich Jorgensen, Tucson, AZ, em maio de 2000.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.28-35, maio/jun. 2000
32
dôneas. A alta eficiência de transformação
e o baixo custo operacional, assim como a
simplicidade dos protocolos de transfor-
mação e de seleção, são as maiores razões
para a universalidade do uso do sistema
Agrobacterium.
Transformação por
eletroporação de
protoplastos
Protoplastos são células vegetais in-
dividualizadas e desprovidas de paredes
celulares que foram eliminadas com o au-
xílio de enzimas pectocelulolíticas. Em
condições adequadas de cultura de teci-
dos, os protoplastos podem reconstituir
suas paredes celulares, regenerando um
novo tecido que pode dar origem a uma
nova planta (Bourgin et al., 1979). A ele-
troporação de protoplastos consiste na
indução de poros na membrana celular de
protoplastos por meio de pulsos elétricos
de alta voltagem. Estes poros permitem a
entrada do vetor de transformação con-
tendo o gene de interesse para o interior
da célula e, como os poros são reversíveis,
ou seja, fecham-se novamente após ter-
minada a aplicação do pulso elétrico, os
protoplastos contendo o vetor de transfor-
mação podem regenerar-se em novas plan-
tas (Fig. 14) (Fromm et al., 1985).
Os protoplastos, logo após ter sido iso-
lados, são imediatamente colocados em um
eletroporador na presença do vetor de
transformação, contendo o gene de inte-
resse. O pulso elétrico é muito rápido e,
logo após, os protoplastos são transferidos
para um meio de cultura onde serão sele-
cionados aqueles que forem transfor-
mados. A grande vantagem deste método
em relação aos outros é que a transfor-
mação é feita em células individuais. Assim,
todo o tecido regenerado será originado a
partir de uma única célula, evitando desta
forma o surgimento de quimeras (tecido
constituído de células transformadas e
não-transformadas), problema observado
com certa freqüência, quando se realiza
transformação em tecidos ou órgãos. A
grande desvantagem deste método reside
justamente na dificuldade de obtenção de
uma nova planta a partir de um protoplas-
to. O processo é lento, exige mudanças
constantes de meios de cultura e condições
de cultivo e possui, geralmente, uma baixa
Biotecnologia
Folha cortada e colocada na
Folha da planta a ser presença de enzimas que Obtenção dos protoplastos
transformada digerem as paredes celulares isolados
Plasmídeo contendo o cassete
de transformação
+
protoplastos isolados
+ -
Regeneração da planta Seleção dos protoplastos Eletroporador
transformada transformados
Figura 14 - Transformação de plantas por eletroporação
NOTA: Segmentos foliares da planta a qual se quer transformar são digeridos com enzimas que
degradam as paredes celulares, para a liberação dos protoplastos. Os protoplastos são
purificados e transferidos para a cuba de eletroporação com o DNA plasmidial, contendo
o cassete de transformação, onde serão submetidos a pulsos elétricos para a formação dos
poros na membrana celular. Após a eletroporação, os protoplastos são transferidos para
meio de seleção, onde apenas os protoplastos transformados com a construção gênica se
multiplicarão.
eficiência. Para algumas espécies vegetais, cido no qual se quer transferir o gene. Este
o processo de regeneração do protoplasto método de transformação também é co-
pode ser um forte limitante ao uso desta nhecido como bombardeamento ou gene
técnica. gun (arma de genes) e inicialmente pro-
Por outro lado, a eletroporação tem si- posto por Sanford et al. (1987). As micro-
do extremamente útil em estudos de ex- partículas utilizadas pela biobalística são
pressão transiente, que é a expressão do partículas microscópicas (de 0,2 a 4 µm de
gene exógeno sem que ele tenha sido ne- diâmetro) de ouro ou tungstênio, que pos-
cessariamente incorporado ao genoma. suem adsorvido à sua superfície o vetor de
Neste caso, o gene se expressa transito- transformação, contendo o cassete com o
riamente na célula transformada, mas à me- gene de interesse. As micropartículas atra-
dida que as células dividem-se e multiplicam- vessam de forma não-letal a parede celular
se, a expressão do gene vai diminuindo até e a membrana plasmática, alojando-se de
desaparecer por completo. A análise da forma aleatória no interior das células. Uma
expressão transiente após eletroporação vez na presença do líquido celular, o DNA
permite testar rapidamente a funcionalida- adsorvido à superfície da micropartícula
de de uma construção gênica, sem a ne- encontra condições para se tornar livre, po-
cessidade de obter uma planta transgênica. dendo então ser incorporado ao genoma
nuclear da célula vegetal (Rech & Aragão,
Transformação por 1998 e Lacorte et al., 1999).
biobalística As micropartículas são aceleradas em
A biobalística, como o próprio nome direção ao tecido-alvo por meio de uma on-
indica, funciona de forma análoga a uma da de choque que pode ser gerada de di-
arma de fogo, onde micropartículas re- versas formas, sendo que a mais utiliza-
vestidas com o vetor de transformação são da atualmente é através de uma descarga
aceleradas em alta velocidade contra o te- de gás hélio à alta pressão. O aparelho res-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.28-35, maio/jun. 2000
Biotecnologia 33

ponsável por gerar a onda de choque é de-

nominado de acelerador de micropartículas
Esquema de um acelerador de partículas que
ou bombardeador e está esquematizado na
utiliza gás hélio à alta pressão
Figura 15. A onda de choque gerada pela
liberação rápida do gás hélio lança a mem- Entrada de gás hélio
brana carreadora (onde as micropartículas
estão depositadas) a uma altíssima velo-
cidade contra uma tela de retenção que Mecanismo que
retém esta membrana e permite a passagem rompe a
membrana de
apenas das micropartículas. Estas, por sua ruptura Membrana de ruptura
vez, continuarão sua trajetória pela inércia
e irão atingir diretamente o tecido que está
posicionado logo abaixo da tela de reten- Câmara de
ção (Fig. 16). Todo o processo ocorre no alta pressão
Membrana carreadora
de gás hélio
interior de uma câmara sob vácuo, para contendo as micropartículas
com DNA
evitar a desaceleração das partículas causa-
da pelo atrito com o ar.
Esta técnica é bastante versátil, pois Tela de retenção
permite potencialmente a transformação de Bomba de
qualquer espécie vegetal ou genótipo, assim vácuo Tecido vegetal
como qualquer tipo celular ou mesmo orga-
nelas, como mitocôndrias e cloroplastos.
Válvula de vedação
Além disso, a técnica de transformação por
biobalística pode ser considerada relativa-
mente simples, rápida e que não envolve
maiores investimentos em infra-estrutura e
equipamentos. O próprio acelerador de par- Figura 15 - Esquema de um acelerador de partículas a gás hélio, utilizado para
tículas é um aparelho simples e de baixo transformação de plantas por biobalística
custo. Uma outra vantagem da biobalística
é a maior eficiência de transformação em
Gymnospermas e Angiospermas monocoti-
ledôneas, o que não é observado com a trans- Disparo
formação por Agrobacterium (Rech & (Liberação da pressão)
Aragão, 1998). A biobalística também é bas-
Etapa 1 Etapa 2
tante utilizada, à semelhança da eletropo-
ração de protoplastos para estudar a fun-
Câmara de alta
cionalidade de construções gênicas. pressão Membrana
Membrana carreadora
carreadora lançada de
ANÁLISE DAS encontro à tela
PLANTAS TRANSFORMADAS de retenção

POR TÉCNICAS MOLECULARES

Microprojéteis
A expressão de um gene repórter ou a aderidos na Tela de retenção
face inferior da
sobrevivência de um explante em meio membrana
seletivo é considerada apenas como evi- carreadora
Microprojéteis
dência da transformação, não sendo su- com DNA
ficiente como prova definitiva da integração Embrião são lançados
contra o embrião
e expressão do cassete no genoma da plan-
ta. Como foi frisado anteriormente, mesmo
com o uso dos genes marcadores de sele- Figura 16 - Vista em detalhe do funcionamento do acelerador de partículas no mo-
mento do disparo
ção e repórter, pode ocorrer a presença de
NOTA: O gás hélio cria um ambiente de alta pressão no interior da câmara e quando a membra-
falsos positivos. A reação em cadeia da
na de ruptura é rompida por uma agulha, há liberação de uma grande quantidade de
polimerase (PCR) (Mullis & Faloona, 1987) energia que desloca a membrana carreadora em direção à tela de retenção. Ao atingir
e o Southern blot (Southern, 1975) são duas esta tela, os microprojéteis aderidos à membrana carreadora são, por sua vez, projetados
técnicas moleculares indispensáveis para em direção ao tecido vegetal posicionado logo abaixo.

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34
a confirmação da presença e da integração
do cassete de transformação no genoma das
plantas transformadas. No caso do PCR, o
gene de interesse e/ou um dos genes mar-
cadores são amplificados bilhões de vezes
in vitro, por enzimas que sintetizam novas
fitas de DNA e com o auxílio de um termo-
ciclador, máquina que simula os ciclos de
replicação do DNA. Estes bilhões de cópias
do gene podem então ser facilmente vi-
sualizados na forma de uma banda em um
gel de agarose. A Figura 17 ilustra sucin-
tamente o processo de detecção por PCR.
No caso do Southern blot, o gene pode
ser visualizado pela utilização de sondas
marcadas radiotivamente (P32) que se ligam
(hibridizam) especificamente ao gene de
interesse ou a um dos genes marcadores
(Fig. 18). O DNA total da planta é inicial-
mente extraído e clivado por enzimas de
restrição em sítios específicos da molécula
de DNA que flanqueiam o cassete de trans-
formação. Desta forma, o cassete é liberado
do resto do genoma e transferido para uma
membrana que, posteriormente, é colocada
na presença da sonda radioativamente mar-
cada, para que possa ocorrer a formação
da molécula híbrida entre o gene exógeno
presente no cassete de transformação e a
sonda. Ou seja, uma fita simples de DNA
do gene exógeno com uma fita simples de
DNA da sonda unem-se, devido à formação
de pontes de hidrogênio, formando nova-
mente uma fita dupla de DNA. Quando na
presença de um filme de raios X, as sondas
marcadas o impressionam, devido à emissão
de radiação, dando origem a uma banda
que corresponde ao gene de interesse. De-
pendendo do tipo de clivagem realizado no
DNA total da planta, o Southern blot pode
permitir a estimativa do número de cópias
do cassete no genoma receptor (Romano,
1998).
Muitas vezes, a integração do cassete
de transformação no genoma da planta não
significa necessariamente que o gene será
expresso, ou seja, que ele vá produzir a pro-
teína ou enzima de interesse. Isto é um
problema muito comum observado em
transformação de plantas e os motivos que
levam a isso possuem inúmeras causas,
sendo que muitas delas ainda não foram
completamente desvendadas. A forma mais
simples para checar se um gene está sendo
expresso ou não é pela observação de seu
fenótipo em uma planta completamente re-
Biotecnologia
Marcadores de peso molecular
T
Termociclador
Máquina que
DNA genômico sintetiza in vitro
oo Gene exógeno
DNA amplificado bilhões
contendo o gene
exógeno de vezes
Gene exógeno
visualizado como
uma banda no gel
Figura 17 - Detecção do gene exógeno por meio da amplificação do DNA via PCR
NOTA: Nesta técnica, bilhões de cópias do gene exógeno são sintetizadas in vitro. O termociclador
é a máquina que simula as condições necessárias para síntese do DNA in vitro. Após a
amplificação, o produto do PCR é aplicado em gel de agarose, para visualização da banda
correspondente ao DNA do gene exógeno.
Liberação do cassete de
transformação com o gene
exógeno
Enzima de +
restrição Sonda marcada com P32
forma uma molécula híbrida
com o gene exógeno
Sonda marcada
com P32 é colocada Marcadores de
na presença do peso molecular
gene exógeno
Gene exógeno
Corte da molécula de DNA
genômico contendo o O gene exógeno é detectado na
cassete de transformação
por enzimas de restrição
forma de uma banda em um filme
que foi impressionado pela
radiação emitida pelo P32
Figura 18 - Detecção do gene exógeno com o uso da técnica de Southern blot
NOTA: Nesta técnica, o DNA total é clivado por enzimas de restrições e os fragmentos de DNA
gerados são separados em gel de agarose e transferidos para uma membrana de náilon,
conservando sua posição de corrida no gel. O fragmento que contém o gene exógeno
hibrida-se com uma sonda marcada, de seqüência homóloga à seqüência do gene exógeno.
A molécula híbrida de DNA formada pela sonda e pelo fragmento de DNA, contendo o
gene exógeno, emite radiação luminosa que impressiona o filme de raios X, gerando uma
banda que confirma a presença do gene.
generada ou em sua progênie (descen- produto do gene pode não causar nenhuma
dentes), desde que o produto do gene em alteração expressiva no fenótipo final da
questão cause alterações que possam ser planta. A purificação bioquímica da pro-
detectáveis visualmente ou por técnicas teína ou da enzima produzida pelo gene
moleculares e bioquímicas. Como foi dito exógeno pode ser difícil de ser realizada,
anteriormente, a expressão de determina- exigindo pessoal e infra-estrutura adequa-
dos genes pode ocorrer em níveis tão bai- dos, o que muitas vezes pode ser bastante
xos, que mudanças no fenótipo da planta complexo e caro.
podem não ser perceptíveis ou, ainda, o Existem técnicas moleculares que per-
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Biotecnologia
mitem observar a expressão dos genes de
forma fácil e rápida. As mais utilizadas são
o northern blot (Alwine et al., 1977) e o
western blot (Burnette, 1981 e Towbin et
al., 1979). O northern blot permite detectar
a quantidade e o tamanho do RNA mensa-
geiro produzido pelo gene exógeno através
de hibridização com sondas específicas mar-
cadas radioativamente. No western blot,
detecta-se a proteína ou enzima produzida
por este RNA mensageiro, através da li-
gação com anticorpos específicos. Ambas
as técnicas possuem sensibilidade sufi-
ciente para detectar pequenas quantida-
des de RNA mensageiro ou de proteína pro-
duzidas pelo gene exógeno e, tecnicamente,
não são difíceis de ser realizadas. A confir-
mação da presença do produto do gene, à
semelhança do PCR e do Southern blot, é
feita pela presença de uma banda e, nos dois
casos, já se busca a identificação do pro-
duto da expressão do gene. Assim, mesmo
que o gene esteja inserido no genoma da
planta, é necessário que este seja funcional
para ser detectado por estas técnicas. O
interessante em utilizar o northern blot e o
western blot é que eles permitem não só a
detecção da expressão do gene, como tam-
bém quantificar a intensidade desta ex-
pressão pela intensidade das bandas que
são geradas. Isto é de grande importância
para os pesquisadores, pois, além da inte-
gração do gene no genoma da planta, é
muito importante saber se este está-se ex-
pressando em níveis adequados, para que
ocorra a mudança fenotípica esperada.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O que vinha sendo colocado como uma
possibilidade para o futuro, hoje já pode
ser encarado como realidade. São inúmeras
as espécies vegetais, assim como as ca-
racterísticas genéticas estudadas no cam-
po da transformação genética de plantas,
com objetivos que vão desde a obtenção
de plantas resistentes ou tolerantes a con-
dições de estresses bióticos e abióticos,
até plantas com melhor qualidade nutri-
cional ou capazes de produzir fármacos
(biorreatores). A tecnologia de introdu-
ção de genes exógenos via transformação
genética de plantas tem disponibilizado,
para os melhoristas, genes antes impos-
síveis de ser manipulados pelos métodos
convencionais de melhoramento. Com a
eliminação das barreiras que impediam o
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.28-35, maio/jun. 2000
cruzamento interespecífico, é esperado um
novo salto tecnológico para o setor agrícola,
principalmente no que diz respeito ao lan-
çamento de outras cultivares. O uso de orga-
nismos transgênicos como modelos de
estudo também tem colaborado significa-
tivamente para elucidação de processos e
fenômenos importantes nas áreas de Gené-
tica, Fisiologia, Biologia celular e Biologia
molecular. No entanto, ainda há inúmeros
desafios a serem vencidos, tais como a
adequação do processo de cultivo e rege-
neração in vitro para várias espécies recalci-
trantes, compreensão da função da grande
maioria dos genes e a manipulação gené-
tica de características complexas, que são
governadas pela ação de vários genes e que
freqüentemente estão associadas à produ-
tividade.
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36 Biotecnologia

Utilização de plantas transgênicas como reatores biológicos

para produção de proteínas heterólogas
Paulo César De Lucca 1
Eneida Abreu Parizotto 1
Adilson Leite 2

Resumo - Nos últimos anos, plantas transgênicas têm sido testadas com sucesso
como reatores biológicos para a produção de proteínas heterólogas. O custo reduzido
de produção, a capacidade de produzir proteínas complexas e o menor risco de estas
proteínas vincularem patógenos nocivos ao homem fazem das plantas transgênicas
um sistema especialmente interessante para a produção de fármacos protéicos. Desta
forma, plantas transgênicas já foram utilizadas na produção de hormônios, anticorpos
e vacinas.
Palavras-chave: Plantas transgênicas; Fármacos protéicos; Vacinas; Proteínas re-
combinantes.

INTRODUÇÃO
A descoberta da agricultura e da pe-
cuária, há cerca de 10 mil anos, estabeleceu
uma das condições básicas que pro-
piciaram o desenvolvimento das diversas
civilizações. Este desenvolvimento inau-
gurou uma nova fase para a humanidade,
na qual os seres humanos começaram a
exercer controle sobre o meio ambiente em
que viviam, através da domesticação de
animais e plantas. A adoção da agrope-
cuária favoreceu a fixação do homem no
campo e permitiu grande aumento popu-
lacional (Borém & Milach, 1999).
O emprego de tecnologia no período
pós-guerra transformou novamente a agro-
pecuária, elevando a produção mundial de
alimentos, que foi acompanhada de novo
aumento populacional. Entretanto, a utili-
zação corrente de tais práticas está rapida-
mente deteriorando o meio ambiente. A
partir dos anos 80, o advento das técnicas
de transferência de genes entre espécies
diferentes, conhecidas como Engenharia
genética, tornou possível o desenvolvi-
mento de plantas transgênicas com pro-
priedades agronômicas especiais. Deste
modo, a agricultura moderna está sen-
do transformada pela introdução de plan-
tas modificadas geneticamente, através da
transferência de genes que promovem, prin-
cipalmente, resistência a herbicidas, pató-
genos e pragas, além do melhoramento da
qualidade das sementes e frutos (Gander
& Marcellino, 1997).
Recentemente, esta tecnologia tem sido
aplicada na produção de plantas transgê-
nicas com o objetivo de transformá-las em
biorreatores (reatores biológicos) capazes
de produzir óleos, carboidratos e proteínas,
diferentes daqueles sintetizados natural-
mente pelas plantas. Esta nova aplicação
biotecnológica das plantas transgênicas é
conhecida internacionalmente como Plant
Molecular Farming. O termo agropecuária
molecular é o que melhor define esta ativi-
dade.
PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS
Proteínas heterólogas são proteínas ou
peptídios sintetizados em organismos di-
ferentes daqueles de sua origem. A neces-
sidade de produzir grandes quantidades,
ou ainda, de produzir proteínas livres de
contaminantes presentes no tecido origi-
nal, justifica a utilização de organismos ge-
neticamente modificados (OGMs) na pro-
dução de proteínas heterólogas. Este fato
adquire grande importância principalmente
no caso de proteínas ou peptídios humanos
utilizados como fármacos. Órgãos e plasma
humanos representam as fontes naturais
de proteínas, tais como, hormônios, fato-
res de coagulação sangüínea e albumina.
Devido ao alto risco de contaminação com
patógenos, principalmente de natureza viral,
várias destas proteínas naturais têm sido
substituídas por moléculas similares sinte-
tizadas em OGMs, denominadas proteínas
recombinantes. Deste modo, hoje podemos
encontrar em farmácias os hormônios re-
combinantes, como o do crescimento e in-
sulina humana, produzidos em bactérias.
As bactérias, devido a sua relativa sim-
plicidade, foram os primeiros seres vivos
manipulados geneticamente com o objetivo
de produzir proteínas heterólogas. Entre-
tanto, devido a propriedades intrínsecas
da síntese de proteínas em microorga-
nismos, as bactérias não constituem o sis-
tema mais apropriado para a produção de
proteínas humanas. Assim como os demais
seres vivos, elas sintetizam suas proteínas
através de um processo de polimerização
de aminoácidos, denominado de tradução.
A reação de polimerização ocorre através

1
Doutorando, UNICAMP-CBMEG, Caixa Postal 6010, CEP 13083-970 Campinas-SP.
2
Dr., Pesq. UNICAMP-CBMEG, Caixa Postal 6010, CEP 13083-970 Campinas-SP. E-mail: aleite@unicamp.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000

Biotecnologia
da formação de ligações peptídicas entre a
carboxila de um aminoácido e o grupo ami-
no da cadeia lateral do aminoácido subse-
qüente na cadeia protéica. Assim sendo,
as proteínas resultantes apresentam uma
extremidade contendo um grupo amino li-
vre, chamada N-terminal, e outra contendo
uma carboxila livre, chamada C-terminal. Já
a seqüência linear de aminoácidos ligados,
chamada de estrutura primária, determina a
identidade da proteína.
A tradução é realizada por ribossomos,
um complexo de ácidos nucléicos e pro-
teínas, e consiste na decodificação da se-
qüência nucleotídica de uma molécula de
ácido ribonucléico específico, denomina-
do mensageiro (mRNA), na seqüência de
aminoácidos. A tradução ocorre a partir da
extremidade N-terminal. Nas bactérias, o
aminoácido iniciador do processo de sín-
tese é obrigatoriamente uma molécula do
aminoácido metionina, modificada pela pre-
sença de um radical formil. Nos eucariotos,
por sua vez, a síntese protéica é iniciada
por uma metionina não-modificada. A gran-
de diferença entre os processos de síntese
protéica de bactérias e de eucariotos reside
no fato de que, nos organismos superiores,
os produtos da síntese podem sofrer mo-
dificações durante o processo de polime-
rização, ou após este processo. Dentre as
modificações mais freqüentes podemos
citar a proteólise e a adição de carboidratos
(glicosilação), fosfatos (fosforilação) e
grupos acil (acilação) (Bednarek & Raikhel,
1992). Estas modificações, conhecidas co-
mo pós-traducionais, constituem uma im-
portante etapa na produção de proteínas
em eucariotos. Em muitos casos, nestes
organismos, a atividade biológica das pro-
teínas depende de modificações pós-tradu-
cionais.
A proteólise, por exemplo, consiste na
hidrólise, catalisada por enzimas, da ligação
entre aminoácidos específicos. A maioria
das proteínas secretadas por células de eu-
cariotos sofre este tipo de processamento
simultaneamente com sua síntese. Estas
proteínas são sintetizadas por um conjunto
de ribossomos ligados ao retículo endo-
plasmático (RE). Inicialmente, a extremidade
N-terminal da cadeia nascente, contendo a
metionina inicial, é internalizada no sistema
de canais do RE, onde ela sofre proteólise
com a retirada de um peptídio de, aproxima-
damente, 20 aminoácidos, conhecido como
peptídio sinal, que é também responsável
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000
pelo direcionamento da proteína nascente
para o lume do RE. Esta proteólise pode
determinar alteração do aminoácido pre-
sente na extremidade N-terminal da proteí-
na. Como as bactérias não apresentam este
tipo de processamento pós-traducional, é
inevitável a presença de metionina na
extremidade N-terminal de suas proteínas.
Alguns bacilos apresentam um sistema de
processamento similar. Neste caso, as pro-
teínas sintetizadas apresentam um peptídio
na extremidade N-terminal, que é retirado
quando ocorre a transferência da proteína
do citoplasma bacteriano para uma região
compreendida entre a membrana e a parede,
denominada periplasma. No entanto, este
sistema apresenta baixo rendimento de pro-
dução de proteína, sendo pouco utilizado
na produção de proteínas heterólogas. Por-
tanto, na maioria das vezes, as proteínas
recombinantes produzidas em bactérias
apresentam metionina na extremidade
N-terminal. Para a obtenção de uma pro-
teína com seqüência primária idêntica à
seqüência nativa é necessário seu proces-
samento in vitro.
A agregação de proteínas desnaturadas
em estruturas denominadas corpúsculos de
inclusão representa outra dificuldade dos
sistemas de produção em bactérias. A ativi-
dade funcional das proteínas depende de
interações com outras moléculas. Por exem-
plo, a resposta fisiológica a um determinado
hormônio depende de seu reconhecimento
por uma molécula de uma proteína recepto-
ra presente na célula-alvo. O reconheci-
mento é mediado por contatos direcionais
entre as duas moléculas, e, portanto, de-
pende da estrutura tridimensional das
moléculas envolvidas na interação. Como
as proteínas heterólogas produzidas em
bactérias encontram-se desnaturadas, isto
é, sem uma estrutura definida, estas não
apresentam atividade funcional. Para a
obtenção de proteínas com atividade simi-
lar à das nativas, as proteínas recombinan-
tes produzidas em bactérias devem ser
obrigatoriamente submetidas a um pro-
cesso de renaturação. Nos organismos
superiores, inclusive em plantas, o enovela-
mento tridimensional das proteínas sin-
tetizadas direcionadas para o RE é assistido
por proteínas especializadas denominadas
chaperoninas. Adicionalmente, em muitos
casos, a estrutura tridimensional das pro-
teínas é estabilizada por ligações do tipo
ponte de dissulfeto entre resíduos de ami-
37
noácidos, cisteínas presentes nelas ou em
diferentes cadeias da proteína. A formação
destas pontes é catalisada pela enzima dis-
sulfeto isomerase, presente apenas no RE
de eucariotos (Galili et al., 1998). Podemos
concluir, portanto, que sistemas com base
em organismos eucarióticos estão melhor
equipados para a produção de proteínas
heterólogas.
As leveduras Saccharomyces cerevisae
e Pichia pastoris consistem em sistemas
eucarióticos muito utilizados na produção
de proteínas heterólogas. Apesar de este
tipo de sistema apresentar rendimentos tão
altos quanto os bacterianos, as proteínas
sintetizadas geralmente são extensamen-
te modificadas através de glicosilação. Al-
terações estruturais que determinam ins-
tabilidade e insolubilidade constituem
problemas adicionais deste sistema (Hig-
gins, 1995). Seqüências codificadoras de
proteínas heterólogas podem também ser
transferidas para células isoladas de insetos
e de mamíferos, através da infecção por ví-
rus. Culturas destas células podem ser utili-
zadas para a produção de proteínas hete-
rólogas em larga escala. Estes sistemas são
caracterizados pela capacidade de produzir
proteínas corretamente enoveladas e pela
sua habilidade de promover modificações
pós-traducionais, produzindo proteínas
com alto grau de identidade com as pro-
teínas nativas (Gray, 1995). No entanto, o
requerimento de meios de cultura com-
plexos e o emprego de reatores sofisticados
prejudicam sua utilização para produção de
proteínas em larga escala.
Recentemente, animais transgênicos
têm sido testados para a produção de pro-
teínas heterólogas. Um dos sistemas des-
critos direciona a produção das proteínas
recombinantes para o leite. Este sistema foi
inicialmente desenvolvido em camun-
dongos (Gordon et al., 1987). No entanto,
pode ser facilmente adaptado para animais
que apresentam maior rendimento na pro-
dução de leite, como: caprinos, ovinos e
bovinos. Devido à limitação da produção
em fêmeas em fase de lactação, métodos
alternativos que eliminam esta inconve-
niência têm sido propostos, como a pro-
dução em urina (Kerr et al., 1998) e esperma
(Dyck et al., 1999). A utilização de animais
transgênicos permite a síntese de proteínas
heterólogas de alta qualidade. Porém, a cul-
tura de células de mamíferos apresenta um
alto custo de produção.
38 Biotecnologia

As plantas, assim como os demais sis-
temas eucarióticos, são caracterizadas pela
presença de sistemas de modificação e
processamento pós-traducionais. O baixo
custo de obtenção de plantas transgêni-
cas e de produção de biomassa vegetal,
quando comparado com os custos rela-
tivos aos animais transgênicos, representa
uma grande vantagem deste sistema. O fato
de até o momento não ter sido encontrado
nenhum vírus de planta capaz de infectar o
homem, indica que as plantas constituem
um sistema de produção mais seguro para
a produção de fármacos protéicos.
DIFERENTES ESTRATÉGIAS PARA
A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS EM PLANTAS
A produção de proteínas recombi-
nantes em plantas pode ser realizada de
duas maneiras. Na primeira delas, o gene
que codifica a proteína heteróloga é in-
serido no genoma da planta. A integração
estável do gene torna possível a produção
permanente da proteína recombinante e a
transferência desta característica à pro-
gênie da planta transformada. Na segunda
estratégia, o gene que codifica a proteína
heteróloga é fusionado com o gene que
codifica a proteína da capa de um vírus de
Produção de proteínas para diferentes órgãos e compartimentos
heterólogas em plantas celulares, o período do desenvolvimento
transgênicas da planta, bem como, os níveis de produ-
A produção de proteínas heterólogas ção. Assim sendo, a elaboração desta fase
em plantas, a partir do gene integrado no depende do conhecimento de expressão
gênica em plantas, isto é, do conhecimento
genoma, pode ser dividida em cinco etapas
dos processos que envolvem a manifes-
principais:
tação do gene, resultando na produção da
a) inserção do gene que codifica a pro- proteína por ele codificada. Os genes são
teína heteróloga em um vetor de constituídos por uma região central, de-
transformação de planta; nominada estrutural, que compreende a
b) transformação da planta; seqüência nucleotídica que codifica a série
c) seleção e regeneração das plantas de aminoácidos que compõe a proteína. Nos
eucariotos, a região estrutural da maioria dos
transformadas;
genes é interrompida por regiões não-
d) análise das plantas regeneradas;
codificadoras denominadas íntrons. Por sua
e) extração, purificação e caracteriza- vez, as regiões codificadoras são denomi-
ção estrutural e funcional da pro- nadas exons (Fig. 19). O mesmo não ocorre
teína recombinante. nos procariotos, onde geralmente ocorre
A primeira etapa, correspondente à uma perfeita colinearidade entre a seqüência
inserção do gene que codifica a proteína nucleotídica do gene e dos aminoácidos na
heteróloga no vetor de transformação de proteína.
planta, deve ser precedida de um rigoroso A expressão gênica inicia-se no núcleo
planejamento. Esta fase deve levar em con- com a produção de uma molécula de mRNA,
ta o direcionamento da proteína sintetizada através de uma reação de polimerização ca-
Núcleo
não traduzida

não traduzida
planta. O vírus modificado é então utilizado
Es trutura l
Prom otor

Região 5'

Região 3'
para infectar plantas, onde rapidamente se
Região

multiplica, estabelecendo a produção do

conjunto de suas proteínas, incluindo a
proteína mista da capa com a proteína hete- Gene
róloga. Trata-se de uma produção transi-
tória, pois neste caso não ocorre a integra-
ìntro n IV
Íntro n II

Inton III
Íntro n I
E xon 1

E xon 2

E xon 3

E xon 4

E xon 5

Transcrito Transcrição
ção permanente do gene no genoma da Pro cessam en to
primário
planta. Neste sistema, a proteína recom- 7

M -Gppp- -AAAA...
binante deve ser recuperada a partir de
extratos de tecidos infectados através do "Splicing"
processamento da proteína da capa viral. mRNA
7

A produção de proteínas heterólogas a M -Gppp- -AAAA...

partir de genes integrados no genoma da
planta é mais trabalhosa e demorada que a
com base em sistemas virais. A primeira es- Citoplasm a R ib osso m o
tratégia envolve a obtenção de plantas trans- 7

M -Gppp- -AAAA...
gênicas, enquanto que na segunda a planta
funciona apenas como um veículo para a
amplificação das partículas virais. No entan- Tradu ção
to, a produção mediada por vírus apresenta
o inconveniente de determiná-la principal-
mente nas folhas, ao passo que a integração
permanente apresenta maior versatilidade,
Pro teín a
podendo dirigir a produção exclusivamente
para os diversos órgãos, tecidos e compar-
timentos celulares das plantas. Figura 19 - Diversas fases da expressão gênica

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000

Biotecnologia
talisada pela enzima RNA polimerase, deno-
minada transcrição (Fig. 19). Uma vez que
esta enzima utiliza a região estrutural como
molde para a polimerização, o mRNA pro-
duzido apresenta uma seqüência de ribo-
nucleotídeos com composição de bases
complementares a esta região. Inicialmente,
o mRNA produzido apresenta regiões com-
plementares aos íntrons e exons.
As diferentes células de um organismo
pluricelular apresentam o mesmo genoma,
sendo sua especialização dependente do
conjunto de genes que é expresso. Portan-
to, o controle da expressão gênica exerce
papel fundamental no desenvolvimento do
organismo, mediando os processos de di-
ferenciação e manutenção da atividade
celular. O controle da transcrição constitui
o primeiro ponto de regulação da expressão
gênica. As regiões que flanqueiam a região
estrutural dos genes encontram-se envol-
vidas neste controle inicial. O promotor,
localizado na extremidade 5' do gene, com-
preende a seqüência que antecede a região
estrutural. Esta região abrange seqüências
nucleotídicas específicas que indicam o
local para a ligação do complexo protéico
responsável pela atividade da RNA po-
limerase, e também o local para o início do
processo de transcrição (Fig. 19). O promo-
tor apresenta adicionalmente seqüências-
alvo para outros fatores protéicos com
capacidade de modular a atividade trans-
cricional. Tais fatores não são considerados
essenciais para a transcrição, pois este pro-
cesso pode ocorrer, ainda que geralmente
em níveis baixos, na sua ausência. Estes
elementos reguladores agem ativando ou
inibindo a transcrição em resposta a di-
versos estímulos, e são responsáveis pelo
controle diferencial dos níveis de expressão
gênica nos diversos tecidos, e diferentes
estádios de desenvolvimento. Dessa forma
os promotores respondem pela tecido-es-
pecificidade da expressão.
Localizadas posteriormente na região
estrutural dos genes, portanto na extremi-
dade 3', encontram-se as seqüências espe-
cíficas que determinam o final do processo
de transcrição. Finalizada a transcrição,
ainda no núcleo, as regiões dos íntrons são
retiradas e as correspondentes aos exons
são ligadas, em um processo conhecido
como mRNA splicing. A maturação do
mRNA completa-se através da adição de
uma guanosina metilada na extremidade 5',
e da adição de um número variável de ade-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000
ninas na extremidade 3'. As adeninas, em
número de 100 a 200, são adicionadas por
uma polimerase específica e constituem a
cauda de poli-A. A partir deste momento,
o mRNA maduro está pronto para deixar o
núcleo, transferindo-se para o citoplasma,
onde por sua vez servirá como molde para
a síntese protéica (Fig. 19).
A transferência de genes que codificam
proteínas heterólogas de interesse, visan-
do sua produção em plantas, deve levar
em conta os diferentes aspectos da expres-
são gênica discutidos anteriormente. De
modo geral, o gene de interesse é incluído
em um cassete de expressão, onde ele será
flanqueado por um promotor e uma região
de terminação, ambos originários de genes
de plantas. Os níveis de expressão e o local
do acúmulo, órgão ou tecido, da proteína
heteróloga, são os principais fatores que
prevalecem na escolha do promotor. Atual-
mente, existe um grande número de pro-
motores de plantas disponíveis, sendo que
a opção por um deles dependerá da estra-
tégia a ser empregada na produção da pro-
teína heteróloga. Portanto, dependendo do
promotor escolhido, podemos dirigir a
produção da proteína recombinante espe-
cificamente para os diferentes órgãos das
plantas, ou ainda, para a planta inteira. O
promotor do transcrito 35S do vírus do mo-
saico da couve-flor (P35S CaMV) e seus
derivados encontram-se entre os mais uti-
lizados na produção de proteínas heteró-
logas em plantas (Kusnadi et al., 1997).
Apesar de ser considerado um promotor
constitutivo, isto é, capaz de promover a
expressão de forma generalizada na planta,
o P35S CaMV apresenta atividade variá-
vel nos diversos tecidos, sendo mais ativo
em folhas. A região promotora do gene que
codifica a ubiquitina de milho, também um
promotor constitutivo, foi utilizada na
produção de avidina (Hood et al., 1997),
β-glicoronidase (Witcher et al., 1998) e apro-
tinina (Zhong et al., 1999). A utilização
deste promotor nestes casos resultou no
acúmulo de altos níveis das proteínas hete-
rólogas em embriões de milho. A avidina,
glicoproteína encontrada na clara de ovos
de aves, répteis e anfíbios, é utilizada na
produção de reagente para uso em imu-
noensaios. A avidina recombinante cons-
titui a primeira proteína produzida em plan-
tas disponível comercialmente (Sigma).
As folhas não são órgãos adequados
para o armazenamento de proteínas re-
39
combinantes, pois seus tecidos apresentam
grande quantidade de água e alta atividade
hidrolítica, resultando em baixa estabilidade
da proteína produzida. No entanto, as se-
mentes apresentam tecidos especializados
capazes de armazenar proteínas de forma
eficiente durante longos períodos. Apesar
desta vantagem, até o momento poucos
sistemas com base na expressão específica
em sementes foram descritos. Para exem-
plificar a produção de proteínas heterólogas
especificamente em sementes, descreve-
mos, a seguir, a construção de um cassete
de expressão que desenvolvemos para a
produção de hormônio do crescimento hu-
mano (hGH) em plantas transgênicas (Leite
et al., 2000).
Uma cópia da seqüência de DNA codi-
ficador (cDNA) do hGH foi obtida através
de um processo inverso ao da transcri-
ção. Este processo de polimerização utiliza
mRNA como molde, e é catalisado pela en-
zima transcriptase reversa originária de
retrovírus. A seqüência resultante, por ser
complementar ao mRNA maduro, não apre-
senta os íntrons. O fragmento de DNA cor-
respondente ao hGH foi isolado de uma
coleção de cDNAs (biblioteca de cDNA)
feita através de transcrição reversa de mRNAs
preparados a partir de hipófise humana. A
seqüência nucleotídica que codifica o
peptídio sinal (PS) do hGH natural foi subs-
tituída por uma seqüência equivalente,
previamente descrita em uma proteína de
reserva de semente de Coix lacryma-jobi
(Ottoboni et al., 1993). Esta substituição
resultou na produção do fragmento PSc-
hGH (Fig. 20), e teve como objetivo garantir
o direcionamento da proteína produzida
para o RE, que, conforme descrito ante-
riormente, apresenta as condições neces-
sárias para o correto processamento e eno-
velamento estrutural da proteína recém-
sintetizada.
À extremidade 5' do fragmento PSc-
hGH foi adicionado o promotor do gene
que codifica γ-kafirina (PKAF), uma pro-
teína de reserva de semente de sorgo (Fig.
20). As proteínas de reserva acumulam-se
em grandes quantidades nas sementes,
onde constituem fontes de nitrogênio e
enxofre a ser utilizadas nos primeiros está-
dios do desenvolvimento das plântulas.
Devido aos altos níveis de expressão pro-
porcionados por seus promotores, os ge-
nes que codificam proteínas de reserva de
sementes representam excelente fonte de
40 Biotecnologia

Figura 20 - Diagrama do plasmídeo pPGK-hGH

NOTA: O cassete de expressão utilizado na expressão de hGH recombinante em sementes de tabaco é mostrado como um inserto da
região de T-DNA do vetor binário pBI131 (Clontech). No vetor, o gene seletivo np tII (neomicina-fosfotransferase II), que
promove resistência ao antibiótico kanamicina, e o gene repórter gus (β-glicoronidase), são controlados pelos promotores
PNOS (nopalina sintase) e PRBS (ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase), respectivamente. As bordas direita e esquerda do T-DNA
estão representadas por BD e BE, respectivamente. A região 3’ do gene da nopalina-sintase (3’NOS), contendo sinal e sítio de
poliadenilação, flanqueia os genes nptII e gus, enquanto uma região similar do transcrito 35S do vírus do mosaico da couve-
flor flanqueia o gene hGH. A seqüência primária do peptídio-sinal de Coix inserido na extremidade amino-terminal do hGH
é mostrada como um inserto no cassete de expressão.

promotores para a produção de proteínas
heterólogas em sementes. Na extremida-
de 3' do fragmento PSc-hGH, adicionou-se
um fragmento de DNA correspondente à
região de terminação do transcrito 35S do
vírus do mosaico da couve-flor (3’35S) (Fig.
20). Posteriormente, o fragmento PKAF-
PSc-hGH-3’35S, resultante das adições
das seqüências reguladoras ao fragmento
PSc-hGH, foi inserido na região do T-DNA
do plasmídeo pBI131 (Clontech), vetor uti-
lizado na transformação de plantas me-
diada por agrobactéria, resultando no plas-
mídeo pPGK-hGH. A Figura 20 mostra
que a região do T-DNA, flanqueada pe-
los bordos direito (BD) e esquerdo (BE),
inclui também os genes que codificam a
neomicina-fosfotransferase II (NPT II), e
β-glicoronidase (GUS), controlados pelos
promotores PNOS (nopalina sintase) e
PRBS (ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase),
respectivamente. Portanto, a integração do
T-DNA, contendo o cassete de expressão,
para o genoma da planta, propicia a pro-
dução de três novas proteínas. Duas delas,
a NPT II, que confere resistência ao an-
tibiótico kanamicina, e GUS, uma enzima
cuja atividade é facilmente detectável, são
produzidas em toda a planta devido à uti-
lização de promotores constitutivos. A re-
sistência ao antibiótico kanamicina é muito
útil na fase de seleção das plantas sub-
metidas ao processo de transformação. Por
outro lado, a atividade de GUS é utilizada
como um indicador para confirmação da
transferência do T-DNA. Detalhes relati-
vos ao método de transferência, media-
do por agrobactéria, e seleção das plantas
transformadas podem ser encontrados em
Leite et al. (2000), e em outros artigos desta
revista.
A análise de extratos protéicos de di-
versos órgãos de plantas de tabaco trans-
formadas com o plasmídeo pPGK-hGH,
demonstrou que o promotor de γ-kafirina
foi capaz de dirigir a produção de hGH de
forma exclusiva para as sementes. O se-
qüenciamento da extremidade N-terminal
do hGH recombinante produzido em se-
mentes resultou em seqüência idêntica à
descrita para o hormônio maduro (Leite et
al., 2000), comprovando o direcionamento
do hormônio recombinante para o RE, e seu
concomitante processamento. Demons-
tramos ainda que extratos das sementes de
tabaco transgênico competem com hor-
mônio natural em ensaios de ligação com
receptores específicos. Posto que o reco-
nhecimento pelos receptores depende da
estrutura tridimensional das moléculas en-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000
volvidas, este resultado representa uma
clara indicação do correto enovelamento e
da funcionalidade do hormônio recom-
binante sintetizado nas sementes de tabaco
(Leite et al., 2000).
A rizosecreção, isto é, a secreção de
proteínas recombinantes em exsudatos de
raízes é outro exemplo de sistema de ex-
pressão de proteínas heterólogas em plan-
tas. São utilizados promotores de genes
específicos de raízes, e a secreção da proteí-
na recombinante depende da adição de um
peptídio-sinal capaz de endereçar a pro-
teína para o RE. Borisjuk et al. (1999) demons-
traram a eficiência deste sistema produ-
zindo altos níveis de proteína fluorescente
de água viva (GFP), fosfatase alcalina de
placenta humana e de uma xilanase bacte-
riana no meio hidropônico em que plantas
transgênicas de tabaco foram cultivadas.
O custo da extração e purificação das
proteínas heterólogas pode representar
sérias limitações no emprego de plantas
transgênicas como biorreatores. Com o
objetivo de reduzir tais custos foram desen-
volvidas estratégias alternativas. Uma de-
las baseia-se na inserção do polipeptídio
de interesse em uma proteína portadora. O
direcionamento da proteína sintetizada,
neste caso, é realizado pelo PS presente na
Biotecnologia
proteína portadora. Esta estratégia foi uti-
lizada na produção de encefalina inserida
na albumina 2S de Arabidopsis thaliana
(Vandekerckhove et al., 1989), e do anti-
coagulante hirudina inserido em oleosi-
na (Parmenter et al., 1995). Os sinais de
endereçamento presentes nas proteínas
portadoras de albumina 2S e oleosina dire-
cionaram as proteínas recombinantes para
os corpúsculos protéicos e lipídicos, res-
pectivamente. As oleosinas são proteínas
associadas às membranas dos corpúsculos
lipídicos em sementes. A grande vantagem
deste sistema reside no fato de que os cor-
púsculos lipídicos e proteínas associadas
são facilmente purificados por flotação
através de centrifugação. Os resultados
descritos na produção de hirudina em
sementes de Brassica napus demonstraram
a eliminação de mais de 90% das proteínas
contaminantes (Parmenter et al., 1995).
PLANTAS TRANSGÊNICAS
COMO BIORREATORES PARA A
PRODUÇÃO DE FÁRMACOS
PROTÉICOS
Devido às diversas características des-
critas anteriormente, a utilização de plantas
como biorreatores apresenta grande in-
teresse para a produção de proteínas e
peptídios utilizados como fármacos. Plan-
tas transgênicas estão sendo testadas na
produção de anticorpos (Smith, 1996),
antígenos vacinais (Mason & Arntzen,
1995 e Mor et al., 1998), hormônios (Vander-
kerckohove et al., 1989, Matusumoto et al.,
1995 e Leite et al., 2000), soroalbumina hu-
mana (Sijmons et al., 1990), peptídios an-
ticoagulantes (Parmenter et al., 1995) e enzi-
mas (Cramer et al., 1996).
Os anticorpos ou imunoglobulinas são
proteínas multiméricas complexas, cuja fun-
ção primária é o reconhecimento e ligação
a antígenos. Em plantas, a produção de anti-
corpos pode ter aplicações tanto in situ
quanto ex situ (Whitelam & Cockburn,
1996). Na aplicação in situ, o anticorpo re-
combinante age como um reagente na pró-
pria célula em que é sintetizado, podendo,
portanto, ser utilizado com o objetivo de
modular a atividade in vivo de um deter-
minado antígeno, ou ainda, como uma
forma de promover imunização intracelular
contra patógenos. A produção de anti-
corpos em plantas transgênicas para uso
ex situ compreende uma grande variedade
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.36-42, maio/jun. 2000
de aplicações, tais como: controle de polui-
ção ambiental, produção de reagentes indus-
triais, sensores moleculares, reagentes para
diagnóstico, soros contra toxinas e vene-
nos, inibidores de infecções e infestações,
contraceptivo e terapias contra câncer. A
maioria das aplicações dos anticorpos
requer grandes quantidades, sendo, por-
tanto, seu uso limitado pelo rendimento dos
sistemas de produção. Entretanto, a utiliza-
ção de plantas tem dado novo estímulo ao
emprego de anticorpos recombinantes. As
plantas, além de apresentarem alto rendi-
mento de produção, até o momento consti-
tuem-se no único sistema de expressão
capaz de produzir anticorpos completos
funcionais. Este fato foi demonstrado de
forma definitiva com a produção de um
anticorpo do tipo IgA em tabaco (Ma et al.,
1995). Imunoglobulinas do tipo IgA são
anticorpos diméricos, e correspondem à
principal classe de anticorpos presentes em
secreções como saliva, lágrima, leite e se-
creções do sistema respiratório e digestivo.
O anticorpo IgA produzido reconhece a
adesina de Streptococcus mutans, agente
causal da cárie dentária, e poderá ser uti-
lizado como aditivo anticárie em den-
tifrícios.
A produção de vacinas orais e nasais
constitui outra aplicação promissora das
plantas transgênicas. A produção de an-
tígenos vacinais em plantas apresenta
grandes vantagens de custo e, no caso de
plantas comestíveis, permite a inoculação
da vacina diretamente através da ingestão,
sem a necessidade de purificação e proces-
samento prévio. Adicionalmente, as vaci-
nas orais e nasais requerem meios menos
sofisticados de administração, redução no
número e treinamento do pessoal envolvi-
do em campanhas de vacinação em massa.
Mason et al. (1992) inauguraram este cam-
po de aplicação das plantas transgênicas,
descrevendo a produção de um antígeno
de superfície do vírus da hepatite B em
tabaco. Thanavala et al. (1995) demons-
traram que o antígeno produzido em plan-
tas é capaz de promover resposta imune
idêntica àquela do antígeno recombinante
produzido em leveduras. Com base nestes
resultados, a empresa inglesa Axis Gene-
tics iniciou, em 1999, a primeira fase de tes-
tes clínicos de uma vacina oral contra he-
patite B, utilizando batatas transgênicas.
As plantas transgênicas foram tam-
bém testadas na produção de antígenos
41
de maior complexidade estrutural. Desta
forma, foram produzidos os antígenos bac-
terianos vacinais: toxina termolábil (LT) de
Escherichia coli (Haq et al., 1995) e toxina
colérica (CT) de Vibrio cholerae (Arakawa
et al., 1998). Estas toxinas apresentam es-
truturas similares, são proteínas hexaméri-
cas constituídas por uma subunidade A,
que se associa com uma estrutura em forma
de argola formada por subunidades B. Haq
et al., (1995) demonstraram a formação
espontânea de estruturas pentaméricas de
LT-B em batatas transgênicas. Posterior-
mente, utilizando uma nova linhagem de
batata transgênica, o mesmo grupo de-
monstrou forte resposta imune e proteção
parcial em camundongos (Mason et al.,
1998) e em humanos (Tackett et al., 1998).
O emprego de plantas comestíveis na
produção de vacinas merece cuidados,
especialmente com relação à dosagem. O
uso excessivo ou inadequado pode induzir
tolerância aos antígenos.
Vantagens da utilização de
plantas transgênicas como
biorreatores
As plantas são capazes de produzir
proteínas com estruturas complexas a um
baixo custo. Além de representarem a bio-
massa mais barata da natureza, as plantas
geralmente não contêm proteínas homólo-
gas às dos animais, o que permite o emprego
de processos menos complexos e dispendio-
sos na purificação das proteínas recombi-
nantes. No entanto, o emprego de plantas
transgênicas é especialmente interessante na
produção de fármacos protéicos, devido ao
baixo risco de contaminação por patógenos.
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Biotecnologia 43

Doenças de plantas e biologia molecular

Francisco Murilo Zerbini 1
Sérgio Hermínio Brommonschenkel 2
Luis Artur Costa do Vale 3
Luciana P. Ambrozevícius 4
Acelino Couto Alfenas 5

Resumo - O impacto da biotecnologia na diagnose, na caracterização e no controle de

doenças de plantas está apenas começando a ser percebido. A tecnologia de DNA recom-
binante, a produção de plantas transgênicas e as técnicas de clonagem posicional de
genes vêm sendo utilizadas na produção de plantas resistentes a doenças, no desen-
volvimento de métodos de diagnose extremamente sensíveis e precisos, e em estudos
básicos de caracterização de fitopatógenos, principalmente os vírus. Marcadores
moleculares são ferramentas extremamente úteis em programas de melhoramento
genético, visando resistência a doenças, diminuindo o tempo necessário para obtenção
de cultivares com características agronômicas desejáveis. Genes de resistência
encontrados em espécies selvagens já foram clonados e transferidos para espécies
cultivadas, inclusive para aquelas pertencentes a gêneros afins. Plantas transgênicas
resistentes a vírus já vêm sendo plantadas em escala comercial nos Estados Unidos
desde 1996, e estão em fase de testes no Brasil. Métodos de diagnose, como a reação em
cadeia da polimerase (PCR), são utilizados rotineiramente na detecção de diversos
fitopatógenos, como os geminivírus. O seqüenciamento completo ou parcial de genomas
virais é parte fundamental da caracterização de vírus de plantas. Todas essas aplicações
visam, em última análise, à melhoria das condições de sanidade das plantas e,
conseqüentemente, ao aumento da produção de alimentos.
Palavras-chave: Plantas transgênicas; Marcadores moleculares; RDP; Diagnose
molecular; Taxonomia molecular.

INTRODUÇÃO
As aplicações da biotecnologia em Fito-
patologia vão desde o auxílio em estudos
básicos de caracterização de fitopatóge-
nos até o desenvolvimento de métodos
diagnósticos mais sensíveis e precisos.
Além disso, uma das principais caracte-
rísticas buscadas em plantas transgênicas
é a resistência a doenças, principalmente
viroses. De modo geral, a virologia é a área
de Fitopatologia que mais tem-se bene-
ficiado dos avanços na Biologia molecular,
uma vez que a caracterização molecular de
vírus de plantas é relativamente simples,
devido ao pequeno tamanho dos genomas
virais e à facilidade de sua obtenção em
forma pura. O objetivo deste artigo é in-
formar a respeito de aplicações gerais da
biotecnologia na Fitopatologia. Essas apli-
cações incluem basicamente o uso de mar-
cadores moleculares no melhoramento para
resistência a doenças, clonagem de genes
de resistência a partir de espécies culti-
vadas e sua introdução em outras cultiva-
res/espécies, produção de plantas transgê-
nicas resistentes a vírus, desenvolvimento
de técnicas de diagnose molecular de fito-
patógenos, como a hibridização molecular
e a reação em cadeia da polimerase (PCR),
e taxonomia molecular.
RESISTÊNCIA GENÉTICA
NO CONTROLE DE DOENÇAS
DE PLANTAS
O plantio de cultivares resistentes
constitui o método mais desejável para o
controle de doenças de plantas. Sua ado-
ção pelos agricultores é simples, barata e
permite que continuem explorando a cultu-
ra de seu interesse apenas substituindo
a cultivar suscetível por outra resistente. É
um método de controle que apresenta a

1
Engo Agro, Ph.D., Prof. Adj. UFV - Depto Fitopatologia, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: zerbini@mail.ufv.br
2
Engo Agro, Ph.D., Prof. Adj. UFV - Depto Fitopatologia, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: shbromo@mail.ufv.br
3
Engo Agro, M.Sc. UFV - Depto Fitopatologia, CEP 36571-000 Viçosa-MG.
4
Engo Agro, UFV - Depto Fitopatologia, CEP 36571-000 Viçosa-MG.
5
Engo Florestal, Ph.D., Prof. Tit. UFV - Depto Fitopatologia, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: aalfenas@mail.ufv.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000

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vantagem de reduzir a utilização de agro-
tóxicos na agricultura e a conseqüente con-
taminação do ambiente. Entretanto, a
obtenção de uma cultivar resistente não é
tão simples quanto a sua utilização pelo
agricultor.
A obtenção de uma variedade comercial
com resistência a uma ou mais doenças é
demorada e trabalhosa. Envolve a iden-
tificação de fontes de resistência, muitas
vezes presentes apenas em germoplasma
selvagem repleto de características inde-
sejáveis, o cruzamento deste germoplasma
com o material comercial e os retrocruza-
mentos das plantas resistentes selecio-
nadas das progênies com o progenitor
recorrente, visando restabelecer as carac-
terísticas agronômicas desejáveis e manter
a característica de resistência. Muitas
vezes, aquelas indesejáveis, fortemente
ligadas ao gene de resistência, impedem
que se atinja esse objetivo. Por razões ope-
racionais, usualmente aqueles genes de
resistência com efeito fenotípico marcante,
que permite separar qualitativamente as
plantas em duas classes discriminantes
(resistentes ou suscetíveis), atraem a aten-
ção dos melhoristas. Além da facilidade
de seleção, esse tipo de resistência é, na
maioria das vezes, monogênica, o que fa-
cilita também a sua incorporação em varie-
dades comerciais. Entretanto, o plantio
continuado de variedades contendo esses
genes, cujo efeito é quase sempre raça-
específico, exerce uma pressão de seleção
sobre a população do patógeno, levando à
predominância de raças capazes de atacar
essas plantas e forçar o início de um novo
ciclo para se obter uma variedade resistente
à nova raça predominante.
Ao contrário da resistência monogê-
nica, que já foi extensivamente estudada e
manipulada por fitopatologistas, melho-
ristas e geneticistas, outras formas mais
complexas de resistência, como por exem-
plo a horizontal, ainda são pouco com-
preendidas (Geiger & Heun, 1989). A fer-
ramenta para o estudo dessa resistência
complexa era apenas a genética quantitativa
6
Maiores informações sobre marcadores moleculares ver o artigo, Aplicação de marcadores moleculares no melhoramento genético, nesta
publicação.
clássica, que não permitia dissecar a resis-
tência poligênica em loci discretos ou
identificar o papel de genes individuais na
resistência (Young, 1996). Assim, apesar
de em muitos casos essa resistência mos-
trar ação não raça-específica, os fitopato-
logistas e melhoristas não tentaram intro-
duzi-la em variedades comerciais por ela
ser quantitativa, o que torna o processo de
seleção mais difícil e exige maior controle
das condições experimentais, e por acre-
ditar-se que, caso ela fosse governada por
muitos genes de efeito pequeno, isso difi-
cultaria sobremaneira a transferência dessa
característica.
TÉCNICAS MOLECULARES
NO MELHORAMENTO
VISANDO À OBTENÇÃO
DE CULTIVARES RESISTENTES
As técnicas moleculares encontram
grande aplicação no estudo e incorporação
em cultivares comerciais de resistência
monogênica raça-específica, bem como de
resistência quantitativa.
Resistência monogênica
A disponibilidade de marcadores mole-
culares ligados a genes de resistência pode
ser de grande utilidade para o melhora-
mento. O primeiro passo para a sua identi-
ficação é a escolha da fonte de resistência
a ser estudada (progenitor resistente) e de
uma cultivar suscetível com a qual esta será
cruzada para a obtenção de uma progênie
segregante (F2, retrocruzamento, linhagens
recombinantes – RILs, etc.). Definidos os
progenitores, detectam-se marcadores6
RAPD, RFLP, AFLP, microssatélites etc.,
polimórficos entre os progenitores resis-
tente e suscetível e analisam-se as segrega-
ções destes e da resistência em uma progê-
nie segregante. Os marcadores fortemente
ligados ao gene de resistência co-segregam
com a resistência.
A técnica de análise de bulks segre-
gantes (BSA) (Michelmore et al., 1991)
associada a marcadores RAPD tem-se
mostrado de grande utilidade na identi-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
Biotecnologia
ficação de marcadores ligados a genes que
conferem resistência a doenças. Nessa
técnica, amostras de DNA de indivíduos
da progênie segregante que apresentam o
mesmo fenótipo (R - resistente, ou S - sus-
cetível, no caso) são misturadas em quan-
tidades eqüimolares, após o que as duas
misturas são amplificadas com vários oli-
gonucleotídeos. Ambos os bulks R e S
usualmente contêm quantidades aproxi-
madas de DNA molde para aqueles marca-
dores que não estão fortemente ligados
ao loco que confere resistência. Logo, a
maioria dos marcadores será amplificada de
forma idêntica nos dois bulks. Entretanto,
os marcadores RAPD ligados ao gene de
resistência mostrar-se-ão intensos no bulk
R e fracos ou ausentes no bulk S, e apenas
estes serão avaliados em toda a progênie
para a confecção de um mapa localizado
com base na co-segregação destes e da
resistência. A técnica de BSA é particular-
mente útil, quando usada com marcadores
RAPD, porque muitos oligonucleotídeos
podem ser testados em busca de polimor-
fismos entre os dois bulks, com muita efi-
ciência.
Marcadores fortemente ligados a um
determinado gene R podem ser utilizados
para a seleção indireta das plantas resis-
tentes em um programa de melhoramento
utilizando a mesma fonte de resistência, com
base na presença ou não do marcador cor-
respondente (Kelly, 1995). Essa técnica
mostrar-se-á mais útil para aqueles casos
em que a avaliação de doença é difícil ou
não pode ser feita precocemente. A deter-
minação da presença do marcador pode ser
feita ainda em plântulas, eliminando a ne-
cessidade de manutenção de plantas que
não contêm o gene R e, portanto, não inte-
ressam ao melhorista.
Dispondo dos marcadores adequados,
a introdução de genes R de várias fontes
seria bem menos demorada e trabalhosa.
Utilizando marcadores ligados aos genes
que se deseja incorporar, a introdução de
genes de resistência (genes R) efetivos
contra diferentes raças do patógeno, ori-
Biotecnologia
ginários de diversas fontes, em uma mesma
cultivar (piramidamento de genes R), po-
deria ser feita sem se testar uma mesma
planta contra vários isolados do patógeno.
O mesmo raciocínio aplica-se para a intro-
dução de resistência a diferentes pató-
genos em uma mesma cultivar. Marcadores
dispersos ao longo do genoma poderiam
ser usados para selecionar contra o genoma
do progenitor doador (fonte de resistência),
reduzindo o número de retrocruzamentos
necessários para recompor o genoma do
parental recorrente (cultivar comercial).
Utilizando marcadores que flanqueiam um
gene R, pode-se monitorar a recombina-
ção nessas regiões e eliminar rápido e efi-
cientemente o DNA residual indesejável
associado ao gene (linkage drag). Estima-
se que utilizando esse procedimento con-
siga-se, em duas gerações, uma quantidade
de DNA residual associada ao gene R tão
pequena que só seria obtida após 100 ge-
rações de retrocruzamento convencional
(Young & Tanksley, 1989). Com essas técni-
cas, cultivares com genes R de especifi-
cidades diferentes poderiam ser obtidas
mais rapidamente, podendo ser utilizadas
para a rotação de genes R e plantios de
misturas de cultivares ou multilinhas, que
são estratégias para a obtenção de resis-
tência durável a partir de genes R raça-
específicos.
A obtenção de marcadores muito pró-
ximos ao gene de resistência por meio de
um mapeamento de alta resolução é também
o primeiro passo para a clonagem do gene
com base em mapeamento genético. Este
processo já foi realizado na Universidade
Federal de Viçosa (UFV) para o gene Sw-5
(Fig. 21), que confere resistência ao com-
plexo viral que causa o vira-cabeça-do-
tomateiro (Tomato spotted wilt virus,
TSWV; Groundnut ringspot virus, GRSV;
Chrysanthemum stem necrosis virus,
CSNV; e Tomato chlorotic spot virus,
TCSV) (Brommonschenkel et al., 1997), e
está sendo realizado para o gene de resis-
tência à ferrugem do eucalipto (Puccinia
psidii), para o qual já se dispõe de marca-
dores RAPD fortemente ligados (Junghans
et al., 1999).
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
45
Resistência quantitativa vado no loco em questão, e assim utilizar
Algumas características quantitativas, um teste estatístico para determinar se há
que mostram uma distribuição contínua em diferença entre os indivíduos das dife-
uma população segregante, por vezes são rentes classes quanto à característica quan-
controladas, em grande proporção, por um titativa mensurada. Quando há diferença
número pequeno de locos. A análise ge- significativa, assume-se que um gene ou
nética utilizando marcadores moleculares genes que afetam tal característica estão
e mapas de ligação pode elucidar o número fisicamente ligados ao marcador utilizado
e a localização desses locos que controlam para subdividir a população. A análise é
características quantitativas, denominadas repetida para todos os outros marcadores
quantitative trait loci (QTLs) (Tanksley, dispersos pelo genoma para identificar o
1993). Se um pequeno número de QTLs maior número possível de QTLs. Como não
(1-3) explicar grande parte da variância é possível determinar se o efeito é devido a
fenotípica, a característica pode ser traba- um gene ou a genes ligados, o termo QTL
lhada como se fosse qualitativa, utilizando designa uma região do cromossomo, defi-
seleção assistida por marcadores. nida pela ligação a um marcador molecular,
A análise de QTLs é realizada em po- que tem um efeito significativo sobre uma
pulações segregantes (retrocruzamento, característica quantitativa (Tanksley, 1993).
F2/F3, RILs), derivadas de cruzamentos Estudos recentes demonstraram que a
controlados entre pais contrastantes para resistência quantitativa é devida, em grande
a característica que se deseja estudar. São parte, a poucos QTLs (até cinco na maioria
obtidos marcadores moleculares polimór- dos casos) de efeito pronunciado, contra-
ficos entre os pais e segregantes na popu- riando a expectativa de muitos genes de
lação estudada. O princípio básico da aná- pequeno efeito. Alguns desses QTLs são
lise é a partição da população em classes raça-específicos e outros não. Alguns ge-
genotípicas para cada loco marcador (ho- nes identificados como participantes de um
mozigoto para o alelo do pai resistente, he- fenótipo de resistência quantitativa ma-
terozigoto, homozigoto para o alelo do pai peiam nas mesmas regiões que genes R de
suscetível), com base no fenótipo obser- efeito maior anteriormente caracterizados,
F2
P1 P2 F1 R R R S R S R R R R R R R S R R R R R R S R
Figura 21 - Detecção do gene Sw-5 por meio de ensaio com base em PCR
NOTA: O DNA genômico foi extraído de plântulas, amplificado com um par de primers específico
para uma região ligada ao gene. Posteriormente, o produto da amplificação foi clivado
com uma enzima de restrição que revela polimorfismo genético entre plantas resistentes
e suscetíveis. P1 - Progenitor suscetível; P2 - Progenitor resistente; R - Plantas resistentes;
S - Plantas suscetíveis. Este ensaio permite a distinção de plantas resistentes homozigotas
das heterozigotas.
46
sugerindo que estes também podem atuar
na resistência poligênica. A descoberta de
que poucos QTLs respondem pela maior
parte da resistência estimula a tentativa
de transferir esses QTLs para variedades
suscetíveis, por meio de seleção assistida
por marcadores ligados a esses QTLs ou,
no futuro, pela transformação de plantas
diretamente com os genes clonados de
maior efeito. O piramidamento desses ge-
nes pode levar a um controle efetivo da
doença, com amplo espectro de ação sobre
as diferentes raças do patógeno.
Teoricamente, a seleção assistida por
marcadores é superior aos métodos con-
vencionais, quando a fração da variância
aditiva explicada por eles supera a herda-
bilidade da característica. Essa técnica
suplementará, mas não substituirá os mé-
todos tradicionais, e será mais útil para
características controladas por poucos lo-
cos, cuja avaliação pelos métodos clás-
sicos seja cara ou difícil, assim como para
patógenos, é difícil estabelecer condições
de infecção uniformes para um screening
preciso rotineiramente, mas que podem ser
conseguidas em um experimento bem
controlado para o mapeamento dos locos
envolvidos (Mehlenbacher, 1995).
CLONAGEM DE GENES E
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
Vários genes de resistência já foram
isolados e clonados a partir de cultivares
comerciais de diversas espécies de plantas,
abrindo-se novas possibilidades para a
obtenção de plantas resistentes. Indepen-
dente da origem e do patógeno a que con-
ferem resistência, a maioria dos genes R
clonados apresenta domínios comuns,
possivelmente envolvidos no reconhe-
cimento de elicitores do patógeno e de uma
cascata de sinais que levará à ativação de
genes de defesa, caracterizando a resposta
resistente (Hammond-Kosack & Jones,
1997). A transformação de uma variedade
comercial suscetível diretamente com um
gene R clonado pode ser feita por meio da
bactéria Agrobacterium tumefaciens, a
qual é capaz de incorporar um DNA exóge-
no ao genoma da planta. Poder-se-ia des-
sa forma introduzir os genes de resistência
sem causar alterações significativas na
composição genética da variedade co-
mercial, o que pouparia grande quantidade
de tempo e trabalho . Pela transformação
genética, é possível transferir genes de
resistência mesmo entre espécies incom-
patíveis. A chance de sucesso é maior,
quando as espécies envolvidas são taxo-
nomicamente próximas. Essa técnica é
muito importante para doenças, para as
quais não há fontes de resistência dispo-
níveis na própria espécie ou em espécies
compatíveis, o que impede o melhoramen-
to convencional. Na UFV, o gene Sw-5,
originário de uma espécie não-domestica-
da de tomate (Lycopersicon peruvianum),
foi introduzido com sucesso em fumo via
transformação genética (Fig. 22, p.64). As
plantas transgênicas mostraram resistên-
cia a alguns isolados de Tospovirus que
causam essa doença, mas não a outros
(Brommonschenkel et al., 1998). Estão
sendo conduzidos trabalhos para a incor-
poração desse gene em alface, para a qual
não foram identificadas fontes de resis-
tência ao vira-cabeça.
Além da transferência de genes entre
plantas, a transformação genética permite
que se utilizem genes de outros organismos
para tornar as plantas resistentes. Podem-
se produzir, por exemplo, plantas trans-
gênicas que expressem compostos antimi-
crobianos que aumentem a sua resistência
a doenças, ou que expressem parte do ge-
noma de um fitovírus e passem a ser resis-
tentes a este. Outra possibilidade é aumen-
tar os mecanismos de defesa já presentes
na própria planta, como, por exemplo,
produzindo plantas transgênicas que apre-
sentem resistência sistêmica adquirida de
forma constitutiva ou que produzam maior
quantidade de fitoalexinas (Michelmore,
1995, Baulcombe, 1996, Swords et al., 1997
e Jung & Wyss, 1999).
Apesar de todas as possibilidades cria-
das pelas técnicas de Biologia molecular
para se obter resistência de plantas a doen-
ças, provavelmente nenhuma delas con-
duzirá à obtenção de uma resistência eterna,
sem risco de ser superada pelo patógeno.
A grande vantagem dessas técnicas é
reduzir o tempo necessário para a criação
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
Biotecnologia
de variedades resistentes, permitindo a
incorporação de resistência de forma rápida
naquelas cultivares que melhor atendem às
necessidades do mercado. Outro avanço
importante é a criação de especificidades,
pela utilização de genes de outras espécies
de plantas, e de novos mecanismos de
defesa, a partir de genes da planta ou de
outros seres vivos, como bactérias, mamí-
feros e fitovírus, aumentando assim o arse-
nal à disposição do fitopatologista-melho-
rista do futuro, para o controle de doenças
por meio de resistência genética.
PLANTAS TRANSGÊNICAS
RESISTENTES A VÍRUS:
RESISTÊNCIA DERIVADA
DO PATÓGENO
O fenômeno da proteção cruzada, co-
nhecido desde a década de 40, consiste na
indução de resistência em plantas a iso-
lados de uma determinada espécie de vírus,
após infecção inicial por um isolado dessa
mesma espécie. Caso o isolado utilizado
para a indução de resistência seja atenuado,
isto é, não provoque sintomas na planta
infectada, a proteção cruzada pode ser
utilizada para se obterem plantas resis-
tentes. Utilizada com sucesso para o con-
trole do vírus da tristeza de Citrus, a
proteção cruzada prova que as plantas
possuem mecanismos de defesa contra o
ataque de patógenos, que podem efetiva-
mente protegê-las, ou seja, torná-las resis-
tentes, caso sejam ativados antes do início
da infecção. Além disso, o fenômeno sugere
que, no caso das infecções virais, a presen-
ça do vírus ou de uma de suas proteínas na
célula hospedeira é suficiente para ativar
os mecanismos de defesa da planta. Assim,
sugeriu-se que, caso uma proteína viral fos-
se expressa constitutivamente na planta,
seria possível induzir resistência ao vírus.
Essa estratégia, proposta no início da dé-
cada de 80 e denominada “resistência de-
rivada do patógeno” (RDP), evitaria os ris-
cos associados à proteção cruzada, na qual
a estirpe atenuada efetivamente infecta de
forma sistêmica a planta. Com isso não
ocorreria replicação viral ou produção de
qualquer outra proteína viral na planta
transgênica (Sanford & Johnston, 1985).
Biotecnologia
Com o desenvolvimento das técnicas
de clonagem molecular de genomas virais
e transformação genética de plantas, a
utilização da RDP tornou-se realidade. O
primeiro exemplo prático foi a produção de
plantas de fumo resistentes ao vírus do
mosaico (TMV), em 1986 (Powell-Abel et
al., 1986). Essas plantas, que expressavam
a proteína capsidial do vírus, apresentavam
um atraso de até 45 dias no surgimento de
sintomas, após inoculação com o TMV.
Inúmeros relatos de RDP vêm surgindo
na literatura desde o relato inicial para o
TMV. Além da proteína capsidial, outras
proteínas virais vêm sendo utilizadas,
como replicases, proteases e proteína de
movimento (Fitchen & Beachy, 1993). Em
alguns casos, a expressão de proteínas
virais levou ao surgimento de sintomas de
infecção viral nas plantas transgênicas,
indicando que ela é um fator de patoge-
nicidade. Nesses casos, que incluem prin-
cipalmente as proteínas de movimento
célula-a-célula dos fitovírus, formas mu-
tantes das proteínas vêm sendo utilizadas
para a indução de RDP.
Está claro que não existe apenas um
mecanismo responsável pela RDP, pois
esta pode ser obtida em plantas que não
expressam proteína, mas apenas o RNA
mensageiro transgênico. Neste caso de re-
sistência derivada de RNA, o nível de
proteção obtido tende a ser próximo à
imunidade, e a planta se torna resistente
mesmo quando a concentração de inóculo
é elevada, mas o grau de especificidade da
resistência é maior, ou seja, a planta é pro-
tegida apenas contra estirpes virtualmente
idênticas àquela da qual o transgene foi
obtido. Já nos casos em que a resistência é
conseqüência da presença de proteína, o
nível de proteção é menor e, ela pode ser
quebrada, quando a concentração de
inóculo é elevada, mas o espectro de ação
é maior. Existem, inclusive, relatos de
proteção contra mais de uma espécie de
vírus em plantas transgênicas, que expres-
sam o gene derivado de uma única espécie
viral.
No caso da expressão da proteína capsi-
dial do TMV em plantas de fumo, com-
provou-se que a resistência é resultado
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
do acúmulo de proteína no citoplasma
(Reimann-Philipp & Beachy, 1993). A con-
centração elevada de proteína impede que
o RNA viral seja exposto para tradução pe-
los ribossomos. A exposição do RNA (de-
sencapsidação) é um processo que ocorre
espontaneamente nas células do hospe-
deiro, devido ao pH e à concentração de
cálcio no citoplasma. A proteína transgê-
nica desloca o equilíbrio da reação de de-
sencapsidação, fazendo com que a grande
maioria das partículas virais permaneça
intacta no citoplasma e impeça que o vírus
inicie o ciclo de infecção. Desse efeito
resultam as características desse tipo de
resistência. Como uma pequena fração das
partículas virais será desencapsidada, a
infecção ocorrerá, embora a uma taxa me-
nor, o que leva ao atraso no surgimento
dos sintomas típicos desses casos. A re-
sistência pode ser quebrada por altas
concentrações de inóculo, que levam a um
maior número de moléculas de RNA viral
expostas para tradução. Finalmente, a
especificidade da resistência é menor, pois
proteínas capsidiais pertencentes a dife-
rentes estirpes de vírus ou, em alguns ca-
sos, a diferentes espécies podem associar-
se para formar o capsídeo de partículas
virais (um fenômeno comumente deno-
minado transcapsidação).
Por outro lado, o estudo da resistência
derivada de RNA demonstrou que as
plantas possuem um sistema interno de de-
gradação de mRNA, que é ativado sempre
que um determinado mRNA (endógeno ou
transgênico) atinge um nível excessivo no
citoplasma da célula. Esse sistema foi
denominado “silenciamento gênico pós-
transcricional” (SGPT) (Baulcombe, 1996).
O SGPT é altamente específico, o que
protege os outros mRNAs celulares. Dessa
forma, caso o transgene derivado do vírus
ultrapasse esse nível limite, o mecanismo
de SGPT será ativado, levando à destruição
do mRNA transgênico. Quando o vírus
penetra na célula, seu RNA também será
degradado, pois possui seqüência de nu-
cleotídeos idêntica ou muito semelhante
à do transgene, sendo reconhecido pelo
sistema celular de degradação. A especi-
ficidade da resistência derivada de RNA é,
47
portanto, conseqüência da especificidade
do mecanismo celular de SGPT. Como esse
mecanismo é altamente eficiente, a con-
centração do inóculo viral não influencia
no grau de proteção, que é geralmente abso-
luto (imunidade).
Embora a natureza do mecanismo de
SGPT ainda não seja totalmente compreen-
dida, a forma pela qual a célula discrimina
os mRNAs foi recentemente determina-
da por Hamilton & Baulcombe (1999). Pe-
quenos RNAs complementares ao mRNA,
ou seja, RNAs anti-senso (asRNAs) são
produzidos em plantas, apresentando
SGPT. Devido ao seu pequeno tamanho,
esses asRNAs podem ser transportados
célula-a-célula e a longa distância na planta,
sendo assim a molécula responsável pelo
transporte sistêmico do sinal de SGPT.
Esses asRNAs podem ser a causa (por meio
da produção de RNA de fita dupla) ou o
efeito (por meio da degradação desse RNA
de fita dupla) do SGPT.
No Quadro 1, são apresentados os re-
latos de RDP existentes na literatura para
vírus pertencentes à família Potyviridae.
Apesar dos inúmeros relatos de RDP
existentes na literatura, apenas dois casos
vêm sendo aplicados em nível comer-
cial. Desde 1996, plantas de abobrinha
(Cucurbita pepo), expressando os genes
das proteínas capsidiais de três fitovírus
(ZYMV, WMV-2 e CMV), vêm sendo cul-
tivadas nos Estados Unidos (Tricoli et al.,
1995). Essas plantas são praticamente
imunes à infecção por esses três vírus. Des-
de 1998, plantas de mamoeiro (Carica
papaya) resistentes ao vírus da mancha-
anelar (PRSV-P), também devido à expres-
são do gene da proteína capsidial, vêm
sendo cultivadas no Havaí (EUA) (Lius et
al., 1997). Até hoje inexistem relatos de
quebra de resistência.
DIAGNOSE MOLECULAR
DE FITOVÍRUS E
OUTROS FITOPATÓGENOS
A diagnose de fitopatógenos é reali-
zada por meio de uma série de técnicas,
envolvendo identificação de estruturas do
patógeno em tecido infectado, isolamento
e cultivo em meio de cultura, testes bio-
48 Biotecnologia

QUADRO 1 - Plantas transgênicas resistentes a Potyvírus por meio da expressão de genes virais relação à diagnose, os métodos com base
Espécie de planta Espécie viral Proteína viral na hibridização molecular têm importância
fundamental para os patógenos consti-
Cucurbita pepo (abóbora) e tuídos apenas por ácidos nucléicos, como
Cucumis melo (melão) ZYMV e WMV-2 CP os viróides, e as estirpes defectivas de
C. melo ZYMV, WMV-2 e CMV CP vírus, nas quais não ocorre formação de
capsídeo (Salazar & Querci, 1992).
C. pepo ZYMV e WMV-2 CP
A hibridização é uma técnica altamente
Carica papaya (mamão) PSRV-P CP
específica e precisa, que possibilita a de-
Gladiolus sp. (gladíolo) BYMV CP e AS-CP
tecção de concentrações baixas do ácido
Lactuca sativa (alface) LMV CP nucléico no extrato da planta. Baseia-se na
Nicotiana benthamiana PStV CP com ou sem ATG clonagem de uma seqüência específica do
N. benthamiana LMV (resistência ao PVY) CP ácido nucléico do patógeno (sonda). A
N. benthamiana PPV Nib especificidade é determinada pelo tamanho
N. benthamiana PPV CI e pela seqüência de nucleotídeos da sonda.
N. benthamiana PPV P1 O ácido nucléico (fita simples) que se quer
detectar deve ser então imobilizado em um
N. benthamiana VNV CP
suporte sólido (membrana de nitrocelulose
Nicotiana tabacum (fumo) TEV Nia
ou náilon), para que hibridize com a sonda
N. tabacum PRSV-P CP
utilizada para a detecção (Fig. 23, p.64). As
N. tabacum TVMV CP condições de hibridização podem ser
N. tabacum TEV 6K/VPg ajustadas, variando-se a temperatura e/ou
n
N. tabacum PVY CP a concentração de componentes da solu-
Prunus domestica (ameixa) PPV CP ção, de forma que a sonda hibridize apenas
P. domestica PRSV-P (resistência ao PPV) CP com um ácido nucléico de alta homologia
Solanum tuberosum (batata) PVY CP (>90%), ou seja capaz de formar híbridos
estáveis também com moléculas de menor
FONTE: Zerbini & Maciel-Zambolim (no prelo). homologia (>70%), caracterizando alta ou
baixa especificidade, respectivamente. Essa
químicos para identificação de bactérias e dições apropriadas (Ausubel et al., 1991). consideração é crítica, já que a quantidade
uso de sorologia, principalmente para vírus Estas técnicas tornaram-se realidade com de hibridização observada entre organis-
e também para bactérias (Grogan, 1981). A o advento da tecnologia de DNA recom- mos relacionados pode ser controlada
diagnose molecular vem sendo utilizada binante, que possibilitou a produção de pelas condições do teste (Gilbertson et al.,
principalmente em virologia, devido às sondas de ácido nucléico com especifi- 1991).
dificuldades de identificação de diversos cidade suficiente para uso em larga escala. Para o preparo da sonda, faz-se a clo-
fitovírus por meio de testes biológicos Estas sondas (clones obtidos a partir do nagem de um ou mais fragmentos do ge-
ou sorológicos (Miller & Martin, 1988 e genoma do patógeno ou oligonucleotí- noma do patógeno em plasmídeos. O
Sequeira, 1992). Entretanto, os testes mo- deos, cuja seqüência tem como base a fragmento de DNA do patógeno é freqüen-
leculares mais difundidos para a diagnose seqüência do genoma do patógeno) são temente produzido por PCR ou RT-PCR.
de fitoviroses podem ser aplicados para facilmente obtidas no caso de fitovírus, e Para que o DNA clonado seja utilizado como
outros fitopatógenos, nos casos em que a podem ser armazenadas por tempo inde- sonda é necessário marcá-lo, utilizando-se
diagnose por métodos convencionais não terminado na forma de uma cultura bacte- para isto isótopos radioativos (o mais
seja capaz de produzir os resultados ne- riana. Uma das principais vantagens das comum é o fósforo 32) ou compostos não-
cessários (Batista, 1993). A seguir, serão técnicas moleculares em relação à sorolo- radioativos como digoxigenina, biotina e
comentadas as principais técnicas de diag- gia é a facilidade de produção das sondas, fluoresceína (Harper & Creamer, 1995). Os
nose molecular empregadas atualmente. comparada à produção de anti-soro. métodos de marcação mais utilizados são
A técnica de hibridização tem sido denominados nick-translation e random
Hibridização de ácidos empregada para detecção de vírus huma- priming (Sambrook et al., 1989 e Ausubel
nucléicos nos, microorganismos contaminantes de et al., 1991).
Técnica com base na habilidade de uma alimentos e, a partir de 1981, para detecção No método de nick-translation, o
fita simples de ácido nucléico em hibridi- de vírus vegetais (Owens & Diener, 1981, plasmídeo contendo a sonda é incubado
zar com uma fita complementar sob con- Hull, 1986 e Karjalainen et al., 1987). Com na presença das enzimas DNase e DNA

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Biotecnologia
polimerase e dos quatro nucleotídeos uti-
lizados na síntese do DNA (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP, sendo um dos quatro mar-
cados). A DNase introduz cortes na fita de
DNA (nicks), que são reparados pela DNA
polimerase. Durante o reparo, os nucleo-
tídeos marcados são incorporados à fita
de DNA, gerando a sonda marcada. Essa
técnica é simples e rápida, entretanto o nível
total de marcação incorporado às sondas é
relativamente baixo.
No método de random priming, uti-
lizam-se hexanucleotídeos (primers) de
seqüência aleatória (random). A fita dupla
do plasmídeo contendo a sonda é desna-
turada e os hexanucleotídeos alinham-se
ao DNA nas regiões em que ocorre parea-
mento de bases. Em seguida, os quatro
nucleotídeos (um deles marcado) e a DNA
polimerase são adicionados à reação. A
DNA polimerase sintetiza uma fita com-
plementar, utilizando os hexanucleotídeos
e os nucleotídeos marcados. Assim, uma
quantidade muito maior de nucleotídeos
marcados é incorporada à fita de DNA,
gerando uma sonda com maior atividade
específica.
De modo geral, um teste de hibridização
segue os seguintes passos:
a) preparo dos extratos vegetais;
b) adição dos extratos à membrana e
fixação pelo calor ou luz ultravioleta;
c) adição da sonda, contendo também
uma fonte de DNA não-específica
(normalmente tRNA de levedura, es-
perma de salmão ou DNA de timo de
bovino) para bloquear sítios livres
na membrana, evitando que a própria
sonda se ligue à membrana;
d) incubação (hibridização propria-
mente dita);
e) lavagens para remoção do excesso
de sonda;
f) exposição da membrana a um filme
de raios X.
No caso de sondas não-radioativas,
uma etapa adicional é a incubação com a
substância que se liga à sonda, permitindo
a visualização da reação. É interessante
notar que, nesse caso, a hibridização é se-
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guida por um tipo de ELISA (teste soro-
lógico). A sonda contendo nucleotídeos
marcados com biotina é detectada com o
uso de avidina ou estreptoavidina, seguido
de um anticorpo específico para a avidina,
conjugado a uma enzima (por exemplo,
fosfatase alcalina). A detecção é feita com
a quebra do substrato da enzima. Nucleo-
tídeos marcados com digoxigenina e fluo-
resceína são detectados por anticorpos
antidigoxigenina e antifluoresceína, res-
pectivamente, conjugados à fosfatase
alcalina.
Reação em cadeia de
polimerase (PCR)
É uma técnica bastante simples, versátil
e de ampla aplicação, desenvolvida por
Kary Mullis em 1980, que revolucionou a
genética molecular através da possibili-
dade de produzir um grande número de
cópias de uma seqüência específica do
DNA, facilitando o estudo e a análise dos
genes (Mullis, 1990). A técnica com base
na amplificação, em progressão geométrica,
da seqüência de interesse do DNA é limi-
tada por dois oligonucleotídeos (primers)
e apresenta uma sensibilidade muito supe-
rior a qualquer outra (Henson & French,
1993 e Hu et al., 1995). Os principais obstá-
culos para o seu uso em larga escala são a
alta freqüência de falsos positivos, devido
a contaminações de reagentes e pipetas, e
à sensibilidade da enzima utilizada nas
reações à presença de substâncias inibi-
doras em certos extratos vegetais. A fim de
comprovar o resultado obtido, é funda-
mental que se inclua um controle negativo,
ou seja, uma amostra contendo todos os
reagentes, exceto o DNA molde, para se
ter certeza de que nenhum reagente está
contaminado, e um controle positivo, para
assegurar que a amplificação não está
sendo inibida por compostos presentes no
extrato vegetal (Kwok & Higuchi, 1989).
Eiras et al. (1998) relatam que de 1990
até 1998, 77 espécies de vírus de plantas
dentro de 29 gêneros e 8 famílias já foram
detectadas por PCR. Embora os reagentes
para PCR tenham um custo relativamente
alto, o que inviabiliza o seu uso com um
grande número de amostras, a técnica de
49
PCR tem diversas vantagens sobre outros
métodos como hibridização ou ELISA, por
utilizar uma pequena quantidade de amos-
tras de tecido, permitir a detecção do pató-
geno em baixíssimas concentrações e em
amostras estocadas por longo período, e
por permitir, além da detecção, uma carac-
terização suplementar do patógeno, ou
mesmo a clonagem completa de genomas
virais para estudos de infectividade.
Uma reação de PCR é composta por
ciclos repetitivos, e no final de n ciclos, a
reação contém um máximo de 2n moléculas
de fita dupla de DNA para cada molécula
inicialmente presente na amostra, que são
cópias da seqüência de DNA entre os
oligonucleotídeos (Fig. 24, p.64) (Watson,
1992). Cada ciclo é composto por três pas-
sos (Fig. 24, p.64):
a) desnaturação das fitas duplas de
DNA, a 94o-95oC por 30s a 1min;
b) alinhamento dos oligonucleotídeos
com o DNA, a 37-60oC por 1-2min (o
tempo e a temperatura de anelamento
são dependentes da composição de
bases, tamanho dos oligonucleo-
tídeos, da sua homologia com o DNA
que se pretende amplificar e sua
concentração, condições que influ-
enciam o nível de especificidade do
teste);
c) extensão das cadeias de DNA, a 72oC
por 30s a 5min, dependendo do ta-
manho do fragmento a ser amplifi-
cado (ação da DNA polimerase; um
tempo de extensão muito longo deve
ser evitado, já que a enzima, tendo
terminado a extensão da seqüência
desejada, irá concentrar-se em oli-
gonucleotídeos pareados indevida-
mente).
Os componentes básicos de uma rea-
ção de PCR são os dois oligonucleotídeos,
que marcarão os pontos iniciais para sín-
tese de DNA (o tamanho do oligonu-
cleotídeo, normalmente com 15 a 25 bases,
deve ser suficiente para que não haja anela-
mento aleatório em regiões do DNA que
não sejam a seqüência-alvo), a enzima DNA
polimerase (a mais comum é a Taq DNA
polimerase), os quatro desoxinucleotídeos
50
e a fita molde que se deseja amplificar. A
reação deve ser feita na presença de um
tampão que propicia condições para a en-
zima atuar. A concentração de MgCl2 é
crítica, devendo ser ajustada de acordo
com as condições do teste.
A seqüência dos oligonucleotídeos
baseia-se naquela que se deseja amplificar
e é a responsável pela especificidade da
reação. Por exemplo, caso a seqüência dos
oligonucleotídeos corresponda a regiões
altamente conservadas do genoma do
patógeno, fragmentos de diferentes estir-
pes ou mesmo espécies poderão ser ampli-
ficados. Ao contrário, caso a seqüência
dos oligonucleotídeos corresponda a re-
giões variáveis do genoma, apenas a raça
ou estirpe que deu origem aos oligonu-
cleotídeos terá o fragmento amplificado.
Além disso, oligonucleotídeos universais
podem ser desenhados com base em ali-
nhamentos de diversas estirpes ou isola-
dos do patógeno, e que ampliem a região
correspondente de qualquer uma dessas
estirpes ou espécies (Langeveld et al., 1991
e Rojas et al., 1993).
Os produtos da PCR podem ser obser-
vados diretamente em gel de agarose cora-
do com brometo de etídeo sob luz ultra-
violeta, o que é uma vantagem nos casos
de diagnose, já que permite uma avaliação
rápida e fácil de um grande número de
amostras.
A Figura 25 (p.65) ilustra o uso da PCR
na identificação de fitovírus infectando
cucurbitáceas (Richards, 1998). Nessas
culturas, é comum a ocorrência simultânea
de mais de um vírus (infecção mista), o que
praticamente impossibilita a diagnose com
base em sintomas. Além disso, três dos
vírus mais comumente encontrados são
Potyvirus, o que dificulta o uso de soro-
logia, devido às freqüentes reações cru-
zadas entre os anti-soros. Utilizando-se
PCR com oligonucleotídeos específicos
para cada vírus, fragmentos de tamanhos
distintos são amplificados, diferenciando
claramente os vírus e permitindo a diagnose
rápida e precisa tanto nos casos de infec-
ções simples quanto mistas.
As amostras a ser submetidas à reação
de PCR geralmente são preparadas por meio
da extração de ácidos nucléicos totais,
utilizando-se protocolos variados, de acor-
do com a planta de interesse e a necessi-
dade de eliminação de compostos inibi-
dores da DNA polimerase presentes nesta.
No caso de fitovírus com genoma composto
de RNA, um passo anterior é a reação de
transcriptase reversa (RT), que sintetiza o
DNA complementar a partir da fita de RNA
viral, constituindo-se no único substrato
utilizado pelas DNA polimerases termo-
estáveis. Nesses casos, é comum referir-se
como RT-PCR ao invés de PCR.
A técnica de PCR pode também ser
utilizada em conjunto com outras, para
investigar a diversidade genética de pa-
tógenos oriundos de diferentes regiões
geográficas, a fim de gerar informações para
programas de melhoramento genético,
estudos epidemiológicos ou para o desen-
volvimento de variedades resistentes. Pode
também ser utilizada na quantificação de
patógenos em tecidos vegetais (também
chamada de PCR quantitativo), para clo-
nagem de fragmentos de genomas, seqüen-
ciamento genético, preparação de sondas
moleculares, estudos de movimentação de
fitovírus e de sua replicação na célula
hospedeira, estudos de interação planta-
patógeno, classificação de patógenos,
monitoramento da infecção e colonização
de plantas, estudos da expressão gênica
durante a infecção da planta e para estudos
da evolução do relacionamento entre orga-
nismos.
TAXONOMIA MOLECULAR
O advento das técnicas de DNA recom-
binante tornou possível e até mesmo trivial
a determinação da seqüência de nucleo-
tídeos de genomas de diversos organis-
mos, incluindo fitopatógenos como fungos,
bactérias, vírus e nematóides. Uma vez de-
terminada a seqüência de fragmentos do
genoma de diversos organismos, ela pode
ser comparada com o objetivo de estabe-
lecer o relacionamento taxonômico entre
esses organismos, o que é comumente de-
nominado análise filogenética. Esse tipo
de análise baseia-se no grau de homolo-
gia de seqüência para estabelecer o nível
de relacionamento entre diferentes se-
qüências.
A análise filogenética é essencialmente
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
Biotecnologia
estatística. Através dela calcula-se a pro-
babilidade de mutações no genoma, que
gera variabilidade na seqüência de nucleo-
tídeos, se esta ocorrer ao acaso e tornar-se
fixa na população (Li, 1997). De forma
intuitiva, pode-se perceber que mutações
que conferem vantagem a um organismo
tendem a fixar-se mais rapidamente, en-
quanto aquelas que conferem desvantagem
tendem a desaparecer. Mutações neutras,
no entanto, podem fixar-se na população
ou desaparecer ao longo do tempo. Quando
se comparam diferentes seqüências de
nucleotídeos, devem ser levados em con-
sideração o número de mutações, a fre-
qüência em que ocorrem em uma deter-
minada posição da seqüência e o tipo de
mutação (substituição, deleção ou dupli-
cação de seqüências).
A análise filogenética vem sendo usada
com freqüência em estudos de taxonomia
de bactérias e vírus. Para bactérias, é comum
o uso da seqüência do RNA ribossômico
16S, cujo nível de variabilidade reflete o
verdadeiro grau de relacionamento entre
diferentes gêneros e espécies. Para fito-
vírus, devido ao pequeno tamanho de seus
genomas, é freqüente o uso das seqüências
completas do genoma viral. Entretanto,
o uso da seqüência do gene da proteína
capsidial é mais comum.
A taxonomia molecular vem adquirindo
grande relevância nos últimos anos. Para
bactérias e vírus, organismos para os quais
características morfológicas praticamente
não possuem valores taxonômicos em nível
de espécie, a análise filogenética possui
um valor incalculável, e diversos problemas
taxonômicos vêm sendo resolvidos graças
à sua utilização. De fato, para certas famílias
de fitovírus, a análise filogenética é o prin-
cipal critério utilizado na definição de novas
espécies, aliado às propriedades bioló-
gicas do fitovírus.
A Figura 26 ilustra o uso da análise filo-
genética na determinação do relacionamen-
to taxonômico entre fitovírus (Santana et
al., 1999). Diferentes isolados brasileiros de
Potyvirus causadores do endurecimento
dos frutos do maracujazeiro tiveram a se-
qüência do gene da proteína capsidial de-
terminada. Essas seqüências foram com-
paradas com aquelas de outras espécies
Biotecnologia
24
100
44
100
79
58
84
Figura 26 - Árvore filogenética, preparada a partir das seqüências de aminoácidos da
região N-terminal de isolados de Potyvirus causadores de endurecimento
dos frutos do maracujazeiro, e de outros Potyvirus. Observa-se que todos os
isolados brasileiros, exceto ES, se agrupam em um mesmo ramo. Esse ramo,
por sua vez, está agrupado com os isolados de CABMV, SeMV e SAPV. Os
isolados de PWV formam um ramo completamente distinto.
de Potyvirus que causam o mesmo tipo de
sintoma, Passionfruit woodiness virus
(PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus
- Passiflora (CABMV-Pass). A análise de-
monstrou que os isolados brasileiros agru-
pam-se com isolados de CABMV e, por-
tanto, estão mais relacionados com essa
espécie do que ao PWV. Entretanto, devido
a diferenças nas propriedades biológicas
desses isolados (que não infectam Vigna
unguiculata) e os isolados de CABMV
(que infectam esse hospedeiro), os isolados
brasileiros devem ser classificados como
uma espécie distinta de Potyvirus. Esse
tipo de estudo é de fundamental impor-
tância em programas de melhoramento
genético, quer utilizando a resistência na-
tural do hospedeiro, quer utilizando a re-
sistência derivada do patógeno.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.43-52, maio/jun. 2000
51
de expressão de genes cujos produtos
35
BA1 atuam na degradação de proteínas e ácidos
29
55
PA1A nucléicos do patógeno, e na reação de
54
PE hipersensibilidade, a morte celular rápida
82
97 MG e localizada característica da reação de
BA2 resistência observada em diversos patos-
SP1 sistemas. Ao mesmo tempo, diversos pató-
PA1B
genos desenvolveram a capacidade de
86
SP2
inibir ou retardar essa resposta de defesa.
A biotecnologia deve permitir avanços
SAPV
CABMV-MOG notáveis no estudo dessas interações.
CABMV-UK
Atualmente, a biotecnologia deve ser enca-
71
99
CABMV-MO
rada pelo fitopatologista não como um fim
ES
em si mesma, mas principalmente como uma
89 ferramenta poderosa capaz de beneficiar
SEMV
100
virtualmente todas as áreas da Biologia.
CABMV-ZI
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Biotecnologia 53

Biotecnologia e microorganismos
aplicados à agroindústria
Pedro Braga Arcuri 1
Edna Froeder Arcuri 2

Resumo - A biotecnologia moderna, através de algumas técnicas de Biologia molecular,

a saber Engenharia genética (clonagem), uso de plasmídeos de Agrobacterium sp.,
reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridização de ácidos nucléicos e filogenia
molecular, tem sido aplicada em áreas da agroindústria. Dessa forma, serão demons-
trados exemplos dessa aplicação em três campos distintos que envolvem bactérias:
culturas lácticas para a fabricação de derivados do leite, ecologia microbiana ruminal
e fixação biológica de nitrogênio. Com isso, faz-se necessária a regulamentação da
liberação de organismos geneticamente modificados no meio ambiente através do
controle governamental, com referência ao órgão brasileiro responsável, a Comissão
Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).
Palavras-chave: Engenharia genética; Biologia molecular; Bactérias láticas; Microbiota
ruminal; Fixação de nitrogênio; Biossegurança.

INTRODUÇÃO QUADRO 1 - Alguns marcos históricos do desenvolvimento da biotecnologia de alimentos

Por biotecnologia entende-se qualquer Data Processo/Produto/Invenção Região ou país

tecnologia que explore as atividades bio-
químicas de organismos vivos ou seus pro- 3500-3000 AC Massa azeda de pão Suíça
dutos (por exemplo, enzimas isoladas). O
~3300 AC Massa azeda de pão Mesopotâmia, Egito
termo biotecnologia foi primeiramente de-
finido por Karl Ereky, no final da Segunda A partir de 3000 AC Cerveja e alimentos com fermentação Suméria, Babilônia,
Guerra Mundial, referindo-se a métodos lática (leite, carne, peixes, vegetais, Costa Mediterrânea
intensivos de agricultura. Desde então, vá- cereais)
rias definições foram sugeridas, associando ~1500 AC Vinho Costa Mediterrânea
biotecnologia principalmente ao uso de mi-
croorganismos na fabricação de produtos ~início da idade Cristã Vinagre de vinho Costa Mediterrânea
de valor comercial, como alimentos, aditivos Idade Média (séc. XIV) Vinagre de vinho industrial França
para a indústria de alimentos, medicamen-
1780 Caracterização química do ácido lático Suécia
tos etc. Assim, a produção de antibióticos,
de leite fermentado
por um lado, e a produção de cervejas e ou-
tras bebidas fermentadas, por outro, estão 1818 Descrição das propriedades fermentativas Alemanha
entre os processos biotecnológicos indus- de fermentos
triais estabelecidos há longo tempo. Em
1857 Descrição da fermentação lática (Louis França
relação à produção de alimentos, a bio-
Pasteur)
tecnologia é de conhecimento milenar na
produção de fermentados (Quadro 1), mas 1873 Primeira cultura bacteriana pura: Bacterium Reino Unido
foi somente no século XIX que Louis Pasteur lactis (Lactococcus lactis)
identificou microorganismos (bactérias e 1881 Produção microbiológica industrial de Dinamarca e Alemanha
leveduras) como sendo os agentes causa- ácido lático
dores das fermentações. Porém, com o de-
senvolvimento do conhecimento em Biolo- 1890 Isolamento e cultivo dos primeiros starters Dinamarca e Alemanha
gia molecular e genética, incluindo o domínio para queijo e coalhada
das técnicas laboratoriais de transferência FONTE: Holzapfel (1997).

1
Engo Agro, Ph.D., Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, CEP.36038-330. Juiz de Fora-MG. E-mail: pbal@cnpgl.embrapa.br
2
Enga Alimentos, Ph.D., Pesq./Profa EPAMIG - CT/ILCT, CEP 36045-560 Juiz de Fora-MG. E-mail: efa3@hotmail.com.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000

54
de genes de um organismo para outro, de
espécie diferente (Woese, 1994), o potencial
da biotecnologia foi grandemente expandi-
do. A estas técnicas mais recentes a Asso-
ciação Brasileira de Empresas de Biotecno-
logia (Abrabio) convencionou denominar
Biotecnologia Moderna, como sinônimo de
“modificação genética”. Assim, uma defi-
nição atual para biotecnologia seria “qual-
quer técnica ou processo que utilize um
organismo vivo, geneticamente modificado
ou não, para sintetizar um produto útil, ou
realizar uma reação química desejável”. A
fim de utilizar um termo comum na litera-
tura científica mundial, tais técnicas serão
doravante denominadas “técnicas de Bio-
logia molecular”.
A Biologia molecular teve início na dé-
cada de 30 e mesmo quando, nos anos 50,
ocorreram avanços significativos no co-
nhecimento, sua aplicabilidade prática era
mínima. As aplicações práticas começaram
a surgir com avanços nos conhecimentos
da genética, no funcionamento da célula,
nos mecanismos moleculares de controle
das atividades metabólicas, assim como nas
estruturas moleculares de macromoléculas,
tais como o DNA e proteínas. Atualmente,
a Biologia molecular tem obtido destaque
na imprensa e em debates, envolvendo di-
versos setores da sociedade, devido, por
um lado, às vantagens comparativas e, por
outro, aos riscos potenciais de organismos
transgênicos, especialmente na agricultura.
O objetivo deste trabalho é apresen-
tar uma visão sumarizada de algumas das
técnicas de Biologia molecular mais uti-
lizadas atualmente, bem como descrever
brevemente o potencial de algumas destas
técnicas em áreas da agroindústria perti-
nentes ao uso de microorganismos, com
exemplos em que bactérias são utilizadas.
Dado o largo espectro da utilização de vá-
rios tipos de microorganismos (bactérias,
leveduras, protozoários) na agroindústria,
foram selecionados exemplos recentes nas
áreas de culturas lácticas para a fabricação
de derivados do leite, nutrição de ruminan-
tes (ecologia microbiana ruminal) e nutrição
de plantas (fixação biológica de nitrogênio
atmosférico).
TÉCNICAS DE BIOLOGIA
MOLECULAR APLICADAS A
MICROORGANISMOS
A seguir serão descritas sucintamente
algumas técnicas utilizadas em trabalhos
envolvendo microorganismos, seja como
ferramentas ou como objeto final de mani-
pulação.
Engenharia genética:
clonagem de genes e
transformação de células
hospedeiras
A Engenharia genética é um termo
genérico para procedimentos laboratoriais
que resultam em uma alteração direta e
predeterminada do genótipo de um orga-
nismo. Nesta técnica, genes e seqüências
de DNA são isolados, purificados e em
seguida manipulados in vitro por procedi-
mentos de clonagem do DNA. As molé-
culas de DNA recombinante geradas desta
maneira carregam novas combinações de
seqüências de DNA que, por sua vez, foram
desenhadas de modo que possam ser in-
troduzidas e expressas numa célula “hos-
pedeira”. Portanto, a seqüência de DNA
introduzida poderá vir a controlar a síntese
de uma proteína que de outra forma não
seria produzida por aquela célula. Na En-
genharia genética, endonucleases de res-
trição e DNA ligases são enzimas usadas
na construção de moléculas de DNA re-
combinante, no qual o gene ou fragmento
(seqüência) de DNA de interesse é ligado
a um DNA vetor (plasmídeo, bacteriófago
etc.). A função deste DNA vetor é permi-
tir a introdução do gene exógeno na célula
hospedeira.
Uso de plasmídeos de
Agrobacterium sp. em
Biologia molecular
Plasmídeos são estruturas extracro-
mossomais de reprodução autônoma, re-
presentados como pequenos círculos. Gran-
de parte dos plasmídeos conhecidos é
formada por fitas duplas de DNA, embora
alguns outros sejam compostos por fi-
tas simples. Tais plasmídeos contêm genes
que mobilizam o DNA para ser transferi-
do para as células da planta-hospedeira
(Fig. 27).
O gênero gram-negativo Agrobacterium
é composto por bactérias fitopatogênicas
que causam a formação de tumores, cres-
cimento indiferenciado de tecidos em uma
grande variedade de plantas. As duas es-
pécies mais amplamente estudadas são A.
tumefaciens, causadora de calos indiferen-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000
Biotecnologia
ciados e A. rhizogenes, responsável pela
hipertrofia maligna de raízes, a partir de
tecido radicular danificado (Zupan &
Zambryski, 1995). Ambos os tipos de tu-
mores continuam a crescer na ausência de
células de Agrobacterium, indicando a pos-
sibilidade de a informação genética ser
transmitida e estabelecida no tecido in-
fectado via plasmídeos. Foram identifi-
cados dois plasmídeos, tumor induction
(Ti) e root induction (Ri), responsáveis pelo
aparecimento das respectivas hipertrofias
descritas anteriormente (Hooykaas & Bei-
jersbergen, 1994). Estes plasmídeos pas-
saram a ser utilizados como ferramentas
para a introdução de genes exógenos em
plantas, sendo então vetores, a partir de
um segmento denominado T-DNA (Lipp-
Nissinen, 1993). Em resumo, promove-se a
introdução de genes de interesse para a
planta-hospedeira acoplados a genes mar-
cadores, por exemplo, genes para resistên-
cia a antibióticos (Sheng-Jin et al., 1996),
necessários para a identificação de eventos
bem-sucedidos da transferência genética
ainda nos estádios iniciais do processo.
Esta técnica vem causando avanços enor-
mes na Engenharia genética de plantas,
cujos exemplos mais conhecidos são varie-
dades comerciais resistentes a herbicidas
(Zambryski, 1992). Por exemplo, o herbicida
glifosato é letal para plantas por inibir uma
enzima necessária para a síntese de ami-
noácidos aromáticos. Ocorre que foram
descritas na literatura cepas de bactérias
gram-negativas do gênero Salmonella,
resistentes ao glifosato. Tais bactérias fo-
ram isoladas e os genes de resistência ao
glifosato foram transferidos para plantas
(via transformação genética, por exemplo,
para soja) (Padgette et al., 1996), usando-
se o plasmídeo Ti como veículo, o que torna
aquelas plantas resistentes ao herbicida.
Outras aplicações incluem a introdução de
genes para resistência ao déficit hídrico,
tentativas de alterar o valor nutritivo de
alimentos vegetais, introdução de genes
marcadores (ou repórteres) da expressão
de outros genes e o uso de bactérias para a
biorremediação, o tratamento in situ de resí-
duos de difícil degradação (Brettell & Mur-
ray, 1996).
Reação em cadeia da
polimerase (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR)
Biotecnologia 55

consiste na amplificação enzimática in vitro

de uma seqüência específica de ácido nu-
cléico (Saiki, 1998). A Figura 28 exemplifica
Material genético
o princípio e a automatização da PCR. Ho-
introduzido je, largamente utilizada, esta técnica permi-
te a multiplicação rápida de fragmentos de
DNA.
DNA
Exógeno
Os reagentes necessários para a PCR
são adicionados ao microtubo, a saber: dois
Resist.
antibiótico primers (seqüências iniciadoras, oligonu-
Origem
cleotídeos sintéticos complementares ape-
A.T. nas à extremidade da seqüência de DNA a
ser amplificada); amostra de DNA conten-
do a seqüência-alvo; DNA polimerase ter-
moestável, por exemplo, a enzima Taq DNA
Região de origem
Resist. de replicação polimerase (isto é, DNA polimerase prove-
antibiótico

A niente de bactérias Thermus aquaticus);

a) vetor de transfecção b) E.coli B os quatro desoxinucleotídeos (A, G, T e C);
Transferência
tampão específico (PCR buffer) e MgCl2. A
por conjugação
seguir, o microtubo contendo a mistura é
transferido para a máquina de ciclos tér-
micos (termociclador) que é então progra-
c) A.tumefaciens mada quanto ao número de ciclos e quanto
ao binômio tempo/temperatura de cada eta-
pa de um ciclo. Um ciclo consiste de três
etapas sucessivas. A primeira é a denatu-
ração térmica do DNA a 95°C por cerca de
D.Ti
A. tumefaciens C um minuto. Na segunda etapa chamada de
renaturação ou anelamento, a temperatura
é reduzida, por exemplo para 55°C por um a
DNA Exógeno
dois minutos para que ocorra a hibridização
dos primers na seqüência-alvo. Para a ter-
ceira etapa, chamada de síntese ou ampli-
ficação, a temperatura é de 72°C por um a
Cromossomo
dois minutos, que é a temperatura ótima
d) Célula vegetal para a função catalítica da Taq DNA poli-
merase. Após o último ciclo programado
Núcleo
haverá milhões ou bilhões de cópias da
seqüência-alvo. A técnica de PCR tem ti-
D
do um enorme impacto em várias áreas de
estudo. A PCR facilitou a clonagem de frag-
Célula vegetal
mentos de DNA ou de genes, principal-
mente na obtenção de cDNA (isto é, uma
Figura 27 - Produção de plantas transgênicas usando-se Agrobacterium tumefaciens
cópia de DNA obtida a partir de uma mo-
lécula de RNA), de moléculas de mRNA
NOTA: A - Vetor genérico (não-específico) de transfecção contendo: material genético a ser
raras; bem como facilitou a seleção e cate-
introduzido na planta, extremidades de T-DNA, origens de replicação tanto para E. coli
gorização de bibliotecas de genes (Arcu-
quanto para A. tumefaciens e dois marcadores (genes para resistência a antibióticos);
ri, 1999a); a mutação in vitro e detecção da
B - Este vetor pode ser introduzido em E. coli visando clonagem (multiplicação) e transfe-
rido para A. tumefaciens via conjugação; C - O plasmídeo residente (Ti) é a ferra-
ocorrência de mutações; o mapeamento fí-
menta utilizada para transferência do vetor para a planta (D-Ti). Este plasmídeo foi
sico do cromossomo e uma série de outras
previamente alterado para remover os genes de patogenicidade, mantendo-se a capacidade aplicações.
de infecção; D - O plasmídeo Ti foi capaz de mobilizar o vetor e transferi-lo para células
vegetais, que crescem em cultura de tecidos. A partir destas células, a característica Hibridização de ácidos
desejada, por exemplo, resistência a um herbicida, pode ser selecionada de células, nucléicos
crescendo em meio contendo antibióticos. Das células sobreviventes, plantas intactas podem Ácidos nucléicos (DNA ou RNA) são
ser regeneradas. polímeros compostos por nucleotídeos.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000
56 Biotecnologia

rência de relações (parentesco) entre or-

ganismos e mecanismos evolutivos através
da comparação de seqüências de ácidos
nucléicos, proteínas ou outras macro-
moléculas. Em outras palavras, a filogenia
molecular utiliza trechos do material ge-
nético dos organismos da mesma forma que
a taxonomia clássica utiliza características
anatômicas, morfológicas ou bioquímicas.
O corolário para a filogenia molecular ba-
seia-se no fato de que o material genético
dos organismos de diferentes linhas de
descendência acumula alterações resul-
tantes de mutações ao acaso. Como regra
geral, quanto mais divergentes duas se-
qüências, tanto mais distantes evolutiva-
mente, assumindo-se que ambos os orga-
nismos possuem um ancestral comum.
Conseqüentemente a diferença entre se-
qüências permite a construção de árvo-
res genealógicas. As vantagens do uso
de dados de seqüências de ácidos nu-
cléicos sobre características fenotípicas
ou morfológicas no estudo de filogenia
incluem:
a) o largo espectro de organismos que
podem ser classificados, ao se tra-
balhar com seqüências de genes
ou moléculas universais. A árvore
Figura 28 - Sumário da reação em cadeia da polimerase (PCR)
filogenética universal mais aceita
NOTA: Descrição de um ciclo da reação. A fita dupla da molécula de DNA é inicialmente
atualmente baseia-se na seqüência
denaturada a 94oC, seguindo-se uma etapa de anelamento ou hibridização, onde pequenos
de ácidos nucléicos da molécula
pedaços iniciadores (primers) são pareados às respectivas regiões homólogas. O ciclo
termina com a atividade da enzima polimerase, a 55oC que promove a formação de uma
do RNA ribossômico16S (organis-
fita homóloga a cada fita de DNA original. Seguem-se vários ciclos semelhantes, resultando mos procarióticos) ou18 (eucarióti-
em um grande número de cópias da seqüência-alvo. cos), conforme ilustrado na Figu-
ra 30;
b) seqüências de macromoléculas per-
Estes, por sua vez, são moléculas compos- detectar os híbridos formados entre a son- mitem trabalhar com um grande nú-
tas por fosfato, base nitrogenada (adenina, da e o DNA ou RNA-alvo, utilizam-se ra- mero de características, resultando
guanina, citosina, timina e uracila), ribose dioisótopos ou reações imunológicas, con- em árvores filogenéticas de maior
ou desoxirribose. Sondas de oligonucleo- forme sucintamente ilustrado na Figura 29. estabilidade, ou seja, com menores
tídeos, à semelhança dos primers para PCR, Nas reações imunológicas a sonda é pre- chances de ser alteradas, à medida
são pequenas seqüências de nucleotídeos parada ligando-a a um anticorpo específico que novas seqüências sejam obti-
construídas para se associarem especifi- para uma enzima, por exemplo, biotina ou das. A maior importância comer-
camente (isto é, formarem híbridos) a se- fosfatase alcalina, e esta a uma substância cial e industrial da construção de
qüências homólogas no material genético que reaja liberando um produto colorido árvores filogenéticas deve-se ao fa-
de um organismo ou grupo de organismos ou emitindo luz que possa ser detectada to de que novos microorganismos
(Sambrook et al., 1989). Portanto, uma vez por fotografia através de filmes de raios X estão sendo identificados a cada
que se conheça uma seqüência de nucleo- (Raskin et al., 1997). Vários kits comerciais dia, muitos deles de grande impor-
tídeos que seja específica para um tipo de estão disponíveis através de catálogos (im- tância industrial, como organismos
organismo, é possível detectá-lo através pressos ou via internet) ou firmas de pro- patogênicos (Arcuri, 1999a), pro-
da hibridização da parte homóloga do seu dutos para laboratório. dutores de substâncias de interesse
material genético com uma sonda, numa comercial, potencialmente perigo-
amostra de ácidos nucléicos oriunda de Filogenia molecular sos durante o processamento de ali-
uma outra ambiental (Stahl, 1996). Para A filogenia molecular permite a infe- mentos etc.;

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000

Biotecnologia 57

A B

C D

Figura 29 - Sumário das reações de hibridização e detecção de ácidos nucléicos com sondas de oligonucleotídeos em suporte sólido
NOTA: A - Imobilização do extrato de ácidos nucléicos de uma amostra ambiental em um suporte sólido, em geral membranas de nylon positivamente
carregadas ou nitrocelulose.; B - A sonda de oligonucleotídeos é previamente marcada com substâncias antigênicas (no caso de marcadores
não-radioativos). A sonda é hibridizada com a amostra de ácido nucléico (DNA ou RNA) numa reação em meio líquido, com temperatura e
outros parâmetros controlados. O excesso de sondas é removido por sucessivas lavagens da membrana. C - Um anticorpo específico para o
marcador da sonda, previamente ligado a um sistema detector (em geral uma enzima) é adicionado, embebendo-se a membrana em solução
própria. D - Um substrato da enzima detectora é adicionado à solução e o híbrido sonda-ácido nucléico é então detectado colorimetricamente
ou por emissão de luz através de fotografia com filme para raios X.

c) para organismos unicelulares, a fi-
logenia molecular permitiu grande
avanço no conhecimento por viabi-
lizar a inferência de relações evoluti-
vas que de outra forma não poderiam
ser obtidas, uma vez que organismos
unicelulares raramente são conserva-
dos como fósseis, como ocorre com
organismos mais complexos.
Finalmente, a manipulação dos dados
de seqüências de ácidos nucléicos, com o
auxílio de programas de computador, per-
mite análises relacionadas com a homolo-
gia e o alinhamento das seqüências, o que
implica em menor custo, especialmente
quando as análises são associadas à PCR
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000
e equipamentos automáticos de seqüen-
ciamento (Blumberg, 1987 e Bottger, 1996).
ALGUMAS APLICAÇÕES
DA BIOLOGIA MOLECULAR A
MICROORGANISMOS DE
INTERESSE AGROINDUSTRIAL
Exemplos e potencialidades no uso de
técnicas descritas anteriormente serão apre-
sentados para aplicação em atividades agro-
industriais.
Bactérias láticas para a
indústria de laticínios
Bactérias láticas constituem um grupo
de gram-positivas, não-patogênicas, não-
formadoras de esporos. Este grupo contém
os gêneros Lactococcus, Streptococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
Tais bactérias são utilizadas na fabrica-
ção de uma grande variedade de produtos
lácteos. A arte de produzir esta diversidade
de produtos baseia-se numa biotecnologia
clássica, cujas técnicas, com base princi-
palmente na seleção das bactérias láticas
usadas no processo de fermentação, foram
desenvolvidas há séculos.
As bactérias láticas contribuem para a
formação do sabor, aroma, textura e outras
características organolépticas que caracte-
rizam cada produto. Além disso, elas tam-
bém protegem as fermentações contra o
58
Bacteria
Green
non-sulfur
bacteria
Gram
positives
Purple
bacteria
Pyrodictium
Cyanobacteria
Flavobacteria
Thermotogales
Figura 30 - Árvore filogenética dos organismos vivos com base em seqüências de RNA ribossômico
FONTE: Dados básicos: Woese & Pace (1993).
NOTA: Os comprimentos das linhas são proporcionais às diferenças evolutivas.
desenvolvimento de microorganismos pa-
togênicos e deterioradores, pela produ-
ção de ácido lático, competição pelo subs-
trato e algumas vezes pela produção de
substâncias antimicrobianas, tais como as
bacteriocinas. Estudos têm sugerido que
algumas cepas de bactérias láticas podem
ter efeitos benéficos à saúde humana, tais
como efeito estimulador do sistema imu-
nológico, redução do risco de câncer e do
nível de colesterol no sangue, mas ainda
não há provas definitivas destes efeitos
benéficos (Renault, 1996).
Há poucos anos, a obtenção de bacté-
rias láticas com melhor performance tecno-
lógica, por exemplo, com maior capacidade
acidificante, maior capacidade proteolítica
ou aromatizante, assim como apresentando
resistência a bacteriófagos ou produzindo
bacteriocinas, somente poderia acontecer
por meios clássicos de seleção de isola-
dos obtidos direto da natureza ou após o
tratamento de uma cultura com agentes
mutagênicos, na esperança que apenas a
característica desejável fosse obtida sem
qualquer outra alteração causada por mu-
tações secundárias. Atualmente, os co-
nhecimentos em Biologia molecular e gené-
tica (tecnologia do DNA recombinante)
Archaea
Entamoebae
Euryarchaeota
Methanosarcina
Cren- Halophiles
Methano-
archaeota bacterium
Methan-
Thermoproteus ococcus
T.celer
permitem identificação, obtenção e, quan-
do necessário, modificações precisas do
gene ou genes responsáveis pela caracte-
rística desejada.
A tecnologia do DNA recombinante é
uma das mais poderosas ferramentas na
obtenção de bactérias láticas melhoradas
para desempenho industrial, sendo que o
microorganismo resultante deve ser equiva-
lente ao ancestral selvagem para ser de grau
alimentar (food grade). Os maiores avanços
nesta área têm sido descritos para o gênero
Lactococcus, para L. lactis em particular,
para o qual metodologias e uma variedade
de vetores e outras ferramentas genéticas
foram desenvolvidas. Lactococcus geneti-
camente modificados têm sido desenvol-
vidos para ser usados não só como culturas
starter (fermentos) para a elaboração de
produtos lácteos, mas também como veto-
res ou fábricas celulares para a produção
de novas enzimas, proteínas, expressão de
produtos homólogos ou heterólogos. Re-
centemente, tem-se estudado a possibi-
lidade do uso de algumas bactérias láticas
como vetores para novos antimicrobianos,
proteínas antigênicas (Mercenier & Tan-
nock, 1999 e Wells et al., 1993) e molécu-
las estimuladoras do sistema imunológico
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Biotecnologia
Eucarya
Animals
Slime
molds
Fungi
Plants
Ciliates
Flagellates
Trichomonads
Microsporidia
Diplomonads
(Steidler et al., 1995). Algumas bactérias
láticas estão sendo “engenheiradas” e ava-
liadas quanto à sua habilidade de atuar co-
mo vetores vivos na produção de novas
vacinas orais (Daly & Davis, 1998). Os
trabalhos com bactérias láticas estão ba-
sicamente no estádio laboratorial ou em
teste de avaliação através de produção em
pequena escala.
Bactérias lácticas geneticamente modi-
ficadas, com genes homólogos ou hete-
rólogos, devem ser avaliadas caso a caso
quanto à segurança para uso em produtos
alimentícios, levando-se em consideração
desde a origem do gene clonado até o efeito
do produto do gene e da nova característica
em relação aos produtos lácteos, ou seja,
do seu habitat até a saúde do consumidor.
A transferência horizontal de gene é outro
aspecto a ser considerado para o uso de
bactérias láticas geneticamente modifica-
das em alimentos (Huggett & Verschu-
ren, 1996). A clonagem de genes de uma
bactéria lática em outra bactéria lática, ou
em outra bactéria qualquer, em geral não
resultará na produção de um novo produto
que não tenha sido previamente consu-
mido, mas deve considerar-se que a con-
centração do produto poderá ser diferente.
Biotecnologia
Muitos estudos são ainda necessários,
particularmente para os outros gêneros,
além do Lactococcus, para os quais existem
poucas ferramentas como vetores quali-
ficados para uso em alimentos (food grade),
e como protocolos de análises. Maiores
conhecimentos dos processos metabóli-
cos em nível molecular, como identificação
de genes envolvidos e sua regulação, são
a mola-mestre para melhorar o desempenho
tecnológico da bactéria lática por modi-
ficação genética.
Ecologia microbiana ruminal
A síntese de proteína por microorga-
nismos ruminais desempenha um papel
fundamental na nutrição de animais ru-
minantes. A maior parte da microbiota
ruminal consiste de bactérias anaeróbias
estritas e protozoários ciliados. Estes dois
grupos determinam a maior parte da ativi-
dade fermentativa no rúmen (Nagaraja et
al., 1997). Fungos ruminais anaeróbios ocor-
rem em números mais baixos e seu papel na
digestão da celulose ainda não está com-
pletamente conhecido (Orpin & Joblin,
1997).
A população microbiana no rúmen e
sua diversidade são afetadas por diversos
fatores (Dehority & Orpin, 1997). A dieta
do animal ruminante é provavelmente um
dos mais influentes. A alteração da fermen-
tação ruminal pode ter efeitos positivos na
produção ruminal, quando se pretende
aumentar o desempenho animal através do
incremento em ganho de peso, aumento da
produção de leite ou da eficiência repro-
dutiva. O conhecimento da ecologia micro-
biana ruminal é, portanto, fundamental para
o desenvolvimento de estratégias de ali-
mentação que visem o aumento da efi-
ciência de utilização dos alimentos pelos
ruminantes. O controle da fermentação
ruminal tem sido realizado com resultados
parciais através do uso de produtos quí-
micos como isoácidos (por exemplo, isobu-
tirato para aumentar a produção de pro-
pionato e diminuir a produção de amônia
ruminal) (Piva et al., 1988) ou antibióticos
ionóforos, por exemplo, monensina, que em
última instância aumenta a concentração
relativa de propionato e diminui as con-
centrações de metano e acetato, aumen-
tando a eficiência de utilização da energia
contida no alimento (Lana & Russell, 1997).
Animais criados no pasto são expostos
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000
a inúmeros compostos naturais, presentes
nas forragens, devido ao seu metabolis-
mo secundário. Tais compostos secundá-
rios, como taninos, saponinas e alcalóides
são comumente relacionados com a queda
do valor nutritivo das forragens, quando
encontrados em concentrações elevadas
(Ayres et al., 1997). Por outro lado, alguns
estudos sugerem que taninos em baixas
concentrações podem proteger parte da
proteína dietética de sofrer degradação
ruminal e ser absorvida no intestino del-
gado (Barry, 1989).
O conhecimento dos mecanismos de
ação de compostos químicos sobre os gru-
pos de microorganismos ruminais, bem co-
mo o efeito da adição de substâncias para
o controle de subpopulações da microbio-
ta ruminal, como protozoários ou grupos
de bactérias com determinada atividade
metabólica, foi sempre complicado. Isso
devido à dificuldade de reproduzir o am-
biente ruminal em meios de cultura artifi-
ciais in vitro; como consequência, a im-
possibilidade de isolar todos os tipos de
microorganismos ruminais endógenos; e
devido à enorme complexidade do ecos-
sistema ruminal. As interações entre espé-
cies de microorganismos ruminais são
estudadas através de modelos muito sim-
plificados. Junte-se a esses o fato de que
os métodos convencionais de estimarem-
se populações microbianas, como conta-
gens diretas e estimativa através do número
de colônias viáveis, quando aplicadas a
amostras de conteúdo ruminal, resultam em
números bastante discrepantes.
Contagens diretas do conteúdo ruminal
e a técnica do número mais provável (MPN)
são influenciadas pelo horário da coleta,
técnicas de amostragem e meios de cultura
utilizados (Kajikawa et al., 1990). Contagens
que se baseiam em colônias viáveis, além
da influência dos fatores anteriormente
considerados, apresentam ainda eficiências
de plaqueamento dependente das espécies,
o que em geral resulta em estimativas me-
nores do que as contagens diretas. Outros
métodos, com base em concentrações de
substâncias encontradas naturalmente nas
populações naturais (purinas, ácido dia-
mino-pimélico etc.), apresentam também
vantagens e desvantagens que extrapolam
o objetivo deste trabalho.
Técnicas de Biologia molecular têm
demonstrado um grande potencial como
ferramentas para o avanço do conhecimen-
59
to da ecologia microbiana ruminal e de outros
ecossistemas complexos. Uma das ferra-
mentas utilizadas são sondas de oligonu-
cleotídeos desenhadas para se hibridizarem
as regiões espécie-específicas da molécu-
la de RNA ribossômico de tamanho 16S
(Raskin et al., 1997). Esta especificidade
permite a identificação e uma estimativa da
atividade metabólica da espécie ou grupo
microbiano em estudo, uma vez que a quan-
tidade de RNA ribossômico numa célula
mantém uma relação linear com a sua taxa
de crescimento (Arcuri, 1999b). Por exem-
plo, uma célula de Escherichia coli em
fase exponencial de crescimento contém 104
a 105 cópias da molécula de rRNA 16S
(Rosset et al., 1966). Portanto, esta técnica
expressa a abundância de uma seqüência
particular de rRNA em relação ao RNA total
extraído de uma amostra. Uma desvantagem
é que se trata de uma técnica relativamente
sensível, não permitindo inferência, quan-
do a população em estudo estiver abaixo
de 106 células/mL. A técnica denominada
PCR competitiva utiliza um controle interno
de DNA, com a finalidade de controlar va-
riações entre as reações, e permite a quan-
tificação confiável dos produtos da PCR
(Reilly & Attwood, 1998). É possível adian-
tar que esta técnica combina a especificidade
das sondas de oligonucleotídeos, porém são
dirigidas para os genes que codificam a
síntese do rRNA16S com a sensibilida-
de da PCR numa forma que permite a quan-
tificação de populações bacterianas de
ecossistemas complexos. Recentemente,
Reilly & Attwood (1998) concluíram que a
técnica de PCR competitiva permitiu a quan-
tificação da bactéria proteolítica Clostridium
proteoclasticum de forma acurada e rela-
tivamente rápida, a partir de amostras do
conteúdo ruminal de vacas que pastejaram
forragens ricas em proteína solúvel e po-
bres em carboidratos na Nova Zelândia.
Estes autores alertam que a preparação para
o método, isto é, a construção de primers
específicos e de controles internos de DNA
são etapas demoradas.
Várias outras áreas de manipulação da
microbiota ruminal têm sido pesquisadas,
entre elas destacam-se o aumento da ati-
vidade celulolítica (Orskov, 1995), utilização
de hemicelulose e biodegradação de lignina
(Jeffries, 1996), regulamentação de produtos
da fermentação (acetato e metano,em parti-
cular) (Cook, 1995), diminuição da atividade
proteolítica, aumento da produção bacte-
60
riana de aminoácidos específicos e fixação
anaeróbia de nitrogênio.
As limitações de aplicação de técnicas
de Biologia molecular, ou, genericamente,
de biotecnologia moderna para o aumento
do desempenho produtivo de ruminantes
incluem, segundo Nagaraja et al. (1997):
a) isolamento e identificação taxonômi-
ca de cepas para inoculação no rúmen
e recombinação de DNA;
b) isolamento e caracterização de enzi-
mas promissoras para aplicação in-
dustrial ou como inoculantes rumi-
nais;
c) nível de produção, localização e efi-
ciência de secreção de enzimas re-
combinantes;
d) estabilidade de genes introduzidos;
e) capacidade de sobrevivência e con-
tribuição ao funcionamento ruminal
de cepas geneticamente modificadas
introduzidas no rúmen.
Fixação de nitrogênio
Cerca de 85% da fixação de nitrogênio
é feita biologicamente. Organismos dia-
zotróficos são procarióticos que possuem
a habilidade de utilizar nitrogênio atmos-
férico (N2) como fonte para o crescimento
e a biossíntese. Tais organismos realizam a
redução do N2 a NH4, o que contribui para
o fornecimento de nitrogênio para várias
espécies vegetais de importância agro-
nômica, assim como as leguminosas soja,
feijão e forrageiras. As técnicas de Biologia
molecular têm contribuído significativa-
mente para a identificação e seleção de no-
vas espécies fixadoras de nitrogênio, bem
como para o aumento da sua fixação e do
conhecimento a respeito da especificidade
entre o organismo simbionte e as espécies
leguminosas (Moreira et al., 1993) e gra-
míneas, em particular cana-de-açúcar (Do-
bereiner & Pedrosa, 1987, Long & Stas-
kawicz, 1993 e Mackersie & Brown, 1987).
Uma importante área de aplicação da bio-
tecnologia moderna refere-se à possibi-
lidade de estabelecer relações filogenéticas
entre microorganismos a partir de caracte-
rísticas fisiológicas. Em razão disso sabe-
se hoje que a habilidade de fixar nitrogênio
atmosférico está disseminada em poucos
gêneros dos domínios de Eubacteria e
Archaebacteria (Schneider & Bruijn, 1996).
A família Rhizobiaceae para plantas legu-
minosas e o gênero Azotobacter para gra-
míneas são os grupos simbiontes mais
importantes. Bactérias filamentosas do gê-
nero Frankia são também importantes por
ser simbiontes de árvores (Valdes et al.,
1997). Um dos modelos filogenéticos mais
usados no caso da fixação biológica de ni-
trogênio é obviamente o sistema enzimático
nitrogenase. O complexo enzimático nitro-
genase apresenta uma estrutura altamen-
te conservada, isto é, há poucas diferenças
entre as diversas espécies diazotróficas
(Oliveira et al., 1999).
O isolamento e a identificação de es-
pécies ou cepas mais eficientes na fixação
do nitrogênio, em diversos ecossistemas e
relacionados com as diferentes espécies
vegetais, têm sido realizados através do
uso de marcadores genéticos de genes ne-
cessários para a síntese, atividade e regu-
lação da nitrogenase (Rosado et al., 1998).
Mais de 30 genes já foram relacionados com
o processo de fixação de nitrogênio. Os
genes para dinitrogenase e dinitrogenase
reductase fazem parte de um sistema com-
plexo de regulação, um regulon, ou seja,
uma rede interativa de operons (genes es-
truturais que são transcritos em conjunto,
sob o controle de um gene regulador). Este
sistema é denominado nif regulon. O com-
plexo nitrogenase está sujeito a diversos
controles. Estudos da estrutura das pro-
teínas que compõem o complexo nitrogenase
indicaram que a maioria das nitrogenases
contém molibdênio ou vanádio e ferro como
cofatores (Scott et al., 1983). Além disso,
dados de seqüenciamento dos genes re-
lacionados com o complexo nitrogenase ou
ainda com os genes codificadores do rRNA
16S, têm sido utilizados em estudos de co-
evolução entre os organismos fixadores de
nitrogênio e as plantas hospedeiras (Rei-
nhold et al., 1997).
Outras aplicações das ferramentas de
Biologia molecular incluem o rastreamento
de seqüências específicas de DNA, via PCR
como marcadores genéticos de cepas ge-
neticamente modificadas introduzidas em
ecossistemas naturais; e o balanço ener-
gético do processo eficiente de fixação de
nitrogênio, devido à grande demanda de
energia envolvida (Monza et al., 1997).
A habilidade de bactérias do gênero
Rhizobium interagir com raízes de plantas
leguminosas é mediada pela informação ge-
nética contida em um plasmídeo (Cramer
& Radin, 1990 e Kloepper & Beauchamp,
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.53-62, maio/jun. 2000
Biotecnologia
1992). O efeito da temperatura ambiente so-
bre a nodulação, sobrevivência e desem-
penho da simbiose foi estudado recente-
mente (Pinto et al., 1998). Estes autores
observaram que as temperaturas elevadas
no solo (45oC) podem afetar a sobrevivência,
o estabelecimento em nódulos e outras
propriedades simbiontes de diferentes cepas
de Rhizobium. Destas, as cepas simbiontes
do feijão isoladas do cerrado brasileiro
mostraram-se particularmente sensíveis a
choques térmicos freqüentes, devido ao
fato de nelas ocorrerem com maior freqüên-
cia recombinações genéticas ou deleções
de pequenas partes do material genético.
BIOSSEGURANÇA
Espera-se que organismos geneticamen-
te modificados exerçam influência profunda
e abrangente sobre toda a cadeia produtiva
de alimentos num futuro próximo. Devido a
isso os governos de vários países criaram
órgãos de regulamentação e controle da li-
beração de organismos geneticamente mo-
dificados no ambiente. No Brasil, o órgão
regulador é a Comissão Técnica Nacional de
Biossegurança (CTNBio), pertencente ao
Ministério da Ciência e Tecnologia. A CTNBio
controla, regulamenta e propõe normas para
o teste, manuseio e eventual liberação no meio
ambiente de organismos geneticamente mo-
dificados, incluindo viróides, vírus, células e
organismos multicelulares, produzidos ou não
no Brasil. Atualmente, existem cerca de 120
instituições públicas e privadas no país, cre-
denciadas pela CTNBio, para desenvolver
atividades com organismos transgênicos,
através da concessão de Certificados de
Qualidade em Biossegurança. Cerca de 700
processos de liberação planejada no meio
ambiente de um organismo geneticamente
modificado estão em andamento. Tais pro-
cessos incluem a elaboração de uma proposta
para a liberação planejada, a avaliação desta
pela CTNBio, com pareceres de comissões
setoriais específicas e a publicação do pare-
cer final no Diário Oficial da União. Todas as
informações referentes à CTNBio, bem co-
mo a legislação sobre organismos genetica-
mente modificados, podem ser encontradas
na internet (CTNBio, 1999).
CONCLUSÃO
Alguns poucos exemplos de cada área
foram utilizados para ilustrar o estado da
Biotecnologia
arte da biotecnologia relacionada com mi-
croorganismos em relação à agroindústria.
O uso de técnicas de Biologia molecular
tem sido advogado por muitos como um
recurso poderoso para o desenvolvimento
de novas cultivares e formas de produção
que permitam ao mundo fazer face ao cres-
cente aumento populacional e o inevitável
aumento da demanda por alimentos, fibras
e outras matérias-primas de origem animal
e vegetal. Juntem-se a esse desafio o impe-
rativo da preservação dos recursos natu-
rais e a melhoria da qualidade de vida da
população mundial. Estes últimos fatores
têm sido, em grande parte, utilizados como
justificativa para o uso crescente das téc-
nicas de Biologia molecular, tendo em vista
tão-somente o incremento da produtividade
ou do valor do produto acabado. Porém, é
também crescente a quantidade de notícias
e ações judiciais, em vários países, rela-
cionadas com o questionamento do uso
indiscriminado das técnicas de Biologia
molecular, sem os necessários testes de lon-
ga duração, para a criação e liberação no
meio ambiente de organismos geneticamen-
te modificados. Os produtos resultantes do
uso das técnicas de Biologia molecular,
bem como a eventual limitação do seu uso,
irão depender, portanto, não apenas de
interesses lucrativos de corporações agro-
industriais, mas especialmente dos limites
impostos pela sociedade em relação a ques-
tões éticas, sociais e ambientais.
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Biotecnologia 67

Biotecnologia na pecuária: genética molecular

Mario Luiz Martinez 1
Marco Antônio Machado 2
Ademir de Moraes Ferreira 3

Resumo - Os trabalhos de seleção dos animais têm ocorrido, tradicionalmente, com

base em seus desempenhos fenotípicos. A avaliação genética dos indivíduos, que se
baseia no fenótipo, é influenciada por uma série de fatores de meio que marcou o
mérito genético. Paralelamente, existem características de importância econômica
difíceis de ser medidas ou de baixa herdabilidade, para as quais os métodos
tradicionais de seleção não são efetivos. Nos últimos anos, com o avanço da genética
molecular, novas alternativas estão sendo disponibilizadas. Mapas genéticos, com
inúmeros marcadores moleculares, já se encontram disponíveis na maioria das
espécies domésticas de interesse econômico. O avanço tecnológico nesta área permitiu
a realização de diversos trabalhos voltados para a identificação de genes ou
marcadores associados a Lócus de Característica Quantitativa. A identificação destes
genes ou QTLs tem permitido que se estude a importância e o impacto da seleção
com auxílio de marcadores (MAS), e que se realizem manipulações em nível de
DNA, visando à geração de animais transgênicos.
Palavras-chave: Marcadores moleculares; QTL; Transgênicos; Genética; Biotecnologia.

INTRODUÇÃO
As diferenças genéticas entre indiví-
duos devem-se aos diferentes genes que
eles possuem. Estima-se que o genoma de
um bovino tenha cerca de 100 mil genes.
Alguns destes têm efeitos simples e direto,
tal como ocorre para a cor da pelagem. Isto
significa que é fácil identificar e selecionar
aqueles indivíduos que possuem estes
genes. Todavia, tais situações são raras,
pois, na maioria das características, incluin-
do as de importância econômica, como a
produção de leite ou ganho de peso e cres-
cimento, são muitos os genes que inte-
ragem para produzir o efeito final. Isto
significa que é difícil identificar um gene
em particular que tenha um efeito signifi-
cativo sobre determinada característica.
A habilidade do melhorista em reco-
nhecer animais que possuem alelos ou uma
combinação deles, que aumenta a produ-
ção, é muito limitada. A seleção clássica
baseia-se no fenótipo do indivíduo. Em
muitas situações, o fenótipo não se expres-
sa no indivíduo para características ligadas
ao sexo (leite e produção de ovos) ou em
características de difícil mensuração (efi-
ciência alimentar, resistência a doenças,
adaptação). Em alguns casos, o fenótipo
não é uma indicação precisa do genótipo.
Isto deve-se ao fato de que a variação ge-
nética em produtividade depende da va-
riação alélica em um grande número de
lócus, e a expressão gênica destes lócus é
altamente afetada pelos fatores do meio
ambiente. Neste caso, a variação da carac-
terística ou a variação genética é de na-
tureza quantitativa, e os lócus individuais
que afetam a expressão da característica
são denominados Lócus de Característica
Quantitativa (QTL) (Geldermann, 1975).
Além disso, produtividade e adaptação são
características compostas, consistindo de
muitos componentes e, freqüentemente,
existem correlações genéticas negativas
entre alguns destes como, por exemplo,
quantidade de leite e teor de proteína ou
gordura do leite. Isto diminui a resposta à
seleção, para cada um dos componentes
da característica (De Koning & Weller,
1994).
Para superar essas limitações, os me-
lhoristas utilizam métodos que se baseiam
nos parentes (pais, avós, tios, sobrinhos,
irmãos etc.), que apresentam parte de uma
mesma composição genética. Conseqüen-
temente, medidas do desempenho feno-

1
Engo Agro, Ph.D. Genética Quantitativa, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 – Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz
de Fora-MG. E-mail: martinez@cnpgl.embrapa.br
2
Engo Agro, D.S. Genética e Melhoramento, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 – Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz
de Fora-MG. E-mail: machado@cnpgl.embrapa.br
3
Veterinário, D.S. Zootecnia, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 – Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz de Fora-MG.
E-mail: ademirmf@cnpgl.embrapa.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000

68
típico de parentes fornecem informações
sobre o genótipo de um dado indivíduo
relacionado. Estes métodos são conhe-
cidos como seleção pelo pedigree, seleção
de família, ou teste de progênie, dependen-
do do tipo de parente usado. Todavia,
mesmo quando estes métodos são utiliza-
dos de uma forma ótima, a taxa de progres-
so genético é bem menor do que aque-
la que seria possível, se houvesse uma
perfeita informação genética sobre uma
característica. Além disso, a maioria das
tentativas, com base nesses métodos, em
combinar a produtividade das raças euro-
péias com a adaptação das raças nativas
tem falhado. Isso é devido, principalmen-
te, à inabilidade de fazer uma seleção si-
multânea das várias características. Em
particular, problemática é a necessidade de
avaliar indivíduos simultaneamente para
produtividade e para adaptação ao estresse
climático ou resistência à doença, o que
reduz a produtividade. Os métodos clássi-
cos de seleção não são também capazes de
identificar a presença, nas raças nativas,
de variáveis de um ou mais alelo raro de um
QTL que afeta positivamente a produtivi-
dade ou a qualidade dos produtos (Soller
& Beckmann, 1989). Essas variáveis nem
sempre são identificadas, porque sua pre-
sença é mantida encoberta, devido à baixa
produtividade da raça nativa, que, em geral,
tem uma grande proporção de variantes dos
alelos de um QTL, os quais afetam negati-
vamente a característica.
Os avanços nas tecnologias de DNA,
nos últimos dez anos, oferecem possi-
bilidades para a identificação de animais
geneticamente superiores de uma forma
mais direta. Os genes funcionais de cada
indivíduo constituem-se em uma pequena
parte (menos de 5%) do DNA total de um
indivíduo e, na maioria dos genes restan-
tes, não se conhecem ainda as suas fun-
ções. Entretanto, espalhado no genoma do
indivíduo, existem milhares de pequenos
fragmentos de DNA denominados micros-
satélites, que têm-se tornado muito úteis.
Estes segmentos de DNA são compostos
de simples di, tri ou tetranucleotídeos re-
petidos, que, quando amplificados através
de uma reação em cadeia de polimerase
(PCR), apresentam grande variação de
comprimento ou alelos entre os indivíduos
(Tautz & Schlotterr, 1994). Um microssaté-
lite típico contém 12 repetições, embora
possa variar de duas a 20 repetições. A im-
portância dos microssatélites, no estudo
de características de cunho econômico, é
que eles não exercem nenhum efeito sobre
a característica. Todavia, se um determi-
nado microssatélite está localizado perto
de um gene funcional importante, como para
a maior síntese de proteína do leite, ele tende
a ser herdado conjuntamente. Assim, por
meio da identificação do microssatélite
teremos boa chance de identificar os indi-
víduos que possuem o gene desejável.
O objetivo dos cientistas, que estudam
o genoma das espécies domésticas, é pro-
duzir mapas genéticos de ligação bastan-
te densos para ajudar na investigação de
genes simples de importância econômica
e de QTL que contribua para a variação
contínua de algumas características de im-
portância econômica. Os mapas de ligação
são de grande utilidade para desenvolver
estratégias para a seleção com auxílio de
marcadores (MAS).
A seleção para alelos de um QTL é uma
nova forma de seleção genética. Os prin-
cípios envolvidos nas técnicas da genética
quantitativa são relevantes para as formas
de seleção que são qualitativas. Os quatro
componentes do progresso genético (varia-
bilidade genética, intervalo de gerações,
intensidade de seleção e a precisão) têm
os seus equivalentes na seleção assistida
por marcadores e na seleção por alelos de
um QTL. As decisões, sobre o quê sele-
cionar, devem-se basear nos aspectos eco-
nômicos, para que o produto genético
possa ser usado comercialmente e o proce-
dimento de seleção a ser utilizado com
certeza seja uma combinação da seleção
quantitativa, MAS e seleção de alelos de
QTLs.
O desenvolvimento de marcadores ge-
néticos e os mapas de ligação têm per-
mitido que os lócus, que afetam caracte-
rísticas quantitativas e qualitativas (QTL
ou genes de efeito maior), sejam mapeados.
As ferramentas fornecidas pela tecnologia
do DNA revelarão muito da biologia das
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
Biotecnologia
características de importância econômica.
Tais mapas têm sido realizados para
investigar partes do genoma que contêm
genes que afetam características de inte-
resse, mas sem o conhecimento de possí-
veis lócus de efeito suficientemente grande
e que seja importante manipulá-los indi-
vidualmente (Beever et al., 1990, Bovenhuis
et al., 1992, Crawford et al., 1994 e Georges
et al., 1995).
MAPAS GENÉTICOS
DE LIGAÇÃO
Os métodos usados para descobrir poli-
morfismos em nível do DNA são ao acaso,
ou seja, o polimorfismo descoberto pode
estar localizado em qualquer posição do
genoma. Para máxima utilidade, depois de
descobrir marcadores com DNA polimór-
fico, eles devem ser mapeados, uns em
relação aos outros. Para isso, é necessário
que eles estejam segregando juntos em
uma mesma família. Por meio dos genóti-
pos dos pais e da progênie de cada famí-
lia, com relação a um determinado par de
marcadores, é possível determinar se eles
estão sendo transmitidos juntos ou sepa-
rados, e determinar a proporção de recom-
binação entre eles. Se um ou ambos os
pais são heterozigotos para ambos os
marcadores, informações sobre ligação e
recombinação podem ser obtidas, através
da distribuição dos marcadores entre os
genótipos das progênies.
Amostras de DNA podem ser armaze-
nadas indefinidamente e pequenas quan-
tidades são necessárias para análise de
polimorfismo. À medida que um laboratório
continua a identificar o genótipo dos mem-
bros de uma família, com relação a outros
marcadores polimórficos que são desco-
bertos, informações sobre a segregação de
mais e mais marcadores se acumulam nos
membros daquela família. Conseqüente-
mente, quando um novo marcador é desco-
berto, ele pode ser mapeado facilmente
através da análise do genótipo dos mem-
bros da família. A informação acumulada
sobre a segregação dos marcadores ante-
riormente mapeados é, então, usada para
identificar novos marcadores que este-
jam ligados a estes, e também o grau de
Biotecnologia
recombinação entre o novo e o mais pró-
ximo marcador anteriormente identificado.
Não é necessário fazer novamente a análise
do genótipo de nenhum dos marcadores
anteriormente identificados. Dessa forma,
após algum tempo, vai-se construindo um
mapa genético de ligação de uma espécie
ou raça.
Embora qualquer grupo de famílias
possa ser usado para o mapeamento de
marcadores polimórficos, isso é mais pre-
ciso quando os pais das famílias são os
mais heterozigotos e também os maiores
possíveis. É por isso, que o grupo de famí-
lias usado para o mapeamento bovino
consiste de grandes famílias de irmãos-
completos, produzidos por múltipla ovula-
ção e transferência de embriões, ou de
meio-irmãos (Barendse et al., 1994 e Bishop
et al., 1994).
Várias técnicas, com base no polimor-
fismo do DNA, são utilizadas para a cons-
trução dos mapas genéticos de ligação:
Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP); Single Strand Conformation
Polymorphism (SSCP); Simple Sequence
Repeats (Microssatélites ou SSR); Amplified
Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Marcadores que se baseiam em genes co-
nhecidos são importantes para “amarrar”
mapas de diferentes espécies (O’Brien et
al., 1993). Marcadores com base em mi-
crossatélites são importantes pela sua fa-
cilidade na análise do genótipo e por pro-
porcionarem mapas de densidade ilimitada
(Beckmann & Soller, 1990).
No Quadro 1, estão sumarizados os
mapas genéticos de ligação para diferentes
espécies. Para efeito comparativo, são mos-
tradas as informações equivalentes dos
projetos do genoma humano e do camun-
dongo.
ESTRATÉGIAS PARA
A DETECÇÃO DE QTL
Atualmente, duas maneiras básicas
estão sendo utilizadas para detectar a asso-
ciação entre marcadores e variação do QTL.
Uma, é a do gene candidato (Rothschild &
Soller, 1997), que se baseia no estudo da
variação de uma característica em rela-
ção à variação do nível do DNA em genes
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
69
conhecidos, julgados envolvidos direta- de crescimento em bovinos e a porcenta-
mente na fisiologia e desenvolvimento gem de proteína do leite. Em galinhas, viro-
da característica em estudo. Quando tais ses endógenas, como um grupo, mostram
associações são identificadas, a seleção grande indicação de estarem associadas
pode ser com base na variante conhecida com a variação genética em produtividade
do gene, com efeito positivo sobre a carac- (Gavora et al., 1991 e Iraqi et al., 1991, 1994).
terística. Outra maneira, é a utilização do Estudos de simulação têm indicado que,
mapa genético de ligação, que envolve em pequenas populações fechadas, um
mapear QTL em uma região específica do pequeno número de diferentes variantes
cromossomo, por meio da ligação a um de um determinado gene é necessário ser
marcador anônimo, e estabelecer associa- mantido. Admitindo-se que a estrutura de
ções entre alelos específicos do marcador um variante do gene candidato também
e alelos de efeitos positivos ou negativos representa um variante funcional, uma sim-
no QTL e, então, basear a seleção no alelo ples análise de variância é necessária para
do marcador. identificar a associação entre variante da
estrutura de DNA e a característica em
Utilização de genes estudo, considerando as variantes estru-
candidatos turais como a variável independente, e o
A utilização de genes candidatos para valor da característica como a variável de-
identificar a associação entre marcadores pendente.
e QTL tem produzido bons resultados. Isto O uso de genes candidatos nesses ti-
inclui a associação entre variantes da pos de análise é muito atrativo, pois os
kappa-caseína e lactoalbumina em gado e resultados, quando positivos, podem ser
a produção de proteína do leite e a quali- usados por MAS em todas as populações
dade do queijo (Bovenhuis & Weller, 1994); que tenham o variante positivo do gene
entre variantes RFLP do receptor do estro- candidato. Contudo, até o momento, ape-
gêneo e fertilidade (Rothschild et al., 1994); nas cerca de 2 mil genes foram clonados de
entre variantes SSCP do lócus do hormônio um total de 100 mil estimados como fun-
QUADRO 1 - Situação atual dos mapas genômicos de algumas espécies
Porcenta-
Marcadores gem de
Espécies Bancos de Dados
mapeados abrangência
do genoma
Humano > 15.000 ~ 95% http://gdbwww.gdb.org/
http://www.genome.wi.mit.edu/
Camundongo > 14.000 ~ 100% http://www.informatics.jax.org/
http://gdbwww.gdb.org/
Bovinos > 870 ~ 90% http://sol.marc.usda.gov/genome/cattle/cattle.html
http://www.ri.bbsrc.ac.uk/bovmap/bpvmap.html
Ovinos > 250 ~ 75% http://dirk.invermay.cri.nz/
http://tetra.gig.usda.gov.8400/sheepgbase/manager.html
Suínos > 750 ~ 90% http://www.public.iastate.edu/~pigmap/pigmap.html
http://sol.marc.usda.gov/genome/swine/swine.html
Aves ~ 600 ~ 90% http://poultry.mph.msu.edu/
http://www.ri.bbrsc.ac.uk/chickmap/
Eqüinos > 300 ~ 85% http://www.vgl.ucdavis.edu/~ lvmillon/
http://www.ri.bbrsc.ac.uk/horsemap/
70
cionais em vertebrados. Isto significa que
a grande maioria dos QTLs provavelmente
será encontrada entre os 98% dos genes
ainda não-clonados.
Utilização de
marcadores anônimos em
mapas genéticos de ligação
Os mapas genéticos de ligação são cons-
tituídos, na sua grande maioria, de mar-
cadores anônimos. No entanto, estes mar-
cadores podem ser utilizados para detectar
associações com QTL. Diferentes popu-
lações podem ser utilizadas para acom-
panhar a segregação de marcadores e a
associação destes com características de
interesse agronômico.
Mapeamento do QTL
em cruzamento entre duas
linhagens consangüíneas
O princípio básico desta forma de ma-
pear QTL é bem ilustrado, usando o cru-
zamento entre linhagens consangüíneas
(Soller, 1974 e Soller et al., 1976). Considere,
por exemplo, duas linhagens consangüí-
neas que difiram em um lócus de um mar-
cador M, tal que a linhagem 1 tenha ge-
nótipo MM e a linhagem 2 genótipo mm.
Se a região do cromossomo próximo ao
marcador é uma em que não existe nenhum
QTL que afete a característica em estudo, a
média esperada da característica dos indi-
víduos F2 de genótipo MM será a mesma
dos indivíduos F2 de genótipo mm. Con-
tudo, se próximo ao marcador existe um
QTL denominado A que afete a caracte-
rística, de maneira que o genótipo da linha-
gem 1 é MA/MA e da linhagem 2 é ma/ma,
uma comparação entre a média da caracte-
rística dos indivíduos F2 com genótipos
MM e mm irá refletir apenas o efeito quan-
titativo do genótipo AA comparado com o
genótipo aa. Uma diferença significativa
entre os genótipos MM e mm da popula-
ção de F2 será indicativa de um QTL nas
proximidades do marcador M, mostrando
assim uma ligação. Vários resultados, com
base neste tipo de delineamento, têm sido
reportado em plantas (Kahler & Wehrhahn,
1986, Edwards et al., 1987, Weller, 1987,
Paterson et al., 1988, Weller et al., 1988 e
Stuber et al., 1992).
Mapeamento do QTL dentro de
populações puras
Em populações puras, tais como aves
ou gado, alelos dos marcadores e do QTL
devem estar em equilíbrio de ligação, ou
então próximos deste, a não ser que o mar-
cador e o QTL estejam muito pertos um do
outro. Nesse caso, as relações entre alelos
do marcador e do QTL serão diferentes
entre os cromossomos que estiverem se-
gregando na população. Isto é, alguns
cromossomos estarão carregando a combi-
nação MA, outros Ma, outros mA e outros
ma, e os indivíduos na população carrega-
rão todas as combinações possíveis desses
gametas. Desde que apenas os indivíduos
heterozigotos (MA/ma ou MA/mA) são
informativos para as análises de ligação,
isto significa que, quando marcadores com
apenas dois alelos são usados, uma grande
porção de indivíduos da população não
será informativa para este tipo de estudo.
Mesmo nessa situação, haverá indivíduos
que serão heterozigotos em ambos os
lócus, do marcador e do QTL, e o mapea-
mento do QTL será com base nas relações
específicas entre os alelos do marcador e
do QTL das progênies destes indivíduos.
Quando marcadores com múltiplos alelos
(polialélicos) são usados, a proporção de
indivíduos heterozigotos para os dois lócus
será muito maior.
Em um delineamento de irmãos-com-
pletos, uma grande família é formada atra-
vés do acasalamento de dois indivíduos.
Se um é heterozigoto para o marcador e o
outro é homozigoto, haverá dois tipos de
genótipos para o marcador entre as pro-
gênies. Se ambos os pais são heterozigotos
para os mesmos alelos do marcador, haverá
três tipos de genótipo entre as progênies;
e quatro tipos, se ambos os pais são hetero-
zigotos, porém com alelos diferentes para
o marcador polialélico. Em qualquer si-
tuação, o estudo da ligação baseia-se na
diferença entre os valores da característica
das progênies com diferentes genótipos
para o marcador. A potência das análises
estatísticas com base numa única família
de irmãos-completos é muito limitada, pois
os pais de uma única família, mesmo sendo
heterozigotos para o marcador, podem não
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
Biotecnologia
ser heterozigotos para o QTL. Dessa forma,
a análise de ligação geralmente requer a
combinação das informações de diversas
famílias. Existem outros tipos de delinea-
mentos estatísticos que permitem uma
análise eficiente (Soller & Genizi, 1978,
Knott & Haley, 1992, Plotsky et al., 1993 e
Andersson et al., 1994).
No delineamento de meio-irmãos, uma
grande família é formada através do acasala-
mento de um único indivíduo, geralmente
um macho, com muitas fêmeas. Se o pai em
comum é heterozigoto para o marcador, a
progênie pode ser dividida em dois gru-
pos, de acordo com o alelo marcador trans-
mitido pelo pai em comum. A análise é en-
tão realizada da mesma forma que a de
irmãos-completos (Soller & Genizi, 1978,
Geldermann et al., 1985, Gonyon et al., 1987,
Weller et al., 1990, Anderson-Eklund
& Rendel, 1993, De Koning & Weller,
1994, Georges et al., 1995 e Martinez et al.,
1998 ab).
Mapeamento do QTL através do
cruzamento de duas populações
Um delineamento especial, que com-
bina algumas características do cruzamento
entre linhagens consangüíneas, pode ser
utilizado para mapear QTL através do cru-
zamento entre populações que estejam se-
gregando os mesmos alelos dos marca-
dores, que estão próximos ou já tenham
fixados os alelos do QTL, que afetam a ca-
racterística de interesse (Beckmann &
Soller, 1988). Esse tipo de delineamento é
particularmente apropriado para mapear
QTL associado à resistência a doenças,
adaptação e produtividade em cruzamento
entre raças nativas e exóticas.
SELEÇÃO COM AUXÍLIO
DE MARCADOR (MAS)
A combinação do desenvolvimento
científico e tecnológico permitiu que, no
início da década de 80, houvesse metodo-
logia disponível para identificar genótipos
para produtividade e adaptação, direta-
mente no nível do DNA. Isso abre um novo
caminho para o desenvolvimento e imple-
mentação de programas de melhoramento
genético, que se baseiam na seleção no
Biotecnologia
nível do DNA do indivíduo. Nesses pro-
gramas, variantes na estrutura do DNA em
um determinado lócus servem como um
marcador da presença de alelos, tendo efei-
tos positivos ou negativos no QTL que
afeta a característica. A seleção de indiví-
duos que possuem alelos favoráveis no
QTL, com base na avaliação direta de seu
DNA, é denominada de MAS (Soller &
Beckmann, 1983, Smith & Simpson, 1986,
Soller & Beckmann, 1989 e Soller, 1994).
Quando MAS é comparada à seleção com
base no fenótipo, pode ser mais precisa,
pois não é afetada pelos efeitos do meio
ambiente, não é limitada a um sexo e não
requer testes caros ou que destruam o indi-
víduo. MAS pode ser realizada bem cedo
na vida do indivíduo, reduzindo o intervalo
de gerações; ainda pode incluir todos os
indivíduos e mesmo aqueles que ainda não
nasceram, através da análise do genótipo
do embrião, e assim aumentar a intensidade
de seleção.
Desde que MAS analise a variação alé-
lica de cada QTL, ela pode ser capaz de
identificar algum variante de um alelo
escondido em raças nativas. MAS pode
também permitir a identificação e a rápida
introgressão de alguns poucos alelos do
QTL de raças melhoradas que aumentem a
produção em raças nativas adaptadas, ou
para a transferência de lócus específicos
associados à resistência das raças adapta-
das ou nativas para as raças melhoradas
(Beckmann & Soller, 1987).
IMPACTO DA TECNOLOGIA
DE MARCADORES
A seleção com auxílio de marcadores
(MAS) utiliza-se das informações de re-
giões específicas dos cromossomos, em
que os genes que afetam os QTLs estão
localizados, para identificar indivíduos com
combinações favoráveis de QTLs. Existem
três fases no desenvolvimento de progra-
mas de seleção com auxílio de marcadores.
Na fase de detecção, os polimorfismos do
DNA são usados com marcadores para
detectar QTLs que estejam segregando em
determinadas populações com freqüências
alélicas específicas. Um ou mais alelos
associados ao QTL são identificados, o
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
efeito do alelo do QTL determinado e a sua
posição no genoma é estimada. Na fase de
avaliação, os marcadores são testados em
populações-alvo ou em famílias, para
determinar se o QTL está segregando nes-
tas populações. Na fase de implementação,
os marcadores são utilizados dentro e entre
famílias, para gerarem um banco de dados
de genótipos. Esses dados serão então
combinados com as informações feno-
típicas e de pedigree, na avaliação do
mérito genético dos indivíduos dentro de
uma população.
Vários QTLs têm sido detectados em
populações experimentais e comerciais de
bovinos, suínos e ovelhas. Em gado de
corte, QTLs têm sido detectados para peso
ao nascimento (Rocha et al., 1992),
desenvolvimento de chifre (Georges et al.,
1993b), crescimento na pré-desmama,
gordura e área do olho do lombo (Beever
et al., 1990), hipertrofia muscular (Grobet et
al., 1997) e doença de Pompe (Reichmann
et al., 1994). Em gado de leite, têm si-
do reportados marcadores para produção
de leite e seus componentes (Cowan et
al., 1990, Hoeschele & Meinert, 1990,
Bovenhuis et al., 1992 e Georges et al., 1995),
para produção de queijo (Graham et al.,
1984), para a síndrome de Weaver (Georges
et al., 1993a) e para BLAD (Shuster et
al., 1992 e Kehrli et al., 1994). Em suínos,
QTLs têm sido reportados para fertilida-
de (Rothschild et al., 1996), crescimento do
nascimento até 30kg, espessura média de
toucinho e porcentagem de gordura abdo-
minal (Andersson et al., 1994). Em ovelhas,
um QTL tem sido reportado para fecun-
didade (Montgomery et al., 1993) e hiper-
trofia muscular (Cockett et al., 1994). Em
aves, Kaam et al. (1998) realizaram uma
varredura no genoma, utilizando 368 mar-
cadores microssatélites, e identificaram
QTLs afetando o consumo de alimentos
e o peso aos 48 dias. Tuiskula-Haavisto et
al. (1998) localizaram genes afetando a
qualidade de ovos, enquanto Szydlowski
& Szwaczkowski (1998) identificaram QTLs
associados ao peso corporal, produção
inicial de ovos, peso médio dos ovos e
idade na maturidade sexual.
Vários estudos de simulação têm com-
71
parado os programas de seleções clássicos
àqueles que incorporam informações sobre
marcadores aos dados fenotípicos (MAS).
As estratégias que utilizam MAS têm sido
sempre superiores, nas primeiras gerações,
às estratégias nas quais a seleção é feita
apenas pelo fenótipo (Lande & Thompson,
1990, Zhang & Smith, 1992, Gimelfarb &
Lande, 1994, Whittaker et al., 1995 e
Meuwissen & Goddard, 1996). Gimelfarb
& Lande (1994) reportaram que a resposta
à seleção na primeira geração foi mais do
que duas vezes superior com o uso de MAS
do que com a seleção clássica. A magnitude
do aumento é dependente do número de
gerações de seleção, tamanho e estrutura
da população, número de marcadores, her-
dabilidade da característica e magnitude
do efeito do QTL. A seleção assistida por
marcadores é mais eficiente em grandes
populações e nas primeiras gerações de
seleção (Lande & Thompson, 1990, Zhang
& Smith, 1992, Gimelfarb & Lande, 1994,
Whittaber et al., 1995 e Meuwissen &
Goddard, 1996) e quando ocorre a seleção
antes da mensuração da característica
(Meuwissen & Goddard, 1996).
Quando a herdabilidade aumenta, o
aumento na resposta, devido à incorpo-
ração da informação do marcador, é redu-
zido em relação à seleção com base apenas
no valor genético (EBV), como medido
atualmente.
Gibson (1994) e Garrick (1997) usaram
simulação para estimarem a resposta à
seleção em uma população, na qual um QTL
e marcadores a ele ligado estavam segre-
gando. Em ambos os estudos, a resposta
pela MAS foi maior nas primeiras gerações
de seleção. Todavia, a resposta em um
tempo após 10 - 15 gerações de seleção foi
maior através da seleção pelo EBV, igno-
rando as informações sobre os marcadores.
Estes autores consideram que este resul-
tado é devido à redução da média dos
valores poligênicos nos animais selecio-
nados com os alelos desejáveis do QTL.
Após um aumento na freqüência dos alelos
desejáveis do QTL, levando-os em direção
à sua fixação, a média residual dos valores
poligênicos na população é menor do que
a proveniente da seleção com base no EBV,
72
ignorando as informações do QTL. Isto
surge, inicialmente, através da redução da
precisão da estimativa do mérito genético
total e nas gerações posteriores, através
da criação do desequilíbrio gamético.
ANIMAIS TRANSGÊNICOS
A seleção entre animais domésticos vi-
sa aumentar a freqüência de genes favo-
ráveis para uma mesma raça ou linhagem.
A utilização de outras raças traz uma maior
variabilidade na população sob seleção,
que no entanto pode não ser suficiente
para alcançar os objetivos do programa.
As modernas técnicas moleculares são
capazes de introduzir uma variabilidade
genética ilimitada, visto que genes de inte-
resse podem ser isolados de uma espécie e
transferidos para outra, gerando assim um
animal transgênico.
Manipulação genética
do DNA
O genoma de um organismo constitui-
se de todo DNA encontrado em sua célula.
Uma bactéria possui um genoma pequeno
com cerca de 6 mil genes. Um mamífero,
por outro lado, possui em torno de 100 mil
genes, sendo o genoma constituído de 97%
de DNA não codificante e apenas 3% de
genes ou seqüências codificantes. Os ma-
míferos apresentam um número de genes
16 vezes maior do que uma bactéria e o
genoma, como um todo, apresenta cerca
de 500 vezes mais DNA.
Um gene pode ser manipulado e estu-
dado em detalhes, se este for isolado do
resto do genoma por meio de clonagem
molecular. O processo de clonagem utiliza
vetores para o transporte e manipulação
de genes. Estes, freqüentemente, são
plasmídeos bacterianos ou vírus que in-
fectam bactérias. Estes vetores são como
parasitas, que apenas se multiplicam
quando dentro de uma célula. A maioria
dos vetores apresenta um genoma bastan-
te pequeno (5 a 50 genes), podendo ser
manipulado in vitro facilmente. O DNA do
vetor, contendo o gene incorporado, é
facilmente multiplicado e isolado, consti-
tuindo-se um clone. A clonagem molecular
requer que seja avaliado um grande número
de clones numa biblioteca de DNA.
Uma biblioteca de DNA é um conjunto
de inúmeros clones, ou fragmentos de
DNA, de um determinado organismo. Uma
biblioteca de DNA de mamífero é produzida
pelo isolamento do DNA genômico do
mamífero; digestão do DNA com enzimas
de restrição, o que vai resultar num gran-
de número de fragmentos de DNA e incor-
poração dos fragmentos de DNA, alea-
toriamente, num grande número de vetores,
sendo um fragmento para cada vetor. Os
produtos da proliferação de cada combi-
nação vetor/fragmento constituem-se um
clone. Após um grande número de gera-
ções, todas as seqüências de DNA, pre-
sentes no genoma do mamífero, estarão
representadas na biblioteca. Uma vez cons-
truída, a biblioteca é analisada detalha-
damente na procura de clones específicos,
que são identificados e propagados sepa-
radamente dos outros clones. O clone
isolado, contendo o fragmento de DNA de
interesse, pode ser utilizado para diversos
fins, como a produção de animais trans-
gênicos.
Produção de animais
transgênicos
Um animal transgênico pode ser defi-
nido como aquele que apresenta seqüên-
cias de DNA exógenas, oriundas de outros
organismos da mesma espécie ou de espé-
cies diferentes. Os primeiros animais
transgênicos foram produzidos por micro-
injeção de DNA em pró-núcleos de ratos
(Gordon et al., 1980). No entanto, a defini-
ção de animal transgênico foi refinada após
o trabalho de Gordon & Ruddle, em 1981,
que postularam que um animal transgênico,
além de apresentar uma seqüência de DNA
exógena, deve ser capaz de transmitir o gene
exógeno aos seus descendentes e também
apresentar a expressão deste gene. Ratos
transgênicos têm sido amplamente utili-
zados para o estudo do controle genéti-
co de uma função fisiológica, controle da
expressão de genes, doenças de herança
genética, doenças virais humanas e também
como modelo para a modificação genética
de animais domésticos (Jaenisch, 1988).
Acredita-se que mais de 10 mil estirpes de
ratos transgênicos já foram produzidas.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
Biotecnologia
Atualmente, a comunidade científica e
a indústria privada estão bastante interes-
sadas na produção de animais transgênicos
de grande porte, embora o custo seja extre-
mamente elevado. Em bovinos, os esforços
estão concentrados em genes de alto re-
torno econômico, tais como:
a) produção de proteínas farmacêu-
ticas com expressão nas glândulas
mamárias;
b) alteração genética de proteínas do
leite para a produção de uma formu-
lação apropriada a crianças;
c) modificação genética de proteínas
do leite, visando aumentar a produ-
tividade, qualidade ou diferentes de-
rivados do leite;
d) modificação genética na vaca, vi-
sando aumentar a produção de leite
ou adaptação ambiental.
Existem dois procedimentos bastante
utilizados na produção de animais trans-
gênicos. O primeiro a ser desenvolvido foi
a microinjeção direta de DNA no núcleo de
um embrião unicelular. Poucos anos depois,
tornou-se possível o cultivo de células
prematuras de embriões de rato in vitro,
que vão gerar linhagens de rato. Uma alte-
ração no genoma destas células provoca
uma alteração no genoma dos ratos deri-
vados dela (Bishop, 1999).
Microinjeção direta em
pró-núcleos
Um embrião unicelular pode ser isolado
horas após a fertilização. Neste estádio de
desenvolvimento, o embrião contém dois
núcleos (pró-núcleos), sendo um originado
do gameta masculino e o outro do gameta
feminino. Cada pró-núcleo contém apenas
um conjunto de cromossomos, em vez de
dois conjuntos encontrados numa célula
normal diplóide. Utilizando uma seringa de
vidro extremamente fina, com o auxílio de
micromanipuladores, é possível a intro-
dução de DNA exógeno em um dos pró-
núcleos. O DNA exógeno é freqüentemen-
te integrado aos cromossomos dos pró-
núcleos, possivelmente porque a célula
reconhece o DNA exógeno como um frag-
mento de DNA quebrado que precisa ser
reparado. O embrião continua a se desen-
Biotecnologia
volver normalmente e, após a fusão dos
pró-núcleos, este é introduzido no oviduto
de uma fêmea (Bishop, 1999).
A eficiência deste procedimento, em
ratos, varia de 1% a 4% de microinjeções
de DNA, para resultar numa progênie
transgênica (Brinster et al., 1985). Em
ovinos, suínos e caprinos, a eficiência de
transformação, utilizando microinjeções, é
em torno de 1% (Rexroad, 1992 e Elbert &
Schindler, 1993). Em bovinos, a eficiência
de transformação é bem mais baixa, ficando
em torno de 0,2%. Esta baixa eficiência em
bovinos, eleva demasiadamente o custo de
produção de um animal transgênico e ainda
pode ser atribuída a fatores reprodutivos e
de genética molecular. No lado reprodutivo,
os zigotos podem ser produzidos por
fertilização in vitro ou por recuperação
cirúrgica in vivo. Este último é mais
eficiente, no entanto, é menos utilizado,
devido ao fato de requerer um grande
número de vacas a ser superovuladas.
Mesmo sem a microinjeção de DNA, ape-
nas 30% dos embriões chegam a blasto-
cistos capazes de iniciar a gestação e ape-
nas 50% a 60% destes blastocistos chegam
a produzir um bezerro (Dominko & First,
1992 e Monson et al., 1992). Uma melhoria
na eficiência reprodutiva, aumentaria a
eficiência de transformação de bovinos.
A eficiência do lado molecular também
é bastante baixa. Em bovinos, a eficiência
de integração gênica ao nascimento é de
apenas 4% a 5% (Rexroad, 1992), enquanto
em suínos esta chega a 10%, e em ovinos
foram reportadas até 35% (Brinster et al.,
1985 e Wall & Seidel, 1993). As causas
dessa baixa integração e expressão podem
ser devidas a vários fatores como: cons-
trução microinjetada, pureza do DNA,
tempo de microinjeção, raça ou estirpe,
inserção aleatória, degradação do DNA e
disponibilidade de sítios de integração
(Brinster et al., 1985).
Alguns procedimentos alternativos
foram utilizados com o objetivo de aumen-
tar a eficiência de transformação em bo-
vinos. Krisher et al. (1994) utilizaram um
screening por PCR em embriões micro-
injetados, buscando transferir apenas em-
briões comprovadamente transgênicos.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
No entanto, a sensibilidade da técnica de
PCR é tanta, que esta detectava DNA não-
integrado, sendo estes embriões falso-
positivos.
Apesar de todas estas dificuldades, bo-
vinos transgênicos já foram produzidos por
microinjeção de DNA, visando quase que
exclusivamente à produção de proteínas far-
macêuticas expressas no leite (Krimpenfort
et al., 1991).
Introdução de DNA em células
não-diferenciadas
Este é um procedimento alternativo,
quase que exclusivo para ratos. Foi desen-
volvido a partir do isolamento de células
chamadas stem cells ou ES, que se proli-
feram indefinidamente (pluripotentes) em
meio de cultura (Martin, 1981). Este método
consiste em incubar um fragmento de DNA
clonado com células ES e aplicar uma rápida
descarga elétrica no meio, visando alterar
temporariamente a permeabilidade da
membrana das células ES, fazendo com que
haja a penetração de fragmentos de DNA
presentes no meio. Além da pluripotência,
as células devem apresentar totipotência,
ou seja, a capacidade de diferenciar-se, ini-
ciando o desenvolvimento do embrião. As
células são injetadas num blastocisto hos-
pedeiro e podem colonizar o embrião for-
mando uma linhagem germinativa que vai
dar origem a um animal quimérico, conten-
do o DNA introduzido (Jaenisch, 1988). Se
a quimera atingir os órgãos reprodutivos,
esse animal vai produzir metade de seus
gametas originada das células ES e a outra
metade originada de células normais. O
cruzamento desse animal heterozigoto com
animais normais vai dar origem a diversos
animais heterozigotos, e o cruzamento entre
os heterozigotos vai resultar em indivíduos
homozigotos para o gene artificialmente
inserido. Uma desvantagem deste proces-
so é que esses cruzamentos adicionais
levam tempo e, no caso de bovinos, é bas-
tante demorado.
Uma vantagem deste procedimento é a
possibilidade de selecionar genótipos in
vitro antes da transferência das células ES
para o embrião. Este fato possibilita o uso
de construções especialmente desenhadas,
73
visando uma inserção sítio específica por
meio de uma recombinação homóloga
(Bishop, 1999).
Células potenciais ES de bovinos, ovi-
nos e suínos apresentam pluripotência,
mas não-totipotência (Anderson, 1992).
Algumas exceções, no entanto, são os tra-
balhos de Sims & First (1993) e First et al.
(1994), em que foram produzidos bezerros
transgênicos a partir de culturas de células
ES totipotentes.
Vários fatores, como métodos de isola-
mento de células ES; métodos de cultivo e
prevenção de diferenciação, estádio do
embrião para fornecer células ES, paren-
tesco e identificação de descendentes afe-
tam substancialmente o isolamento, deriva-
ção, cultivo, pluripotência e totipotência
das células potenciais ES de bovinos.
O uso da introdução de DNA em células
não-diferenciadas de bovinos, pode provi-
denciar um sistema mais eficiente de trans-
ferência gênica. No entanto, muitos traba-
lhos ainda necessitam ser desenvolvidos
para que esta técnica possa ser mais efi-
cientemente utilizada (First et al., 1994).
ASPECTOS DA SAÚDE ANIMAL
Os avanços na medicina veterinária e
as pesquisas na área zootécnica tiveram
considerável impacto na produção animal,
através do controle ou da eliminação de
algumas das devastadoras doenças que
afetam a indústria animal. Apesar destes
avanços, as doenças continuam sendo o
fator de maior impedimento à obtenção de
produções mais eficientes, sendo respon-
sáveis por cerca de 20% das perdas do
potencial de produção nos Estados Uni-
dos (Report..., 1984). Perdas por doenças
infecciosas derivam não apenas da morte
dos animais, mas também da perda da
eficiência dos que sobrevivem. No Brasil,
perdas equivalentes a 50kg de ganho de
peso foram registradas em bezerros de
até 12 meses de idade (Ploeger et al., 1990).
Segundo Honer & Gomes (1990), um bo-
vino infestado com carrapato e vermes, se
não for tratado, sofre perdas de 18 a 47kg
de peso/ano. Furlong et al. (1996) estimaram
em fêmeas mestiças Holandês-Zebu queda
74
na produção de 23%, devido à infestação
por carrapatos. Teodoro et al. (1998) esti-
maram perda de 26% (529kg) na produção
de leite por lactação em vacas holandesas
infestadas com carrapatos.
Base genética da resistência
a doenças
A ciência da resistência a doenças en-
globa as áreas da imunogenética, biologia
molecular, manejo e Medicina veterinária,
e é afetada pela influência do meio ambiente
que contribui para a resistência ou para a
falta desta. Hutt (1974) considera doença
como sendo qualquer condição que afete
saúde, produtividade ou reprodução sub-
normal. Ele enumera uma série de doenças
causadas por um único gene, ou por alguns
poucos, que produzem susceptibilidade a
elas, inclusive esterilidade em novilhas
brancas, baixa viabilidade e problemas
digestivos em carneiros cinza e câncer de
olho em bovino, entre outras. Recente-
mente, descobriu-se uma herança simples,
como a mioloencefalopatia degenerativa
progressiva weaver em gado Pardo Suíço
e a deficiência adesiva de ligação aos leu-
cócitos (BLAD) em gado Holandês. Outras
condições deletérias, que têm herança
simples, provavelmente serão descobertas
no futuro. Alguns destes genes são retidos
na população em freqüência relativamente
alta, porque eles estão ligados a genes que
aumentam a produção. A condição weaver
está associada a um aumento de 674kg de
leite e 26kg de gordura na raça Parda Suíça
(Hoeschele & Meinert, 1990). A grande
ênfase da pesquisa em terapia via genes
em humanos e o alto grau de homologia do
DNA entre bovinos e humanos sugerem
que a terapia via genes possivelmente será
utilizada em bovinos. A caracterização do
gene CD18, em bovinos que apresentam
os sintomas da BLAD, tem 83% de homo-
logia de seqüência com o gene que causa
condição similar em humanos. Em algumas
situações, o bovino pode servir como um
protótipo para se estudarem certas condi-
ções em humanos. Defeitos causados por
um único gene provavelmente não terão
no futuro o mesmo impacto que tiveram no
passado, pois existem, atualmente, méto-
dos que permitem a detecção de animais
heterozigotos para uma determinada do-
ença. Um exemplo disto é a detecção de
animais heterozigotos para BLAD (Kehrli
et al. 1992).
Lie (1990) sugere que a resistência es-
pecífica a uma doença está restrita a algu-
mas doenças ou patógenos e que é nor-
malmente influenciada por um único gene
de efeito maior. Por outro lado, a resistência
geral a doenças não está limitada a pató-
genos e é influenciada pelo efeito cumu-
lativo de muitos genes e pelos efeitos dos
fatores ambientais. A grande preocupação
da indústria, desde muito tempo, são as
doenças infecciosas. A literatura é farta em
trabalhos que demonstram variação gené-
tica para resistência a doenças em muitas
espécies, inclusive nas de grandes ani-
mais (Nielsen et al. 1996, Steine, 1996 e
Emanuelson, 1997). As estimativas de her-
dabilidade para resistência a um antígeno
são geralmente baixas, mas têm variado, de
muito baixas até a 0,7. Se esta ampla
variação nos valores das herdabilidades é
específica dos antígenos e espécies, ou
simplesmente causada pela variância da
amostragem, fica difícil de ser determinada.
Shook (1989) discutiu a seleção para re-
sistência a doenças, apontou critérios de
seleção, revisou os custos das doenças em
nível dos rebanhos, e concluiu que a sele-
ção para resistência a doenças era neces-
sária e que todos os segmentos da indús-
tria animal necessitavam criar facilidades
para o melhoramento genético dessa re-
sistência.
O problema básico na seleção para
resistência a doenças é a obtenção de da-
dos. Na Noruega e Suécia, onde qualquer
antibiótico ou outro medicamento só pode
ser administrado pelo veterinário, todos os
tratamentos em animais são registrados em
uma central de dados, e servem como in-
formações para a seleção. Nos programas
de melhoramento de gado de leite da No-
ruega, cetose e mastite foram incluídas
como objetivos de seleção, desde 1978
(Solbu & Lie, 1990). Embora ganhos ge-
néticos importantes tenham sido obtidos
para as características de doenças nos pro-
gramas de teste de progênie, isso provocou
uma redução de cerca de 15% na produção
de leite. Se a mastite não é incluída como
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
Biotecnologia
um critério de seleção, o aumento genético
seria de 1,3% de mastite em seis anos.
Todavia, quando a mastite é incluída como
critério de seleção, ela é reduzida em 0,9%.
A utilização de marcadores e de técni-
cas analíticas pode auxiliar no processo de
seleção de resistência a doenças. Os tipos
de antígenos do linfócito bovino (BoLA),
equivalente ao complexo maior de histo-
compatibilidade (MHC) em humanos, têm
sido mencionados como associados à
saúde e à produção em bovinos. Os tipos
BoLA têm sido chamados, por Lewin (1989),
de genes de efeito maior (major genes). Este
autor discute as classes de genes I, II e III
do MHC e claramente indica a associação
dos antígenos da classe I do BoLA com
várias doenças, particularmente com a
leucose bovina. Biozzi et al. (1979), com
base em seus experimentos de seleção para
resistência a doenças em camundongos,
concluíram que: “O efeito da regulação
poligênica da resposta à seleção contra
antígenos é essencialmente não-especí-
fico. O mesmo grupo de genes regula a
resposta dos anticorpos para muitos com-
plexos imunogênicos não-relacionados
com aqueles utilizados durante a seleção
genética”. Essa conclusão claramente dá
suporte à idéia da seleção para resistência
geral a doenças.
Imunocompetência geral
O uso de um critério único de seleção
para a resistência a doenças pode trazer
riscos em potencial. Por exemplo, Shook
(1989), ao discutir sobre o uso em potencial
da contagem de células somáticas (CCS)
no leite, como um critério para a seleção de
touros, sugere que a avaliação genética e a
seleção de touros pelas filhas com menos
CCS poderiam levar à melhoria do manejo e
aos programas de tratamento para reduzir
a incidência de mastite. Todavia, a seleção
a longo prazo para diminuição da CCS pode
também reduzir a habilidade da vaca a res-
ponder às infecções do úbere. A extensão
com que a CCS prediz o status do meca-
nismo de defesa e reflete a presença ou
ausência de mastite não é conhecida. Em
gado de leite, a mastite é a doença que traz
maiores prejuízos ao criador, principalmente
em rebanhos de alta produção e é causada
Biotecnologia
por um grande número de microorganis-
mos. A seleção efetiva contra a infecção
causada por um ou alguns poucos micro-
organismos pode ter valor limitado, pois
outros microorganismos poderão rapida-
mente tornar-se os agentes infecciosos
predominantes. Isto ilustra porque a sele-
ção deve ser para a imunocompetência
geral ou para a resistência a uma ampla
variedade de infecções. Almlid (1981) dis-
cutiu os aspectos da seleção indireta para
resistência a doenças e sugeriu o uso de
grupos sangüíneos, sistemas de histo-
compatibilidade maior, atividade leucócita,
enzimas e hormônios. Todavia, embora a
seleção indireta tenha sido sugerida há
muito tempo, ela não tem sido implemen-
tada com sucesso.
Em resumo, pode-se dizer que existem
diferenças genéticas aditivas para resis-
tência a muitas doenças, o que dá suporte
à seleção. Embora os valores das herdabi-
lidades estimadas tenham sido, em geral,
baixos em muitas situações, isto pode ter
sido conseqüência de diagnóstico e anota-
ções imprecisas. Os desafios de animais
com patógenos específicos para medir
imunidade não parece ser algo factível na
prática, mas os desafios com moléculas
específicas podem ser úteis. Esperam-se
que, em futuro próximo, informações sobre
problemas de saúde e seus respectivos
tratamentos sejam registrados, à seme-
lhança do que já ocorre rotineiramente na
Noruega e Suécia, o que facilitará na im-
plementação dos programas de seleção.
A forma mais provável para melhorar o
diagnóstico e o registro dos eventos será
medir a imunocompetência geral dos touros
nos programas de inseminação artificial. A
precisão dos resultados poderá ser melho-
rada à medida que os conhecimentos sobre
genética molecular e imunogenética aumen-
tarem. A precisão da avaliação dos touros
para os problemas de saúde poderá ser
verificada através de estudos de controle
em dados obtidos sobre estes problemas
nos rebanhos. Devido ao aumento do
custo com a saúde dos bovinos, à medida
que a produção aumentar, bem como as
restrições quanto ao uso de drogas e medi-
camentos nos sistemas de produção animal,
os touros para inseminação artificial pos-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.67-78, maio/jun. 2000
sivelmente serão avaliados e selecionados
para aumentar a resistência a doenças em
suas filhas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As tecnologias que afetam o melho-
ramento genético podem ter seus efeitos
sobre a estrutura do melhoramento ou do
setor de produção da estimativa do mérito
genético e/ou da precisão das estimativas
do valor genético. A tecnologia dos marca-
dores tem seus efeitos em cada uma dessas
áreas, através de várias aplicações: produ-
zindo genótipos juvenis desejáveis, antes
de mensurar o fenótipo; utilizando MAS
para característica que não faz parte dos
critérios de seleção atuais ou para a que já
faz parte e também para verificação de pa-
rentesco.
Qualquer tecnologia que afete a prolifi-
cidade dos animais, sua idade ao primeiro
cio e sua vida reprodutiva, certamente
afetará a mudança genética. Tecnologias
reprodutivas, tais como clones, partição de
embriões, coleta de ovócito e o uso de célu-
las embrionárias, aumentarão a intensidade
de seleção e reduzirão o intervalo de gera-
ções. Espera-se que a aplicação da seleção
com auxílio de marcadores permita que as
decisões de seleção sejam realizadas em
idades mais precoces e, assim, afete a es-
trutura genética da população. Como já
mencionado, isso trará grandes benefícios
para as características que não podem ser
medidas antes de uma determinada idade
ou que seja dependente do sexo do indiví-
duo. O uso de marcadores genéticos tem a
capacidade de permitir a predição do mérito
genético para características que são difí-
ceis de ser mensuradas e por essa razão
não participavam dos critérios de seleção.
Associações entre marcadores e alelos de
QTLs podem predizer o desempenho de
características, tais como a marmorização e
a maciez da carne, sem a necessidade da
medição de animais em grande escala. Além
disso, marcadores para características que
fazem parte dos objetivos específicos de
um selecionador, mas que não estão dentro
do objetivo geral da seleção, tais como a
resistência a uma determinada doença ou
alguma característica morfológica, podem
75
ser avaliados sem a necessidade de incluir
estas características em programas nacio-
nais de avaliações. Dekkers (1999), em seu
trabalho sobre a aplicação da tecnologia
da genética molecular no melhoramento no
século XXI, concluiu que existe uma grande
oportunidade para melhorar as taxas de
ganho genético nas populações de animais
domésticos, desde que as informações
sobre as tecnologias moleculares sejam
incorporadas aos programas de seleção.
Conclui, ainda, que o uso errôneo destas
informações pode levar a um ganho gené-
tico subótimo nas primeiras gerações e um
ganho reduzido nas posteriores.
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Biotecnologia 79

Biotecnologia na pecuária: tecnologias reprodutivas

Mario Luiz Martinez 1
Ademir de Moraes Ferreira 2
Marco Antônio Machado 3

Resumo - Os avanços sobre as técnicas reprodutivas iniciam-se com a inseminação

artificial, responsável pelo grande aumento do potencial genético dos animais. Os
aspectos relativos à transferência de embriões e à fertilização in vitro são técnicas que
visam basicamente multiplicar, de forma mais intensa, fêmeas de genótipos superiores,
assim como a sexagem de espermatozóides e de embriões, e a produção de clones em
animais. Os impactos sobre o ganho genético da ovulação múltipla e transferência de
embriões, bem como das demais tecnologias reprodutivas sobre a viabilidade
econômica da utilização destas técnicas, buscam efetivamente a melhoria da eficiência
técnico-econômica dos sistemas de produção.
Palavras-chave: Fertilização in vitro; MOET; Sexagem; Clonagem; Reprodução;
Biotecnologia; FIV.

INTRODUÇÃO
Os aumentos na eficiência da produção
dos rebanhos, nos últimos 40 anos, prin-
cipalmente nos países desenvolvidos, têm
sido espetaculares. Índices de desempe-
nho, tais como produção de leite por vaca
e taxa de crescimento em gado de corte,
praticamente dobraram nesse período.
Esses resultados foram possíveis pela uti-
lização de inovações tecnológicas associa-
das aos benefícios econômicos que pro-
porcionaram à pecuária. Muito do ganho
produtivo obtido foi conseqüência da me-
lhoria constante do potencial genético dos
animais, facilitado pela melhoria das técni-
cas de reprodução, que indiscutivelmen-
te contribuíram para reduzir o custo do
aumento da eficiência reprodutiva.
Os novos conhecimentos em repro-
dução, que vêm sendo gerados em ritmo
acelerado, permitirão não só o incremento
da produção e produtividade na pecuária,
mas também a perpetuação de genomas de
espécies ameaçadas, uma necessidade
urgente nos países em desenvolvimento
(Mariante & Bem, 1992), além de contribuir
para a melhoria das técnicas já existentes,
bem como para o desenvolvimento de no-
vas tecnologias reprodutivas, das quais
depende o sucesso das biotecnologias de
manipulações genéticas (Headon, 1994 e
Sainz, 1997).
Os maiores investimentos em Ciência
e Tecnologia nos últimos anos, nos paí-
ses em desenvolvimento, aproximam-se
de 0,7% do PIB, enquanto nos países in-
dustrializados situam-se ao redor de 3,0%.
Isso explica porque a maioria dos avan-
ços científicos, que possibilitaram o de-
senvolvimento da Biotecnologia moderna,
foi gerada pela comunidade científica dos
países industrializados (Carneiro, 1998). A
importância da biotecnologia, num futu-
ro próximo, pode ser exemplificada pela
estimativa do valor projetado no mercado
global para investimento em pesquisas e
em transgênicos, em torno de dois a três
bilhões de dólares para o ano 2000 e cerca
de seis bilhões em 2005 (Carneiro, 1998).
Todas as áreas da Biotecnologia estão
em processo contínuo de evolução rápida,
sendo inevitáveis as transformações que
ocorrem ou ocorrerão no setor agropecuá-
rio e industrial de maneira geral, decorren-
tes desse processo, sendo que qualquer
país ou região que pretenda participar e
competir no mercado mundial não pode
deixar de considerar esse fato.
O objetivo deste artigo é revisar os
principais avanços científicos ocorridos
na pecuária, descrevendo e discutindo as
biotecnologias de reprodução já em uso
ou aquelas promissoras para um futuro
próximo, e analisar as perspectivas de seu
uso para a continuidade do progresso dos
criadores.
TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO
ANIMAL
As biotecnologias reprodutivas são de
fundamental importância para o desenvol-
vimento da pecuária no país, independente

1
Engo Agro, Ph.D. Genética Quantitativa, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz de
Fora-MG. E-mail: martinez@cnpgl.embrapa.br
2
Veterinário, D.S. Zootecnia, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz de Fora-MG.
E-mail: ademirmf@cnpgl.embrapa.br
3
Engo Agro, D.S. Genética e Melhoramento, Pesq. EMBRAPA Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Dom Bosco, CEP 36038-330 Juiz
de Fora-MG. E-mail: machado@cnpgl.embrapa.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000

80
de quais sistemas de produção de leite
devam vigorar no futuro, com animais
puros (zebuínos ou taurinos) ou mesti-
ços.
Inseminação artificial
A inseminação artificial tem sido a
biotecnologia da reprodução de maior
sucesso e eficácia em produção animal,
sendo responsável por índices de in-
cremento genético na pecuária leiteira
em torno de 1,0% a 1,5% ao ano (Lohuis,
1995).
A inseminação artificial revolucionou
a população comercial de gado de leite nos
últimos 50 anos, permitindo a disseminação
de genótipos superiores em grande escala.
Em alguns países, praticamente 100% das
vacas de leite são acasaladas através da
inseminação artificial. A rápida dissemina-
ção dessa tecnologia deveu-se à combi-
nação de fatores genéticos, econômicos e
técnicos. O seu uso permitiu o estabeleci-
mento dos testes de progênie e, conse-
qüentemente, a avaliação do mérito gené-
tico de touros em muitos rebanhos. Além
disso, ela tornou disponíveis os melhores
genótipos a toda a população de animais.
A pesquisa genética foi bastante favore-
cida com a inseminação artificial, em virtude
de poder usar os touros em vários reba-
nhos, o que eliminou o confundimento do
efeito do touro com o efeito do rebanho,
no desempenho produtivo. Os avanços
téc-nicos relativos aos aspectos de
qualidade, envasamento, congelamento e
armazena-mento do sêmen tornaram a
inseminação artificial uma prática indicada
e confiável, e fizeram com que seu custo se
mantivesse praticamente constante nos
países desen-volvidos, isso permitiu a sua
ampla utili-zação.
As vantagens zootécnicas e econômi-
cas da inseminação artificial têm aumen-
tado a substituição do acasalamento natu-
ral pelo seu uso nos rebanhos de gado de
leite em diversos países. Segundo infor-
mações da Associação Brasileira de Inse-
minação Artificial (Asbia) (Evolução...,
1997), cerca de 2.861.851 fêmeas bovinas
(4,71%) foram inseminadas no Brasil no ano
de 1997, sendo 1.339.022 de leite (8,68%) e
1.531.830 (3,38%) de corte. Esses números
mostram que a técnica ainda é pouco utili-
zada no Brasil, embora consagrada e muito
utilizada em outros. Na maioria dos países
desenvolvidos, o uso da inseminação artifi-
cial varia de 60% a 90%. Nos Estados Uni-
dos, segundo Freeman & Lindberg (1993),
cerca de 70% do gado de leite é acasalado
artificialmente, enquanto a maioria dos 30%
restantes é acasalada pela primeira vez com
touros filhos de inseminação artificial. Isto,
aliado à melhoria de manejo e alimentação,
tem permitido um grande aumento na pro-
dução de leite.
A maioria dos programas comerciais
com inseminação artificial usa sêmen con-
gelado. Todavia, os produtores da Nova
Zelândia inseminam a maior parte de suas
vacas com sêmen resfriado, durante uma
pequena temporada. Desta maneira, o nú-
mero de touros necessários para atender a
população de bovinos é menor, pois, na
técnica de congelamento do sêmen, muitos
espermatozóides morrem. Assim, a pressão
de seleção pode ser maior sem necessaria-
mente ter de usar mais recursos, ou seja,
pode-se obter a mesma taxa de ganho gené-
tico com um custo menor.
Os fatores técnicos, econômicos e ge-
néticos são diferentes para gado de corte.
Em países como o Canadá, Estados Unidos,
Austrália e Brasil, os rebanhos de gado
de corte são constituídos por um número
muito maior de animais, o que ocorre ao
contrário em países europeus. Isso dificulta
a identificação de cios e pode tornar o uso
da inseminação artificial menos indicado,
pela menor eficiência e, portanto, maior
custo. Além disso, como as características
relacionadas com a produção de carne
podem ser medidas em ambos os sexos, o
teste de progênie oferece menos vanta-
gem que no caso de gado de leite. A com-
binação destes fatores faz com que o uso
da inseminação artificial em gado de corte,
na maioria dos países desenvolvidos, seja
menor do que 10% (Cunningham, 1998).
Diversos fatores não permitem que a
inseminação artificial seja utilizada inten-
samente em muitos países em desenvol-
vimento (Chupin & Schuh, 1993). Em geral,
a baixa produção de leite por vaca (1.000
a 2.000 litros por lactação) faz com que o
custo da inseminação artificial seja pro-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
Biotecnologia
porcionalmente elevado em relação ao in-
cremento de produção obtido. Este custo
torna-se ainda maior devido aos estresses
ambiental e nutricional a que são subme-
tidas as vacas, com os deficientes meios
de transporte e comunicação que fazem com
que a inseminação artificial apresente
resultados inferiores. Outro fator adicional
é o número escasso de vacas em controle
leiteiro oficial, que é a base de sustentação
para os programas de teste de progênie,
daí ser impossível obter os mesmos ganhos
genéticos que aqueles alcançados nos
países em desenvolvimento.
Chupin & Thibier (1995) e Chupin &
Schuh (1993) realizaram um excelente tra-
balho de diagnóstico do uso da insemi-
nação artificial nos países desenvolvidos
e em desenvolvimento, respectivamente,
nos quais verificaram que mais de 50 mi-
lhões de inseminações eram realizadas
por ano. Os países desenvolvidos com
cerca de 30% dos bovinos do mundo eram
responsáveis por aproximadamente 83%
das inseminações artificiais. Nestes países,
o número total de inseminação artificial
vem-se declinando, acompanhando a
diminuição do número de vacas leiteiras.
Em contrapartida, nos países em desenvol-
vimento, esse número vem aumentando,
mesmo a despeito dos fatores desfavo-
ráveis já mencionados. A inseminação
artificial é uma tecnologia que será, ainda
por muito tempo, a grande ferramenta res-
ponsável pelo melhoramento dos reba-
nhos.
A maior limitação na aplicação da inse-
minação artificial continua sendo a baixa
eficiência na identificação dos cios, pois
esta taxa não-identificada varia de 40% a
60% (Roche & Mihm, 1996). A necessidade
de assistência técnica especializada perió-
dica, por onerar o custo de produção, fez
com que a técnica da inseminação artificial
só fosse utilizada por produtores com certa
escala de produção e boa margem de lucro
por litro de leite produzido. Por esse mo-
tivo, torna-se imperioso o apoio de órgãos
governamentais de fomento para estabe-
lecimento e manutenção de programas
comunitários de inseminação artificial,
principalmente para médios e pequenos
produtores.
Biotecnologia
Transferência de embriões
A transferência de embriões compreen-
de a superovulação de doadoras, coleta e
transferência de embriões para as recepto-
ras, a fresco ou congelados. A transferência
de embriões foi inicialmente desenvolvi-
da através de técnica cirúrgica. Nos últimos
20 anos, os métodos de coleta, congela-
mento e transferência de embriões bovinos
têm sido aperfeiçoados substancialmente,
e os países europeus tiveram uma grande
influência científica no desenvolvimento
dessa tecnologia em bovinos.
A coleta cirúrgica, congelamento e
transferência de embriões provenientes de
vacas superovuladas tiveram origem em um
laboratório de pesquisa em Cambridge
(Rowson, 1971, Rowson et al. 1972, Wilmut,
1972 e Wilmut & Rowson, 1973). Este labo-
ratório foi o primeiro a produzir animais
idênticos, através da micromanipulação de
embriões e também o primeiro a realizar expe-
rimentos de clones através da transferên-
cia de núcleo em várias espécies, como bo-
vinos, ovinos, suínos e eqüinos (Willadsen,
1979 e Willadsen & Polge, 1981). O pro-
gresso desta tecnologia na Europa foi pa-
ralelo ou precedido pelos estudos condu-
zidos nos Estados Unidos e Japão. O uso
da transferência de embriões vem cres-
cendo em todo o mundo, com um total de
482.996 embriões transferidos em 1996, dos
quais 10.140 foram conduzidos na Áfri-
ca (2,5%), 169.201 na América do Norte
(41,0%), 49.861 na América do Sul (12,0%),
64.119 na Ásia (15,5%), 111.321 na Europa
(27,0%) e 8.354 na Oceania (2,0%), segundo
Thibier (1998), sem computar vários países
que não enviaram relatórios à Sociedade
Internacional de Transferência de Em-
briões.
Atualmente, é possível superovular
vacas e efetuar coletas não-cirúrgicas com
um desempenho médio em torno de quatro
embriões por coleta. O congelamento dos
embriões em nitrogênio líquido já é realiza-
do como rotina, embora a eficiência seja
reduzida, quando comparado com a trans-
ferência de embrião a fresco. Da mesma for-
ma, a implantação não-cirúrgica ou inovu-
lação já é também uma rotina.
O principal benefício da transferência
de embriões é produzir mais bezerros de
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
uma mesma vaca, do que seria possível
através da reprodução normal. Uma vaca
chega a ter cerca de 75 mil ovócitos em
seus ovários (Hansel & Godke, 1992), e
produz em média quatro a cinco bezerros
em toda a sua vida através da reprodução
normal. Com a transferência de embriões
ela pode ter de 25 a 30 bezerros e com as
novas tecnologias como a fertilização in
vitro pode chegar a 100 ou mais bezerros.
Os benefícios para aumentar a eficiência
reprodutiva de vacas selecionadas são:
a) vacas geneticamente superiores po-
dem contribuir mais para os progra-
mas de melhoramento. Esta contri-
buição pode ser maximizada caso
seus filhos sejam selecionados para
os programas de teste de touros e
posterior uso na inseminação arti-
ficial;
b) aumento da taxa de seleção materna,
que combinada com a rápida mu-
dança genética, pode ser usada para
estabelecer programas especiais de
melhoramento (MOET) (Nicholas &
Smith, 1983), podendo até dobrar o
ganho genético em relação aos pro-
gramas convencionais.
A transferência de embriões pode tam-
bém ser utilizada para a rápida expansão
da genética de rebanhos elites, como nos
programas especiais de melhoramento
(MOET) que foram ou estão sendo execu-
tados no Canadá (TEAM), Dinamarca
(FY-BI), Finlândia (Asmo), França (Gene-
tique Avenir), Alemanha (Osnabrück),
Inglaterra (Genus) e Nova Zelândia (Del-
ta) (Callesen et al., 1996). De 1985 a 1995, o
programa MOET da Dinamarca com gado
de leite, denominado projeto FY-BI, foi uma
parte essencial das tentativas de melhorar
o potencial genético do gado de leite di-
namarquês, usando sistematicamente su-
perovulação e transferência de embriões.
Muitos dos resultados deste projeto podem
ser encontrados nos trabalhos de Callesen
et al. (1992, 1995, 1996, 1997).
A transferência de embriões pode ainda
ser utilizada para reduzir custos de trans-
porte internacional de material genético
superior, substituir com rapidez os genó-
tipos de uma população ou ainda aumentar
a possibilidade de gêmeos após a bipartição
81
e transferência.
Um dos entraves na adoção de progra-
mas de transferência de embriões está na
necessidade de as vacas elites, utilizadas
como doadoras, serem retiradas do sistema
de produção (Brockington & Martinez,
1996). Outro fator limitante na sua aplica-
ção é a grande variação no número de
ovulações e de embriões viáveis obtidos
em cada superovulação (Betteridge &
Rieger, 1993). O avanço nos conhecimen-
tos do controle fisiológico da dinâmica
folicular fará com que a regulação dos ciclos
estrais deixe de ser sustentada em bases
empíricas (Hansel & Godke, 1992) e, com
isso, certamente as respostas superovula-
tórias serão melhores e mais uniformizadas,
reduzindo o custo do embrião, que varia
de um país para outro, mas que em geral
é superior a US$ 100,00. O custo elevado
do produto nascido, em muitos casos, é
incompatível com o momento econômico
da atividade leiteira no Brasil, o que tem
desestimulado sua adoção por maior nú-
mero de produtor.
Isto tem feito com que a técnica seja
basicamente utilizada em vacas de alto valor
genético, as denominadas elites. Atual-
mente, nos países desenvolvidos pratica-
mente 100% dos touros jovens para teste
de progênie são produzidos através da
transferência de embriões.
Fertilização in vitro (FIV)
As pesquisas nos últimos anos têm-se
concentrado na fertilização in vitro, tecno-
logia quase toda conduzida dentro do la-
boratório. Ovócitos imaturos são coletados
de ovários de animais vivos ou de animais
abatidos e, posteriormente, maturados e
fertilizados em laboratório e mantidos em
cultivo para se desenvolverem até um
determinado estádio, quando então são
transferidos para uma receptora ou con-
gelados para posterior transferência. To-
do o processo é conhecido como Produção
in vitro (PIV) de embriões, usando-se tam-
bém comumente a terminologia Fertilização
in vitro (FIV). Este procedimento foi des-
crito em detalhes por Gordon (1994) e expe-
riências mais recentes foram revisadas por
Tervit (1997).
Nos últimos cinco a sete anos, a produ-
82
ção de embriões através da FIV tem sido
bastante acelerada, conseqüência da aspi-
ração de ovários em matadouros ou da
aspiração transvaginal in vivo (punção
folicular), com auxílio de equipamento de
ultra-som. Um grupo de pesquisadores da
Irlanda foi um dos pioneiros no estudo da
FIV, utilizando ovários de vacas de mata-
douros (Lu et al., 1987). A exploração comer-
cial da FIV foi posteriormente implementa-
da na Dinamarca, com base na obtenção
de ovócitos por meio da punção folicular
(Pieterse et al., 1988, 1991, Schans et al.,
1992 e Kruip & Boni, 1994). Este procedi-
mento tornou-se uma forma muito atrativa
para a produção de animais provenien-
tes de doadoras elites, incluindo aquelas
com problemas reprodutivos (Den Daas
& Merton, 1994). Quando utilizada em
novilhas, a FIV pode contribuir significati-
vamente para o melhoramento genético dos
rebanhos (Greve et al., 1993). O grande
desenvolvimento da FIV já pode ser obser-
vado na Europa e Japão, onde foram trans-
feridos, respectivamente, 6.848 e 4.642
embriões produzidos in vitro.
Embora várias pesquisas estejam sendo
desenvolvidas, visando às respostas mais
eficientes na FIV, ainda não se obteve uma
taxa de sucesso economicamente viável.
Em geral, menos de 20% dos ovócitos fer-
tilizados transformam-se em embriões
viáveis para a transferência (Sainz, 1997),
sendo também maior a perda durante a
gestação. O resultado final é que embriões
produzidos pela tecnologia de FIV ainda
apresentam menor fertilidade do que aque-
les embriões convencionais, em que se
obtêm, normalmente, taxas de gestação de
60%. Segundo Callesen et al. (1998), a viabi-
lidade de embriões provenientes de FIV,
transferidos não-cirurgicamente, tem sido
animadora, gerando taxas de gestação em
torno de 50% a 55%, apenas 10% menor
do que com embriões produzidos in vivo.
O aumento da taxa de mortalidade fetal até
um máximo de 20% tem sido observado em
gestações com embriões oriundos de FIV
(Reichenbach et al., 1992). Bezerros fracos
e grandes, com aumento da incidência de
partos distócicos, têm sido descritos para
gestação de embriões produzidos pela
FIV, mas é necessário um número maior de
dados e registros mais precisos sobre os
eventos e as dificuldades do parto, e a
determinação precisa do peso do bezerro
nascido, para que se possam tirar conclu-
sões mais definitivas. Revisões sobre os
aspectos da morfologia e viabilidade dos
embriões produzidos in vivo versus in vitro
foram realizadas por Greve et al. (1993) e
Avery & Greve (1993, 1995).
É também aceito, em geral, que a viabi-
lidade de embriões congelados produzidos
via FIV é inferior à dos embriões conge-
lados produzidos in vivo (Mermillod et al.,
1992, Massip et al., 1993ab e Wurth et al.,
1994), e os resultados ainda não apresen-
tam níveis aceitáveis. Até então não se co-
nhecem as causas dessa diferença na via-
bilidade entre os embriões produzidos via
FIV e à dos embriões produzidos in vivo,
bem como os métodos para melhorar a efi-
ciência na coleta de ovócitos.
Embora a produção de embriões pela
FIV deva contribuir decisivamente para
uma maior eficiência reprodutiva, como
instrumento de multiplicação rápida do
material genético melhorado existente,
encurtando o intervalo de gerações e inten-
sificando a seleção, sua importância vai
além do interesse comercial, pois, ao permi-
tir a produção em larga escala de ovócitos
maturados e fecundados, servirá de ferra-
menta indispensável para outras biotecno-
logias, como clonagem, produção de célu-
las totipotentes, preservação de ovócitos,
transgênese, formação de gêmeos idênticos
e marcadores genéticos (Trounson, 1992).
Um bom ajustamento da técnica de FIV
poderá melhorar a sua eficiência, porém
serão necessários conhecimentos mais
profundos dos processos moleculares e
imunológicos, envolvendo suas diversas
etapas (Trounson, 1992 e Gordon, 1994).
A Embrapa Gado de Leite tem sido pro-
curada por algumas cooperativas de grande
porte, que demonstraram interesse em
montar laboratórios visando à produção
maciça de fêmeas F1 (Girolando), tão logo
a técnica da FIV apresente eficiência eco-
nomicamente viável.
Sexagem de espermatozóides
e de embriões
A seleção do sexo em bovinos é de
grande interesse para a atividade leitei-
ra, por ser a fêmea a unidade produtiva
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
Biotecnologia
(Gordon, 1994). Essa seleção pode ser feita
por sexagem dos espermatozóides, dos
embriões ou do feto. Por vários anos, muitas
tentativas de sexar espermatozóides têm
sido realizadas, mas nenhuma tem prova-
do ser suficientemente específica, confiável
e de alta repetibilidade. O método poten-
cialmente promissor com uso de anticorpo
H-Y, para eliminar o cromossomo Y do es-
permatozóide, teve que ser abandonado
depois de verificar que o antígeno H-Y não
é preferencialmente expresso no esperma-
tozóide Y.
Os esforços mais recentes para sexa-
gem dos espermatozóides baseiam-se na
separação daqueles que têm o cromosso-
mo X ou Y (Cran, 1992 e Cran et al., 1993),
com posterior uso deles na técnica de FIV
(Johnson, 1995 e Rath et al., 1996). A di-
ficuldade deste método está no fato de que
o número de espermatozóides a ser sepa-
rado é relativamente baixo (Johnson, 1995),
sendo necessário separar um esperma-
tozóide por vez. Isto é possível porque o
espermatozóide que carrega o cromossomo
Y (macho) difere ligeiramente daquele que
carrega o cromossomo X (fêmea) na quan-
tidade de DNA (cerca de 3%) que contém.
Utilizando-se lâmpada de laser, na colora-
ção do teor de DNA, os espermatozóides
podem ser separados por um equipamento
de citometria de fluxo. O sistema funciona,
mas tem ainda algumas imperfeições. A se-
paração é apenas 90% correta e o esperma-
tozóide é danificado durante o processo, o
que reduz a taxa média de fertilidade. To-
davia, o fator mais limitante é a velocidade
do processo, já que com os equipamentos
atuais apenas cerca de 1.000 espermato-
zóides por segundo são separados. Con-
siderando-se que uma inseminação nor-
malmente requer, pelo menos, 10 milhões
de espermatozóides (mais de 2,5 horas para
separação), é evidente que esta técnica não
pode ser usada na pré-sexagem em massa
do sêmen para uso normal na inseminação
artificial.
Com a finalidade de reduzir o número
de espermatozóides requerido, Seidel et al.
(1997) desenvolveram um método de inse-
minação que requer a colocação do esper-
matozóide na porção superior do oviduto.
Usando 100 mil e 250 mil espermatozóides
Biotecnologia
por inseminação, eles obtiveram respecti-
vamente taxas de concepção de 20% e 10%
menores do que aquelas obtidas com con-
centrações normais utilizadas na insemi-
nação artificial. Este tipo de pesquisa, asso-
ciado ao aumento da taxa de separação dos
espermatozóides, pode vir a gerar proce-
dimentos, cujos custos e benefícios justifi-
quem comercialmente o seu uso. Contudo,
estes procedimentos deverão estar dispo-
níveis tão-somente na próxima década.
Em síntese, pode-se dizer que vários
métodos vêm sendo testados na sexagem
dos espermatozóides, com base nas dife-
renças físico-químicas entre espermato-
zóides X ou Y (sensibilidade ao pH, carga
elétrica das membranas plasmáticas, mor-
fologia do núcleo e cabeça, velocidade de
migração, diferenças na densidade...) ou
biológicas (antígenos de superfície, conten-
do o DNA...), segundo Cotinot et al. (1993)
e Hossepian et al. (1997). Os resultados
são ainda contraditórios, imprecisos e com
baixa repetibilidade.
Outra forma que vem sendo utilizada
para obtenção de produtos com sexo pre-
determinado é a sexagem de embriões. Com
as tecnologias atuais, é possível extrair uma
célula de um embrião jovem (Thomsen et
al. 1991 e Bredbacka et al. 1994) e com o
uso de sondas de DNA, verificar se ele é
macho ou fêmea. Todavia, esta metodolo-
gia não é ainda amplamente utilizada, é
relativamente cara e por se tratar de um
método invasivo, ou seja, com rompimento
da zona pelúcida, o que por precaução sa-
nitária não pode ser comercializada inter-
nacionalmente (Hossepian et al., 1997),
aumenta o risco de redução na taxa de ferti-
lidade. Na França, esta técnica é oferecida
aos criadores em conjunto com a trans-
ferência de embriões (Thibier & Nibart,
1995). São pesquisados também métodos
não invasivos para a sexagem de embriões,
sendo importante que a técnica não pro-
voque efeito deletério sobre o embrião,
permitindo sua criopreservação ou suces-
so na transferência, além de boa confiabi-
lidade, repetibilidade, simplicidade e rapi-
dez (Cotinot et al., 1993). Entre os métodos
que vêm sendo empregados destacam-se:
análise citogenética, uso de sondas de DNA
específicos para o cromossomo Y, identifi-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
cação de antígenos H-Y e dosagem de en-
zimas do cromossomo Y (Gordon, 1994 e
Hossepian et al., 1997).
A pré-seleção in vitro de embriões de
bovinos tem sido bastante estudada em
vários laboratórios e é aceito, em geral, que
embriões machos desenvolvem-se mais
rapidamente do que embriões fêmeas, pelo
menos em alguns sistemas in vitro de pro-
dução de embriões (Avery et al., 1991, 1992,
Valdivia et al., 1993 e Dufour et al., 1994).
Dentro do contexto da FIV, em que
alguns poucos milhares de espermato-
zóides são necessários para a fertilização,
é possível utilizar sêmen sexado para a
produção de embriões em larga escala. Os
custos poderão ser reduzidos substan-
cialmente e quase todos os embriões pro-
duzidos seriam do sexo desejado. Existem,
todavia, alguns problemas que devem ser
resolvidos, tais como custo, qualidade ge-
nética e disponibilidade de ovócitos, meios
de cultivo de embriões mais eficientes na
FIV, além da obtenção de taxas razoáveis
de fertilidade com sêmen congelado, en-
vasado e sexado, e sêmen fresco sexado e
depois envasado e congelado. A viabili-
dade comercial deste processo é possível,
mas certamente transcorrerão ainda alguns
anos antes que se torne realidade.
Bisecção de embriões
(Bipartição)
Embora a bipartição de embriões possa
contribuir para o aumento da eficiência bio-
lógica (em até 25%) e a produção de gêmeos
idênticos, para experimentos em nutrição,
genética etc. (Gordon, 1994), seu uso vem
sendo limitado. Isto, provavelmente, por
exigir embriões de excelente qualidade
(mórula compacta e blastocisto), que terão
a zona pelúcida rompida para execução da
técnica, reduzindo sua viabilidade nas
implicações sanitárias e no congelamen-
to.
Doenças da
reprodução/abortos
Pesquisas futuras ou em desenvolvi-
mento poderão propiciar melhores méto-
dos de controle e erradicação de doenças
que afetam a reprodução como brucelose,
leptospirose, campilobacteriose, tricomo-
none, IBR/BVD.
83
Testes diagnósticos
Os métodos clássicos para o diagnós-
tico de doenças têm duas estratégias bá-
sicas: o isolamento, cultivo e identificação
do agente infeccioso, e a detecção de an-
ticorpos específicos contra o patógeno
presente ou não no soro do animal afetado.
Embora esses métodos venham permitin-
do o controle e a erradicação de várias en-
fermidades importantes, eles apresentam
alto custo, falta de especificidade e demora
nos resultados.
As tecnologias de manipulação de DNA,
com a produção in vitro de anticorpos mo-
noclonais (mais preciso e específico), têm
possibilitado o desenvolvimento de antíge-
nos e anticorpos recombinantes de bacté-
rias e vírus (McCullough, 1993 e Zarlenga,
1994), com uma produção de kits para
diagnóstico de campo, de doenças da re-
produção e outras.
Vacinas
As vacinas tradicionais dividem-se em
dois grupos: as produzidas com organismos
vivos atenuados e com organismos mortos.
As vacinas contendo organismos mortos,
em geral, têm eficácia menor, mas, em com-
pensação, maior segurança. Em certos ca-
sos, a vacina viva pode provocar aborto
ou até mesmo reascender a própria doença
que se procura evitar.
A biotecnologia oferece oportunidades
de imunizar animais contra antígenos oriun-
dos de patógenos de interesse, sem expor
diretamente o animal a esse patógeno, pe-
la transferência do gene do antígeno a um
vetor não-patógeno (Sainz, 1997).
Produtos terapêuticos
As técnicas de transferência de genes
em microorganismos têm possibilitado a
produção de novos agentes terapêuticos,
como, por exemplo, antibióticos, interferon
etc. (Headon, 1994), produtos de ação far-
macológica cada vez mais potentes e tam-
bém de suma importância no tratamento das
infecções inespecíficas do aparelho genital.
Ovulação múltipla
e transferência de embriões
(MOET) como ferramenta
para o melhoramento
Uma alternativa para aumentar a taxa
84
de ganho genético em uma população é
através da superovulação de vacas de mé-
rito genético superior e a posterior coleta e
transferência de embriões (MOET). Esta,
quando executada em um rebanho, no qual
são utilizados apenas os animais do próprio
rebanho, é dito de MOET fechado. Nesta
situação, os machos são avaliados pelo
desempenho das irmãs e das mães e os me-
lhores machos são utilizados como pais da
nova geração. Alternativamente, existem
outras estruturas de MOET. Em uma delas,
os touros (sêmen) utilizados são de fora
do rebanho e apenas as matrizes são exclu-
sivamente daquele núcleo ou rebanho. A
este esquema, diz-se que o MOET é semi-
aberto. Uma alternativa é utilizar sêmen de
fora do núcleo genético e uma vez ou outra
incorporar alguma matriz de fora do núcleo.
Em geral, denomina-se esta alternativa de
MOET aberto.
Nicholas & Smith (1983) introduziram o
conceito de MOET em um esquema de me-
lhoramento, para aumentar o ganho gené-
tico em 30% na seleção de uma caracte-
rística. Diminuir o intervalo de gerações,
compensa a perda da precisão, devido à
seleção apenas pelo pedigree. Joen et al.
(1990) usaram simulação para avaliar di-
versos esquemas de MOET e, na maioria
dos casos estudados, o ganho genético
obtido com o MOET foi superior ao ganho
obtido pelo teste de progênie.
Programas de seleção em populações
fechadas têm maior taxa de consangüini-
dade, quando comparados com programas
de seleção em populações abertas. A con-
sangüinidade é um problema comum em
populações pequenas, como no caso da
seleção combinada com MOET. Todavia, o
uso de sondas de DNA, para escolher os
animais geneticamente mais divergentes
entre aqueles aparentados, pode minimizar
os efeitos da consangüinidade.
Esquemas alternativos de MOET têm si-
do estudados por muitos autores. McDaniel
& Cassell (1981) fizeram um resumo sobre
os usos alternativos da transferência de
embriões e seus efeitos sobre as taxas de
ganho genético. Powell (1981) avaliou as
possibilidades de erros nas avaliações ge-
néticas, principalmente para mães de tou-
ros, que poderiam resultar da transferên-
cia de embriões. Miller (1989) estudou o
esquema de MOET aberto e concluiu que,
especialmente em grandes populações, o
uso de machos testados pela progênie e a
seleção de fêmeas jovens em um rebanho
sob o esquema MOET resultam em taxas
de ganhos maiores do que o esquema do
MOET fechado. Em alguns casos, fêmeas
podem ser escolhidas nas populações e
trazidas para o núcleo MOET. Dekkers &
Shook (1990), usando simulação, estimaram
que o valor presente da taxa de retorno de
20 anos de um esquema de seleção em um
núcleo aberto de MOET, foi de 10% a 20%
maior do que o do teste de progênie con-
vencional.
A maioria dos cálculos do ganho ge-
nético, para a seleção com MOET, supõe
que todos os embriões viáveis transferidos
irão produzir o número esperado de fêmeas,
e que o ganho genético esperado através
da seleção de irmãos também será obtido.
Essas pressuposições a respeito do ganho
esperado, em geral, não são obtidas. A outra
razão de não se obter o ganho genético es-
perado é a herança citoplasmática, que é
transmitida maternalmente. Em razão disso,
as diferenças entre vacas, causadas pelos
efeitos do DNA mitocondrial, são incluídas
como parte da expressão fenotípica das
características de importância econômica.
Assim, quando a seleção de fêmeas é uti-
lizada, os efeitos destes mitocôndrios são
incluídos na estimativa do valor genético
da fêmea, mas não são transmitidos através
de seus irmãos machos para as filhas des-
tes, produzindo, assim, um erro na diferença
predita dos touros jovens nos esquemas
MOET. Schutz (1991) verificou que dife-
renças de 17 pares de base (pb), no RNA
mitocondrial, estavam associadas com pro-
dução de leite, reprodução e custos para
se manter um animal saudável. Verificou
ainda que a substituição de um par de base
foi relacionada com o aumento da produ-
ção de 842 kg de leite e 37 kg de gordura.
Uma outra substituição de 1pb foi relacio-
nada com o decréscimo de 36 dias no pe-
ríodo de serviço.
As diferenças fenotípicas que ocorrem,
devido à herança mitocondrial, mas que não
são transmitidas do pai para suas filhas,
criam erros nas avaliações por pedigree.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
Biotecnologia
A correção para este efeito pode ser facil-
mente realizada, incluindo-se no modelo de
avaliação genética um efeito fixo para cada
linha materna, que pode ser considerada
fixa por não ocorrer segregação e recombi-
nação no RNA mitocondrial, pois ele passa
intacto da mãe para as filhas. As linhas
maternas podem ser definidas, voltando-
se ao pedigree materno até a vaca funda-
dora de populações, que esteja registrada.
Outra forma seria a utilização de marcado-
res mitocondriais, para características de
importância econômica, visando o ajuste
das diferenças devidas a estes efeitos sobre
o fenótipo das fêmeas.
Em trabalhos experimentais de seleção
com MOET, Callesen et al. (1996, 1997) de-
monstraram que um rebanho pode ser es-
tabelecido com base na transferência de
embriões das 25% melhores fêmeas, com
manutenção de níveis satisfatórios de
reprodução e produção. Brockington &
Martinez (1996) utilizaram simulação para
avaliar os efeitos econômicos do uso de
um esquema MOET em rebanhos pequenos
(máximo de 50 fêmeas em reprodução) e
concluíram que embora fosse possível
obter ganhos genéticos de 1% ao ano na
população de fêmeas, a viabilidade econô-
mica do sistema de produção dependeu
criticamente de um mercado consumidor
para a aquisição dos embriões que foram
produzidos em excesso.
No futuro, rebanhos-núcleos poderão
ser mantidos para programas de melhora-
mento por várias razões:
a) manejo uniforme para os animais a
serem selecionados;
b) uso de novos métodos de seleção,
como o auxílio de marcadores mo-
leculares;
c) seleção para aumento da eficiência
alimentar;
d) seleção para resistência a doenças.
Além disso, planejamentos ideais de
acasalamentos podem ser realizados pa-
ra produzir machos para os testes de pro-
gênies e também para a disseminação na
população comercial. Da mesma forma,
rebanhos-núcleos podem ser utilizados
nos casos em que não exista uma infra-
estrutura bem organizada de controle lei-
Biotecnologia
teiro e de inseminação artificial, pois um
pequeno número de pessoas com qualifi-
cação pode operacionalizar um programa
MOET, no qual touros jovens selecionados
nos rebanhos-núcleos seriam utilizados na
população comercial de vacas.
Clones
O primeiro clone de animais domésticos
foi obtido em carneiro, aproximadamente,
12 anos atrás (Willadsen, 1986). No início
das pesquisas com clones, o material bá-
sico de estudo eram as células embrionárias,
pois acreditava-se que, além deste estádio,
a diferenciação irreversível das células já
teria ocorrido. Indivíduos idênticos foram
obtidos inicialmente através da divisão
física do embrião. Pensava-se que a divisão
repetida poderia gerar grande número de
indivíduos idênticos, mas os resultados
mostraram que isso não foi possível. Uma
técnica alternativa, com base na transplan-
tação de núcleo tem-se mostrado mais
viável. O núcleo de células de embriões,
em estádio inicial de desenvolvimento, é
transferido para óvulos não-fertilizados,
dos quais retiraram-se o seu núcleo. Isto
aumenta o número potencial de indivíduos
clonados, embora a perspectiva de obter
ciclos repetidos de clonagem e cultura de
embriões não está sendo totalmente alcan-
çada. Além disso, alguns problemas relati-
vos ao crescimento de tecidos de embriões
clonados têm ocorrido durante o desen-
volvimento ainda no útero e mesmo após o
nascimento. Os resultados de gestações
prolongadas, aumento da taxa de mortali-
dade de fetos e perinatal foram revisados
recentemente por Kruip & Den Daas (1997).
Todavia, não se sabe se essas anormalida-
des são resultantes do procedimento de
transferência nuclear ou do processo da
FIV em si. Mais pesquisas básicas são
necessárias para identificar as fontes des-
tes problemas, que, mesmo de baixa fre-
qüência, são suficientes para inibir o de-
senvolvimento de qualquer tecnologia,
envolvendo a cultura de embriões e, conse-
qüentemente, a adoção da clonagem da
indústria genética.
No início de 1997, as discussões sobre
clonagem tornaram-se intensas, com a in-
formação sobre a obtenção de uma ovelha
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
(Dolly) através da clonagem de uma célula
somática de um animal adulto (Wilmut et
al. 1997). Eles utilizaram as técnicas de
transferência nuclear, mas com o núcleo de
células provenientes do tecido mamário de
uma ovelha adulta. A cultura dessas célu-
las foi estabelecida para reprogramar as
células aos seus estádios de pré-diferen-
ciação. Embora a taxa de sucesso tenha
sido baixa (um animal clonado dentre 277
tentativas), esses resultados, sem dúvida,
estimularam o aumento de trabalhos de pes-
quisa sobre clonagem. Este grande aconte-
cimento tem sido seguido de reportagens
na mídia (Verano, 1999) sobre a produção
de animais clonados de células fetais ou
somáticas, nos Estados Unidos, Japão e
Escócia.
A clonagem de embriões em bovinos
pode ser uma tecnologia competitiva para
alguns propósitos, entre estes, serão des-
tacados os seguintes: aumento da taxa de
ganho genético, disseminação do ganho
genético, multiplicação de animais trans-
gênicos e exploração da heterose.
Aumento da taxa de ganho
genético
Nos programas de seleção de gado de
leite que se baseiam nos testes de progênie,
a taxa de ganho anual para características
de produção está entre 1% e 2% e a maioria
deste ganho é proveniente da maior inten-
sidade e precisão na seleção dos touros.
Como são necessárias mais da metade das
fêmeas para produzir novilhas de repo-
sição, a intensidade de seleção desta via é
muito pequena. Com uma produção efici-
ente de clones e testes eficientes como
base para a seleção entre os clones, a taxa
de ganho pode, a princípio, ser aumentada.
Teepker & Smith (1989) analisaram a
resposta à seleção de clones obtidos via
transferência de embriões e a resposta à
seleção entre os clones, considerando ape-
nas a variância genética aditiva. A resposta
à seleção de clones ocorre apenas uma vez
e a sua vantagem foi equivalente a cerca
de quatro anos de seleção convencional
(teste de progênie). O teste destes grupos
de clones e o seu uso na população comer-
cial, segundo estes autores, produziriam
ganhos que requereriam de 15 a 17 anos de
85
ganhos dos testes de progênies. Ganhos
adicionais dependeriam dos testes dos clo-
nes e posterior acasalamento entre eles.
Existem, todavia, algumas desvanta-
gens. A realização de testes precisos dos
clones, especialmente para características
de baixa herdabilidade, não pode ser feita
com precisão em condições de campo e,
sim, em condições especiais. Além disso,
o uso de clones pode reduzir rapidamente
a variabilidade genética de população, as
perspectivas de ganho no futuro e, possi-
velmente, a capacidade adaptativa em um
curto intervalo de tempo, assim como
reduziria a capacidade de fazer frente às
doenças. Alguns estudos têm concluído
que, no geral, o ganho potencial não parece
ser suficiente para justificar a clonagem
como um meio de acelerar o melhoramento
genético em gado de leite (De Boer et al.,
1994 e Ruane et al., 1997).
Disseminação do ganho genético
Atualmente, o ganho genético obtido
nos grandes programas de melhoramen-
to é disseminado principalmente através da
inseminação artificial e com menor impacto
através da transferência de embriões. O
aumento do custo na obtenção das infor-
mações de campo, nas quais a seleção se
baseia, com a competição internacional na
indústria, está induzindo as organizações
a concentrarem os testes e a seleção em
rebanhos-núcleos ou em sub-populações.
Com testes precisos, tais sistemas poderão
identificar fêmeas elites, para as quais po-
derá haver uma grande demanda por clo-
nes. A revista Veja (Verano, 1999) noticiou
que uma novilha, de uma fazenda para-
naense, com apenas um ano de idade, da
raça Limousin, cujo nome é Húrsola, havia
sido selecionada pela empresa ABS Glo-
bal para a produção de clones. Segundo a
reportagem, os cientistas responsáveis pe-
lo trabalho irão retirar células da orelha do
animal e enviarão para os laboratórios, nos
Estados Unidos, para a realização da clo-
nagem.
Multiplicação de
animais transgênicos
Devido às baixas taxas de sucesso e ao
alto custo envolvido na obtenção de um
animal transgênico funcional, certamente
86
haverá um grande interesse comercial na
multiplicação de tais animais. O interesse
por animais transgênicos com certeza é
maior pela indústria de produtos farma-
cêuticos do que pela indústria de produção
de alimentos.
Exploração da heterose
Nos cruzamentos entre raças de leite
de origem Bos taurus e raças de origem
Bos indicus ou de origem local, nos países
tropicais, uma quantidade razoável (25%
ou mais) de heterose tem sido regularmen-
te observada nos diversos estudos condu-
zidos (Cunningham & Syrstad, 1988 e
Madalena et al., 1990). Isto é relativamente
fácil de obter na primeira geração de cruza-
mento, utilizando-se sêmen das raças Bos
taurus em fêmeas Bos indicus. Todavia, as
diferentes estratégias de acasalamentos
subseqüentes não retêm toda a heterose
do primeiro cruzamento. Entretanto, se for
possível produzir continuamente indiví-
duos F1, a heterose máxima será mantida.
Uma solução interessante pode ser o uso
da transferência de embriões, utilizando-
se aqueles que foram clonados de células
de vacas F1 elites. Os aspectos econômi-
cos desta tecnologia foram examinados
por Jarvis (1996). Segundo este autor, as
circunstâncias, nas quais esta solução po-
derá ser economicamente viável, são bas-
tante limitadas. Em primeiro lugar, o custo
exige que o retorno líquido por vaca seja
razoavelmente alto, o que implica alta pro-
dução por vaca e um preço de leite razoa-
velmente alto. Em segundo lugar, é neces-
sário que se tenha um bom serviço de
suporte, dada a especificidade da tecno-
logia. Em terceiro lugar, a produção destes
animais pode ser de interesse apenas dos
países tropicais, onde a heterose apresen-
tada pelos indivíduos F1 tem o seu maior
valor.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como os animais podem ser reprodu-
zidos com os métodos atualmente existen-
tes, qualquer avanço em tecnologia deve
adicionar alguma coisa ao que vem sendo
realizado. Isto apenas será possível, se os
benefícios forem maiores que os custos.
Os benefícios, na maioria dos casos, são de
ordem genética, conseqüência do aumen-
to do valor das progênies resultantes da
seleção de touros, vacas ou clones. Para
cada caso, haverá custos diferenciados pa-
ra se testar e selecionar, além do custo
operacional de cada tecnologia. Este por
sua vez, é dependente da taxa de sucesso
obtida.
A linha básica para se avaliarem os
benefícios de qualquer nova tecnologia
reprodutiva é, certamente, aquela propor-
cionada pela própria natureza, ou seja, a
monta natural. Qualquer criador pode aca-
salar as suas fêmeas com um macho. Isto
tem um determinado custo e conveniência,
e produzirá descendentes com um certo
mérito genético, os quais, na sua maioria,
estarão ao redor da média da raça.
A inseminação artificial, muito utilizada
pelos criadores de gado de leite, tem pro-
vado ser eficiente para a melhoria do mérito
genético dos rebanhos a um custo relati-
vamente pequeno. Todavia, em gado de
corte, o seu uso é pequeno, pois os custos
adicionais são altos, relativos aos ganhos
genéticos adicionais. A sexagem de sêmen,
visando à determinação do sexo da pro-
gênie, poderá trazer benefícios para ambos
os sistemas de produção de leite e carne.
Em gado de leite, poderia quase que do-
brar a intensidade de seleção das fêmeas e
em gado de corte, o cruzamento rotacional
sistemático, visando maximizar a heterose
entre raças, poderia tornar-se mais atrativo
e todos os produtos dos cruzamentos ter-
minais seriam machos.
Enquanto a inseminação artificial é uti-
lizada em quase que 70% das fêmeas de
gado de leite em muitos países desenvol-
vidos, a transferência de embriões tem
alcançado menos de 1% de utilização. A
razão básica é que os custos são altos e os
benefícios pequenos. Os benefícios gené-
ticos são provenientes da seleção de mães
e isto é sempre menos preciso do que a se-
leção dos machos, visto que estes podem
ter um grande número de progênies ava-
liadas. Além disso, a intensidade de seleção
de fêmeas é menor do que a realizada nos
machos. A pré-sexagem de embriões pode-
rá ser uma possibilidade em sistemas espe-
cializados, associada ao uso convencional
da transferência de embriões ou da FIV.
Aumentar a intensidade de seleção de
fêmeas através da FIV só será viável com a
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.79-88, maio/jun. 2000
Biotecnologia
redução do custo de produção de uma ges-
tação, proveniente de embriões de vacas
altamente selecionadas. Para isto, várias
barreiras têm ainda que ser vencidas. A pro-
dução em massa de embriões via FIV requer
grande disponibilidade de ovócitos, e isto,
atualmente, só é possível através de vacas
provenientes de matadouro, que na maioria
das vezes são de baixo valor genético. Isto
prejudica a seleção de fêmeas e desta forma
compete com a inseminação artificial em
termos de custo. As tentativas, para se
desenvolver um sistema de produção de
gêmeos, não têm provado ser viáveis eco-
nomicamente para os diversos sistemas de
produção comercial.
A clonagem, particularmente de células
adultas, pode adicionar algum benefício
genético na seleção de machos e fêmeas,
em princípio menor do que a produção em
massa de embriões via FIV, pois a fonte
de ovócito não seria um problema. Todavia,
a tecnologia ainda é relativamente recen-
te para se ter taxa de sucesso e custo bem
previsíveis. Geneticamente, há um gran-
de ganho em potencial, pois a metade da
variância genética na população estaria ain-
da presente dentro dos grupos de irmãos-
completos. Os custos e métodos de iden-
tificar geneticamente com precisão os
melhores clones, nesta situação, ainda
necessitam de muitas pesquisas.
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Biotecnologia 89

Plantas transgênicas e biossegurança

Geraldo Magela de Almeida Cançado 1

Resumo - A tecnologia do DNA recombinante gerou novas perspectivas para o

desenvolvimento da agricultura de forma nunca antes imaginada. A barreira existen-
te entre as espécies foi eliminada e hoje tornou-se corriqueiro transferir genes entre
espécies de organismos filogeneticamente distantes entre si. Apesar de as possibilidades
parecerem ilimitadas, questões de biossegurança e de bioética têm levado inúmeros
países a assumirem uma postura de prudência para a adoção desta nova tecnologia.
O questionamento sobre o impacto de produtos transgênicos na natureza e na saúde
de homens e animais levou à criação de legislações que regulamentam especificamente
os trabalhos e o uso de produtos transgênicos. No Brasil, a Lei de Biossegurança veio
justamente preencher uma lacuna existente na legislação para o setor biotecnológico,
principalmente no que diz respeito a manipulações genéticas em seres vivos. A exis-
tência de uma legislação específica possibilitou ainda a criação da CTNBio.
Palavras-chave: Biotecnologia; Impacto ambiental; Fluxo gênico; CTNBio; OGM.

INTRODUÇÃO perda crescente e irreparável de valioso anualmente em todo o mundo. A ativida-

patrimônio genético (Altieri, 1991). Muitas de agropecuária tem assumido um papel
Cerca de 10% a 20% do total de espécies
espécies de animais, plantas e microorga- preponderante na descaracterização de vá-
vivas do mundo encontram-se no Brasil,
nismos têm sido extintas sem ter sido co- rios ecossistemas. No Brasil, ecossistemas
o que o coloca entre os maiores no que se
nhecidas ou suficientemente estudadas como a Mata Atlântica, o Cerrado, a Ama-
refere à biodiversidade. Além do Brasil,
pelo homem. Devido a esta massiva inter- zônia e o Pantanal Mato-Grossense têm
outros países, localizados na faixa tropical
venção no ambiente, a taxa de extinção das suas áreas preservadas reduzidas ano após
e subtropical, possuem grande diversidade
espécies tem atingido proporções mil vezes ano.
biológica. Só na América Latina, Brasil,
superiores às taxas naturais (Raven, 1998). Dentre as inúmeras atividades rela-
Colômbia e México possuem cerca de 50%
Caso esta tendência se mantenha ao lon- cionadas com a agricultura, o processo de
da diversidade biológica de todo o mundo
go dos próximos anos, estima-se que, até o melhoramento genético tem contribuído
(Varella et al., 1999).
final do próximo século, três quartos das significativamente para esta perda de varia-
Hoje, estima-se que a população mun-
espécies existentes já tenham desapareci- bilidade, caracterizando um grande contra-
dial tenha alcançado o patamar de 6 bilhões
do do mundo (Raven, 1998). Muito além senso, já que o sucesso do melhoramento
de pessoas e, até o final do ano 2200, espera-
de ser apenas uma estatística trágica, isto é estritamente dependente desta variabi-
se uma população de mais de 10 bilhões de
representa uma grande ameaça para a lidade. O uso generalizado de cultivares
habitantes (James, 1998). Uma boa parcela
segurança alimentar da humanidade, pois melhoradas, adaptadas ao sistema de pro-
dessas pessoas vive ou viverá em países
todo o processo de melhoramento vegetal dução agrícola tecnificado, freqüentemen-
localizados nas regiões tropicais, justa-
e animal, seja ele promovido pelo método te, tem levado os agricultores a abando-
mente onde se concentra a maior parte da
convencional, seja pelo biotecnológico, ali- narem o cultivo de variedades locais, que
biodiversidade do mundo. Os centros re-
cerça-se justamente na existência da varia- acabam perdidas pelo desuso, caracteri-
manescentes de biodiversidade têm sofri-
bilidade genética. zando um franco processo de erosão gené-
do uma constante pressão provocada pela
expansão desordenada da agricultura, tica. Apesar de as cultivares melhoradas
AGRICULTURA E O apresentarem inúmeras vantagens para o
aumento da exploração dos recursos natu-
IMPACTO AMBIENTAL sistema de produção em larga escala, estas,
rais e crescimento de centros urbanos e
industriais. Dentre os inúmeros efeitos Com a crescente necessidade de expan- freqüentemente são oriundas de ancestrais
negativos advindos desta intensa ocupa- são da agricultura, milhares de hectares de muito próximos, apresentando uma base
ção e uso do planeta, pode-se destacar a flora e de fauna silvestres são destruídos genética muito estreita. Isto faz com que as

1
Engo Agro, M.Sc., Pesq. EPAMIG-CTSM-FECD, Caixa Postal 33, CEP 37780-000 Caldas-MG. E-mail: cancado@epamigcaldas.com.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000

90
plantas cultivadas se tornem muito sus-
cetíveis às variações do ambiente e ao
surgimento de novas doenças e pragas,
fenômeno comumente conhecido como
“vulne-rabilidade genética” (Borém, 1999).
Em contrapartida, as espécies locais são
extremamente heterogêneas na sua compo-
sição genética, abrigando a variabilidade
genética necessária à resistência e tolerân-
cia a estresses bióticos e abióticos.
O uso de cultivares melhoradas e de
espécies exóticas, originadas de outras re-
giões e que foram introduzidas pelo homem
intencionalmente ou por acidente, pode
promover mudanças no perfil das espécies
que colonizam um determinado ambien-
te, e culminar com o desaparecimento de
outras preexistentes, que são incapazes de
competir pelos seus recursos vitais com as
novas espécies introduzidas. No caso de
animais, tem sido bastante comum a elimi-
nação de espécies locais, ocasionada pela
competição, parasitismo e pelo predatismo
de novas espécies introduzidas (Varella et
al., 1999).
PLANTAS TRANSGÊNICAS
Atualmente, com o advento da técnica
de DNA recombinante, é possível melhorar
espécies cultivadas pela introgressão de
genes de interesse diretamente no genoma.
As plantas transgênicas surgiram a partir
da técnica de DNA recombinante e podem
ser definidas como plantas obtidas por
manipulação genética, com incorporação
ao seu genoma de genes de outras plan-
tas, que não se cruzam sexualmente com
ela, ou mesmo genes provenientes de
organismos tão geneticamente diferen-
tes, como vírus e bactérias, daí a origem do
nome transgênico. O surgimento destas
novas plantas acabou por suscitar calo-
rosa discussão sobre temas como biosse-
gurança e bioética. As opiniões polariza-
ram-se entre os que são a favor e os que
são contra o uso da técnica de manipulação
genética em seres vivos.
Acredita-se que novas cultivares, mais
bem adaptadas e eficientes, permitirão a
atividade agrícola em áreas consideradas
inaptas para a agricultura, possibilitando a
reintegração ao sistema produtivo de áreas
utilizadas de forma inadequada no passado
e que hoje são consideradas improdutivas.
O aumento esperado da produtividade,
com a utilização generalizada de plantas
transgênicas, poderá atenuar o avanço da
agricultura para novas áreas, reduzindo a
pressão sobre áreas ainda não exploradas
e que, atualmente, constituem valiosa fon-
te de biodiversidade. A qualidade de pro-
duto também é outro aspecto forte desta
tecnologia, do qual se espera uma grande
contribuição das plantas transgênicas, com
grandes vantagens para o consumidor. Por
outro lado, há uma intensa discussão sobre
os possíveis efeitos negativos da adoção
desta nova tecnologia sobre o ambiente e
a saúde do homem e de animais.
De qualquer forma, a tecnologia do
DNA recombinante representou um gran-
de avanço para o melhoramento de plantas.
Muitas vezes, o trabalho desenvolvido pelo
melhorista torna-se difícil e demorado, devi-
do à transferência na ocasião da hibridação
de inúmeras características sem valor agro-
nômico com a característica desejada. Isso
ocorre com freqüência, quando se busca
fonte de resistência em espécies silvestres,
pois estas apresentam inúmeras caracte-
rísticas que, num primeiro momento, não
teriam valor para os objetivos do melhorista.
Geralmente, no processo de melhoramento
convencional, a eliminação destas caracte-
rísticas indesejáveis pode demorar vários
anos e chegar a décadas, como ocorre com
as culturas perenes. Em alguns casos, o
gene de interesse pode estar tão próximo a
um outro de efeito negativo ou deletério
(nesse caso, diz-se que há uma ligação gêni-
ca), que se torna quase impossível elimi-
nar o efeito negativo deste gene na nova
cultivar, inviabilizando o processo de me-
lhoramento para a característica em questão.
Desta forma, com o uso da técnica do DNA
recombinante, a partir do momento em que
um determinado gene seja identificado co-
mo o responsável por uma característica
desejável, ele poderá ser transferido direta-
mente para uma nova cultivar, num prazo
significativamente menor. Com a transfe-
rência do gene como uma estrutura indi-
vidual, torna-se possível fazer modifica-
ções genéticas mais controladas, evitando,
assim, o efeito negativo de outros genes.
Segundo Bill (1987) cita-do por Hoffman
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
Biotecnologia
(1990) a transferência individual implicaria
até mesmo em um menor risco ambiental,
pois apenas uma característica seria mo-
dificada, sendo bem mais fácil de ser mo-
nitorada e controlada no ambiente. Mas a
grande vantagem do uso da técnica do
DNA recombinante, sobre o melhoramento
convencional, é que na maioria dos casos,
este último fica restrito apenas ao cruza-
mento entre as espécies filogeneticamente
próximas, devido à existência de inúmeras
barreiras que impedem cruzamento entre
espécies muito distantes. Com o uso das
técnicas biotecnológicas, isso deixou de
ser uma limitação. É freqüente encontrar
nos dias de hoje, trabalhos na literatura, co-
mo os de Sheng & Citovsky (1996), Tinland
et al. (1994, 1995), Zupan & Zambryski
(1995), Engströn et al. (1987) e Stachel &
Zambryski (1986), que demonstram a trans-
ferência de genes entre espécies de filos
distintos, como é o caso da introdução de
genes de bactérias (organismo procarioto)
no genoma de plantas (organismo euca-
rioto). O melhoramento tem a sua disposi-
ção um vasto pool gênico, que teorica-
mente cobriria todos os genes disponíveis
na natureza.
No entanto, ao contrário do que se
pensava até recentemente, sabe-se hoje
que esta nova tecnologia não veio para
substituir o processo de melhoramento
convencional. O isolamento, a clonagem e
a transferência de novos genes para plantas
devem contribuir de forma fantástica, para
que o desenvolvimento de novas cultivares
torne-se cada vez mais eficiente e rápido.
Os métodos biotecnológicos, apesar das
grandes potencialidades, não podem gerar
muitos resultados aplicados, quando des-
vinculados dos programas de melhora-
mento convencional, devido à necessidade
de cultivares agronomicamente adequadas
para receberem as construções gênicas.
Além disso, a transformação genética para
as características quantitativas, aquelas go-
vernadas por vários genes e que freqüen-
temente estão associadas com o caráter de
produtividade, ainda é tecnicamente difícil
de ser realizada pela manipulação direta de
genes. Outro motivo é que muitos dos
genes envolvidos com a produtividade
ainda não foram identificados. O sucesso
Biotecnologia
da transformação de plantas, observado
até o momento, tem-se concentrado justa-
mente nas características de herança sim-
ples, ou seja, características governadas
por um ou pouco genes.
Fluxo gênico
Fluxo gênico pode ser definido como a
troca de alelos entre indivíduos, isto é, a
transferência de alelos de uma varieda-
de/espécie para outra (Borém, 1999). O pro-
cesso de troca de genes entre espécies filo-
geneticamente muito distantes é muito raro
na natureza, limitando-se a alguns casos
de bactérias e de vírus que são capazes de
transferir seus genes para outros orga-
nismos. Como conseqüência da adoção
generalizada de plantas cultivadas que
foram geneticamente manipuladas, espera-
se o surgimento de fluxo de novos genes
oriundos dos mais diversos organismos,
para o interior dos sistemas agrícolas, e des-
tes, por sua vez, para o interior de ecossis-
temas naturais (Varella et al., 1999). A partir
deste raciocínio, inicia-se uma das princi-
pais discussões acerca do uso das plantas
transgênicas.
A dispersão de genes de espécies culti-
vadas para espécies silvestres e plantas
daninhas é potencialmente um problema
ecológico de grande importância. Segundo
Borém (1999), a teoria disponível sobre o
assunto sugere que a dispersão de um
gene, no espaço e no tempo dependerá,
em parte, dos seguintes aspectos:
a) vantagem competitiva do gene;
b) fluxo gênico;
c) integração do gene exótico no ge-
noma hospedeiro;
d) probabilidade do movimento do ge-
ne de um indivíduo para outro em
uma geração.
Ainda, segundo Borém (1999), várias
etapas são necessárias para que o fluxo
gênico ocorra em condições de campo:
a) os indivíduos devem ser compatí-
veis sexualmente;
b) deve ocorrer coincidência temporal
e espacial dos indivíduos;
c) os híbridos devem ser viáveis;
d) a transmissão gênica deve ocorrer
nas gerações seguintes;
e) deve ocorrer recombinação gênica
entre os genomas;
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
f) o gene não deve ser excluído do ge-
noma receptor.
Os riscos ao homem e ao meio ambien-
te, envolvidos com a liberação de um orga-
nismo geneticamente modificado (OGM),
ainda são bastante imprevisíveis, jus-
tamente pela infinidade de combinações
genes/organismo receptor que a técnica
oferece. Mas é importante observar que o
impacto negativo, que determinado OGM
possa causar ao homem ou ao meio ambien-
te, está restrito às peculiaridades do gene
inserido e da planta-alvo da transformação.
Isto impossibilita que o tema seja tratado
de forma generalizada, como vem ocorren-
do até o momento. Em se tratando de plan-
tas transgênicas, cada caso é único, deven-
do ser avaliado individualmente.
O gene específico, assim como seu pro-
duto, a espécie transformada, seu tipo de
reprodução (autógama, alógama ou assexua-
da), as características do vetor de trans-
formação, isto é, presença de outros genes
nas construções, tais como os de seleção
para resistência a antibióticos, são alguns
dos pontos que devem ser considerados
na ocasião da liberação de um OGM. A le-
gislação brasileira (Brasil..., 1995), que trata
da biossegurança e liberação destes orga-
nismos, questiona, além destes pontos,
uma série de outras características que ela
julga importante para garantir a segurança
no uso de OGMs.
A pesquisa e o desenvolvimento na área
de biotecnologia são encarados e reconhe-
cidos pela comunidade científica nacional
e internacional, como uma opção estraté-
gica para garantir a segurança alimentar no
futuro. Há uma expectativa de aumento de
consumo de alimentos no mundo, não só
pelo aumento da população nos países po-
bres, mas também pelo aumento da expec-
tativa de vida nos países ricos. Especula-
se que a forma tradicional de cultivo, não
conseguirá suprir esta demanda crescente
(James, 1998). Desta forma, torna-se impe-
rativo investir no desenvolvimento de no-
vas tecnologias. Países que não o fizerem
agora, estarão em um futuro próximo depen-
dentes de tecnologias externas e, portan-
to, sujeitos a pagamento de royalties. Tam-
bém é certo que, apesar de toda a polêmica
associada ao uso dos transgênicos, as
inovações tecnológicas não deverão ser
91
barradas em sua trajetória normal de de-
senvolvimento, mas sem dúvida, há uma
grande necessidade de estudos sérios e
detalhados sobre os possíveis impactos
que poderão advir com o uso generalizado
de OGMs. Tiedje, citado por Varella et al.
(1999), aponta alguns detalhes que devem
ser considerados no início de qualquer
pesquisa com plantas geneticamente ma-
nipuladas e que levam em conta o risco po-
tencial da nova cultivar:
a) potencialidade para se tornar uma
nova planta daninha;
b) potencialidade para amplificar os
efeitos de plantas daninhas já exis-
tentes;
c) potencialidade para causar dano a
espécies não-alvo;
d) potencialidade para provocar dese-
quilíbrio em ecossistemas;
e) potencialidade para promover a per-
da de recurso genético importante.
Ellstrand & Hoffman (1990) listaram
algumas estratégias para reduzir o risco de
escape gênico:
a) isolamento espacial: para espécies
com taxa de fecundação cruzada mui-
to elevada, o isolamento por distân-
cia pode ser uma opção bastante
eficiente para prevenir o cruzamen-
to com espécies silvestres;
b) métodos culturais de isolamento:
em certos casos, práticas simples,
tais como plantio tardio ou anteci-
pado, para evitar a coincidência de
florescimento com as espécies sil-
vestres. Barreiras com outras espé-
cies de plantas também podem in-
terceptar o pólen produzido;
c) métodos genéticos de isolamento:
modificações genéticas das culturas
podem ser utilizadas para isolá-las
reprodutivamente. Quando o produ-
to não for a semente ou o fruto, po-
dem-se utilizar genótipos genetica-
mente alterados para ser macho-
estéreis ou genes letais, que invia-
bilizam a germinação do grão de
pólen. A incompatibilidade genética
entre as espécies também pode ser
considerada como uma forma de
isolamento.
92
A remoção mecânica de flores e a elimi-
nação das espécies sexualmente compa-
tíveis também são alternativas para impedir
o fluxo de genes (Dale, 1992). Existem outras
estratégias que poderão conferir uma maior
barreira ao escape de genes, tais como a
transformação de cloroplastos, utilizando
a herança materna para expressar a carac-
terística. Desta forma, o pólen não trans-
mitiria o gene exógeno (Daniell et al., 1998).
No processo de fluxo de genes, ocorre
a transferência de genes de uma população
para outra, podendo estes genes tornarem-
se estáveis ou não nas gerações futuras.
Se os genes transferidos conferem alguma
vantagem adaptativa em relação aos indi-
víduos selvagens, ele deve contribuir para
o surgimento de formas mais aptas a de-
senvolverem-se no ambiente, do que as
espécies silvestres. Isto assume importân-
cia, quando se trabalha com genes de resis-
tência a doenças, resistência a herbicidas,
tolerância à seca e ao frio, entre outros
(Doebley, 1990). Dessa forma, a possibi-
lidade de fluxo de genes entre espécies
cultivadas e seus parentes silvestres
confere risco de introgressão de genes
engenheirados em plantas silvestres e po-
de trazer como conseqüência, além da
eliminação de outras espécies, a criação de
espécies de plantas daninhas de difícil
controle. Doebley (1990), estudando o fluxo
de genes entre milho e teosinto (espécies
silvestres filogeneticamente próximas ao
milho cultivado), observou por análises
moleculares a introgressão de genes de mi-
lho em teosinto e vice-versa. Este autor
acredita que em algumas condições espe-
ciais, quando há ganho adaptativo para o
teosinto e não há interferência com carac-
terísticas importantes de adaptação, tais
como dispersão natural de sementes, o gene
poderá ser transferido para a população de
teosinto e estabilizar-se. No entanto, esta
espécie tem uma distribuição limitada ape-
nas no México e na América Central. Por-
tanto, o risco de fluxo de genes engenhei-
rados para espécies silvestres seria mais
crítico em regiões onde localizam-se os si-
milares silvestres, o que poderia ocorrer nos
centros de origem (Centros de Vavilov). Pa-
ra a soja, que apresenta seu centro de ori-
gem na China, há uma maior probabilidade
de fluxo gênico em espécies silvestres na-
quele país do que em outra região do mun-
do, onde é considerada espécie exótica.
Não se acredita que espécies agronô-
micas geneticamente manipuladas possam
vir a tornar-se um problema em ambientes
silvestres. A maioria das espécies domesti-
cadas, cuja sobrevivência depende em alto
grau do ser humano, dificilmente sobre-
viverá fora de ambientes agrícolas. Além
disso, na ausência de pressão seletiva,
como é o caso de plantas transformadas
para tolerância a herbicidas, no ambiente
silvestre a expressão do gene inserido não
conferiria nehuma vantagem adaptativa
(Scholze, 1999).
Outras questões de
biossegurança
Dentro do tema de biossegurança de
produtos transgênicos, há ainda outras
questões que estão sendo exaustivamente
debatidas, tais como a presença de genes
de seleção que conferem resistência a anti-
bióticos nos OGMs. Apesar de a probabili-
dade de transferência destes genes de plan-
tas para bactérias do solo ou da flora intes-
tinal de humanos e de animais ser bastante
limitada, atualmente condena-se ampla-
mente o uso deles em plantas destinadas
ao cultivo comercial. Há uma tendência em
substituir o uso destes marcadores de sele-
ção por outros que não confiram vantagens
adaptativas a microorganismos (Joersbo et
al., 1998). O uso de antibióticos de forma
indiscriminada na população e na alimen-
tação de animais tem sido motivo muito
maior de preocupação. Em inspeções feitas
em granjas de frangos nos Estados Unidos,
encontraram-se bactérias resistentes inclu-
sive ao antibiótico Vancomicina, último
recurso utilizado pelos médicos, quando
todos os outros tratamentos com antibió-
ticos falham (Folha..., 1999). Outra questão,
bastante discutida mundialmente, é a rotu-
lagem de produtos derivados de OGMs. A
Europa tende a requerer que produtos/ali-
mentos de origem transgênica, assim como
todos seus derivados, sejam rotulados, in-
dependentemente se houve ou não altera-
ção na composição final do produto. Em
outros países, como os Estados Unidos, a
rotulagem de um produto transgênico só
se justifica, à medida que ele contenha algu-
ma substância não-específica do produto
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
Biotecnologia
não-manipulado. O consumidor deve ser
informado disso porque adquirindo e con-
sumindo um produto, cuja constituição seja
diferente da original, ele estará sujeito ao
risco de reações alérgicas por desconhe-
cimento (Castro, 1997). O Brasil, ainda não
tem uma posição definida com relação a
este tema, mas, ao que tudo indica, deverá
optar por uma rotulagem completa dos
produtos geneticamente manipulados, à
semelhança do que se observa na Europa,
independente ou não de estes produtos
serem estritamente equivalentes àqueles
não-transgênicos. Embora isso seja possí-
vel, já é prevista uma grande dificuldade
técnica para rotulagem de todos os produ-
tos de origem transgênica, assim como de
seus derivados. Caso haja necessidade de
rastrear um determinado produto, desde
sua produção até sua chegada ao consu-
midor, haverá um acréscimo considerável
no seu custo final, devido à complexidade
e ao custo desta cadeia de fiscalização.
Não só as questões de biossegurança,
mas também as questões de bioética, de-
vem ser avaliadas de forma criteriosa. Os
recentes avanços alcançados com a clona-
gem de mamíferos, dos quais cita-se como
exemplo mais famoso a criação da ovelha
Dolly, gerada a partir de uma célula germi-
nativa que apresentava o núcleo de uma
célula somática (Wilmut et al., 1997), têm
levantado uma grande preocupação quan-
to a possibilidade de clonagem de seres
humanos e os princípios éticos que isso
envolve. É muito importante que esse tipo
de preocupação seja extrapolado para a ma-
nipulação genética de plantas. Hoje, ouve-
se falar no desenvolvimento de tecnologias
como a do Terminator, que impede a multi-
plicação de novas sementes pelo produ-
tor, por inviabilizar a germinação daquelas
oriundas de plantas geneticamente altera-
das (Crouch, 1998). Este é um típico exem-
plo do uso da tecnologia que visa apenas
criar uma estratégia de controle de merca-
do, sem ganhos significativos para a
sociedade como um todo.
Lei de Biossegurança e CTNBio
Embora no Brasil a discussão sobre
biossegurança seja recente, diversos paí-
ses já vêm tratando do assunto a bastante
tempo. Como exemplo de legislações exis-
Biotecnologia
tentes unicamente para tratar de biossegu-
rança e bioética, podemos citar a Argentina,
onde existe a Comissão Nacional de Acon-
selhamento sobre Biotecnologia Agrícola
(Conabia), a Índia, com o Recombinant
DNA Advisory Committee (RDAC) e a No-
va Zelândia com Interim Assessment Group
(IAG). Nos Estados Unidos, a legislação
de biossegurança é considerada uma das
mais complexas do mundo. Várias insti-
tuições são responsáveis pela regulamen-
tação e fiscalização, sendo as principais a
Food and Drug Administration (FDA),
National Institute of Health (NIH), United
States Departament of Agriculture (USDA)
e Environmental Protection Agency (EPA).
Na Comunidade Européia, de onde surgem
as maiores restrições ao uso de OGMs, cada
país é obrigado a possuir uma entidade
competente para avaliar o cumprimento das
normas de segurança biológica relaciona-
das com a introdução de OGMs no meio
ambiente, entretanto, toda a legislação é
supranacional, regulamentando as normas
para todos os países integrantes da Comu-
nidade Européia. Ainda existem organiza-
ções internacionais, que promovem reco-
mendações e normas relacionadas com as
questões de biossegurança. Neste contex-
to, destacam-se diversas entidades, muitas
delas ligadas à Organização das Nações
Unidas (ONU), tais como o Programa das
Nações Unidas para o Meio Ambiente
(UNEP) e Organização das Nações Unidas
para Agricultura e Alimentação (FAO),
dentre outras (Varella et al., 1998).
No Brasil, a Lei no 8.974 (Brasil..., 1995),
mais conhecida como Lei de Biossegu-
rança, só foi decretada e sancionada em
5 de janeiro de 1995, mas já em 1988, a
Constituição Federal previa no seu arti-
go 225, a proteção e preservação do meio
ambiente, colocando como responsabi-
lidade do poder público a manutenção
do equilíbrio ambiental. A Lei de Biosse-
gurança veio justamente preencher uma
lacuna existente na legislação do setor bio-
tecnológico, principalmente no que diz
respeito a manipulações genéticas de seres
vivos. Os principais objetivos desta lei são
normatizar e disciplinar o uso das técnicas
de Engenharia genética na construção, cul-
tivo, manipulação, transporte, comerciali-
zação, consumo, liberação e descarte de
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
OGMs, visando proteger a vida e a saúde
do homem, dos animais e das plantas, bem
como o meio ambiente. A existência de uma
legislação específica possibilitou ainda a
criação de uma comissão específica para
assuntos de biossegurança nacional, a
Comissão Técnica Nacional de Biossegu-
rança (CTNBio).
Dentre as inúmeras funções delegadas
a CTNBio, algumas de maior importância
estão listadas a seguir:
a) criar um código de ética para as ma-
nipulações genéticas e estabelecer
normas e regulamentos para todas
as atividades que envolvam OGMs;
b) acompanhar o desenvolvimento e o
progresso técnico e científico na
biossegurança e em áreas afins, com
o objetivo de resguardar a segurança
da população e do meio ambiente;
c) estabelecer e coordenar as Comis-
sões Internas de Biossegurança
(CIBios), em instituições que desen-
volvam ou utilizem OGMs;
d) emitir parecer técnico sobre a libera-
ção de OGMs no meio ambiente e
exigir Estudo de Impacto Ambiental
(EIA), quando julgar necessário;
e) emitir Certificado de Qualidade em
Biossegurança (CQB) para institui-
ções que desenvolvam ou utilizem
OGMs;
f) emitir parecer técnico sobre qualquer
liberação, importação, transporte,
armazenamento, comercialização,
consumo ou descarte de OGM ou
de produtos que contenham seus
derivados, tornando-o disponível a
órgãos de fiscalização e ao público
em geral.
A CTNBio é composta de membros
efetivos e suplentes, distribuídos da se-
guinte forma:
a) oito especialistas de notório saber
científico e técnico, em exercício no
segmento de biotecnologia, sendo
dois da área humana, dois da área
vegetal, dois da área animal e dois
da área ambiental. Todos são indica-
dos pela comunidade científica e
escolhidos pelo ministro da Ciência
e Tecnologia a partir de uma lista
tríplice de sugestões;
93
b) um representante de cada um dos
seguintes órgãos: Ministério da
Ciência e Tecnologia, Ministério da
Saúde, Ministério do Meio Ambi-
ente, Ministério da Educação e Mi-
nistério das Relações Exteriores,
designados pelos respectivos mi-
nistros;
c) dois representantes do Ministério da
Agricultura, sendo um da área vege-
tal e outro da área animal;
d) um representante de órgão de defesa
do consumidor;
e) um representante do setor empre-
sarial de biotecnologia;
f) um representante de órgão de pro-
teção à saúde do trabalhador.
A CTNBio possui comissões setoriais
específicas, para apoiar tecnicamente os
órgãos de fiscalização já existentes e auxi-
liar na fiscalização e monitoramento das
atividades que envolvam OGMs ou deriva-
dos destes. Outra função destas comissões
setoriais é a de elaborar pareceres técnicos
a respeito de pleitos solicitados a CTNBio.
As normas sumarizadas, para a liberação
planejada no meio ambiente de organismos
geneticamente modificados, estão demons-
tradas na Figura 31.
Apesar de o ato da CTNBio constituir
parecer conclusivo de caráter técnico do
ponto de vista da biossegurança, não é,
entretanto, autorizável para determinar o
plantio de um vegetal transgênico, cuja
responsabilidade é fundamentalmente da
competência do Ministério da Agricultu-
ra. No entanto, compete exclusivamente a
CTNBio determinar a paralisação de quais-
quer atividades envolvendo OGMs, uma
vez constatada a existência de riscos graves
para a saúde do homem e dos animais, para
as plantas e para o meio ambiente (Scholze,
1999). Além da interdição e também me-
diante determinação da CTNBio, infrações
à Lei de Biossegurança poderão ser pas-
síveis de multas e penas de reclusão.
Certificado de Qualidade em
Biossegurança (CQB)
Este certificado é emitido pela CTNBio
a toda empresa que deseja desenvolver
qualquer tipo de trabalho no território na-
cional, envolvendo OGMs ou seus de-
94
Proposta do pesquisador
responsável elaborada na forma
de projeto
Avaliação pela CIBio
Envio à CTNBio
Publicação no Avaliação pela
Diário Oficial da comissão setorial
União específica
Parecer da CTNBio
Decisão sobre a
proposta
Publicação no Diário Comunicação
Oficial da União à CIBio
Figura 31 - Procedimentos requeridos para
liberação planejada de OGMs
no meio ambiente
rivados, seja ela destinada ao ensino, à
pesquisa científica, à prestação de serviços
ou à produção. O CQB será emitido às
instituições que o solicitarem, mediante a
aprovação do requerimento. Este deverá
estar acompanhado de um projeto com a
descrição detalhada da proposta de tra-
balho, assim como informações sobre
instalações existentes, qualificação das
pessoas envolvidas, idoneidade financeira
da instituição, além de outras informações
(finalidade do trabalho, tipo e grupo de ris-
co do organismo etc.). A aprovação da
emissão do CQB levará em consideração,
principalmente, a competência e a adequa-
ção do quadro funcional e a infra-estrutu-
ra disponível, para que os trabalhos com
OGMs possam ocorrer de forma segura e
responsável. O CQB será emitido apenas
para uma proposta específica de trabalho,
ou seja, para uma Unidade Operativa dentro
de uma entidade, podendo ser esta cons-
tituída por um ou mais laboratórios ou outro
tipo de infra-estrutura de funcionamen-
to, tal como uma casa de vegetação ou um
campo experimental. A emissão de um novo
CQB será necessária, sempre que houver
alteração de qualquer componente que
possa modificar as condições previamente
aprovadas. A CTNBio, junto com os órgãos
de fiscalização dos Ministérios, realizará
vistorias anuais nas entidades, podendo,
com base em seus resultados, revogar o
CQB previamente concedido.
Comissão Interna
de Biossegurança (CIBio)
Toda entidade que utilizar técnicas e
métodos de Engenharia genética deverá
criar uma CIBio, além de indicar para cada
projeto específico um pesquisador prin-
cipal, definido na regulamentação como
Técnico Principal Responsável. A CIBio
exercerá suas atividades com a autoridade
estabelecida na lei e deve ser constituída e
nomeada pelo responsável legal da entida-
de. Cada entidade terá uma ou mais CIBios
em função de sua estrutura administrativa
e técnica. As entidades devem reconhecer
o papel legal das CIBios e a elas assegurar
a autoridade e o suporte requeridos para o
cumprimento de suas obrigações e para a
implementação de suas recomendações,
garantindo-lhes a supervisão dos traba-
lhos. As CIBios são componentes essen-
ciais para o monitoramento e vigilância dos
trabalhos de Engenharia genética, mani-
pulação, produção e transporte de OGMs
e para fazer cumprir a regulamentação de
biossegurança.
A composição da CIBio incluirá pes-
soas com conhecimento e experiência ne-
cessários para acessar, avaliar e supervi-
sionar os trabalhos com OGMs que estão
sendo conduzidos na entidade. Ela deverá
ter no mínimo três especialistas em áreas
compatíveis com a atuação da entidade e
recomenda-se a inclusão de pelo menos
uma pessoa leiga, funcionária da entidade
ou não, e que esteja preparada para consi-
derar os interesses mais amplos da comu-
nidade.
As principais responsabilidades da
CIBio são elaborar e divulgar normas e to-
mar decisões sobre assuntos específicos
no âmbito da instituição em procedimentos
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
Biotecnologia
de segurança, sempre em consonância com
as normas da CTNBio. Alguns pontos de
maior destaque da ação das CIBios estão
descritos a seguir:
a) requerer o CQB junto à CTNBio;
b) avaliar e revisar todas as propostas
de pesquisas em Engenharia gené-
tica, manipulação, produção e trans-
porte de OGMs conduzidos pela
entidade;
c) identificar os riscos em potencial
para os pesquisadores, para a co-
munidade e para o meio ambiente.
Comunicar aos pesquisadores e re-
comendar soluções;
d) determinar níveis de contenção e os
procedimentos de segurança a se-
rem seguidos para todo trabalho
experimental envolvendo OGMs;
e) inspecionar, monitorar e atestar a
segurança de laboratórios e outras
instalações antes e durante a utili-
zação para trabalhos ou experimen-
tos com OGMs. No mínimo, duas
inspeções anuais dessas instala-
ções serão realizadas para assegurar
que elas continuem tendo os reque-
rimentos e padrões de contenção
relevantes;
f) rever a qualificação e a experiência
do pessoal envolvido nas pesquisas
propostas, a fim de assegurar que
sejam adequadas para boas práticas
laboratoriais;
g) familiarizar os novos membros com
procedimentos de segurança, de
contenção e com o uso correto de
equipamentos.
A CIBio ficará responsável por enviar
à CTNBio a relação dos projetos de pes-
quisa em andamento ou a serem iniciados,
que envolvam OGMs, bem como a lista de
laboratórios, casas de vegetação e insta-
lações para plantas e animais transgênicos,
especificando os níveis de contenção,
conforme as normas da CTNBio. A CIBio
também deverá enviar relatórios à CTNBio,
sempre que ocorrer qualquer tipo de aci-
dente que envolva ou esteja relacionado
com os trabalhos com OGMs.
O pesquisador responsável deverá es-
tar completamente familiarizado com os
Biotecnologia
requerimentos da legislação de biossegu-
rança, a fim de garantir que, na execução
de qualquer projeto que envolva o uso de
OGMs, eles sejam obedecidos. O pesqui-
sador responsável deverá, ainda, avaliar as
propostas de trabalho e verificar se estão
de acordo com a regulamentação de biosse-
gurança, fornecer informações, quando
solicitado, sobre os projetos da institui-
ção, garantir o uso das normas da CTNBio
e da CIBio nos projetos de pesquisa. Fica a
encargo dele, encaminhar a proposta à
CIBio, para que esta possa ser avaliada e
encaminhada à CTNBio. É de responsa-
bilidade do pesquisador responsável, zelar
pela segurança das pessoas que estejam
trabalhando no projeto com OGMs. Para
tanto, ele deve certificar-se de que todos
tenham recebido treinamento apropriado e
que estejam conscientes da natureza dos
riscos potenciais do trabalho. Deverá ainda,
garantir a boa manutenção dos aparelhos
e da infra-estrutura e notificar imediata-
mente a CIBio, todos os acidentes e doen-
ças possivelmente relacionados com as
atividades com OGMs.
Classificação dos
experimentos com vegetais
geneticamente modificados
quanto aos níveis de risco
e de contenção
O nível de contenção de um experimen-
to deverá ter como base o nível de risco dos
organismos envolvidos no experimento e
ser determinado pelo organismo de maior
nível de risco, sendo este ou não um OGM.
Para mensurar o nível de risco que um
dado organismo possa oferecer, serão con-
sideradas as seguintes questões:
a) o DNA ou RNA transferido para o
organismo, ou seja, o gene em ques-
tão, assim como seu padrão de ex-
pressão no organismo-hospedeiro;
b) o tipo de vetor (agente que carrega
o gene) de transformação utilizado;
c) o organismo hospedeiro da cons-
trução gênica;
d) a quantidade de organismo envol-
vida;
e) o local de realização dos experimen-
tos.
É interessante ressaltar que, para genes
que codificam produtos nocivos para a
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.89-96, maio/jun. 2000
95
saúde humana, para animais ou para o meio cercas, separadas de áreas de trânsito livre
ambiente, o vetor utilizado não deve ser e, ainda, sejam totalmente fechadas, im-
capaz de sobreviver em condições externas pedindo a entrada ou saída de qualquer
a do laboratório. Isso serviria como uma organismo ou partícula. Devem possuir
garantia para impedir o escape acidental uma cabine de duas portas para a troca de
desse gene para o ambiente externo. roupa antes e após a entrada no seu interior.
Os vegetais são classificados em qua- O ar deverá ser filtrado antes de sair do seu
tro grupos, segundo o grau de risco que interior e o acesso deverá ser restrito uni-
podem apresentar para os seres humanos camente a indivíduos que estejam dire-
e para o meio ambiente. A seguir, há uma tamente envolvidos com os experimen-
descrição sucinta de cada grupo: tos em andamento. Todos os experimentos
ou materiais deverão ser esterilizados ou
a) Grupo de risco I: vegetais geneti-
inativados antes de ser descartados. A Fi-
camente modificados ou não, que
gura 32, (p.65) demonstra uma casa de ve-
apresentam um baixo nível de risco
getação adequada a trabalhos com orga-
para o homem e para o ambiente;
nismos dos grupos de riscos I e II.
b) Grupo de risco II: vegetais geneti-
Todo ambiente, onde haja manipulação
camente modificados que são plan-
ou armazenamento de OGMs ou microorga-
tas daninhas ou que podem cruzar-
nismos que apresentem risco à saúde do
se com elas; vegetais cujos genes
introduzidos representam o genoma homem e dos animais, além de ameaça ao
ambiente, deverá ser corretamente iden-
completo de um agente infeccioso
tificado por meio de símbolo apropriado
não-exótico e vegetais associados a
(Fig. 33), à semelhança do que se pratica
microorganismos com potencial para
produzir efeitos negativos no meio em ambientes onde há risco de contamina-
ção por radiação. Como se pode perceber,
ambiente;
a dificuldade de trabalho com organismos
c) Grupo de risco III: vegetais cujos
que apresentam um maior grau de perigo,
genes introduzidos representam o
justifica-se pelo fato do enorme impacto
genoma completo de um agente que estes podem ocasionar ao ambiente
infeccioso exótico transmissível;
vegetais ou microorganismos asso-
ciados a eles, cujos genes introdu-
zidos produzem toxinas para verte-
brados;
d) Grupo de risco IV: agente infeccio-
so exótico que seja transmissível e
que tenha potencial para ser um pa-
tógeno sério para espécies cultiva-
das no país.
Os princípios de contenção têm como
base o reconhecimento de que os organis-
mos usados não constituem uma ameaça
para a saúde humana ou para a dos animais.
A contenção anula ou minimiza a possibi- Figura 33 - Símbolo de biossegurança in-
dicando risco biológico
lidade de um efeito danoso em organismos
NOTA: Este símbolo deve estar fixado em lo-
e em ecossistemas fora da área experimental. cais bem visíveis, em ambientes onde
Como regra, à medida que aumenta o gru- haja manipulação ou armazenamento
po de risco, há necessidade de uma infra- de OGMs ou microorganismos, que
estrutura de contenção mais refinada. Para apresentem risco à saúde de homens e
de animais, além de ameaça ao ambi-
trabalhos em casas de vegetação, o grupo
ente. O símbolo deve estar sempre
de risco I exige apenas casas de vegetação acompanhado de informações sobre o
simples. Já o grupo de risco III exige um microorganismo utilizado, classe de ris-
maior grau de segurança, necessitando que co, pesquisador responsável e telefone
as casas de vegetação estejam isoladas por para contato em caso de acidente.
96
ou ao homem, caso sejam expostos ao
ambiente externo. É interessante relatar,
que as normas de trabalho com organismos
do grupo de risco IV, em casas de vegeta-
ção, ainda não foram estabelecidas pela
CTNBio e, portanto, é totalmente vetado
qualquer tipo de experimentação com esses
organismos no território nacional. Vale lem-
brar que essas normas são específicas para
trabalhos com vegetais em casa de vege-
tação; já para trabalhos em contenção em
laboratórios e com animais e microorga-
nismos, as regras são diferentes.
Apesar de todo este aporte legal e téc-
nico, o Brasil ainda não possui nenhuma
cultivar de plantas transgênicas liberada
para cultivo comercial em território nacio-
nal. Há proposta de uma moratória de cinco
anos, para que os efeitos dos produtos
transgênicos possam ser melhor avaliados.
No entanto, há centenas de liberações pla-
nejadas no ambiente, conduzidas por insti-
tuições de pesquisa públicas ou privadas,
unicamente com o caráter de avaliação do
material no campo.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A moderna biotecnologia, a cada dia,
vem-se tornando mais importante para o
homem como ferramenta útil para solução
de inúmeros problemas, nas mais variadas
áreas. São enormes os avanços obtidos nas
últimas décadas pelo uso da biotecnologia
na agricultura. O Brasil, apesar das severas
limitações financeiras impostas à pesqui-
sa, tem assumido a postura de acompanhar
e absorver os novos avanços que estão
sendo gerados a todo momento pela bio-
tecnologia, assegurando, desta forma, sua
autonomia nesta área. Muito embora isso
seja importante, o país não tem negligen-
ciado as questões de biossegurança e tem-
se preocupado com os possíveis efeitos
negativos que poderão advir com o uso
generalizado de produtos geneticamente
manipulados. No que se refere à legislação
de segurança para atividades que envolvam
OGMs, a Lei de Biossegurança brasileira é
considerada como uma das mais modernas,
estando em conformidade com os mais
rigorosos padrões de segurança praticados
no mundo. Embora seja inquestionável o
potencial oferecido pelas plantas trans-
gênicas para a prática de uma agricultu-
ra mais eficiente e racional, o princípio da
precaução em momento algum deve ser
relegado a segundo plano. Para um país
como o Brasil, que tem na agricultura uma
de suas principais atividades, desempe-
nhando inclusive, importante papel social,
a opção pela adoção ou não de novas
tecnologias que otimizam a atividade agrí-
cola, assume importância estratégica. No
momento, é importante que a discussão so-
bre a necessidade ou não de novas tecno-
logias não fique restrita apenas a questões
meramente políticas e econômicas, de-
vendo considerar-se também os aspectos
sociais e ambientais envolvidos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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agroecoystems? Outlook on Agriculture,
London, v.20, n.1, p.15-23, 1991.
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n.10, p.101-107, set./out. 1999.
BRASIL. Ministério da Ciência e Tecnologia. Lei
no 8974, de 5 de janeiro de 1995. Regulamen-
ta os incisos II e V do § 1o do artigo 225 da
Constituição Federal, estabelece normas para
o uso das técnicas de engenharia genética e
liberação do meio ambiente de organismos
geneticamente modificados, autoriza o Poder
Executivo a criar, no âmbito da Presidência
da República, a Comissão Técnica Nacional
da Biossegurança e dá outras providências.
LEX – Coletânea de legislação e juris-
prudência, São Paulo, v.59, p.32-38, 1995.
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Biotecnologia 97

Aplicação de marcadores moleculares

no melhoramento genético
Marcelo Abreu Lanza 1
Cláudia Teixeira Guimarães 2
Ivan Schuster 3

Resumo - O melhoramento genético tem sido um dos grandes responsáveis pelos

avanços na agricultura, com o desenvolvimento de cultivares superiores, quer pela
maior produtividade, quer pela melhor adaptação aos ambientes adversos. O sucesso
de um programa de melhoramento genético depende fundamentalmente de algumas
etapas como a escolha de genitores que produzam indivíduos com a melhor com-
binação de alelos favoráveis e a seleção de genótipos superiores em populações
segregantes. Uma potente ferramenta para auxiliar o melhoramento são os marca-
dores moleculares, que fornecem um número ilimitado de polimorfismos com base
no DNA e são independentes dos efeitos ambientais e do estádio fisiológico da
planta, permitindo a identificação precoce e precisa de indivíduos com uma melhor
combinação de alelos favoráveis. Os avanços nas técnicas moleculares, na bioinfor-
mática e na genética quantitativa têm contribuído de forma sinergística para o atual
nível de conhecimentos sobre a estrutura genética de várias espécies cultivadas e
silvestres. Assim, várias são as aplicações dos marcadores moleculares, tanto para
auxiliar programas de melhoramento, quanto em estudos de variabilidade genética,
identificação de cultivares, proteção dos direitos do melhorista, avaliação da pureza
genética de sementes, mapeamento genético e ampliação dos conhecimentos na
organização dos genomas.
Palavras-chave: Variabilidade genética; Genoma; Alelos; Polimorfismo.

INTRODUÇÃO
No início, os estudos genéticos eram
realizados utilizando-se marcadores morfo-
lógicos determinados por mutações simples
em um gene particular, gerando alterações
fenotípicas de fácil identificação no orga-
nismo. Os marcadores morfológicos con-
tribuíram significativamente para o esta-
belecimento dos princípios teóricos do
mapeamento genético e das análises de
ligação gênica. No entanto, o número redu-
zido de marcadores fenotípicos disponíveis,
a ausência de ligação destes com caracteres
de importância econômica e os efeitos dele-
térios das mutações limitaram sua utilização
(Guimarães & Moreira, 1999).
Com o advento das técnicas de biologia
molecular, tornou-se possível a manipula-
ção do DNA, que culminou no surgimento
dos vários tipos de marcadores moleculares
disponíveis atualmente. Os marcadores
moleculares apresentam várias vantagens
sobre os marcadores morfológicos por
fornecer um número ilimitado de polimor-
fismos distribuídos aleatoriamente ao longo
de todo o genoma e por ser independentes
dos efeitos ambientais e do estádio fisioló-
gico da planta, permitindo a identificação
precisa dos genótipos em estádios iniciais
do desenvolvimento. O avanço das técni-
cas moleculares tem sido acompanhado de
perto pelo grande desenvolvimento nas
áreas da bioinformática e da genética quan-
titativa. A aplicação dessas técnicas para
acelerar e monitorar os programas de me-
lhoramento genético tem como conse-
qüência grandes avanços no desenvol-
vimento de variedades melhoradas.
MARCADORES MOLECULARES
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphisms
(RFLP) foi o primeiro marcador de DNA a
ser utilizado na construção de mapas ge-
néticos na espécie humana (Botstein et al.,
1980). Em pouco tempo, os marcadores
RFLPs estavam entre os mais utilizados em
várias áreas da genética vegetal. A técnica

1
Engo Agro, M.Sc., Pesq. EPAMIG-CTTP, Caixa Postal 351, CEP 38001-970 Uberaba-MG.
2
Enga Agra, D.Sc., Pesq. EMBRAPA Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas-MG. E-mail: claudia@cnpms.embrapa.br
3
Engo Agro, D.Sc., Pesq. UFV-BIOAGRO, CEP 36571-000 Viçosa-MG.

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.97-108, maio/jun. 2000

98
do RFLP baseia-se na digestão do DNA
genômico com enzimas de restrição.
Os fragmentos gerados de DNA são
separados em gel de agarose e transferidos
para membranas de nylon ou nitrocelulose,
onde são hibridizados com sondas de DNA,
detectando seqüências genômicas homó-
logas a elas. As sondas são seqüências de
DNA marcadas com nucleotídeos radioati-
vos ou quimioluminescentes. Após cada
hibridização, as membranas contendo os
fragmentos de DNA fixados são expostas
a um filme de raios X e submetidas ao pro-
cesso de revelação.
O polimorfismo é obtido, quando ocorre
perda ou surgimento de sítios de restrição,
que são seqüências específicas de quatro
a seis nucleotídeos reconhecidas pelas en-
zimas de restrição utilizadas na digestão
do DNA. Inserções, deleções ou outros
rearranjos, quando ocorrem entre dois sí-
tios de restrição, também alteram o tamanho
dos fragmentos, que são detectados por
possuir uma região homóloga à sonda
de DNA. Esses fragmentos serão polimór-
ficos, quando apresentar qualquer um
dos rearranjos genéticos já citados, sendo
então utilizados na caracterização de in-
divíduos geneticamente diferentes. Os mar-
cadores RFLPs apresentam herança co-
dominante, sendo possível a identificação
de genótipos homozigotos e heterozigotos.
Essa característica é uma das vantagens
do RFLP, uma vez que permite uma aná-
lise mais detalhada da ação gênica e da
interação entre alelos em estudos de ma-
peamento de características quantitativas
(Ferreira & Grattapaglia, 1998). Outra
importante vantagem dos RFLPs é o fato
de representarem locos únicos em cada
genoma e de possibilitar a utilização de
sondas heterólogas, permitindo o mapea-
mento comparativo entre espécies corre-
lacionadas. A Figura 34 ilustra as bases
moleculares dos diferentes marcadores
moleculares e indica quando estes são
dominante ou co-dominante.
Uma grande limitação da técnica de
RFLP é a necessidade de construir biblio-
tecas genômicas para a obtenção das
sondas. Tal limitação é, em parte, superada
na maioria das culturas de interesse eco-
nômico, para as quais existe uma grande
disponibilidade de sondas de DNA, que
podem ser obtidas gratuitamente de insti-
tuições públicas internacionais. Sondas
heterólogas também podem ser utilizadas
entre espécies ou gêneros afins. Outra
limitação é a sua complexidade técnica, o
que requer laboratórios bem equipados e
mão-de-obra especializada.
RAPD
O advento da técnica de Polymerase
Chain Reaction (PCR) (Mullis & Faloona,
1987) e seus posteriores avanços, utilizando
uma enzima DNA polimerase termoestá-
vel e termocicladores programáveis com
elevada capacidade de processamento, im-
primiram grande automatização à síntese
in vitro de DNA. A técnica de PCR consis-
te na síntese enzimática in vitro de um
segmento de DNA, delimitado por um par
de primers de seqüências específicas de
nucleotídeos de fita simples. Primers são
seqüências curtas de DNA, que pareiam
com o DNA-molde e servem de iniciadores
para a síntese in vitro de uma nova fita de
DNA. As reações ocorrem em ciclos alter-
nados de temperatura, sendo que cada
ciclo do PCR envolve três etapas. Na pri-
meira, ocorre a desnaturação da fita du-
pla de DNA, posteriormente, os primers
pareiam-se com as seqüências complemen-
tares específicas que flanqueiam o sítio-
alvo, e então a nova fita de DNA é sinte-
tizada a partir das extremidades 3’-OH livres
Ganho ou perda de sítios de restrição
ou de anelamento de primers
RFLP – co-dominante
RAPD - dominante
AFLP - dominante
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
sítio de restrição
sítio de anelamento de primer
Figura 34 - Bases moleculares dos marcadores de DNA
FONTE: Dados básicos: Paterson (1996).
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Biotecnologia
dos primers por meio da enzima DNA
polimerase. Como cada ciclo é repetido
várias vezes, a amplificação do DNA-alvo
ocorre em progressão geométrica, reque-
rendo uma quantidade muito pequena de
DNA-molde.
A facilidade, a rapidez e a sensibilidade
dessa técnica possibilitaram o surgimen-
to de uma nova geração de marcadores
moleculares com base em PCR. O primeiro
deles foi o Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD) (Williams et al., 1990) ou
Arbitrarely Primed-PCR (AP-PCR) (Welsh
& McClelland, 1990). O RAPD é uma va-
riação da técnica de PCR que utiliza um
único primer de dez nucleotídeos e com
seqüência arbitrária. Portanto, para que um
fragmento de DNA seja amplificado, duas
regiões complementares ao primer devem
estar separadas por até 2.000 pb e em orien-
tações opostas. Com isso, são amplificados
fragmentos de DNA, distribuídos ao acaso
no genoma, sem a necessidade do conhe-
cimento prévio da seqüência do DNA. A
detecção dos produtos de amplificação é
feita em gel de agarose tratado com brome-
to de etídio e visualizado sob luz ultravio-
leta. As bases moleculares do polimorfis-
mo de RAPD são mutações de ponto, ou
deleções no sítio de pareamento do primer,
ou inserções entre os sítios de pareamen-
to, deixando-os a uma distância tal que
impossibilita a sua amplificação. O RAPD
é uma técnica de fácil execução de custo
Inserção ou deleção entre os sítios de restrição
ou de anelamento de primers
RFLP – co-dominante
RAPD e AFLP – co-dominante (raro)
SSR – co-dominante
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
GAATTC GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
CTTAAG
Biotecnologia 99

reduzido e aplicável a qualquer tipo de Microssatélites ou SSR para o desenvolvimento de mapas de liga-
organismo. No entanto, existem problemas Os genomas eucarióticos apresentam ção e para a identificação de indivíduos.
inerentes à reprodutibilidade dos padrões várias classes de seqüências repetidas e Em plantas, os microssatélites são muito
de amplificação, além do baixo conteúdo uma delas consiste em tandem de um a freqüentes e distribuídos ao acaso ao longo
de informação genética por loco, uma vez quatro nucleotídeos, sendo denominadas do genoma, sendo amplamente utilizados
que são marcadores dominantes. Este ti- microssatélites (Litt & Luty, 1989) ou Simple na construção de mapas genéticos. Os mi-
po de marcador possibilita a detecção de Sequence Repeats (SSR). A seqüência de crossatélites apresentam-se como uma das
apenas um alelo por locos, sendo que a DNA que flanqueia estas regiões contendo classes de marcadores mais promissoras
presença de uma banda no gel identifica repetições curtas são conservadas dentro para a ampla utilização nos programas de
indivíduos homozigotos dominantes (AA) de uma espécie, permitindo a seleção de melhoramento, uma vez que são marcado-
e heterozigotos (Aa), não permitindo a dis- primers de PCR que podem ser utilizados res co-dominantes e multialélicos (Fig. 35),
tinção entre eles. O homozigoto recessivo para amplificar os SSRs. O polimorfismo no fornecendo um elevado nível de informação
(aa) é identificado pela ausência da ban- tamanho dos fragmentos obtidos é devido genética por loco. Rongwen et al. (1995),
da. ao número diferente de repetições das se- utilizando sete primers microssatélites pa-
Os avanços no processo de seqüen- qüências simples. Os marcadores micros- ra caracterizar 96 genótipos de soja, en-
ciamento de DNA e os projetos de se- satélites tornaram-se rapidamente os mais contraram de 11 a 26 alelos por loco. Para
qüenciamento de genomas eucariotos têm utilizados pelos geneticistas de humanos, marcadores RFLP, Keim et al. (1989, 1992)
possibilitado um grande acúmulo de in-
formações no nível das seqüências de
DNA. Com isso, marcadores RFLP, RAPD
e informações de seqüências gênicas po-
dem ser convertidos em primers especí- )
ficos para ser utilizados em análises gené-
ticas detalhadas por meio da técnica de
PCR. Sondas genômicas de RFLP, utilizadas
no mapeamento do genoma humano, foram
os primeiros marcadores a serem seqüen-
ciados e amplificados com primers espe-
cíficos, sendo denominados Sequence
Tagged Site (STS) (Olson et al., 1989).
Quando as sondas a serem seqüenciadas
são obtidas de bibliotecas de cDNA, elas A
passam a ser denominadas Expressed
Sequence Tags (EST). Os fragmentos de )
DNA obtidos pela amplificação específica
das sondas de RFLP podem ser clivados
com enzimas de restrição, revelando um
tipo de marcador molecular conhecido
como Cleaved Amplified Polymorphic
Sequences (CAPS) (Konieczny & Ausubel,
1993 e Jarvis et al., 1994). Esses marcadores
apresentam as vantagens práticas do PCR, B
mantendo a natureza co-dominante e alélica
do RFLP. Marcadores RAPD também
podem ser seqüenciados e convertidos em Figura 35 - Padrões de amplificação de microssatélite
primers específicos para amplificação por NOTA: Figura 33A - Padrão de amplificação do microssatélite SSR7 em oito linhagens elites de
PCR. Tais marcadores são denominados milho resolvidos em gel 8% de poliacrilamida não denaturante discriminando oito alelos
diferentes. M é o marcador de peso molecular 25 bp ladder e o tamanho de cada um dos
Sequence Characterized Amplified Regions
alelos está descrito abaixo em pares de base (bp); Figura 33B - Padrão de amplificação do
(SCAR) (Paran & Michelmore, 1993) e
microssatélite Satt038 em uma população F2 de soja, segregando para resistência à raça 3
apresentam uma vantagem sobre o RAPD do Nematóide de Cisto da Soja, resolvido em gel de agarose 3%. Canaletas 1-4, plantas
que é a elevada especificidade da amplifi- homozigotas resistentes, 5-12 plantas heterozigotas, 13-16 plantas homozigotas suscetíveis.
cação, embora mantenham a sua natureza M é o marcador de peso molecular (DNA do fago Lambda digerido com EcoRI, HindIII e
dominante. BamHI).

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.97-108, maio/jun. 2000

100
utilizaram de início 17 sondas de RFLP para
caracterizar 58 genótipos de soja e, poste-
riormente, 132 sondas de RFLP para carac-
terizar 38 genótipos de soja. Apenas duas
sondas no primeiro experimento e três no
segundo apresentaram mais de dois ale-
los.
Pelo fato de serem co-dominantes, mar-
cadores microssatélites, quando ligados a
locos de interesse, permitem obter infor-
mações sobre o tipo de ação gênica de
interações entre diferentes locos. Marca-
dores SSRs são altamente reproduzíveis
e estáveis dentro de uma determinada
espécie, permitindo o intercâmbio de infor-
mações entre diferentes grupos de pesqui-
sa, o que facilita grandemente sua utiliza-
ção na seleção assistida e na integração de
mapas genéticos.
A técnica de SSR é de fácil execução e
pode ser amplamente automatizada pelo
fato de se basear em PCR. No entanto, o
polimorfismo deve ser detectado em géis
de alta resolução, em função das pequenas
diferenças de tamanho entre os segmentos
amplificados, em termos de pares de base.
A maior limitação do método é a obtenção
dos primers específicos que flanqueiam
as regiões altamente repetitivas ou os
microssatélites. Esta etapa requer a cons-
trução de bibliotecas genômicas enrique-
cidas com os microssatélites de interesse,
metodologias eficientes para o screening
das bibliotecas e seqüenciamento de DNA
em larga escala, necessitando de labora-
tórios com uma infra-estrutura bastante
especializada. Esta limitação está sendo
vencida rapidamente, sendo que, para di-
versas espécies de importância econômica,
já existe no mercado um grande número de
primers SSR, o que possibilita a utilização
da técnica com a mesma infra-estrutura uti-
lizada para o RAPD ou PCR convencional,
necessitando apenas de cubas adicionais
para eletroforese em géis de acrilamida. Com
isso, a técnica de SSR torna-se compatível
com RAPD ou PCR convencional, em ter-
mos de custo. Além disso, como apenas
um loco é amplificado em cada indivíduo, é
possível utilizar primers multiplex no ma-
peamento genético, tornando a técnica ain-
da mais barata. Esta estratégia consiste na
utilização de dois ou mais pares de primers
na mesma reação de PCR. Os primers com-
ponentes do multiplex não podem possuir
homologia cruzada e devem amplificar
alelos de tamanhos diferentes.
AFLP
O Amplified Fragment Length
Polymorphisms (AFLP) é uma classe re-
cente de marcadores, que alia a especifi-
cidade dos sítios de restrição do RFLP à
praticidade da amplificação do PCR, apre-
sentando-se como uma ferramenta pode-
rosa na caracterização de genomas e no
mapeamento genético (Vos et al., 1995). A
técnica baseia-se na digestão simultânea
do DNA genômico com duas enzimas de
restrição, sendo EcoRI e MseI as mais
usadas. Adaptadores específicos, com ter-
minais complementares às extremidades
coesivas dos sítios de restrição, são liga-
dos aos fragmentos de DNA digeridos. São
utilizados dois adaptadores específicos,
sendo um para cada sítio de restrição. Os
fragmentos digeridos e com os adaptadores
ligados a eles são submetidos a uma reação
de PCR com primers pré-seletivos, cuja
seqüência é complementar à dos adapta-
dores, acrescidos de um nucleotídeo arbi-
trário na sua extremidade 3’. A amplifica-
ção pré-seletiva é realizada com o objetivo
de aumentar a proporção dos fragmentos
de interesse, com os sítios de restrição de
EcoRI e MseI, e de fazer uma seleção ini-
cial desses fragmentos. Os fragmentos pré-
amplificados são então submetidos às rea-
ções de amplificação seletiva, utilizando
primers com a mesma seqüência dos
primers pré-seletivos acrescida de dois nu-
cleotídeos arbitrários na sua extremida-
de 3’. A detecção dos fragmentos polimór-
ficos é feita em gel de seqüenciamento, uti-
lizando um dos primers seletivos marcados
com radioatividade ou com fluorescência.
A Figura 36 (p.65) exemplifica um resulta-
do de AFLP em uma população F2 de cacau,
utilizando primers fluorescentes, analisa-
dos por meio do seqüenciador automático
ABI377 (Queiroz, 1999).
Uma das vantagens do AFLP é o gran-
de poder de detecção de variabilidade
genética, uma vez que a técnica explora
polimorfismos de restrição e de amplifi-
cação. Dessa forma, é resolvido um grande
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Biotecnologia
número de fragmentos polimórficos em
um único gel de seqüenciamento. Como os
primers utilizados nas etapas de ampli-
ficação são longos, em torno de 20 pb, a
especificidade das reações é aumentada
significativamente, quando comparada
com o RAPD. Assim, o AFLP alia a van-
tagem de explorar regiões genômicas
arbitrárias, sem a necessidade do conhe-
cimento prévio das seqüências do DNA,
com a elevada especificidade da técnica de
PCR. Uma das limitações do AFLP é o baixo
conteúdo de informação genética por loco
que, à semelhança do RAPD, também são
marcadores essencialmente dominantes.
Como o AFLP é realizado em várias etapas,
incluindo a digestão do DNA com enzimas
de restrição, é uma técnica trabalhosa, que
necessita de DNAs genômicos de alta qua-
lidade e de um maior número de reagentes,
tornando-a também mais cara. Outro fato
que contribui para aumentar a complexi-
dade do AFLP é que a resolução dos poli-
morfismos precisa ser realizada em géis de
seqüenciamento, utilizando radioatividade
ou fluorescência, e nem todos os labora-
tórios estão capacitados para trabalhar com
tais metodologias.
APLICAÇÕES DOS
MARCADORES MOLECULARES
NO MELHORAMENTO GENÉTICO
Os marcadores moleculares possibili-
tam várias aplicações e análises genéticas
com grandes oportunidades de utilização
no melhoramento genético.
Diversidade genética
e seleção de genitores
Os diferentes tipos de marcadores mo-
leculares disponíveis apresentam uma
ampla capacidade de amostragem do ge-
noma, sendo de grande potencial para a
avaliação da diversidade genética, tanto
para aplicações filogenéticas e evolutivas,
quanto para fins práticos em programas de
melhoramento genético e na manutenção
de bancos de germoplasma. Os genótipos
são avaliados por meio dos marcadores e
as bandas comuns a todos os indivíduos
são interpretadas como semelhanças gené-
ticas, e as não-comuns, como diferenças
genéticas. Os resultados são codificados
Biotecnologia
de forma que gere uma matriz de similaridade
(ou dissimilaridade), que pode ser grafica-
mente interpretada por meio de análise de
agrupamento ou multivariada.
A escolha dos genitores e o plane-
jamento dos cruzamentos são etapas de
fundamental importância para o sucesso
de um programa de melhoramento (Borém,
1997). Estas etapas podem ser auxiliadas
por meio dos marcadores moleculares, que
fornecem aos melhoristas informações
genéticas adicionais e mais detalhadas dos
genótipos, aumentando a probabilidade de
obtenção de cultivares superiores. A iden-
tificação e seleção de genitores superiores
são críticas em espécies perenes, como fru-
teiras e essências florestais, uma vez que o
tempo para obtenção de uma cultivar me-
lhorada é bastante longo.
A caracterização molecular da diver-
sidade genética entre 38 cultivares de soja
brasileiras, por meio de marcadores RAPD,
foi estreitamente correlacionada com dados
genealógicos, tendo grande utilidade na
seleção de genitores para o Programa de
Melhoramento da Qualidade da Soja para
a Agroindústria da Universidade Federal
de Viçosa (UFV) (Abdelnoor et al., 1995).
O estudo da diversidade genética entre ge-
nitores de feijoeiro, utilizando marcadores
RAPD e proteínas de reserva, agrupou cor-
retamente as cultivares em dois grupos de
acordo com a origem evolutiva, permitindo
uma caracterização mais detalhada dos ge-
nótipos dentro de cada grupo (Vasconcelos
et al., 1996). A escolha de genitores mais
divergentes, dentro de um grupo de linha-
gens-elite de soja, com base em marcadores
moleculares, gerou híbridos F1 mais pro-
dutivos (Miranda, 1998). Em programas de
retrocruzamento, a seleção de genitores
doadores de genes de interesse que sejam
geneticamente mais similares aos genitores
recorrentes permite a recuperação mais
rápida do genoma destes. Desse modo, o
estudo da diversidade genética auxiliado
por marcadores moleculares pode direcio-
nar cruzamentos, favorecendo a obtenção
de cultivares superiores.
O estudo da diversidade genética den-
tro dos bancos de germoplasma gera infor-
mações que têm como objetivo otimizar a
manutenção e o manejo das coleções bá-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.97-108, maio/jun. 2000
sicas, além de facilitar o acesso dos melho-
ristas às coleções. A caracterização de li-
nhagens de milho em grupos heteróticos
é de fundamental importância na escolha
dos genitores para a obtenção de híbridos
com elevada performance agronômica. Me-
didas de distância genética por meio de
RFLP têm sido utilizadas na classificação
de linhagens de milho em grupos heteró-
ticos, bem como a alocação de novas li-
nhagens de origem desconhecida nos dife-
rentes grupos (Dudley et al., 1992 e Livini
et al., 1992). O monitoramento de cruzamen-
tos em pomares de sementes de espécies
florestais tem garantido uma combinação
genética favorável entre indivíduos sele-
cionados (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Fingerprinting e proteção
de cultivares
A caracterização de variedades, linha-
gens ou híbridos por meio de marcadores
de DNA tem sido de grande importância
na proteção do direito intelectual do melho-
rista, sendo utilizada como prova legal em
processos jurídicos nos países em que já
vigoram as leis de proteção de cultivares.
Com a aprovação, no Brasil, da Lei de Pro-
teção de Cultivares, Lei no 9.456, de 25 de
abril de 1997 (Brasil..., 1997), o Serviço Na-
cional de Proteção de Cultivares (SNPC),
órgão vinculado ao Ministério da Agricul-
tura, ficou responsável pelo registro e pro-
teção de novas variedades. Para que uma
variedade seja protegida, é necessário de-
monstrar que ela é diferente de qualquer
outra da mesma espécie. Atualmente, a
proteção de cultivares é feita com base em
descritores morfológicos, tais como, colo-
ração de flor e pubescência, hábito de cres-
cimento, forma da folha, ciclo, resistência
a doenças, entre outras. Em espécies que
possuem uma base genética estreita, como
é o caso da soja, em que as variedades são
obtidas pela hibridação entre um grupo
elite de parentais geneticamente seme-
lhantes, as novas variedades tendem a ser
muito semelhantes e muitas vezes indistin-
guíveis com base nestas características.
Além disso, com o aumento do número de
variedades protegidas no banco de dados
do SNPC, torna-se cada vez mais difícil dis-
tinguir uma nova variedade daquelas já
101
existentes. Então, um sistema com base em
marcadores de DNA e que possa identificar
um padrão único de combinação destes
marcadores, como uma “impressão digital”
(fingerprint), para cada variedade, torna-
se necessário para facilitar a proteção de
novas variedades, e assegurar os direitos
de propriedade intelectual dos melhoristas.
Com a utilização de marcadores multialé-
licos e altamente conservados, como os
SSR, é possível obter um padrão único para
cada variedade. Rongwen et al. (1995),
utilizando sete marcadores de microssaté-
lite, conseguiram distinguir 95 entre 96
genótipos de soja. Os dois únicos genó-
tipos que possuíam alelos idênticos nos
sete locos eram estreitamente aparenta-
dos (93,4% de similaridade com base na
genealogia). Russell et al. (1997), estudan-
do 11 locos de SSR em 24 genótipos de
cevada, encontraram três combinações de
quatro SSR, que identificaram todos os
genótipos avaliados. Estes autores conse-
guiram distinguir inclusive duas linhas
irmãs, que possuíam distância nula, com
base na genealogia.
Marcadores moleculares, pelo fato de
discriminarem a contribuição genética de
cada genitor na sua descendência, podem
ser utilizados para o controle da pureza
genética de sementes híbridas ou de linha-
gens, para a determinação da taxa de polini-
zação cruzada em espécies autógamas e
para a avaliação do tipo de fecundação
predominante em espécies ainda pouco
estudadas. A capacidade de discriminação
dos métodos de fingerprinting molecular
depende do número de marcadores utili-
zados e da freqüência de cada loco dentro
da espécie (Ferreira & Grattapaglia, 1998),
sendo necessário um estudo prévio da va-
riabilidade genética dos locos para cada
espécie a ser avaliada.
Análise de pureza genética
de sementes
Da mesma forma como os marcadores
com base no DNA são úteis na identifi-
cação de cultivares, tornam-se também uma
importante ferramenta na identificação das
misturas varietais em análises de pureza
genética de sementes, com a finalidade de
certificação ou fiscalização de sementes.
102
Comumente, misturas varietais são iden-
tificadas com base em características obser-
vadas na semente, na plântula e, em alguns
casos, com auxílio de eletroforese de pro-
teínas da semente. Em soja, por exemplo, a
análise de pureza genética de sementes é
feita comumente pela cor do hilo e do hipo-
cótilo e reação à peroxidase. Estes caracte-
res são pouco informativos, pois tanto a
cor do hipocótilo, quanto a reação à pe-
roxidase só permitem dois resultados pos-
síveis, sendo que a combinação de ambos
classifica as variedades em quatro grupos
distintos. Cor de hilo apresenta um número
maior de resultados possíveis, represen-
tados pelas diversas cores e tonalidades
de hilo existentes. Entretanto, algumas
variedades, em função de condições am-
bientais particulares, podem apresentar
tonalidades diferentes da cor de hilo e, com
isso, confundir a discriminação entre va-
riedades com cores parecidas. É o caso de
variedades com hilo preto imperfeito, que
podem ser confundidas com as que pos-
suem hilo preto, ou mesmo hilo marrom.
O laboratório de Genética Molecular
de Plantas, do Instituto de Biotecnolo-
gia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO-
BIOMOL) da UFV tem realizado, a pedido
da Delegacia Regional do Ministério da
Agricultura e do Instituto Mineiro de Agro-
pecuária (IMA), análises com base no DNA,
para investigação de pureza genética em
sementes de soja. Sementes consideradas
atípicas por possuírem hilo de coloração
diferente do padrão definido para a varie-
dade são submetidas à análise de DNA,
com marcadores SSR e sementes da varie-
dade da qual as sementes atípicas foram
obtidas. Os resultados têm demonstrado
que nem sempre a diferença na cor do hilo
significa mistura varietal. Em alguns casos,
sementes de hilo preto imperfeito encon-
tradas em lotes de sementes de hilo marrom
são geneticamente idênticas às sementes
do lote. O uso de marcadores com base no
DNA constitui-se uma ferramenta auxiliar
muito poderosa na análise de pureza gené-
tica de sementes, aplicável sempre que a
caracterização visual permitir dúvidas. Até
o momento, este tipo de análise tem sido
feita, explorando-se ao máximo a represen-
tatividade do genoma, pela utilização de
primers bem distribuídos no mapa genético
da cultura. Além das sementes atípicas, são
também analisadas várias sementes do lote
avaliado, para determinar a variabilidade
intra-varietal, e ainda sementes de outras
variedades, que são utilizadas como con-
trole, principalmente quando as atípicas e
as do lote são idênticas. Tal estratégia, que
utiliza vários controles e uma amostragem
dentro do lote de sementes, contribui para
o aumento no tempo e no custo das aná-
lises. Assim, surge a necessidade de obter
uma caracterização molecular das varie-
dades das diversas culturas economica-
mente importantes, por meio de marcadores
com base no DNA. Além de acelerar e re-
duzir os custos das análises de pureza
genética de sementes, este fingerprinting
molecular será de grande utilidade nos
processos de proteção de cultivares. Dessa
forma, bastará analisar as sementes atípi-
cas com os primers que caracterizam a varie-
dade e comparar os alelos obtidos com
aqueles característicos da variedade. Além
disso, com a utilização de DNA extraído da
própria semente (McDonald et al., 1994),
os resultados podem ser obtidos em um
espaço de tempo ainda mais curto, compa-
tibilizando seu uso com a análise para
certificação de sementes.
Melhoramento genético
auxiliado por marcadores
moleculares
Retrocruzamentos auxiliados por
marcadores moleculares
Atualmente, a utilização de marcadores
moleculares em programas de introgressão
de genes por meio de retrocruzamento é o
exemplo mais concreto de melhoramento
genético assistido por marcadores. Germo-
plasmas não-adaptados têm sido utilizados
em programas de melhoramento com o obje-
tivo de introduzir características de herança
simples, como resistência a doenças. O uso
de marcadores moleculares ligados a genes
de interesse é de grande importância na
seleção de genótipos resistentes, princi-
palmente quando o programa de melhora-
mento tem como objetivo introduzir dois
ou mais genes de resistência, quando o
fenótipo é de determinação complexa, ou
quando o processo de avaliação requer a
I n f o r m e A g r o p e c u á r i o , B e l o H o r i z o n t e , v. 2 1 , n . 2 0 4 , p . 9 7 - 1 0 8 , m a i o / j u n . 2 0 0 0
Biotecnologia
destruição da planta, como é o caso de ne-
matóide do cisto em soja.
Além de monitorar a presença do gene
de interesse, a genotipagem molecular dos
indivíduos permite a seleção daqueles mais
semelhantes ao genótipo recorrente e com
melhor conversão na região próxima ao
gene introduzido. Desse modo, o número
de ciclos de retrocruzamentos necessários
para a recuperação do genótipo recorrente
é reduzido de forma acentuada, acelerando
o desenvolvimento de variedades melho-
radas (Openshaw et al., 1994).
Identificação de marcadores
associados a caracteres
de interesse
Grande parte desses trabalhos tem sido
desenvolvida associando-se marcadores
moleculares a caracteres de herança sim-
ples, uma vez que as variações fenotípicas
são de fácil mensuração e análise. Linha-
gens isogênicas são aquelas geneticamente
semelhantes (exceto na região genômica
onde um gene de interesse foi introduzido),
desenvolvidas por meio de ciclos suces-
sivos de retrocruzamentos. Pelo fato de
essas linhagens apresentarem diferenças
genéticas apenas na região de interesse,
elas têm sido utilizadas com bastante
sucesso na identificação de marcadores
ligados a genes de resistência em várias
espécies de importância econômica, como
ao vírus TMV em tomate (Young et al.,
1988), a Pseudomonas em tomate (Martin
et al., 1991) e a Phytophtora megasperma
em soja (Diers et al., 1992).
Outra estratégia que tem revoluciona-
do a identificação de regiões genômicas
associadas a caracteres de herança simples
é a técnica de bulks segregantes, Bulked
Segregant Analysis (BSA), proposta por
Michelmore et al. (1991). Essa metodologia
baseia-se na construção de dois bulks de
DNA contrastantes para uma característica
fenotípica entre os indivíduos de uma po-
pulação segregante. Cada bulk é constituí-
do de uma mistura de DNAs de indivíduos
de uma população segregante com fenó-
tipo semelhante para a característica de
interesse. Dessa forma todos os indivíduos
que compõem um bulk compartilham uma
mesma região genômica que contém o gene
Biotecnologia
de interesse e segregam para as demais
regiões. Assim, o marcador que co-segregar
com os bulks tem uma grande probabi-
lidade de estar ligado à característica
avaliada, sem necessitar da genotipagem
de um grande número de indivíduos nem
da construção de um mapa genético sa-
turado.
Vários exemplos demonstram o sucesso
da técnica de BSA, como a identificação
de marcadores RAPD e RFLP ligados a
genes de resistência ao míldio em alface
(Michelmore et al., 1991, Paran et al., 1991 e
Paran & Michelmore, 1993). Alzate-Marin
(1996), utilizando a análise de bulks segre-
gantes, identificou marcadores RAPD liga-
dos em fase de acoplamento e de repulsão
a genes de resistência a Colletotrichum
lindemuthianum, agente causal da antrac-
nose do feijoeiro. De forma similar, foi iden-
tificado um marcador RAPD co-dominante,
ligado ao gene que confere resistência ao
cancro da haste da soja (Carvalho, 1995).
Regiões genômicas que controlam outras
características importantes como amadu-
recimento do fruto e abscisão do pedice-
lo em tomate, foram também detectadas
utilizando essa estratégia (Giovannoni et
al., 1991). A estratégia de BSA também
pode ser utilizada na identificação de lo-
cos controladores de caracteres quantita-
tivos - Quantitative Trait Loci (QTLs), que
possuam grande efeito sobre a caracterís-
tica de interesse (QTLs) de efeito maior.
Utilizando esta estratégia, Schuster (1999)
identificou seis marcadores moleculares
(quatro RAPD e dois SSR) associados à
resistência da soja ao nematóide de cisto
da soja (NCS). Estes seis marcadores mo-
leculares formaram um grupo de ligação
contendo um QTL responsável por 56%
da resistência à raça 9 e 39% da resistência
à raça 14 do NCS. Cervigni (1999) identi-
ficou dois marcadores SSR, flanqueando
um QTL que responde por 30% da resis-
tência da soja à raça 3 do NCS (Fig. 35B).
A identificação de marcadores ligados
a genes que conferem resistência a vários
patógenos permite monitorar e acelerar a
introgressão destes genes em cultivares
comerciais, além de possibilitar a pirami-
dação de dois ou mais genes de resistência
em uma cultivar comercial. Marcadores
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.97-108, maio/jun. 2000
ligados a genes de interesse fornecem um
ponto de partida para a clonagem de genes
que se baseia em mapa.
Mapeamento de
caracteres complexos
A maioria dos caracteres de importân-
cia econômica está sob controle genético
complexo, envolvendo a ação de vários
genes, o que torna difícil sua manipula-
ção e compreensão. Regiões genômicas
contendo locos gênicos associados a tais
caracteres quantitativos são denominados
QTLs. Marcadores moleculares analisados
por metodologias estatísticas implemen-
tadas em programas de mapeamento de
QTLs têm possibilitado a dissecação dos
caracteres complexos em fatores mende-
lianos simples. O mapeamento de QTLs
possibilita estimar o número e a localização
de genes que controlam a variação feno-
típica de um caráter, a magnitude dos seus
efeitos e as interações com outros QTLs.
A habilidade de detectar QTLs por meio
de marcadores moleculares é função da
magnitude do efeito do QTL, do tamanho
da população em estudo e do nível de satu-
ração do mapa genético.
O mapeamento de QTLs baseia-se em
testes de associação entre marcadores
moleculares e os dados fenotípicos por
meio de várias metodologias estatísticas.
Os procedimentos mais simples para a
detecção de tais associações são os mo-
delos de regressão linear e análise de va-
riância, que analisam a distribuição dos
valores fenotípicos para cada marcador,
separadamente. Esta metodologia é de
execução simples, bastante flexível e não
requer a construção de mapas genéticos.
Uma limitação dessa metodologia é não
permitir a identificação da posição do QTL
e não estimar a magnitude do seu efeito.
Uma alternativa para aumentar o poder
de detecção das associações e para esti-
mar o efeito e a posição dos QTLs tem sido
o mapeamento por intervalo, proposto por
Lander & Botstein (1989). Tal metodologia
utiliza o método da máxima verossimilhança
para estimar a posição mais provável e a
magnitude do QTL no intervalo entre dois
marcadores ligados no mapa genético
(Lynch & Walsh, 1997). O mapeamento
103
por intervalo possui uma maior precisão
nas estimativas do efeito e da posição do
QTL, uma vez que analisa cada centiMor-
gan (cM) do genoma mapeado. No entan-
to, é uma metodologia mais complexa que
necessita tanto da construção de mapas
genéticos quanto da utilização de progra-
mas computacionais específicos para as
análises. Atualmente, novos modelos têm
sido propostos com o objetivo de aumen-
tar a resolução do mapeamento de QTL,
como o mapeamento por intervalo com-
posto (Zeng, 1993, 1994), múltiplos QTLs
(Jansen, 1993) e o mapeamento por inter-
valos múltiplos (Kao et al., 1999).
Um dos problemas nas análises de QTLs
é que o grande número de testes realizados
dificulta o estabelecimento de níveis de
significância estatística, o que pode ser
uma fonte adicional de erro. Para aumentar
a confiabilidade dos resultados, foram
propostos testes de permutação não-para-
métricos, com base na reamostragem dos
dados originais (Churchill & Doerge, 1994
e Doerge & Churchill, 1996). Os testes de
permutação são procedimentos poderosos
na determinação de níveis de significân-
cia para as associações dos QTLs com mar-
cadores, pelo fato de se ajustarem a cada
experimento, independentemente da distri-
buição dos dados. Programas específicos
para o mapeamento de QTLs contendo
algorítmos apropriados para implementar
vários dos procedimentos estatísticos des-
critos estão disponíveis para acesso públi-
co, na internet, como QTL Cartographer
(Program..., 2000) e MapManager QT
(Map..., 2000).
SAM
A seleção de características simples,
com o auxílio de marcadores moleculares,
tem grande utilidade quando a caracte-
rística é de difícil medição, ou quando se
deseja selecionar para diversas caracte-
rísticas simultaneamente, como no caso de
piramidação de genes. No entanto, a sele-
ção assistida por marcadores (SAM) tem
sua maior contribuição na seleção de
características quantitativas. Associações
entre alelos de marcadores moleculares e
alelos de QTLs podem ser usadas para
selecionar, indiretamente, alelos favoráveis
104
de QTLs. Para caracteres de baixa herda-
bilidade, a seleção fenotípica é realizada
em gerações mais avançadas, pois a her-
dabilidade e a acurácia estatística de esti-
mar médias das progênies crescem com o
aumento no número de repetições, gera-
ções, locais e anos de teste, o que leva a
uma ampliação muito grande no número de
plantas a ser avaliado. Sendo assim, os
melhoristas devem optar entre produzir
estimativas mais precisas da média de um
número menor de progênies ou amostrar
um grande número de progênies, com
estimativas menos precisas. A SAM apre-
senta-se como uma alternativa eficiente
para permitir a seleção precoce de caracte-
rísticas de baixa herdabilidade. A seleção
precoce diminui o número de plantas a ser
analisado por família, permitindo a avalia-
ção de um número muito maior de progê-
nies. A SAM é mais efetiva em gerações
iniciais de seleção entre progênies de cruza-
mentos entre linhas endogâmicas (Stromberg
et al., 1994). Nestas gerações, a herdabi-
lidade é baixa, pois o número de repetições
é limitado, e o desequilíbrio de ligação é
alto (Falconer, 1981). O paradoxo é que o
poder de mapeamento de QTLs decresce,
à medida que a herdabilidade abaixa, e é
menor justamente para características que
teoricamente sofreriam o maior impacto pela
SAM (Lande & Thompson, 1990). Para
evitar a detecção de falsas associações en-
tre marcadores e QTLs, um nível de signi-
ficância bastante alto é utilizado para
declarar associação entre um marcador e
um QTL. A utilização de níveis de signi-
ficância bastante estringentes na escolha
dos marcadores aumenta a acurácia da
SAM e produz ganhos significativos desta
sobre a seleção fenotípica. Trabalhos mais
recentes tendem a utilizar a regressão múl-
tipla do fenótipo aos marcadores, como o
método de identificar a associação entre
marcadores e QTLs, e estimar o efeito dos
marcadores (Lande & Thompson, 1990,
Zhang & Smith, 1992 e Gimelfarb & Lande,
1994). Regressão múltipla é um procedi-
mento computacionalmente mais simples
do que o método da máxima verossimi-
lhança, produzindo resultados muito si-
milares (Lande & Thompson, 1990 e Haley
& Knott, 1992).
Os resultados de estudos teóricos e
experimentais permitem concluir que a
SAM pode ser utilizada para aumentar
substancialmente a eficiência dos progra-
mas de melhoramento (Edwards et al., 1987,
Stuber et al., 1987 e Lande &Thompson,
1990). A eficiência da seleção assistida por
marcadores, comparada com a seleção fe-
notípica, é afetada por diversos fatores, tais
como a herdabilidade da característica, a
cobertura do genoma pelos marcadores,
identificação de associação entre marcado-
res e QTLs, tamanho e número de famílias,
tipo de população e escolha do método de
seleção assistida por marcadores. A sele-
ção, utilizando marcadores flanqueando o
QTL, também é mais eficiente do que a se-
leção com base em um único marcador.
Edwards & Page (1994) obtiveram ganhos
de seleção de 38% superiores, quando uti-
lizaram marcadores flanqueando o QTL, em
relação à seleção com base em um único
marcador, quando os marcadores estavam
longe do QTL (20% de recombinação). Com
5% de recombinação entre os marcadores
e o QTL a vantagem foi de 11%. Lande &
Thompson (1990) propuseram a teoria do
índice de seleção, utilizando marcadores
que maximizam a taxa de ganhos genéticos
pela combinação das informações do poli-
morfismo nos locos dos marcadores gené-
ticos com dados da variação fenotípica
entre os indivíduos.
Este índice pode ser usado tanto para a
seleção individual, como para a seleção de
linhas. Porém, a utilização deste índice
requer testes de progênies com repetições,
para a obtenção dos valores fenotípicos.
A seleção que se baseia apenas em marca-
dores pode ser utilizada e possui eficiência
semelhante ao índice, quando p (a pro-
porção da variância genética aditiva da
característica que é associada com o loco
marcador) for maior que p>0,5 para carac-
terísticas de baixa herdabilidade.
Muitas características de importância
econômica são afetadas por vários QTLs.
Além disso, em muitos casos, QTLs para
diferentes características apresentam-se
ligados (Stuber et al., 1987, Edwards et al.,
1987, Jiang & Zeng, 1995 e Ribaut et al.,
1997). QTLs para produção de grãos em
milho, ligados em fase de repulsão, foram
mapeados por Graham et al. (1997). Como
na maioria dos programas de melhoramento,
I n f o r m e A g r o p e c u á r i o , B e l o H o r i z o n t e , v. 2 1 , n . 2 0 4 , p . 9 7 - 1 0 8 , m a i o / j u n . 2 0 0 0
Biotecnologia
o objetivo é melhorar a performance para
diversas características simultaneamen-
te, o número de QTLs envolvidos em um
programa de melhoramento facilitado por
marcadores moleculares deve ser grande.
Devido à natureza intrínseca dos QTLs, e
pelo fato de caracteres quantitativos serem
controlados por um grande número de
genes de pequeno efeito, a seleção recor-
rente assistida por marcadores molecula-
res é uma escolha apropriada para o me-
lhoramento de populações. Através de
ciclos sucessivos de seleção e intercruza-
mentos, a seleção recorrente favorece a
quebra de ligações genéticas, facilitando a
recombinação entre genes e aumentando a
freqüência de alelos favoráveis nas popu-
lações de melhoramento. O uso da seleção
assistida por marcadores moleculares per-
mite a identificação de combinações fa-
voráveis de alelos, permitindo maiores
ganhos com a seleção. Xie & Xu (1998b)
apresentaram uma comparação teórica en-
tre diversos métodos de seleção recorrente
com base em famílias e seleção massal,
utilizando seleção assistida por marcadores
e seleção fenotípica. A seleção recorrente
assistida por marcadores foi duas vezes
mais eficiente do que a seleção fenotípica,
com famílias de tamanho pequeno, baixa
herdabilidade e alta proporção da variação
fenotípica explicada pelos marcadores (p).
Com o aumento da população, aumento da
herdabilidade e diminuição de p, a vanta-
gem da seleção assistida por marcadores
diminuiu. Seleção assistida por marcadores
é mais competitiva com a seleção fenotípica
tradicional, quando a característica possui
baixa herdabilidade. Se o objetivo do pro-
grama de melhoramento é maximizar a
resposta por unidade de custo, a seleção
assistida por marcadores pode ser inferior
à seleção fenotípica, quando a herdabi-
lidade é superior a 30% e o custo da avalia-
ção fenotípica por indivíduo é menor do
que a genotipagem do loco marcador (Xie
& Xu, 1998a).
CONSTRUÇÃO
DE MAPAS GENÉTICOS
O marco inicial do mapeamento gené-
tico foi o reconhecimento do fenômeno da
ligação genética explicado por Morgan
Biotecnologia
(1910). Os primeiros mapas genéticos de
espécies cultivadas (MacArthur, 1934 e
Emerson et al., 1935) foram construídos
antes mesmo do material genético ser atri-
buído ao DNA. O mapeamento genético
baseia-se na hipótese de que a co-trans-
missão de dois marcadores reflete a proximi-
dade entre eles, uma vez que a probabilidade
de ocorrer permutas genéticas entre dois
marcadores é menor, quanto mais próximos
eles estiverem localizados. Tal fato torna
possível ordenar linearmente a informação
genética ao longo dos cromossomos, tendo
em vista que o genoma eucarioto é organi-
zado e transmitido como unidades lineares.
Com o aumento da disponibilidade de mar-
cadores genéticos e de metodologias es-
tatísticas implementadas em programas
computacionais apropriados, existem atual-
mente mapas genéticos saturados para a
maioria das espécies cultivadas.
A distância genética entre os locos é
medida em termos de freqüência de re-
combinação, que é a probabilidade de
ocorrência de permuta genética entre dois
marcadores. A distância de mapeamento,
expressa em centiMorgans (cM), é calcu-
lada com base na freqüência de recombi-
nação por meio de funções de mapeamento
que corrigem as distorções entre a con-
versão das unidades. A função de Haldane
é a mais simples e admite que as permutas
genéticas ocorrem ao acaso e são indepen-
dentes. Já a função de Kosambi considera
interferência parcial nos cálculos da dis-
tância em centiMorgans. A interferência é
o fato de que uma permuta genética afeta a
ocorrência de outras em regiões adjacentes
próximas a ela, considerando, desta forma,
a ocorrência de crossing-overs duplos. A
precisão na medida da distância genética é
diretamente proporcional ao tamanho da
população e ao número de marcadores
analisados.
Para um marcador ser utilizado no ma-
peamento genético, ele deve ser poli-
mórfico entre os indivíduos parentais e
apresentar uma segregação mendeliana
esperada na progênie. Marcadores, cuja
segregação é estatisticamente validada
pelo teste de Qui-quadrado, são agrupa-
dos e ordenados em cada grupo de ligação
com base nas análises de segregação des-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.97-108, maio/jun. 2000
tes em uma população de mapeamento, por
meio de pacotes computacionais apropria-
dos, como MapMaker (Lander et al., 1987)
e JoinMap (Stam, 1993). Vários tipos de po-
pulações segregantes podem ser utilizados
no mapeamento genético, dependendo do
hábito reprodutivo da espécie, do objetivo
do estudo e do tempo disponível. A po-
pulação F2 é bastante utilizada, uma vez
que pode ser obtida com apenas dois ciclos
de cruzamentos e representa todas as pos-
síveis combinações alélicas (AA, Aa e aa),
possibilitando a estimativa do mecanismo
de ação gênica e das interações com outros
locos. Linhagens recombinantes endogâ-
micas (RILs) são obtidas por meio de auto-
fecundações sucessivas dos indivíduos
F2 até atingirem níveis desejáveis de ho-
mozigose. As populações recombinantes
endogâmicas são também utilizadas na
construção de mapas (Burr et al., 1988), com
a vantagem de que os genótipos são per-
petuados em função do elevado nível de
homozigose, permitindo a avaliação feno-
típica em diferentes locais, a quantificação
da interação genótipo x ambiente e o inter-
câmbio entre informações genéticas gera-
das por diferentes grupos de pesquisa.
A ausência de heterozigose é, em parte,
compensada pelos ciclos sucessivos de
autofecundação, que criam maiores opor-
tunidades de ocorrer recombinação, em
comparação com populações F2. No entan-
to, o tempo gasto para produzir esse tipo
de população é bastante elevado, reque-
rendo de cinco a oito ciclos de autofecun-
dação. Populações de retrocruzamento
também podem ser utilizadas no mapea-
mento genético.
O número de marcadores necessários
para construir um mapa genético depende
do tamanho do genoma, do número de cro-
mossomos e da freqüência de recombinação
genética. Um mapa pode ser considerado
completo, quando o número de grupos de
ligação obtido pela análise dos marcadores
for igual ao número de cromossomos ga-
méticos do organismo ou quando todos
os marcadores genéticos mapeados esti-
verem ligados, sugerindo que todas as
regiões do genoma estão representadas.
Não há uma relação geral entre a distância
genética e a distância física, existindo uma
105
grande variação entre organismos e dentro
de um mesmo cromossomo. A quantidade
de DNA correspondente a um centiMorgan
pode variar de 140 kb (1 kb = 1.000 pares de
base), em Arabdopsis, a 2.000 kb em milho
(Lynch & Walsh, 1997). Embora a distância
genética seja altamente variável, a ordem
dos marcadores ao longo dos grupos de
ligação e a distância entre locos ortólogos
em diferentes espécies são extremamente
conservadas (Paterson, 1996). Tal fato su-
gere que regiões contendo DNA repetitivo
são uma das principais causas da grande
diferença no tamanho físico do genoma das
plantas superiores.
OUTRAS APLICAÇÕES
DOS MAPAS GENÉTICOS
Mapeamento comparativo
O mapeamento comparativo envolve a
análise das similaridades e diferenças na
ordem dos genes ao longo dos cromos-
somos, entre espécies correlacionadas que
não podem ser cruzadas sexualmente. Pa-
ra isso, é necessário que os marcadores
genéticos sejam ortólogos, isto é, devem
possuir uma ascendência comum entre
espécies que não apresentam possibilida-
de de cruzamento sexual (Paterson, 1996).
Estudos comparativos têm revelado uma
grande colinearidade entre os genomas,
demonstrando que um número surpreen-
dentemente reduzido de rearranjos cro-
mossômicos distingue espécies e gêneros
correlacionados. Tal conhecimento possi-
bilita a troca de informações relevantes
sobre a função e a localização de genes
entre espécies relacionadas, aumentando
a eficiência e o aproveitamento dos recur-
sos investidos em análises genômicas.
Para que os marcadores moleculares
sejam utilizados em análises comparativas,
eles devem representar locos únicos em
cada genoma. A maioria das análises de
mapeamento comparativo realizadas até o
momento baseia-se em marcadores RFLP.
Os microssatélites, embora possam ser
utilizados, ainda têm uso limitado nesse tipo
de estudo.
Estudos comparativos têm estabelecido
uma ordem comum entre genes em grande
parte do genoma, que foi conservada ao
106
longo de milhões de anos no decorrer da
evolução das espécies (Paterson, 1996). A
grande conservação na ordem dos genes
entre diferentes espécies de gramíneas le-
vou Bennetzen & Freeling (1993) a suge-
rirem que as gramíneas fossem tratadas
como um sistema genético único. Guimarães
et al. (1997), utilizando sondas genômi-
cas de RFLP, encontraram uma grande coli-
nearidade entre os genomas de sorgo e
cana-de-açúcar, sendo observada uma con-
servação de um QTL associado ao floresci-
mento entre milho, sorgo, cana-de-açúcar
e arroz. Estudos realizados por Paterson et
al. (1995) demonstram que QTLs associa-
dos à altura de planta, à deiscência e ao
tamanho de sementes são também conser-
vados em arroz, milho e sorgo. Desta for-
ma, o conhecimento gerado para uma espé-
cie pode ser amplamente transferido para
outra correlacionada, contribuindo para um
aumento sinergístico na identificação e clo-
nagem de genes em espécies de interesse
econômico.
Clonagem de genes com
base em mapa
O mapeamento genético é uma impor-
tante metodologia alternativa na clonagem
de genes, principalmente quando o produ-
to gênico não é conhecido. Nesse caso, o
efeito fenotípico do gene é avaliado em
progênies segregantes, com o objetivo de
identificar marcadores de DNA que flan-
queiam a região genômica de interesse. Em
seguida, o mapeamento físico é utilizado
para clonar um fragmento grande de DNA
que contenha o gene. A manutenção e
replicação in vitro de grandes segmentos
cromossômicos foram facilitadas signifi-
cativamente com o desenvolvimento dos
cromossomos artificiais, tornando a meto-
dologia mais amplamente utilizada. Se-
qüências transcritas, contidas no fragmen-
to cromossômico clonado, são isoladas por
diferentes técnicas e, finalmente, o gene
de interesse é identificado por comple-
mentação, sendo sua função confirmada
em experimentos de transformação gené-
tica. O primeiro gene clonado a partir de
mapa genético foi uma proteína quinase,
que confere resistência a Pseudomona
syringae em tomate (Martin et al., 1994).
CONCLUSÃO
A utilização de marcadores moleculares
com base em DNA proporcionou uma evo-
lução muito grande na genética e no me-
lhoramento de plantas nos últimos anos.
O principal objetivo foi fornecer uma
idéia geral sobre as bases moleculares dos
marcadores de DNA e sobre suas principais
aplicações. Foram abordados os diferen-
tes tipos de marcadores moleculares, enfa-
tizando as vantagens e limitações de cada
um. É importante esclarecer que a utilização
de um tipo de marcador deve ser norteada
pelos objetivos a serem alcançados, pela
complexidade, diversidade genética da cul-
tura e pela estratégia de melhoramento.
Assim, não existe uma técnica perfeita, e
cada situação deve ser avaliada, para que
a escolha dos tipos de marcadores adap-
tem-se a cada uma delas. As possibilidades
de aplicações dos marcadores moleculares
são inúmeras, desde a mais simples como
estudos da diversidade genética de espé-
cies até trabalhos mais complexos de clo-
nagem de genes com base em mapas de
ligação. O grande desafio é tornar essas
técnicas mais eficientes, automatizando
etapas com a possibilidade de analisar um
maior número de dados com rapidez e re-
dução de custos. A combinação dos méto-
dos de melhoramento, das metodologias
estatísticas e das tecnologias moleculares
traz novas perspectivas para o conheci-
mento genético e para a aceleração dos
programas de melhoramento, bem como
aplicações práticas nos processos de pro-
teção de cultivares e de análises de pureza
genética de sementes, entre outras.
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Biotecnologia 109

Sistemas de proteção de cultivares transgênicas

Waldênia de Melo Moura 1

Resumo - As cultivares transgênicas são obtidas pela introdução de genes oriundos de

diferentes espécies e reinos, diretamente no genoma das plantas. Se por um lado essas
cultivares representam um grande avanço para o melhoramento genético, por outro,
podem contribuir para um verdadeiro monopólio no mercado de sementes, em
decorrência dos sistemas legais de proteção vigentes. O grande interesse em
desenvolver cultivares transgênicas diz respeito ao patenteamento de processos e
produtos biotecnológicos através da Lei de Propriedade Industrial (LPI), onde se
inserem as patentes. Teoricamente, o detentor da patente de um gene transgênico
poderia controlar todas as cultivares nas quais esse gene fosse introduzido. Por isso,
a fim de evitar o apropriamento de cultivares por detentores de patentes de genes,
instituiu-se, no Brasil, a Lei de Proteção de Cultivares (LPC). Ambas as leis, conferem
aos detentores de patentes e aos titulares das cultivares o direito de receber royalties
sobre a utilização e comercialização do material protegido ou patenteado. Portanto,
as cultivares transgênicas, de certa forma, podem ser resguardadas por duas leis, o
que, algumas vezes, tem gerado conflitos quanto à aplicabilidade delas. Entretanto,
é importante ficar claro que somente podem ser patenteados os processos e produtos
biotecnológicos que envolvam organismos geneticamente modificados e nunca a
cultivar transgênica obtida. Esta, por sua vez, será protegida apenas através da LPC,
após a emissão de parecer técnico conclusivo emitido pela CTNBio. E, para que as
sementes sejam comercializadas no país, é necessário registrá-las no Registro Nacional
de Cultivares.
Palavras-chave: Culturas transgênicas; Lei de Propriedade Industrial; Proteção de
Cultivares; Lei de Proteção de Cultivares; Royalties.

INTRODUÇÃO de patentes e do mercado de sementes. trangênicos vem crescendo de forma subs-

O uso da biotecnologia na obtenção
de plantas transgênicas trouxe uma nova
dimensão ao melhoramento genético de
plantas, desde o rompimento de barreiras
de cruzamentos, inclusive entre espécies
de diferentes reinos, até a possibilidade
de reduzir o tempo de obtenção de novas
cultivares. Esse avanço tecnológico apre-
senta não só inúmeras vantagens, como
também desvantagens, e tem gerado polê-
micas no mundo inteiro . Sendo discutido
desde os riscos da utilização dessas cul-
tivares para a saúde humana, até os even-
tuais impactos que possam provocar ao
meio ambiente. Por trás dessa polêmica,
existem também interesses econômicos, já
que empresas e países disputam o mono-
pólio dessas novas tecnologias por meio
Nessa guerra, vale-tudo para conquistar o
mercado, até mesmo a divulgação de infor-
mações, muitas vezes com pouco crédito e
falta de embasamento científico. Por outro
lado, o movimento ecológico tem crescido
e confrontado o uso das cultivares trans-
gênicas, debatendo aspectos importantes,
tais como a erosão genética e o desequi-
líbrio ecológico, que podem ser provocados
pelo cultivo dessas plantas. Nesse pano-
rama, os produtos cultivados de forma na-
tural, os orgânicos, vão também ganhan-
do espaço no mercado e conquistando a
sociedade, conseguindo diferenciação de
preços, embora a produção em escala co-
mercial ainda seja pequena. Apesar de to-
do o alvoroço, e repúdio de alguns países,
principalmente os europeus, o cultivo dos
tancial em diversos países, como nos Esta-
dos Unidos, Canadá, China e Argentina.
Estima-se que a área cultivada com plantas
geneticamente modificadas deva atingir 40
milhões de hectares no mundo, no início
do século XXI.
As cultivares transgênicas despertam
grandes interesses econômicos para o
mercado de semente, em decorrência dos
atuais sistemas de proteção vigentes, que
possibilitam a proteção de cultivares e as
patentes de processos e produtos biotec-
nológicos relacionados com o desenvol-
vimento dessas cultivares, através da Lei
de Proteção de Cultivares (LPC) e pela Lei
de Propriedade Industrial (LPI), respecti-
vamente. Essas duas leis são distintas,
embora exista uma interface entre ambas,

1
Enga Agra, D.S. Fitotecnia, Pesq. EPAMIG-CTZM, Vila Gianetti, 46, Caixa Postal 216, CEP 36571-000 Viçosa-MG. E-mail: waldenia@mail.ufv.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000

110
quando se trata de cultivares transgêni-
cas. Entretanto, somente podem ser pa-
tenteados os processos e produtos bio-
tecnológicos que envolvam organismos
geneticamente modificados, enquanto que
a cultivar transgênica só poderá ser pro-
tegida pela LPC, após a emissão de parecer
técnico conclusivo emitido pela Comissão
Técnica de Biossegurança (CTNBio). Por-
tanto, é de fundamental importância que
em programas de melhoramento, que visam
à obtenção de cultivares transgênicas, utili-
zando-se processos ou produtos biotecno-
lógicos patenteados, sejam devidamente
realizados contratos de parcerias, registra-
dos em cartórios e averbados no Instituto
Nacional de Propriedade Industrial (INPI).
Acredita-se que, com sistemas legais de
proteção, as empresas públicas possam
adquirir novas fontes de recursos, uma vez
que estes estão cada vez mais escassos no
país. Obviamente, haverá também maior
competitividade entre os setores público e
privado, e, com isso, espera-se maior pro-
dutividade e qualidade de produtos para o
consumidor. Apesar do pouco tempo que
essas leis entraram em vigor no Brasil, já é
visível o grande interesse do setor privado
na área de melhoramento genético, seja
através da proteção de cultivares e bancos
de germoplasma, seja também pelos nú-
meros crescentes de depósitos de pedi-
dos de patentes de genes transgênicos e
de processos biotecnológicos associados
aos organismos geneticamente modifica-
dos (OGMs). Neste contexto, este artigo
tem como objetivo retratar aspectos impor-
tantes dos sistemas legais de proteção que
envolvem as cultivares transgênicas.
PROTEÇÃO DE
CULTIVARES X TRANSGÊNICOS
A Lei no 9.456, de 25 de abril de 1997
(Pinheiro, 1997), foi regulamentada pelo
Decreto no 2.366, de 5 de novembro de 1997.
Desde maio de 1999, a proteção de culti-
vares, no Brasil, é feita em atendimento a
essa lei e aos normativos da Ata de 1978
da Convenção da União Internacional para
Proteção das Novas Variedades Vegetais
(UPOV). Uma vez que o Brasil tornou-se
membro da UPOV, é possível proteger cul-
tivares estrangeiras de países membros da
UPOV no Brasil e vice-versa. A proteção
de cultivares assegura ao seu titular o di-
reito de reprodução comercial delas du-
rante o prazo de proteção. Fica vedado a
terceiros a venda ou a comercialização do
material de reprodução sem a autorização
do titular. Porém, a proteção recairá somente
sobre o material de reprodução das plantas,
ou seja, sementes, tubérculos, estacas etc.,
e nunca sobre o produto final. O período
de proteção é de 15 anos para as espécies
anuais e de 18 anos para as videiras, árvores
florestais e ornamentais. Atualmente, so-
mente nove espécies de plantas fazem parte
da lista oficial do Ministério da Agricultura,
sendo, portanto, passíveis de proteção no
país: algodão, batata, soja, feijão, milho,
arroz, sorgo, trigo e cana-de-açúcar.
O pedido de proteção de cultivares
transgênicas segue os mesmos padrões
daqueles aplicados para as cultivares obti-
das por métodos de melhoramento tradi-
cionais, diferenciando, apenas, quanto ao
fato de, no primeiro caso ter que apresentar
cópia do parecer técnico conclusivo emiti-
do pela CTNBio. A Lei de Biosseguran-
ça (Brasil, 1999a) estabelece as normas e
os procedimentos para o desenvolvimento,
importação e comercialização de OGMs. Até
o momento, nenhuma cultivar transgênica
foi protegida no Brasil. No entanto, existem
cinco pedidos de proteção de cultivares
de soja transgênicas da Monsanto arquiva-
dos no Serviço Nacional de Proteção de
Cultivares (SNPC), por determinação ju-
dicial.
Pode-se proteger para fins de explo-
ração comercial a nova cultivar e aquela
essencialmente derivada, desde que preen-
chidos os seguintes requisitos: ser distin-
ta, diferente de outra cultivar; homogênea,
apresentar uniformidade nas suas caracte-
rísticas; estável, manter a homogeneidade
durante os sucessivos plantios; e fazer
parte da lista oficial do Ministério da Agri-
cultura. Além disso, não poderá ter sido
oferecida à venda, no Brasil, há mais de um
ano em relação à data do pedido de prote-
ção, e não ter sido oferecida à venda em
outros países, com o conhecimento do
obtentor, há mais de seis anos, para videiras
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
Biotecnologia
e árvores, e quatro anos para outras espé-
cies.
Cultivares que já estão sendo comercia-
lizadas há mais de um ano antes do pedido
de proteção podem também ser protegidas.
Porém, somente para fins de derivação, isto
é, para obtenção de outras cultivares. São,
portanto, de domínio público, podendo ser
exploradas comercialmente sem o consen-
timento do titular. A cultivar a ser protegida
deve apresentar os seguintes requisitos:
ser distinta, homogênea e estável; fazer
parte da lista oficial do Ministério da Agri-
cultura; observar os seguintes prazos: o
período entre a primeira comercialização e
o pedido de proteção deve ter ocorrido até,
no máximo, dez anos. Ressalvando que o
pedido de proteção deve ser feito até, no
máximo, um ano após a inclusão da espécie
na lista oficial do Ministério da Agricultu-
ra. Nesse caso, o período de duração da
proteção da cultivar deverá ser abatido do
número de anos que a cultivar já se en-
contra no mercado, quando for emitido o
certificado provisório.
O pedido de proteção de cultivares é
feito diretamente no SNPC, em Brasília, DF.
Este órgão é responsável pela emissão dos
certificados de proteção de cultivares,
títulos, e está vinculado à Secretaria de
Desenvolvimento Rural do Ministério da
Agricultura, atualmente Secretaria de
Apoio Rural e Cooperativismo. Para tal, é
necessária a realização dos seguintes pro-
cedimentos:
a) formulários preenchidos com infor-
mações sobre a origem genética da
cultivar, método de melhoramento
utilizado, nome do melhorista, obten-
tor da cultivar (pessoa física e/ou
jurídica), descritores mínimos (ca-
racterísticas fenotípicas, como altura
da planta, resistência à doença, etc.)
e outras informações;
b) documento com a denominação da
cultivar. O nome da cultivar é gené-
rico e, portanto, terá a mesma de-
nominação em todos os países onde
for protegida, exceto onde houver
problemas com o idioma. Não é per-
mitido denominações de marcas re-
gistradas e é possível denominações
Biotecnologia
idênticas para cultivares, desde que,
pertençam a espécies de plantas não
afins;
c) testes para provar que a cultivar é
distinta, homogênea e estável (DHE).
As orientações de como realizá-lo
estão contidas nos formulários;
d) duas amostras vivas, representa-
das pelo material de reprodução da
planta. Por exemplo, no caso da soja
transgênica, devem-se apresentar
dois quilos de sementes. Uma amos-
tra será utilizada para testes de ger-
minação e a outra, para compor o
Banco de germoplasma do SNPC;
e) pagamento de taxas: R$ 200,00 no
requerimento, R$ 600,00 na expe-
dição do certificado e anuidade de
R$ 400,00 a ser paga durante todo o
período de proteção. O valor da anui-
dade pode ser reduzido, desde que
o titular assine termo de fiel depo-
sitário da amostra viva, ou seja, que
se responsabilize pela manutenção
desta (valores equivalentes ao ano
2000);
f) manutenção de amostra viva durante
todo o período de proteção da cul-
tivar.
Todos os formulários citados contêm
orientações de como preenchê-los e podem
ser adquiridos no SNPC, sendo específicos
para cada espécie de planta. O pedido de
proteção de cultivares no exterior, em países
membros da UPOV, ficará sujeito à lei da-
quele país, tendo-se que pagar, inclusive,
as taxas exigidas e manter as amostras
vivas. Essa última exigência não se aplica a
cultivares protegidas sem fins de exploração
comercial. Portanto, torna-se oneroso pro-
tegê-las em vários países.
Uma vez que a cultivar está protegida,
é proibida a sua venda, reprodução, im-
portação, exportação etc. , sem autorização
do titular. Caso isso ocorra, o infrator terá
o material apreendido, pagará indenização
e multa de 20% do valor da mercadoria.
Além disso, responderá por crime de vio-
lação dos direitos do melhorista. Caso haja
reincidência, o infrator pagará duas vezes
o valor da multa.
Não ferem os direitos de propriedade
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
111
sobre a cultivar protegida: genes transgênicos, por já estarem adapta-
a) quando o pequeno produtor, defini- das às condições ambientais brasileiras.
do na lei, multiplicar a semente para Sabe-se que cultivares transgênicas desen-
uso próprio ou trocá-la, nunca ven- volvidas em outros países e introduzidas
dê-la; no Brasil podem apresentar problemas de
b) na pesquisa, desde que utilizada adaptação. Assim, a compra e proteção de
como fonte de variação genética, bancos de germoplasmas e de cultivares
exceto o repetido uso da cultivar para nacionais estão sendo feitas maciçamente
formação de híbridos ou para a cria- por empresas transnacionais, as quais,
ção de cultivares essencialmente também, detêm patentes de genes trans-
derivadas. Nesses casos, é necessá- gênicos.
ria a autorização do titular da cultivar No período de 1o de janeiro de 1998, até
protegida, ou, mesmo, a negociação 10 de dezembro de 1999, foram emitidos
da porcentagem de royalties que 152 certificados de proteção de cultivares,
venha a receber, caso sejam obtidas incluindo-se os definitivos e os provisó-
novas cultivares. rios, sendo dez para fins de derivação (Qua-
dro 1). Dentre as espécies passíveis de
A LPC também criou mecanismos para proteção no Brasil, a soja, a cana-de-açúcar,
punição de abuso do poder econômico ou
a batata e o trigo apresentam o maior nú-
mesmo para manobras de mercado. Caso
mero de cultivares protegidas, refletindo a
tais situações ocorram, o governo pode uti-
importância econômica e o maior dinamis-
lizar-se de dois mecanismos: emitir licença
mo dessas espécies. Já o café, um dos prin-
compulsória a terceiros ou determinar o uso
cipais produtos de exportação do Brasil,
público restrito, também usado em casos
não é passível de proteção, provavelmente
de catástrofes. Em ambos os casos, o titular
por se tratar de uma cultura perene e com
perde o direito de exploração da cultivar
baixo retorno de royalties.
protegida por três anos, podendo essa
A soja sozinha já representa, aproxima-
determinação ser prorrogada por mais três
damente, 51% das cultivares protegidas no
anos. Durante esse período, o titular da
Brasil. Das 77 cultivares de soja protegidas,
cultivar receberá remuneração determinada
praticamente 70% estão sob o domínio de
pelo governo e, após retomar os seus direi-
empresas privadas. Atualmente, as culturas
tos, a duração da proteção será subtraída
pelo número de anos de punição.
O direito de proteção pode ser can-
QUADRO 1 - Números de certificados emitidos
celado, quando houver renúncia do titular no Brasil no período de 1o de ja-
ou dos seus sucessores, perda da homo- neiro de 1998 a 10 de dezembro de
geneidade e da estabilidade da cultivar, 1999
ausência do pagamento da anuidade, não
Titulares
apresentação da amostra viva quando Número de
requerida e, ainda, caso a cultivar apresente Espécies certificados Setor Setor
impacto desfavorável. Após o término do emitidos privado público
período de proteção, o direito do titular será (%) (%)
extinto e a cultivar torna-se de domínio Batata 14 100 _
público. Feijão 03 100 _
Trigo 14 79 21
CULTIVARES PROTEGIDAS Cana-de-açúcar 24 67 33
NO BRASIL Algodão 06 67 33
Soja 77 57 43
Apesar de ainda não haver cultivares
Arroz 09 22 78
transgênicas protegidas no Brasil, é in-
Sorgo 03 - 100
teressante analisar, também, o aspecto da
Milho 02 - 100
proteção de cultivares não-transgênicas,
pois, de certa forma, elas constituem ma- Total 152 62 38
teriais promissores para a introdução de FONTE: Listagem... (1999).
112
de soja, milho, canola e algodão transgê-
nicos já possuem participação relevante na
agricultura de diversos países, como EUA,
Canadá e Argentina. A soja transgênica
tolerante ao glifosato já ocupa 54% e 75%
das áreas cultivadas nos EUA e Argentina,
respectivamente. Antes dos sistemas de
proteção, o setor privado investia mais na
produção de sementes de híbridos, o que,
na prática, não deixa de ser um sistema
natural de proteção, pois isso leva o pro-
dutor a adquirir sempre novas sementes.
Com relação aos titulares de cultivares,
observa-se, no cenário nacional, um núme-
ro bastante representativo de empresas
privadas nacionais e transnacionais e pou-
ca expressão do setor público, com exceção
da Embrapa (Quadro 1). No Brasil, basica-
mente o melhoramento de plantas é reali-
zado por empresas públicas, estaduais e
federais. As cultivares até então lançadas
no mercado eram de domínio público, antes
da LPC entrar em vigor. Entretanto, culti-
vares nacionais estão sendo, de certa forma,
protegidas por empresas transnacionais.
Como exemplo, citamos a Monsoy, perten-
cente a Monsanto, que adquiriu as cultiva-
res de soja da FT sementes, a Hoechst S.
Agrevo, que comprou o banco de germo-
plasma de arroz no Sul do Brasil, e a Pioneer,
que comprou as cultivares de soja da Em-
presa Agropecuária Dois Marcos etc. Além
disso, o processo de proteção é oneroso
e, provavelmente, contribui para tal situa-
ção, uma vez que os recursos destinados
às universidades e empresas estaduais de
pesquisa estão cada vez mais escassos.
Outro aspecto a considerar é a falta de uma
estrutura organizada dentro das institui-
ções públicas para tratar exclusivamente
dessas questões, e ser capaz de incentivar
e participar ativamente de todo o processo
relacionado com a propriedade intelectual.
Dos 152 certificados de proteção de
cultivares emitidos no Brasil, 62 % estão
sob o domínio de empresas privadas, en-
quanto que os 38% restantes estão sob o
domínio das empresas públicas, desta-
cando-se as culturas de batata, feijão, tri-
go, cana-de-açúcar, algodão e soja (Qua-
dro 1).
Assim, observa-se no país o surgimento
de empresas titulares de cultivares que, de
certa forma, foram obtidas por empresas
públicas. Estamos trabalhando para quem?
Países onde sistemas de proteção de cul-
tivares existem há mais de vinte anos
retratam um acentuado crescimento de
investimento do setor privado na pesquisa,
e em alguns casos, a extinção de empresas
públicas ou, quando sobreviveram, des-
tinaram-se apenas às pesquisas básicas de
auto-risco. Portanto, devemos estar alertos,
enquanto se debate a polêmica dos trans-
gênicos, as cultivares nacionais estão sen-
do protegidas por empresas transnacionais.
Uma alternativa viável seria o apoio finan-
ceiro do Governo Federal para a proteção
de cultivares nacionais e bancos de ger-
moplasma, resguardando-se, assim, o pa-
trimônio do país.
CULTIVARES
TRANSGÊNICAS X PATENTES
A Lei no 9.279, de 14 de maio de 1996
(Brasil, 1999b), disciplina os direitos e obri-
gações referentes à Propriedade Industrial.
A proteção dos direitos relativos a esta Lei
abrange vários aspectos, dentre os quais a
concessão de patentes.
Patentes são títulos de propriedade
temporários sobre uma invenção, modelo
de utilidade ou desenho industrial con-
cedidos pelo Estado aos detentores de
direitos sobre a criação, seja pessoa física
ou jurídica. A patente confere ao titular o
direito de impedir terceiros, sem o seu con-
sentimento, de produzir, usar, vender ou
importar produtos patenteados. No âmbi-
to da biotecnologia, as patentes têm por
objeto os produtos ou processos biotecno-
lógicos, que abrangem as áreas de microbio-
logia, bioquímica, imunologia e genética.
Entretanto, para que seja requerido um
pedido de patente, é necessário que o obje-
to, produto ou processo, atenda aos se-
guintes requisitos: novidade, utilização ou
aplicação industrial e suficiência descritiva.
Além disso, as invenções devem apresentar
atividade criativa e os modelos de utilidade
devem decorrer de ato inventivo que resulte
em melhoria funcional no seu uso ou fa-
bricação.
Em se tratando de cultivares transgê-
nicas, dois aspectos devem ser conside-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
Biotecnologia
rados: os métodos e processos tecnoló-
gicos e a cultivar propriamente dita. No
primeiro caso, enquadram-se as metodo-
logias desenvolvidas para produzir essas
cultivares, como, por exemplo, o isolamento,
a clonagem e a transferência de genes
modificados para as plantas etc. Esses
processos podem ser patenteados. Já as
cultivares transgênicas, obtidas por mé-
todos patenteados ou não, não são passí-
veis de patente e sim de proteção através
da LPC.
Os depósitos de pedidos de patentes,
que envolvam processos de modificações
genéticas, seguem os mesmos princípios
estabelecidos na lei para qualquer inven-
ção. Podem ser efetuados não só na sede
do INPI, no estado do Rio de Janeiro, co-
mo também nas Delegacias e Representa-
ções Estaduais. Já os pedidos de proteção
para as cultivares transgênicas somente
poderão ser efetuados no SNPC, em Bra-
sília, DF.
Os pedidos de patentes devem ser so-
licitados em formulários específicos, em
três vias, contento: relatório com descrição
suficiente, clara e completa do objeto do
pedido; reivindicação, definindo a matéria
para a qual a proteção é solicitada, estabe-
lecendo-se os direitos do inventor/ criador;
desenho, não obrigatório; resumo, sumá-
rio da descrição técnica do pedido de pa-
tente; e comprovante de recolhimento. Há,
ainda, o pagamento das seguintes taxas:
R$ 109,00, na solicitação do depósito, no
caso de pessoas físicas, microempresas e
instituições de ensino e pesquisa, esse va-
lor cai para R$43,60 e R$75,00, na expedição
da carta patente (valores equivalentes ao
ano 2000). Além dessas taxas, pagam-se
também as anuidades, que são cobradas a
partir do início do terceiro ano de depósito.
A patente de invenção vigorará pelo prazo
de 20 anos e a de modelo de utilidade, por
15 anos, contados da data do depósito.
A manutenção dos direitos do titular
da patente depende de uma série de fato-
res, como: pagamento das anuidades e a
exploração efetiva do objeto patenteado
(o que deverá ocorrer num prazo máximo
de três anos a partir da concessão. Uma
vez iniciada a exploração, não pode haver
interrupção por tempo superior a um ano.
Biotecnologia
À patente que não for explorada poderá
ser concedida uma licença compulsória e,
caso essa não se revele suficiente por um
período de dois anos, poderá ser declarada
a caducidade, extinção da patente decor-
rente da falta de exploração efetiva do obje-
to. Portanto, é importante a comercialização
da patente feita através de licenças. Existem
três formas de licenças: a voluntária, que
licencia terceiros a fabricar e comercializar
o produto ou o processo; a compulsória,
que é uma forma de evitar abuso de poder
e a não exploração de patentes no prazo
previsto em lei; e a oferta de licença, que é
feita pelo INPI, com a autorização do titu-
lar.
No Brasil, já existem vários depósitos
de patentes de invenção, envolvendo pro-
cessos e produtos biotecnológicos asso-
ciados aos organismos geneticamente
modificados, os quais são publicados pe-
riodicamente pelo INPI, tais como, plantas
transgênicas que possuem teor aumentado
de amido, como uma fonte alternativa de
enzimas degradadoras lignocelulósicas,
expressando enzimas celulolíticas, com teor
melhorado de aminoácido contendo enxo-
fre, que expressam genes de geminivírus;
que apresentam controle de lagarta de mi-
lho via formação de limoneno; que apre-
sentam resistências múltiplas a vírus e o
processo para sua produção; que produzem
poli-hidroxialcanoatos; resistência ao glifo-
sato etc. Obtenção de plantas transgêni-
cas; promotores; vetores para introdução
de genes na planta, produto de expressão
e kit de expressão etc. (Consulta..., 2000).
A grande maioria desses depósitos, quase
que exclusivamente, foi solicitada por em-
presas transnacionais, como a Monsanto,
Novartis, Pioneer, Nipon e outras.
Assim, as cultivares transgênicas es-
tariam protegidas de duas maneiras, ou seja,
indiretamente, pela patente do gene, e dire-
tamente, pela lei de proteção de cultivares.
A complexidade dessas leis acabam por
provocar dúvidas quanto a sua interpre-
tação, deixando margens para uma série de
questionamentos. Por exemplo, uma culti-
var de soja transgênica, que contenha no
seu genoma um gene patenteado confe-
rindo resistência a um herbicida, e que
também tenha sido protegida e registrada
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
no SNPC, como ficariam a pesquisa e o
pequeno produtor, quanto aos direitos de
utilização dessa cultivar?
Pela LPC, o pequeno produtor, definido
na lei, pode utilizar e produzir sementes para
uso próprio da cultivar de soja transgêni-
ca sem o consentimento do titular, não
podendo, de forma alguma, comercializar
sementes. A pesquisa também foi resguar-
dada por essa Lei, portanto pode-se utilizar
a cultivar de soja transgênica como fonte
de variação genética, sem o consentimento
do titular, exceto no caso de usos repe-
titivos.
No entanto, argumenta-se que, quando
o pequeno produtor formar uma nova
lavoura com sementes de soja transgênica
colhidas no ano anterior e nela aplicar o
herbicida, estaria ativando um gene paten-
teado e, portanto, deveria pagar royalties.
Então, como poderíamos usufruir dessas
cultivares? Será que o pequeno produtor e
a pesquisa, ao utilizarem-se da soja trans-
gênica, estariam infringindo a LPI patentes?
Qual das duas leis prevalescerá? Talvez a
lei do mais forte e, provavelmente, esses
conflitos serão resolvidos somente na jus-
tiça.
ASPECTOS ECONÔMICOS
DA COBRANÇA DE ROYALTIES
SOBRE AS CULTIVARES
PROTEGIDAS
O royalty é uma taxa cobrada sobre a
venda do material de reprodução, semente,
estaca, tubérculo, etc. e da cultivar prote-
gida, que é repassado ao titular da cultivar,
seja ele pessoa física, seja pessoa jurídica.
Essa taxa é acrescida ao preço do mate-
rial de reprodução da cultivar, elevando os
custos de produção e, conseqüentemente,
o preço do produto final. Com isso, os
royalties serão pagos por nós, consumi-
dores. Não devemos nos esquecer que,
para a comercialização de sementes, ou
outro material de reprodução, é necessário
que a cultivar esteja registrada no Registro
Nacional de Cultivares (RNC).
A lei não estabelece valores de royalties
a serem cobrados. No entanto, tal valor tem
variado entre 3 e 5% do custo da semente.
O valor do royalties pode ser influencia-
do por vários fatores, destacando-se a
113
tecnologia empregada na obtenção das
cultivares. Por exemplo, cultivares trans-
gênicas de soja terão valores de royalties
diferenciados de cultivares de soja não-
transgênicas; atributos que a cultivar ve-
nha a oferecer, ou seja, acúmulo de carac-
terísticas desejáveis, como resistência a
doenças, pragas, melhor qualidade nutri-
cional etc.; e a oferta de cultivares no
mercado, pois, quanto maior a oferta, gera-
se competição e, conseqüentemente, há
uma tendência de queda nos valores do
royalties, evitando-se assim o monopólio
de mercado. Portanto, ao considerarem-se
os aspectos apresentados, os valores dos
royalties podem variar não só entre as
espécies de plantas, como também entre
cultivares da mesma espécie, indepen-
dentemente da tecnologia utilizada para
obtenção delas. Ressalta-se, ainda, que a
LPC estabelece punição para os casos de
abuso de poder.
No Quadro 2, é apresentado o efeito da
cobrança do royalties no custo final de
produção, de várias espécies de plantas.
Observa-se que maiores valores de royalties
são obtidos para espécies que apresentam
a semente com maior participação no custo
de produção, o que trará maiores retornos
econômicos para os titulares e, certamente,
terão programas de melhoramento genético
mais fortes.
Dentre as espécies citadas, a batata
apresentou o maior retorno econômico e
os maiores acréscimos no custo final de
produção. Considerando-se a hipótese do
royalty de 3%, e de acordo com Pinheiro
(1997) a participação de 35,5% da batata-
semente no custo de produção passaria
para algo em torno de 36%, significando
um aumento de R$ 63,00/ha no custo de
produção. Quando tal acréscimo for di-
luído no custo por quilo do produto final
(24 t/ha), no Distrito Federal, teremos um
acréscimo entre R$ 0,10 e R$ 0,15 por saca
de 50kg. Buso (1998) cita vários exemplos
de valores de royalties cobrados em diver-
sos países, como seguem: na Holanda, o
valor médio do royalty é de US$ 0,02 por
quilo de batata-semente, correspondendo,
aproximadamente, a R$ 0,72 por caixa de
30kg, ou aproximadamente a R$ 45,00/ha,
o que resulta em um acréscimo em torno de
114
QUADRO 2 - Efeito da cobrança de royalties no custo final da produção
Participação
da Semente no
Espécies Custo de Produção
(%)
Arroz de sequeiro 16,30
Batata 35,3
Feijão de sequeiro 19,84
Feijão irrigado 11,84
Milho (grão) 4,91
Soja 11,33
Cana-de-açúcar 4,54
FONTE: EMATER-DF, citada por Pinheiro (1997).
2% no custo de produção. Já no Chile, o
valor do royalty é de 5% no preço final da
batata-semente. Considerando-se que a
participação desse insumo contribui com
30% a 50% do custo de produção, os acrés-
cimos estarão entre 1,5% e 2,5%. No Brasil,
outras hortaliças em que o custo da semen-
te ou outro material de reprodução repre-
senta pequena porcentagem no custo fi-
nal, o aumento seria insignificante. Por
exemplo: batata-doce (0,47%); alface (0,62%
a 0,66%); cenoura (2,6% a 3,0 %); beterraba
(4,8% a 5,9%) e abóbora japonesa (7,1%)
(Buso, 1998).
IMPACTOS DAS PATENTES
E PROTEÇÃO DE CULTIVARES
NA PESQUISA
Os impactos esperados com a utilização
de tecnologias patenteadas e a proteção
de cultivares são vários, dentre os quais
serão destacados a seguir.
Maior investimento do
setor privado na pesquisa
O interesse do setor privado no melho-
ramento genético é decorrente dos bene-
fícios advindos da LPC e LPI. Os híbridos
já possuem um sistema natural de prote-
ção, entretanto, as cultivares autógamas
dependem fortemente de um estatuto legal
de proteção para viabilizá-las economica-
mente (Carvalho, 1997). Esse crescimento
também tem sido decorrente das aquisições
e fusões de empresas que detenham ger-
moplasmas elites pelas gigantescas tran-
Acréscimo no custo final da produção
Royalties de 3% Royalties de 5%
% R$/ha % R$/ha
0,49 1,46 0,82 2,43
1,06 63,00 1,76 104,90
0,60 3,00 0,99 5,00
0,36 3,00 0,59 5,00
0,15 0,71 0,25 1,19
0,34 1,35 0,57 2,25
0,14 1,68 0,23 2,80
sacionais, detentoras de patentes de pes-
quisas genéticas, o que pode levar a um
verdadeiro monopólio no mercado de se-
mentes. Nesse contexto, a Monsanto já
adquiriu diversas empresas, tais como, a
Calgene, Asgrow, Dekalb e o setor de se-
mentes da Cargill. No Brasil, comprou a
Agroceres, maior produtora de sementes
de milho do país e o setor de sementes
de soja da FT Pesquisas e Sementes Ltda.
Além disso, fundiu-se com a gigantesca
Holdens Foundation e empresas de bio-
tecnologia como a Agracetus, Ecogen e
Delta Pine (Grain, 1997, citado por Kleba,
1998). A Monsanto, atualmente, disputa
o mercado mundial com outra gigante, a
Du Pont, que, por sua vez, adquiriu 20% da
Pioneer Hi-Breed, destacada empresa de
pesquisa biotecnológica (Almeida, 1998).
Além da preocupação com o monopólio
no mercado de sementes pela Monsanto,
está ocorrendo também um crescimento no
uso do herbicida Roundup, fabricado por
ela, abalando, também o setor de pestici-
das. Empresas, como a Cyanamid, a Du
Pont, a Astra Zeneca PLC e a Novartis estão
em queda no mercado dos agrotóxicos,
pois, com o crescimento do plantio de soja,
aumentaram também as vendas do Roundup.
Como alternativa, a Astra Zeneca já tem
autorização para comercializar, nos EUA, o
Touchdown, com fórmula similar à do
Roundup. Por outro lado, a Norvartis está
trabalhando no desenvolvimento de plan-
tas resistentes a uma nova linha de pesti-
cidas (Kilman, 1999).
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
Biotecnologia
Aumento da parceria
de pesquisas entre
os setores público e privado
É crescente o número de parcerias já
existentes no país entre os setores público
e privado após a entrada em vigor, no Brasil,
do sistema de proteção de plantas. Como
exemplo, a Monsanto e a Novartis, têm rea-
lizado parcerias com várias universida-
des, instituições de pesquisas ou mesmo
cooperativas. Com isso, cria-se, de um lado
a estrutura em pesquisas biotecnológi-
cas e, do outro, um gigantesco banco de
germoplasma. Essas parcerias visam não
só o desenvolvimento de pesquisas con-
juntas para novas cultivares e realização
de testes de plantas transgênicas, como
também o licenciamento de produtos e
processos biotecnológicos patenteados.
Ressaltamos que sempre devem ser
celebrados contratos entre as partes inte-
ressadas, para não haver dúvidas quanto
à participação na parceria e no produto fi-
nal obtido. Em se tratando de transgênicos,
é importante que o contrato seja averba-
do no INPI e registrado em cartório, pois
trata-se de um produto ou processo pa-
tenteado.
Direcionamento
do melhoramento genético
de plantas
Há de se considerar que as espécies de
plantas que trarão maiores retornos econô-
micos oriundos da cobrança de royalties
terão prioridade no melhoramento gené-
tico. Esse reflexo é observado pelo grandio-
so número de cultivares de soja protegidas
nos EUA e, de certa forma, no Brasil, onde,
já responde por 51% dos títulos emitidos
num período de menos de dois anos.
Outro ponto a se considerar é o ciclo
da cultura. As espécies anuais serão mais
atrativas que as semiperenes e perenes,
pois, no primeiro caso, o produtor pagará
royalties todo ano ao adquirir sementes
para implantar a lavoura. Já no caso das
culturas perenes, como fruteiras, espécies
florestais, café etc., o produtor pagará
royalties somente na implantação das
lavouras, as quais serão exploradas por
vários anos, ou, então, caso ele resolva
aumentá-las ou renová-las. Além desse
Biotecnologia
aspecto, o melhoramento genético das
culturas perenes é mais demorado, quan-
do comparado com as culturas anuais e,
dependendo do modo de reprodução da
espécie, pode-se levar até 30 anos para
lançar novas cultivares no mercado, sendo
pouco interessante investir nessas espé-
cies. De certa forma, elas ficaram prejudi-
cadas, até mesmo pelo pouco período de
proteção que a lei estabelece para essas
espécies. Na verdade, a LPC deixa a desejar
em muitos aspectos, ao tratar-se de plantas
perenes e de propagação assexuda.
Surgimento de
empresas prestadoras
de serviço
Já é possível encontrar, no Brasil, em-
presas e/ou pessoa física disponíveis pa-
ra realizar tanto a patente de produtos e
processos, como o pedido de proteção de
cultivares. Surgirão, também, serviços para
a realização de testes de DHE e manuten-
ção de amostras vivas em bancos de germo-
plasma, pois muitas empresas não possuem
infra-estrutura para tal. Outro aspecto im-
portante será o desenvolvimento de testes
biotecnológicos a serem utilizados na
distinção de cultivares.
Incentivo aos pesquisadores
Espera-se que, com a legislação vigen-
te, os pesquisadores sejam mais valori-
zados e incentivados, uma vez que o pro-
duto do seu trabalho poderá trazer grandes
benefícios para as empresas, seja pela pa-
tente de produtos e/ou processos biotec-
nológicos, seja pela proteção de cultivares.
Entretanto, o pesquisador somente poderá
usufruir desses direitos, se for estipulado
em contrato. Caso contrário, todos os bene-
fícios pertencerão à empresa. Portanto, as
instituições devem rever seus contratos ou
mesmo realizar contratos específicos. Wolff
(1997), comenta o incentivo dado aos pes-
quisadores nas universidades e centros
de pesquisa em diversos países, como na
Alemanha, EUA, Japão e Suíça. Nos EUA,
foram criados centros de transferências
de tecnologia que tratam dos direitos da
propriedade intelectual, dando apoio aos
pesquisadores. Especificamente na Univer-
sidade da Califórnia, onde os royalties são
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.109-115, maio/jun. 2000
divididos em 50% com os pesquisadores e
os licenciamentos das patentes respondem
por 30% a 40% da receita da universidade.
Também no Brasil, várias universidades já
dividem os royalties com os professores e
pesquisadores. Na USP, a divisão é feita
ao meio, e parte dos recursos destinado à
universidade é investida no núcleo de
pesquisa do inventor (Wolff, 1997).
Podemos, ainda, citar outros impactos
esperados com todo esse complexo de leis,
tais como a redução na permuta de germo-
plasma, introdução de cultivares estran-
geiras no país, novas fontes de recursos
para pesquisa, maior competição entre os
setores público e privado, e maior produ-
tividade e qualidade de produtos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar de todos os benefícios aponta-
dos, advindos dos sistemas de proteção
de cultivares transgênicas ou não, em de-
corrência da globalização, observa-se que
os beneficiados serão sempre os que de-
têm o conhecimento e o poder, onde a pes-
quisa tem prioridade no país. Nos países
do Terceiro Mundo, essas leis tornam-
se instrumentos poderosos para que em-
presas transnacionais apoderem-se dos
bancos de germoplasmas e cultivares
nacionais. Essas empresas, são também
detentoras de patentes de genes transgêni-
cos e processos biotecnológicos, forman-
do um verdadeiro monopólio no mercado
de sementes.
O Brasil é um país que apresenta uma
das maiores diversidades genéticas de flora
e fauna do mundo. Portanto, se não houver
atitudes do Governo Federal, estaremos
fadados, em um futuro próximo, a pagar
royalties para empresas transnacionais,
para consumirmos nossas próprias culti-
vares.
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gênicos. Conjuntura Econômica, Rio de
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115
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Regulamenta os incisos II e V do §1o do art.
225 da Constituição Federal, estabelece
normas para o uso das técnicas de engenharia
genética e liberação no meio ambiente de
organismos geneticamente modificados,
autoriza o Poder Executivo a criar, no âmbito
da Presidência da República, a Comissão
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questões práticas aplicadas ao cafeeiro. In:
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GENÉTICA E MELHORAMENTO DE
PLANTAS, 3, 1999, Lavras. Anais... Ge-
nética e melhoramento do cafeeiro. Lavras:
UFLA, 1999, p.11-17.
116 Biotecnologia

Cultivo de plantas in vitro e suas aplicações

Maria Eugênia Lisei de Sá 1
Geraldo Magela de Almeida Cançado 2
Clóvis Maurílio de Souza 3

Resumo - A propagação de plantas in vitro é um ramo da biotecnologia que já vem

sendo estudado há bastante tempo, com relatos de trabalhos desenvolvidos desde o
início deste século. Inúmeros avanços foram obtidos e, atualmente, seu emprego nas
mais diversas áreas de pesquisa ocorre de forma corriqueira. Essas áreas vão desde
o desenvolvimento de novas cultivares em processos de fusão de protoplastos e
transformação genética de plantas, até a limpeza clonal, com a propagação de plantas
isentas de vírus e outras doenças, tendo esta última, alcançado enorme destaque na
produção comercial de mudas de melhor qualidade fitossanitária.
Palavras-chave: Cultura de tecidos; Micropropagação; Melhoramento de plantas;
Limpeza clonal.

INTRODUÇÃO
Os princípios teóricos da cultura de
tecidos de plantas foram propostos ain-
da no século XIX, com as teorias de toti-
potência de células vegetais, mas só no
início deste século, em 1902, é que real-
mente apareceram os primeiros trabalhos
de Haberlandt, com o cultivo de tecidos
somáticos de várias espécies de plantas
(Kerbauy, 1997). Haberlandt não obteve
sucesso com seus experimentos, porém
previu o uso de cultura de células como
um meio elegante para o estudo de proble-
mas fisiológicos e morfológicos (Krikorian
& Berquam, 1969).
Hanning (1904), citado por Torres &
Caldas (1990), utilizando algumas espécies
de crucíferas, foi o primeiro a descrever na
literatura o cultivo de embriões imaturos
in vitro. Mais tarde, Knudson (1922) tam-
bém obteve sucesso com embriões de orquí-
deas e, em 1925, Laibach, citado por Torres
et al. (1998), conseguiu recuperar embriões
de híbridos incompatíveis de plantas do
gênero Linum, dando os primeiros passos
para a utilização da técnica no melhora-
mento genético de plantas e, desde então,
inúmeras outras conquistas foram alcan-
çadas. White (1934), em seus estudos, ela-
borou um meio líquido para o cultivo de
ápices radiculares de tomate que permitia
o cultivo por longos períodos. Esse meio
tinha em sua composição sais inorgânicos,
sacarose e extrato de levedura, que eram
responsáveis pela manutenção do desen-
volvimento das plantas. Ainda hoje, apesar
de ter sofrido algumas modificações na
sua composição inicial, como a troca do
extrato de levedura por vitaminas, o meio
White (White, 1937) é utilizado em vários
trabalhos de cultura de tecidos de plantas.
Murashige & Skoog (1962) desenvolveram
um meio nutritivo denominado MS, em que
os níveis de nutrientes inorgânicos tive-
ram como base a constituição do extrato
de folha de fumo. Dessa forma, estes auto-
res conseguiram reproduzir com maior
fidelidade os níveis de nutrientes natural-
mente necessários para o desenvolvimen-
to das plantas. Atualmente, o MS é um dos
meios mais utilizados em trabalhos de cul-
tura de tecidos, mostrando-se adequado
para as mais diversas finalidades. O desco-
brimento e a utilização de fitormônios, tais
como as auxinas e citocininas, também ti-
veram papel preponderante para o avanço
da cultura de tecidos (Kogh et al., 1934
e Miller et al., 1955). Essas substâncias, co-
mo foi observado mais tarde, possuíam
grande influência no padrão de desenvolvi-
mento de órgãos, tecidos e células vegetais.
Hoje, sabe-se que o correto balanço desses
fitormônios, assim como o fornecimento
adequado de nutrientes, pode determi-
nar o sucesso ou fracasso de um cultivo
em particular (Huang & Murashige, 1976).
Com o passar dos anos, a função de
cada constituinte do meio nutritivo foi
intensamente estudada, sendo bem conhe-
cida atualmente. Apesar da existência de
diversas formulações de meios utilizadas
de forma geral em cultura de tecidos, a com-
posição dos meios nutritivos pode variar
enormemente, dependendo da proposta a
que se destina o cultivo in vitro. Sendo
assim, estudos prévios sobre as exigências
nutritivas das plantas são necessários,
sobretudo quando se trata do cultivo in
vitro de novas espécies.
APLICAÇÕES DA CULTURA
DE TECIDOS DE PLANTAS
Dentre todas as aplicações da cultura
de tecidos de plantas, sem dúvida, as de

1
Bióloga, M.Sc., Pesq. EPAMIG-CTTP, Caixa Postal 351, CEP 38001-970 Uberaba-MG. E-mail: eugenia@enetec.com.br
2
Engo Agro, M.Sc., Pesq. EPAMIG-CTSM-FECD, Caixa Postal 33, CEP 37780-000 Caldas-MG. E-mail: cancado@epamigcaldas.com.br
3
Engo Agro, D.Sc., Bolsista FAPEMIG/EPAMIG-CTSM-FECD, Caixa Postal 33, CEP 37780-000 Caldas-MG. E-mail: clovis@epamigcaldas.com.br

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000

Biotecnologia
maior impacto foram as de utilização no
melhoramento genético de plantas e na
recuperação de genótipos livres de vírus e
outros agentes fitopatogênicos. No primei-
ro caso, a utilização da cultura de tecidos
no desenvolvimento de novas cultivares
tem ocorrido das mais diversas formas,
algumas vezes, sendo responsável direta-
mente pelo processo de melhoramento e,
em outras, apenas contribuindo em alguma
etapa do processo. Já a utilização da micro-
propagação para limpeza clonal ganhou
força ainda na década de 60, principalmen-
te devido à inexistência de produtos que
pudessem controlar viroses de plantas. No
passado, muitos genótipos de plantas de
grande potencial agronômico caíram em
desuso devido à baixa produção ocasio-
nada pelas altas taxas de contaminação por
vírus, principalmente em espécies propa-
gadas vegetativamente.
Avaliações comparativas realizadas
com plantas de uma mesma cultivar de
moranguinho, infectadas com vírus, mos-
traram que aquelas livres destes patóge-
nos, via cultura de ápices meristemáticos,
eram duas vezes mais produtivas (Kerbauy,
1997). Atualmente, a produção de matrizes,
a partir de meristemas isolados em conjun-
to com o uso de cultivares resistentes, é a
forma mais efetiva de evitar os danos cau-
sados pelas viroses.
O cultivo in vitro também tem sido
utilizado para a formação e intercâmbio de
germoplasmas, produção de sementes sin-
téticas, microenxertia, estudo de biologia
vegetal, além de outras inúmeras aplica-
ções.
MICROPROPAGAÇÃO COMERCIAL
DE PLANTAS
A produção comercial de plantas in
vitro é uma prática já bastante utilizada
em diversos países da Europa, Ásia, nos
Estados Unidos e, mais recentemente, no
Brasil.
A técnica da clonagem tem-se mostrado
de enorme importância prática e poten-
cial na agroindústria de flores, espécies
frutíferas, florestais e olerícolas. O método
baseia-se na produção de plantas mais
uniformes, sadias e a uma velocidade mui-
to maior do que os métodos convencionais,
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000
sem considerar a manutenção de quanti-
dades consideráveis de plantas por metro
quadrado dentro dos frascos em labora-
tórios protegidas do ataque de pragas,
doenças e intempéries (Lee et al., 1995 e
Kerbauy, 1997). Laboratórios que se dedi-
cam à multiplicação in vitro, em larga esca-
la, de plantas de importância econômica
são denominados biofábricas.
O processo de biofabricação de plan-
tas envolve basicamente cinco etapas
(Fig. 37, p.66):
a) seleção e desinfestação dos mate-
riais que servirão como fonte de
explante;
b) estabelecimento do explante em meio
de cultura;
c) multiplicação dos propágulos atra-
vés de sucessivos subcultivos;
d) alongamento e enraizamento das plân-
tulas in vitro;
e) transplante para casa de vegetação
e aclimatação.
Na área de plantas ornamentais, onde
predominam plantas híbridas, gérbera, cra-
vo, tulipa, orquídea etc., a clonagem in vitro
de matrizes selecionadas tem permitido a
compatibilização de demandas específicas
dos mercados interno e externo, com atribu-
tos importantes, como época de floração,
coloração, tamanho e forma das flores, nú-
mero de flores/plantas, comprimento e
resistência das hastes florais, tamanho e
vigor das plantas (Kerbauy, 1997).
No caso das espécies frutíferas, particu-
larmente abacaxi e banana, a expansão para
novas áreas de cultivo tem sido limitada,
principalmente pela oferta insuficiente de
mudas, assim como pelo baixo padrão fitos-
sanitário (Borges et al., 1997 e Reinhardt,
1998).
A biofábrica do Centro Tecnológico
do Triângulo e Alto Paranaíba (CTTP) da
EPAMIG vem desenvolvendo projetos na
área de produção e comercialização de
diversas variedades de banana, uma vez
que essa cultura tem-se expandido franca-
mente em Minas Gerais, principalmente no
Norte do Estado. Com relação à cultura do
abacaxi, que possui grande expressão na
região do Triângulo Mineiro e Alto Para-
117
naíba, os projetos de pesquisa têm visado
a otimização do processo de obtenção de
plantas em larga escala, tendo em vista o
custo ainda bastante elevado delas.
UTILIZAÇÃO DIRETA
DA CULTURA DE TECIDOS
NO MELHORAMENTO
DE PLANTAS
Uma grande vantagem da cultura de
tecidos é a possibilidade que esta oferece
ao melhorista de plantas de explorar melhor
a variabilidade genética. A utilização em
programas de melhoramento da variação
somaclonal e da mutação induzida in vitro
pode facilitar a obtenção de indivíduos
com melhor vantagem adaptativa a vários
estresses bióticos e abióticos. Aliado a
isso, em muitos casos existe a vantagem
de poder exercer a pressão de seleção no
próprio ambiente de cultivo, culminando
numa economia de espaço e de tempo para
o melhorista.
Variação somaclonal e
mutação induzida
Um problema comumente observado
em plantas cultivadas in vitro, principal-
mente quando estas sofrem excessivo
número de repicagens ou quando passam
pela fase de calo, é o surgimento de plantas
com característias morfológicas distintas
da planta-matriz. O cultivo in vitro ocasiona
uma condição de estresse nas plantas, o
que provoca distúrbios durante a divisão
celular, denominados variações somaclo-
nais. A princípio, o fenômeno foi encarado
como um problema para a produção de mu-
das micropropagadas, no qual se deseja
que todos os clones preservem com fide-
lidade as características da planta-matriz.
Porém, mais tarde, a variação somaclonal
foi vista pelos melhoristas de plantas como
uma forma de explorar melhor a sua variabi-
lidade genética. As cultivares comerciais
de tomate ‘DNAP 9’, com alto teor de só-
lido solúveis, e a cultivar de pimentão ‘Bell
Sweet’, com menor número de sementes
no fruto, são exemplos típicos de seleção
de variantes somaclonais obtidos in vitro
(Evans, 1987 e Morrison & Evans, 1988,
citados por Ferreira et al., 1998). Em am-
bas as cultivares, apesar da ocorrência da
118
variação genética em seu genoma, todas
as características agronômicas originais
foram preservadas.
A maioria das variações somaclonais
origina-se de distúrbios ocorridos durante
o processo de separação dos cromossomos
duplicados na anáfase mitótica, ocasionan-
do poliploidias, aneuploidias, quebras e
pontes cromossômicas. Entretanto, algu-
mas vezes, essas alterações não são herdá-
veis, por não se manterem estáveis durante
as divisões mitóticas, sendo denominadas
alterações epigenéticas. Alterações na se-
qüência de nucleotídeos na fita de DNA,
denominadas mutação de ponto, também
já foram descritas como sendo fruto da va-
riação somaclonal (Evans & Sharp, 1983).
Da mesma forma que o cultivo in vitro
proporciona o aparecimento de variantes
genéticos, mutações podem ser induzidas
artificialmente por outros fatores. A inci-
dência de raios ultravioletas e substâncias
mutagênicas diretamente sobre células,
tecidos ou orgãos de plantas, podem ele-
var consideravelmente a taxa de mutações
gênicas, cromossômicas e extranucleares.
Apesar da indução artificial de mu-
tações já estar sendo utilizada in vivo há
bastante tempo, sua aplicação in vitro
mostrou-se mais atraente, pois permite
manipular em pequenos espaços grandes
quantidades de células vegetais, o que
reduz consideravelmente os riscos dessa
prática, visto que agentes mutagênicos
podem causar câncer em humanos, além
disso, soma-se o fato de reduzir a chance
de aparecimento de quimeras, presença no
mesmo indivíduo de tecidos geneticamente
distintos.
É interessante ressaltar que mesmo a
ocorrência de mutações deletérias pode
ser de grande valia, quando utilizadas em
estudos de metabolismo vegetal e de
expressão de genes. O uso de agentes mu-
tagênicos combinado com sistemas de
seleção em cultura de tecidos vegetais, seja
para localizar mutações em cadeias biossin-
téticas específicas, seja para identificar
genótipos resistentes ou tolerantes a fa-
tores causadores de estresse, oferece am-
plas perspectivas para reduzir os custos
de determinados programas de melhora-
mento.
Isolamento e fusão
de protoplastos
Uma variação bastante interessante da
técnica de cultura de tecidos vegetais é a
regeneração de plantas a partir de proto-
plastos. O protoplasto nada mais é do que
a célula vegetal individualizada, desprovida
das paredes celulares. A priori, protoplas-
tos podem ser isolados de qualquer tecido
vegetal, mas geralmente preferem tecidos
como o do mesófilo foliar ou de calos friá-
veis. Em tecidos tenros, não lignificados,
há uma maior facilidade de isolamento,
obtendo-se um maior rendimento no nú-
mero de protoplastos viáveis (Nagata &
Takebe, 1970 e Nagao, 1978). A eliminação
das paredes celulares dá-se pela ação de
enzimas pectocelulolíticas, que digerem os
componentes das paredes celulares, libe-
rando a célula vegetal que fica envolta ape-
nas pela membrana celular. As células
vegetais, nessa condição, podem ser mani-
puladas de várias formas, com aplicações
em diversas áreas da pesquisa em vegetais,
mas é principalmente no melhoramento de
plantas que vislumbram as maiores poten-
cialidades da utilização de protoplastos.
A variação somaclonal, descrita anterior-
mente, também é observada nas culturas
de protoplastos, pois o próprio fato de man-
ter em cultura um tecido desorganizado,
durante um longo período, favorece o sur-
gimento de variações genéticas (Carneiro
& Conroi, 1990). Nesse caso, a seleção de
determinada característica torna-se mais
simples, devido à facilidade de impor uma
pressão seletiva mais homogênea. Fica fácil
QUADRO 1 - Híbridos somáticos produzidos por fusões de protoplastos
Entre gêneros
Solanum tuberosum + Lycopersicon esculentum
Daucus carota + Aegopodium padagraria
D. carota + Petroselium hortense
Citrus sinensis + Poncirus trifoliata
Brassica oleracea + Sinapis turgida
B. oleracea + Moricandia arvensis
Nicotiana tabacum + Hyoscyamus muticus
Lycopersicon peruvianum + Petunia hybrida
Oryza sativa + Echinochlora oryzicola
FONTE: Dados básicos: Carneiro et al. (1998).
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000
Biotecnologia
portanto, selecionar em meio de cultura,
linhagens de células tolerantes a herbi-
cidas, patógenos ou outros estresses, tais
como toxidez provocada por Al ou baixa
disponibilidade de nutrientes. A mutação
artificial também pode ser empregada em
protoplastos, da mesma forma que é utili-
zada em tecidos e órgãos, sendo que nesse
caso, praticamente ficam anuladas as chan-
ces de surgirem quimeras, já que as novas
plantas originam-se de uma única célula.
Uma utilização de protoplastos no me-
lhoramento de plantas, extremamente
elegante, tem ocorrido na produção de hí-
bridos somáticos entre espécies diferen-
tes (Vieira, 1997). Inúmeros mecanismos
naturais impedem a formação de híbridos
entre espécies por cruzamento sexual. Com
a possibilidade de fundir duas células
distintas, originando uma nova célula que
contenha a carga genética de ambas, to-
das as barreiras pré e pós-zigóticas são
eliminadas. A fusão de protoplastos cria
a possibilidade de formação de híbridos
até entre gêneros diferentes. No Quadro 1,
estão relacionados exemplos de hibrida-
ções interespecíficas e intergenéricas que
foram realizadas com sucesso.
Para que ocorra a fusão de protoplastos,
podem ser utilizados diferentes mecanis-
mos, quer seja por choques de corrente
elétrica, eletrofusão, ou mediado por um
agente químico, como polietilenoglicol
(Vieira, 1997). No caso da eletrofusão, os
protoplastos são submetidos a um campo
elétrico de corrente alternada de alta fre-
qüência, que promove uma polarização, isto
Entre espécies
Nicotiana tabacum + N. repanda
N. tabacum + N. rustica
Solanum tuberosum + S. nigrum
Datura innoxia + D. discolor
Brassica oleracea + B. campestris
B. napus + B. campestris
Oryza sativa + O. officinalis
O. sativa + O. eichingeri
O. sativa + O. brachyantha
Biotecnologia 119

é, um hemisfério positivo e o outro negati-

vo, criando uma força de atração entre as
células adjacentes. Uma vez alinhados, os
protoplastos podem-se fundir, devido ao
surgimento de poros na membrana plas-
mática, ocasionado pela aplicação de pul-
Planta de Planta de
sos rápidos de corrente contínua de alta
tomate batata
voltagem, 500 V/cm, (Carneiro & Conroi,
1990). A Figura 38 ilustra um exemplo hipo-
tético da fusão de protoplastos de tomate
com protoplastos de batata. Embora essa Tecido do Tecido do
fusão já tenha sido descrita na literatura, mesófilo foliar mesófilo foliar
até o momento, não conseguiu um híbrido Digestão das
entre as duas espécies que seja capaz de paredes
produzir tomates e batatas ao mesmo tem- celulares por
po. Outra forma usada para promover a enzimas
pectocelulolíticas
fusão de protoplastos é a utilização de
soluções com elevada concentração de Protoplastos
cátions, 50 a 100 mM de Ca2+, e polietileno- isolados
glicol (PEG). A solução salina neutraliza a
repulsão causada pelas cargas negativas
da membrana, enquanto o PEG aumenta a
viscosidade do meio, promovendo a agre-
gação dos protoplastos (Aldwinckle et al.,
1982 e Vos et al., 1976). Após a fusão dos Mistura dos
protoplastos, obtêm-se vários tipos de cé- protoplastos
lulas em cultura: protoplastos não fundidos,
híbridos entre dois tipos de células e fusões
de células idênticas (Carneiro & Conroi,
1990). Por meio de corantes específicos, Alinhamento dos Polarização por corrente
consegue-se separar os híbridos de inte- protoplastos + - + - alternada (AC)
resse dos outros protoplastos.
Embora a técnica de hibridação somá-
tica seja bastante promissora, ela ainda Criação de poros na
Fusão dos
apresenta limitações que inviabilizam seu Membrana por pulsos de
protoplastos
corrente contínua (CC)
uso de forma generalizada. Para muitos dos
cruzamentos testados, verificam-se difi-
culdades para a regeneração do híbrido e Seleção dos protoplastos
para manter a estabilidade genética. Além híbridos e regeneração
das novas plantas
disso, muitos dos híbridos regenerados são
inférteis, só se multiplicando vegetativa-
mente (Pelletier et al., 1988). De modo geral,
as limitações tendem a ser maiores, à medida
que aumenta a divergência genética entre
os indivíduos envolvidos.

CULTURA DE TECIDOS
AUXILIANDO O
MELHORAMENTO GENÉTICO Híbrido somático
entre o tomate e a batata
Anteriormente, descrevemos a utiliza-
ção direta da técnica de cultura de tecidos
de plantas para gerar variabilidade genéti- Figura 38 - Fusão de protoplasto de mesófilo foliar de tomate (Lycopersicum
ca em programas de melhoramento. Agora, esculentum L.) com protoplasto de mesófilo foliar de batata (Solanum
iremos abordar o seu emprego como ferra- tuberosum L.), com a formação do híbrido interespecífico
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000
120 Biotecnologia

menta auxiliar para geração de novas cul-
tivares.
Resgate de embriões raros
Uma das aplicações da cultura de teci-
dos que têm auxiliado muito programas de
melhoramento de plantas, é a de resgate
de embriões. Devido ao intenso processo
de domesticação imposto pelo homem às
espécies de plantas cultivadas, muitos dos
genes que conferiam tolerância e resistên-
cia a estresses bióticos e abióticos foram
perdidos. Uma das conseqüências da re-
dução da variabilidade genética foi a
dificuldade, por parte dos melhoristas, em
localizar fontes de resistência ou tolerân-
cia em acessos da mesma espécie. Freqüen-
temente, é necessário que o melhorista
recorra à variabilidade existente em espé-
cies silvestres para obter novos genes de
tolerância e resistência. Muito embora, em
alguns casos, o cruzamento sexual entre
espécies diferentes seja possível, ocorren-
do a fusão dos gametas e a formação do
embrião, não é raro o abortamento desse
embrião, devido a uma má-formação do en-
dosperma, barreira pós-zigótica. A técnica
de resgate de embriões em meio de cultura
permite que este se desenvolva normal-
mente, possibilitando a obtenção de hí-
bridos interespecíficos, intra-específicos,
intergenéricos e, em alguns casos, até mes-
mo entre espécies de famílias distintas,
facilitando, sobremaneira, a busca do me-
lhorista por genes de interesse.
Para que o meio artificial utilizado em
cultura de tecidos possa substituir o endos-
estigma e deposição do pólen diretamente pondendo de sete a nove anos de traba-
sobre o saco embrionário. O óvulo fecun- lho para o melhorista (Borém, 1998). Isso
dado é, então, cultivado artificialmente quando se trata de espécies anuais, pois
dando origem ao embrião. De modo geral, em espécies perenes a expectativa de tem-
o que se observa com mais freqüência é o po para obtenção de linhagens em homo-
cultivo do óvulo fecundado em associação zigose é muito maior.
ao ovário ou parte dele. O tecido do ovário Uma forma de acelerar a produção de
é responsável pela produção e forneci- linhagens em homozigose seria por meio
mento em quantidade adequada de várias da produção de plantas haplóides segui-
substâncias essenciais para o desenvolvi- da da duplicação dos cromossomos, num
mento do embrião. Dessa forma, evita-se o processo denominado haplodiploidiza-
labor de testar composições de meio. ção (De Buyser et al., 1985). Com o uso
dessa técnica, a partir de uma população
Produção de linhagens F1, podem-se obter, em apenas uma gera-
duplo-haplóides ção, populações de linhagens em homo-
A produção de linhagens superiores, zigose perfeita, ou seja, que apresentam
para formação de híbridos, necessita de um todos os seus loci em homozigose (Moraes-
longo período para que se possa atingir a Fernandes et al., 1998). Isso corresponde
condição de homozigose. Essa homozi- a um ganho de tempo fantástico para o
gose, geralmente, é alcançada após sete a melhoramento, facilitando enormemente a
nove gerações de autofecundação, corres- obtenção de novas cultivares (Fig. 39).
MELHORAMENTO TRADICIONAL MELHORAMENTO
POR
HAPLODIPLOIDIZAÇÃO
Cultivar 1 x Cultivar 2
AAbb aaBB Cultivar 1 x Cultivar 2
AAbb aaBB
Genótipo da F1 AaBb
Geração F1 AaBb
Gametas AB Ab aB ab
Gametas AB Ab aB ab (micrós-
Genótipos da F2 AABB AaBB aaBB poros)
AABb AaBb aaBb
AAbb Aabb aabb
100 Cultura de
Freqüência de heterozigose (%)

90 anteras
perma na sua função de nutrir o embrião, é 80
necessário que todas as exigências nutri- 70

cionais do embrião sejam bem conhecidas. 60 Duplicação

Dependendo do estádio de desenvolvi- 50 espontânea ou
40 induzida por
mento, o embrião pode requerer apenas colchicina
30
os nutrientes inorgânicos e uma fonte de 20
carboidrato no meio de cultura, mas para 10
embriões muito jovens, freqüentemente, há 0 AABB AAbb aaBB aabb
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Plantas duplo-haplóides com
necessidade de suplementação do meio 100% de homozigose
Gerações
G õ
com fitormônios, antioxidantes, vitaminas, A B
além de outras substâncias necessárias ao
Figura 39 - Comparação entre o processo de produção de linhagens homozigotas por
desenvolvimento. O cultivo de embriões autofecundações (A) e o processo de haplodiploidização de micrósporos (B)
em meio artifcial também é utilizado fre- NOTA: Pelo método convencional são necessárias 7 a 9 gerações de autofecundação para se
qüentemente, quando existem dificuldades alcançar a homozigose, embora sempre permaneça uma pequena proporção de
heterozigose residual. Já no método da haplodiploidização, linhagens com 100% de
na ocasião da fecundação. Nesse caso, a homozigose são obtidas logo após a geração F1, proporcionando economia de tempo e de
fertilização se dá in vitro, com a eliminação custos.
das barreiras pré-zigóticas, eliminação do FONTE: Dados básicos: Moraes-Fernandes et al. (1998).

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000

Biotecnologia
A aquisição do tecido haplóide dá-se
pelo cultivo de células germinativas, que
apresentam apenas a metade da constitui-
ção genética da espécie. No caso de uma
planta diplóide como o milho, cujo genoma
é composto por 20 cromossomos, suas
células germinativas só apresentam metade
desse número, ou seja, dez cromossomos.
Conseqüentemente, as plantas haplóides,
originadas dessa célula germinativa, tam-
bém terão apenas dez cromossomos. Após
a obtenção da planta haplóide, o restabe-
lecimento da diploidia ocorre de forma
natural ou por indução com colchicina,
substância que inibe a polimerização das
fibras do fuso durante a divisão mitótica,
impedindo a migração dos cromossomos
(Nitsch, 1983). Dessa forma, plantas haplói-
des podem-se originar por dois processos
diferentes: processo gimnogenético, quan-
do se originam de células reprodutivas do
sistema feminino e processo androgenéti-
co, quando se originam de células reprodu-
tivas do sistema masculino (Peters et al.,
1998). Para a produção de plantas haplói-
des, o cultivo de anteras é mais utilizado
do que o cultivo de ovários. As anteras pos-
suem um grande número de micrósporos,
podendo gerar centenas de novos indiví-
duos a partir de uma única antera, enquan-
to os óvulos apresentam apenas um saco
embrionário, podendo gerar apenas um
indivíduo por óvulo. Além disso, a res-
posta in vitro da cultura de óvulo ou ová-
rio é menos eficiente do que a cultura de
anteras e micrósporos (Peters et al., 1998).
Produção de sementes
sintéticas
A possibilidade de produção de se-
mentes sintéticas foi encarada com maior
seriedade, a partir do momento que os estu-
dos de embriogênese somática in vitro
começaram a evoluir. O termo embriogê-
nese somática é utilizado para descrever o
processo de formação de embriões a par-
tir de células somáticas ou haplóides. De
forma semelhante aos embriões zigóticos,
embriões somáticos apresentam uma es-
trutura bipolar, constítuida de um ápice
caulinar e de um ápice radicular, além de
apresentarem um sistema vascular fecha-
do, sem conexão com o tecido do explante
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000
121
inicial. Essas características diferenciam embriões, por ser geneticamente idênticos
embriões somáticos dos propágulos resul- à planta que lhes deu origem, permitem a
tantes do processo de micropropagação e perpetuação de populações clonais por
de organogênese (Guerra et al., 1998). meio de sementes (Guerra et al., 1998).
Entretanto, embriões zigóticos diferem de No processo de fabricação de semen-
embriões somáticos pela ausência nestes tes sintéticas, os embriões somáticos são
últimos da recombinação genética pro- encapsulados em hidrogel. A Figura 40 ilus-
porcionada pela união dos gametas e pela tra um esquema de produção de sementes
ausência do endosperma. Dessa forma, a sintéticas, utilizando o processo de embrio-
embriogênese somática caracteriza-se por gênese direta, em que os embriões surgem
ser uma propagação vegetativa. A forma- diretamente do tecido original, e a embrio-
ção de embriões somáticos ocorre de forma gênese indireta, na qual os embriões origi-
natural e um exemplo típico é a formação nam-se do tecido que se diferenciou na for-
de embriões nucelares em citros. Esses ma de calos (Sharp et al., 1980, citado por
Embrião
Calo nucelar ou
zigótico
Embriogênese
Embriogênese Direta
Indireta
Formação
dos
embriões
somáticos
Retirada
dos
embriões
Encapsulação dos Semente
embriões em Sintética
hidrogel
Origem a
uma nova
planta
Figura 40 - Produção de semente sintética pelos processos de embriogênese somática
direta e indireta, a partir de embrião nucelar ou zigótico
122
Schultheis et al., 1990). O material mais uti-
lizado para encapsular os embriões é o algi-
nato de sódio, devido as suas proprieda-
des gelificantes, baixo custo, facilidade de
uso e ausência de fitotoxidez (Redenbaugh
et al., 1986). Há ainda, a possibilidade de
adicionar vários componentes ao gel, tais
como sais minerais, carboidratos, regula-
dores de crescimento, pigmentos opacos
etc., simulando a constituição do endosper-
ma. Como vantagens ao uso de sementes
sintéticas, podemos destacar a produção
de um grande número de embriões somá-
ticos dentro de um curto período, a necessi-
dade de um espaço físico reduzido, a ma-
nutenção da identidade clonal, a produção
das sementes independente de efeitos
sazonais e a ausência de estruturas para
aclimatação de plântulas. Entretanto, a
técnica ainda possui algumas limitações,
tais como a baixa resistência à dessecação,
não-tolerância ao dano mecânico e a baixa
difusão de oxigênio e CO2 (Redenbaugh et
al., 1986).
Conservação e intercâmbio
de germoplasma
As técnicas de cultura de tecidos de
plantas in vitro podem contribuir em todas
as etapas do processo de conservação de
germoplasma, incluindo coleta, indexação
para doenças, quarentena, multiplicação,
caracterização, e avaliação, armazenamento
e distribuição (Withers, 1980). Para espécies
que se propagam vegetativamente, a pre-
servação de germoplasma requer altos
custos com mão-de-obra e disponibilida-
de de grandes áreas. Além disso, essas co-
leções estão sujeitas ao ataque de pragas
e doenças. Para espécies que se propagam
através de sementes, apesar de ser a ma-
neira mais eficiente de conservação, esta
não é sempre adequada, segundo Kartha
(1981), devido ao fato de:
a) algumas plantas não produzirem se-
mentes férteis;
b) algumas sementes permanecerem
viáveis por apenas um curto pe-
ríodo;
c) algumas sementes serem altamente
heterozigotas e, dessa forma, não
são adequadas para a manutenção
dos mesmos genótipos;
d) sementes de algumas espécies de-
teriorarem-se rapidamente, devido à
ocorrência de patógenos internos.
Embora para algumas culturas esta seja
uma alternativa adequada, para muitas
outras a conservação de germoplasma in
vitro talvez não seja uma boa opção. Os
problemas vão desde o custo e o volume
de trabalho elevado até o comprometi-
mento da integridade genética, devido à
ocorrência de variações somaclonais. En-
tretanto, devido aos grandes benefícios
que esta técnica oferece, um intenso volu-
me de pesquisa, na área de recursos gené-
ticos, está sendo desenvolvido unicamente
com o objetivo de viabilizar a conservação
de germoplasmas in vitro.
Transformação genética
de plantas
A cultura de tecidos também é um pas-
so quase que obrigatório para a obtenção
de plantas geneticamente modificadas.
Apesar de atualmente estarem sendo de-
senvolvidos métodos de transformação
que não necessitam passar pela cultura de
tecidos, até o momento, a grande maioria
das plantas geneticamente manipuladas,
que já estão sendo utilizadas pelo homem,
fez uso da cultura de tecidos. No caso de
transformação via bactéria Agrobacterium
tumefasciens, há uma etapa de co-cultivo
do tecido vegetal, discos foliares ou de
embriões, com a bactéria que contém o gene
a ser transferido (Gander & Marcellino,
1997). A bactéria infecta o tecido e transfe-
re o DNA plasmidial, contendo o gene de
interesse para o genoma da planta. Pos-
teriormente, o tecido vegetal é regenerado
em meio de cultura na presença de antibió-
ticos ou herbicidas que permitem apenas
o crescimento das plantas transformadas.
No caso da transformação por biobalís-
tica, partículas microscópicas de ouro ou
tungstênio, com DNA aderido a sua super-
fície, são disparadas a grande velocidade
contra o tecido vegetal (Aragão et al., 1998).
Posteriormente, as células que tiveram as
moléculas de DNA incorporadas ao seu
genoma são recuperadas em meio de cultura
seletivo. No processo de transformação por
eletroporação em protoplastos ou micrós-
poros, célula precursora do grão de pólen,
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.116-123, maio/jun. 2000
Biotecnologia
pulsos elétricos ou uma solução de PEG
proporcionam o aparecimento de poros na
membrana plasmática, permitindo que mo-
léculas de DNA penetrem no interior celular
(Gander & Marcelino, 1997).
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124 Biotecnologia

Micropropagação de plantas:
histórico de uma empresa comercial
Márcio de Assis 
Marcos Paiva 2
Otávio Carlos Armani 3

Resumo - Abordam-se aspectos relativos à atividade comercial de uma empresa de

biotecnologia, bem como uma visão global do seu histórico, implantação, dificuldades
enfrentadas, estratégias e diretrizes. A preocupação com a atualização dos
procedimentos biotecnológicos, satisfação do cliente, investimento em capacitação
técnica e estratégias seguras de crescimento são marcas de uma empresa sintonizada
com as mudanças e exigências do mercado, cada dia mais globalizado.
Palavras-chave: Multiplanta; Biotecnologia; Matriz de planta.

INTRODUÇÃO ças, particularmente viroses. O volume de algumas universidades e centros de pes-

Desde o início do século XX, têm sido
conduzidos trabalhos com o objetivo de
estudar e promover o crescimento de célu-
las, tecidos e órgãos de plantas. Pouco
sucesso foi alcançado nas primeiras dé-
cadas, devido à carência de conhecimen-
tos de fisiologia e de nutrição vegetal, bem
como de infra-estrutura adequada para
execução das atividades. A partir da década
de 50, ocorreram avanços consideráveis na
descoberta, modo de ação e síntese de fitor-
reguladores, o que permitiu a elaboração
de meios de cultura definidos e eficientes.
Dessa forma, foi possível detalhar e aper-
feiçoar o processo de multiplicação con-
trolada in vitro (micropropagação), normal-
mente subdividido em três estádios: início
das culturas, proliferação e enraizamento de
brotações (Murashige, 1974 e Grattapaglia
& Machado, 1998).
A exploração comercial de plantas mi-
cropropagadas começou na década de 60,
com diversas culturas ornamentais, princi-
palmente orquídeas. A utilização da técnica
foi impulsionada por conhecimentos adi-
cionais obtidos na área de patologia, que
demonstravam a sua eficiência na obtenção
de plantas completamente livres de doen-
informações específicas sobre o assunto
cresceu intensamente nas décadas de 70
e 80, quando foram instalados laborató-
rios de médio e grande porte em inúmeros
países, principalmente nos Estados Uni-
dos e na Europa Ocidental (Kitto, 1997).
O enfoque principal continuou sendo a
produção de plantas ornamentais, embora
a de fruteiras, hortaliças e espécies lenho-
sas tenham-se tornado significativas. Vários
fatores contribuíram para a expansão da tec-
nologia: aumento substancial de informa-
ções científicas geradas, o que permitiu a
elaboração de protocolos operacionais; nú-
mero crescente de empresas fornecedoras
de matérias-primas (reagentes, meios de
cultura pré-elaborados etc.); equipamentos
apropriados para a atividade; moderniza-
ção nas estruturas de estufas agrícolas e
outros suprimentos, como bandejas, subs-
tratos, fertilizantes, conjuntos de irrigação,
indispensáveis para a aclimatação e cres-
cimento das plantas após a fase de labo-
ratório.
No Brasil, os primeiros trabalhos nessa
área foram feitos na década de 50, mas o
impulso definitivo ocorreu na década de
70, com a instalação de laboratórios em
quisa do estado de São Paulo e da Embrapa
(Torres et al., 1998). Acompanhando a ten-
dência mundial, foram montados vários
laboratórios comerciais na década de 80,
dos quais dois podem ser considerados de
grande porte: Biomatrix S.A., em Teresópo-
lis (RJ), e Bioplanta Ltda., em Paulínia (SP),
por iniciativa de grupos empresariais liga-
dos à agricultura. Ambos descontinuaram
as atividades poucos anos após a implan-
tação, o que colocou em dúvida a viabili-
dade técnica e econômica da atividade,
diante dos investimentos efetuados e da
enorme expectativa que haviam gerado.
Outros laboratórios de pequeno e médio
porte foram instalados por empresas flo-
restais, canavieiras ou de hortaliças, prin-
cipalmente batata, para dar suporte a traba-
lhos de melhoramento genético ou com fins
comerciais.
Comparando com épocas anteriores, na
década de 90, observou-se um crescimen-
to moderado da atividade, à medida que
algumas de suas limitações tornaram-se
evidentes. Desafios associados com uso
permanente de mão-de-obra qualificada,
baixo nível de automação, estratégia de
produção e logística de entrega de grandes

1
Engo Agro, M.Sc., Multiplanta Tecnologia Vegetal Ltda., Caixa Postal 511, CEP 377795-000 Andradas-MG.
2
Engo Agro, Ph.D., Multiplanta Tecnologia Vegetal Ltda., Caixa Postal 511, CEP 377795-000 Andradas-MG.
3
Engo Electricista, Multiplanta Tecnologia Vegetal Ltda., Caixa Postal 511, CEP 377795-000 Andradas-MG.

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.124-126, maio/jun. 2000

Biotecnologia
quantidades de plantas de qualidade em
curtos espaços de tempo, definição correta
de mercado a ser atingido etc. constituem
barreiras que têm inviabilizado iniciativas
nessa área. A micropropagação apresenta
riscos. Kitto (1997) destaca que a volati-
lidade observada nesse ramo, como em
qualquer outro empreendimento comercial,
está relacionada com um fenômeno que
ocorre mundialmente: passados cinco
anos, 80% de novos negócios não mais
existem e após dez anos, menos de 10%
continuam em atividade. Dispor de co-
nhecimento e estrutura para produção de
plantas em larga escala não é garantia de
sucesso, devendo considerar que o pro-
cesso como um todo é influenciado por
fatores econômicos e pelas oscilações nor-
mais observadas no ramo agrícola.
HISTÓRICO DA MULTIPLANTA
A empresa Multiplanta foi constituí-
da em 1991, com o objetivo de produzir e
comercializar plantas matrizes de moran-
gueiro, mudas de bananeira e sementes de
batata obtidas por processos biotecno-
lógicos. A confiança nessa proposta era
fundamentada na formação científica e
gerencial de dois técnicos, Márcio de Assis
e Marcos Paiva, com cursos de especiali-
zação na área, atividades prévias em órgãos
públicos e na iniciativa privada e na expe-
riência empresarial do outro integrante do
grupo, Otávio Carlos Armani. A escolha
pelo município de Andradas (MG), entre
outros fatores, foi em virtude da sua lo-
calização geográfica, fácil acesso, clima
privilegiado de altitude, ameno e seco,
adequada infra-estrutura, fornecimento
estável de água e energia elétrica, bom
sistema de comunicações, além da dispo-
nibilidade de mão-de-obra de qualidade.
Foram alugados, dentro do perímetro urba-
no, uma propriedade de 4 hectares, cuja
sede foi transformada em laboratório e um
prédio industrial, interligado com a mesma
finalidade.
ESTRATÉGIA OPERACIONAL
O nível de dificuldades que uma em-
presa agrícola enfrenta, independente do
seu porte, para se manter em atividade no
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.124-126, maio/jun. 2000
país, é bastante conhecido. Planejar, insta-
lar e expandir um ramo de negócios recente
e de certa forma questionado apresentam
desafios ainda maiores. Para aumentar as
chances de sucesso, foram inicialmente
estabelecidas as seguintes diretrizes:
a) aplicar corretamente as informações
técnicas disponíveis, para ofertar ao
mercado produtos com caracterís-
ticas inovadoras;
b) dedicar tempo integral e adaptar mé-
todos eficientes de gestão empre-
sarial, para atingir objetivos e metas
propostos;
c) agir preventivamente;
d) consolidar uma imagem de con-
fiabilidade e segurança aos seus
públicos internos, funcionários, e
externos, clientes, fornecedores,
prestadores de serviço, agentes de
crédito e demais divulgadores em
potencial, principalmente profissio-
nais envolvidos com o assunto.
RESULTADOS ALCANÇADOS
Visando o uso adequado dos recursos
humanos, materiais e financeiros, foram
definidas prioridades para a implantação
dos projetos comerciais. A produção de
plantas matrizes de morangueiro, necessá-
rias para a formação de viveiros, foi esco-
lhida por várias razões:
a) experiência prévia de aplicação da
técnica à cultura e conhecimentos
agronômicos adquiridos pelos téc-
nicos citados, em empresas ante-
riores;
b) razoável nível de informações difun-
dido entre os produtores acerca da
importância do trabalho, o qual tem
sido conduzido, desde 1979, pela
Embrapa e esporadicamente por
outros laboratórios;
c) e estilo inovador da maioria desses
produtores receptivos a cultivares
geneticamente melhoradas e de alta
qualidade fitossanitária, diante do
elevado custo de implantação e con-
dução das lavouras.
O morangueiro, no Brasil, é explorado
como cultura anual, sendo indicada a re-
125
novação das mudas, pelo aparecimento de
patógenos e pragas ou mesmo pelo esgo-
tamento natural das plantas após o período
de colheita, que se estende por vários me-
ses. Por isso, tornou-se prática comum a
aquisição anual de matrizes sadias, esta-
belecidas em bandejas, com substrato in-
dustrializado (Assis, 1999b) (Fig. 41, p.66).
A oferta de novas cultivares e a difusão
de informações técnicas constituem fortes
argumentos para que os produtores man-
tenham vínculo permanente com a Multi-
planta, sendo, atualmente, fatores deci-
sivos para a paulatina consolidação do
projeto e o seu elevado nível de previsibi-
lidade comercial.
Simultâneo ao projeto morango, foram
iniciados e progressivamente ampliados
programas de produção de mudas de ba-
naneira e de batata-semente, também em
função de envolvimentos anteriores com
essas culturas e do seu potencial de mer-
cado. A formação de mudas de bananeira
em laboratório foi iniciada, no Brasil, em
meados da década de 80. O sistema apre-
senta algumas vantagens sobre métodos
tradicionais, mudas oriundas de fraciona-
mento de rizomas, chifres e chifrinhos, pela
facilidade de manejo, transporte, ausência
de patógenos e pragas, introdução rápida
de novas cultivares etc. (Fig. 42, p.66). Em
nível mundial, o aprimoramento constante
nos processos de multiplicação e de con-
trole de qualidade, aliado à redução de cus-
tos, tem sido essencial para a sua aceitação.
Isso também ocorre no Brasil, onde a cul-
tura apresenta vasta abrangência e tem
experimentado grandes transformações
tecnológicas nos últimos anos (Souza et
al., 1997).
O terceiro segmento comercial sele-
cionado foi a produção de sementes de ba-
tata de alta qualidade fitossanitária. Com
esse objetivo, são empregadas técnicas
consagradas no país e no exterior há vários
anos, como a cultura de meristemas, para a
eliminação de vírus e outros organismos
sistêmicos, a micropropagação, para o rápi-
do aumento de plântulas sadias; e o culti-
vo protegido em estufas, para obtenção de
sementes de base (classes genética, pré-
básica etc.), utilizadas para a instalação de
lavouras no campo (Assis, 1999a). Diante
126
das dificuldades conjunturais enfrentadas
pela cultura da batata no país, o enfoque
prioritário do trabalho tem sido a produção
de plântulas e de sementes pré-básicas,
utilizadas por produtores e empresas que
trabalham de forma programada para obter
sementes de qualidade e baixo custo.
DESAFIOS ENFRENTADOS
A trajetória da Multiplanta, da implan-
tação à atual posição de estabilidade, tem
sido marcada por situações peculiares, ine-
rentes aos diferentes momentos econômi-
cos do país e aos estádios de evolução e
absorção das tecnologias utilizadas. Além
dos desafios técnicos normais para obter
e ofertar produtos diferenciados, alguns
aspectos operacionais e gerenciais preci-
saram ser também enfocados:
a) uso racional dos recursos para man-
ter o equilíbrio financeiro;
b) habilidade para improvisar, adaptar
ambientes e desenvolver equipa-
mentos para a realização de trabalhos
em laboratório. Por ser uma atividade
recente no país, foi necessário aper-
feiçoar um pacote de produção, prá-
tico e econômico;
c) seleção, treinamento e valorização da
mão-de-obra;
d) busca constante por insumos de me-
lhor qualidade, em alguns casos de-
senvolvendo-os em parcerias com
empresas fornecedoras;
e) persistência para a consolidação dos
projetos;
f) garantir a satisfação dos consumi-
dores, exercitando permanentemente
este fundamento de forma ampla e
efetiva.
ESTRUTURA ATUAL
Em função dos recursos disponíveis e
das características da atividade, optou-se
por um processo de crescimento gradual e
adequado ao mercado. Atualmente, dispõe-
se de razoável infra-estrutura de laboratório,
cerca de 500m2 de área total, sendo 200m2
de salas de crescimento com ambiente con-
trolado (Fig. 43, p.66) e 5.000m2 de estufas
para aclimatação e crescimento de plantas
(Fig. 44, p.66). Vinte funcionários efetivos
estão ligados ao setor produtivo. A empre-
sa possui fornecedores de matérias-primas
e insumos apropriados, assim como for-
mas de embalagem e de transporte para
todos os pontos do país. A capacidade
atual de produção situa-se na faixa de 200
mil plantas por mês. Desde o início das
atividades, vários setores são informatiza-
dos, produção, estoques, vendas, contábil-
financeiro etc. Devido às características
da cultura do morangueiro (predominância
de pequenos e médios produtores concen-
trados por regiões), estabeleceu-se uma
rede de representantes para facilitar o aces-
so e atendimento a eles. Este procedimento
é também aplicado à cultura da bananeira,
para fornecimento de mudas a pequenos
produtores dos perímetros irrigados. No
entanto, predomina o relacionamento dire-
to, sendo a maioria dos contatos comer-
ciais feita com os sócios-gerentes da em-
presa.
PERSPECTIVAS
Embora os investimentos em divulga-
ção e marketing efetuados ao longo dos
anos sejam modestos, percebe-se que a
Multiplanta tornou-se conhecida e desfruta
de conceito positivo junto à classe pro-
dutora e à comunidade técnico-científica.
É crescente a demanda por seus produtos,
motivada pelos resultados alcançados e
pela popularização da tecnologia. Imperfei-
ções ou dúvidas a respeito da performance
de plantas micropropagadas têm sido su-
peradas, através de ajustes nos procedi-
mentos de produção em laboratório e de
modificações em práticas culturais efetua-
das pelos produtores. Para isso, tem con-
tribuído o contínuo trabalho de pesquisa e
extensão, conduzido por órgãos públicos
e a forma correta como novas empresas têm
ingressado na área.
O estádio de maturidade atingido pela
empresa, aliado a outros fatores observa-
dos atualmente, como a boa receptividade
a produtos biotecnológicos, cenário econô-
mico favorável e o vasto potencial agrícola
do país, estimula a sua gradativa ampliação.
Desenvolver estratégia segura de cresci-
mento, para atender mercados cada vez
mais exigentes e globalizados, continuará
sendo um desafio. Algumas medidas pre-
cisam ser enfocadas, como: incorporar mé-
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.124-126, maio/jun. 2000
Biotecnologia
todos modernos e mais eficientes de pro-
dução e controle de qualidade, melhoria no
sistema de micropropagação, de aclima-
tação e crescimento de plantas em estufas,
uso de processos sorológicos e marcado-
res moleculares para detecção de patóge-
nos e monitoramento de identidade clonal;
aprimorar mecanismos para acompanha-
mento técnico e assistência a clientes;
adequar-se a uma nova ordem de negócios
que respeita a criatividade intelectual e
protege materiais genéticos etc. Finalmente,
continuar atento a quaisquer fatores que
de alguma forma possam afetar o desem-
penho da empresa, preservando um estilo
ágil e flexível para rever posições e imple-
mentar novas iniciativas, sempre que isso
se fizer necessário.
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de batata. Informe Agropecuário, Belo
Horizonte, v.20, n.197, p.30-33, mar./abr.
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transformação genética de plantas. Bra-
sília, EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CNPH,
1998. v.1, p.11-20.
Biotecnologia 127

SISTEMA AGROPECUÁRIO EM FOCO

Foto: Erasmo Pereira

Márcio Amaral
Presidente da EPAMIG

RESULTADOS ALCANÇADOS
COM A INTEGRAÇÃO

Apresentar soluções parâmetros de pesquisa da fronteira agrícola de Minas e

tecnológicas para o complexo
agropecuário tem sido, ao longo
desses 25 anos, a principal
atividade da Empresa de
Pesquisa Agropecuária de Minas
Gerais (EPAMIG). A busca de
novas tecnologias, que
garantam maior produtividade,
qualidade e lucros para o
produtor rural, define os
Empresa.
Os resultados destas
atividades estão à disposição de
toda a sociedade, através da
maior oferta de alimentos, com
qualidade e preços acessíveis.
Todo este trabalho de
pesquisa é compensado pela
multiplicidade de resultados
obtidos, como ampliação da
utilização do cerrado, por meio
de técnicas adequadas de
produção, manejo, oferta de
sementes, mudas e cultivares
adaptadas às suas condições.
Novas tecnologias para grãos,
hortaliças e frutas que
promovem a diversificação de
culturas e o conseqüente
aumento da renda do produtor

Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.127-128, maio/jun. 2000

128
rural, ampliam os benefícios
gerados pela pesquisa.
A manutenção de instituições de
ensino voltadas para a
qualificação profissional de
técnicos em Agropecuária
e Agroindústria melhoraram os
níveis de trabalho no campo.
O constante melhoramento
genético de bovinos e o
incentivo ao crescimento de
outras atividades, como a
piscicultura, elevam o padrão
produtivo de Minas Gerais.
Associações com instituições
municipais para o
desenvolvimento regional e
capacitação profissional, bem
como a prestação de serviços
laboratoriais, repasse de
tecnologias, treinamentos,
cursos, desenvolvimento da
agroindústria mineira e apoio
ao pequeno produtor rural, são
ações empreendidas pela
EPAMIG em todo o Estado.
Estas ações contribuem
decisivamente para o
desenvolvimento
socioeconômico de todas as
regiões mineiras, e vêm
assegurando ao Estado
o primeiro lugar na produção
de diversos gêneros
agropecuários.
Com a apresentação deste
perfil da EPAMIG, torna-se clara
a necessidade percebida e
recomendada pela Secretaria
de Agricultura, Pecuária e
Abastecimento de Minas Gerais
(Seapa) de integrar os órgãos
que compõem o sistema
agropecuário do Estado.
Somente através da ação da
assistência técnica e extensão
rural da Emater, no apoio e
repasse de tecnologias ao
produtor, das ações de
fiscalização e controle dos
técnicos do IMA, visando maior
qualidade dos produtos e das
ações de engenharia e
motomecanização agrícola da
Ruralminas, que buscam a
melhoria das atividades rurais,
é que o trabalho da pesquisa,
o primeiro passo nesta
cadeia de ações em prol do
desenvolvimento da
agropecuária mineira, pode ser
ampliado em múltiplos
resultados para o Estado.
A integração é fundamental
para o sucesso de cada órgão e
tem como consequência
inerente, a efetiva atuação do
governo para o pleno
desenvolvimento da
agropecuária de Minas Gerais.
Este é o objetivo a ser
alcançado por todo o Sistema
Operacional da Agricultura,
através da cooperação e
do trabalho conjunto de todos
os órgãos.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v.21, n.204, p.127-128, maio/jun. 2000
Biotecnologia
GOVERNO DO ESTADO DE
MINAS GERAIS
Governador: Itamar Franco
SECRETARIA DE ESTADO DE
AGRICULTURA, PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO
Secretário: Raul Décio de Belém Miguel
Empresa de Pesquisa Agropecuária de
Minas Gerais - EPAMIG
Presidência
Márcio Amaral
Diretoria de Operações Técnicas
Marcos Reis Araújo
Diretoria de Administração e Finanças
Marcelo Franco
Gabinete da Presidência
Eustáquio Amaral
Assessoria de Marketing
Luthero Rios Alvarenga
Assessoria de Planejamento e
Coordenação
Sebastião Gonçalves de Oliveira
Assessoria Jurídica
Marcelo José Alves
Assessoria de Informática
Mauro Lima Baino
Auditoria Interna
Ronald Botelho de Oliveira
Departamento de Pesquisa
Antônio Monteiro de Salles Andrade
Departamento de Produção
José Braz Façanha
Departamento de Ações de Desenvolvimento
Francisco Lopes Cançado Júnior
Departamento de Recursos Humanos
Dalci de Castro
Departamento de Patrimônio e
Administração Geral
Argemiro Pantuso
Departamento de Contabilidade e Finanças
Geraldo Dirceu de Resende
Centro Tecnológico-Instituto de Laticínios
Cândido Tostes
Geraldo Alvim Dusi
Centro Tecnológico-Instituto Técnico de
Agropecuária e Cooperativismo
Maurício Antônio de Oliveira Coelho (Interino)
Centro Tecnológico do Sul de Minas
Geraldo Antônio Resende Macêdo
Centro Tecnológico do Norte de Minas
Cláudio Egon Facion
Centro Tecnológico da Zona da Mata
Domingos Sávio Queiróz
Centro Tecnológico do Centro-Oeste
Miguel Celestino Paredes Zúñiga
Centro Tecnológico do Triângulo e
Alto Paranaíba
João Osvaldo Veiga Rafael
A EPAMIG integra o Sistema Nacional
de Pesquisa Agropecuária, coordenado
pela EMBRAPA