3 DNA Replicazione 2017 - 18

Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A.
Copyright © 2005
Watson
Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Watson
Eventi della fase S: coesione fra i cromatidi fratelli mediante le molecole

di coesina
Modello: struttura e
funzione della coesina
e condensina
Watson Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Coesine, condensine e separasi nel ciclo cellulare
CoxCopyright © 2005
Distruzione della coesina Watson
Watson
Cambiamenti nella struttura cromatinica. I cromosomi sono condensati al massimo durante la fase M
Sintesi del DNA
La doppia elica del DNA agisce da stampo per la propria duplicazione.
Ciascun filamento serve da stampo per specificare la sequenza dei
nucleotidi nel suo filamento complementare
Natura semiconservativa della
replicazione del DNA
Nnn
nnn
Nnn
Replicazione bidirezionale del DNA nei procarioti (una sola origine di
replicazione) e negli eucarioti (molte origini)
Si forma una bolla

(2 forcelle)
Campbell
Complessi proteici
Alberts et al., L’ESSENZIALE nelle
DI BIOLOGIA origini
MOLECOLARE DELLAdi replicazione
CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Unità di replicazione = replicone; un cromosoma ne può contenere migliaia di repliconi
Attività elicasica
Alberts
Reazione fondamentale della
sintesi del DNA
Aggiunta di un deossiribonuceotide
3P all’estremità 3’ da una catena
polinucleotidica (filamento primer)
Il nuovo filamento quindi polimerizza
in direzione 5’ – 3’
L’appaiamento delle basi fra un
deossiribonucleotide trifosfato
(substrati attivati) in arrivo, il
filamento esistente di DNA (filamento
stampo) guida la formazione del
nuovo filamento
Sono necessari anche ioni Mg+2 che
riducono l'affinità del 3'-OH per il suo
idrogeno, generando un 3'-O- necessario
per l'attacco nucleofilico del fosfato in α
del nucleotide che deve essere
polimerizzato
Rilascio di pirofosfato e successiva
idrolisi a due molecole di fosfato
inorganico che liberano energia
favorendo la reazione di
polimerizzazione
Reazione della DNA polimerasi
CoxCopyright © 2005
Reazione di polimerizzazione
Aggiunta di un nucleotide alla volta
ad una catena di DNA crescente
n. medio di nucleotidi polimerizzati nell’unità di tempo
La reazione di replicazione del DNA è catalizzata dalla DNA polimerasi III
La DNA pol. di E.coli assomiglia ad una mano destra in cui il palmo, le dita e il
pollice afferrano il DNA
Ruolo degli ioni metallici nella catalisi della DNA polimerasi
Il sito attivo dell’enzima contiene 2 ioni metallici Mg++ in particolare da residui di aspartico. Un
Mg++ deprotona il gruppo 3’OH per formare il nucleofilo 3’ O- facilitando l’attacco al Pa, l’altro
lega il dNTP in arrivo e facilita l’uscita del pirofosfato
La DNA polimerasi non è capace di catalizzare la sintesi de novo, ma
richiede la presenza di un innesco (primer)
Primer = corto filamento di RNA che si appaia al DNA stampo e dal

quale si estende la catena polinucleotidica in crescita nelle fasi iniziali
della replicazione
Primer (innesco)
Nucleoside trifosfato Filamento stampo a singola catena
Struttura della
forca replicativa
Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli
Capranico editore S.p.A. Copyright © 2005
1
2
3
Modello semidiscontinuo della replicazione DNA
Campbell
Caratteristiche generali di una forcella di replicazione procarioti
Campbell
Forcella di replicazione attiva
Alberts
Proteine presenti in una forcella replicativa
Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright
Van Holde© 2005
Procarioti
DNA pol III Oloenzima = complesso

multiproteico con proteine con attività
catalitica e altre che regolano la funzione
3 copie di DNA Polimerasi «core» e una
del caricatore dello sliding clamp formato
da 5 proteine
Amaldi
Oloenzima formato da diverse subunità

Due complessi catalitici della DNA Polimerasi III
Watson
Assemblaggio della DNA Polimerasi III sul DNA
Questo modello porta il filamento ritardato ad

essere parallelo a quello continuo
DNA polimerasi batteriche:
DNA Pol I = risintetizza il gap lasciato dal primer e attività
esonucleasica (proofreading (3’-5’)
DNA Pol III = catalizza la replicazione del DNA e attività
esonucleasica (proofreading (3’-5’)
DNA Pol II, IV, V= coinvolte nei meccanismi di riparazione
DNA polimerasi eucariotiche: circa 14 DNA diverse:

DNA Pol a, b, d ,e coinvolte nella replicazione, la a è strettamente
associata alla primasi; d ed e coinvolte nella replicazione, correzione
di bozze (proofreading) 3’ – 5’; b nelle riparazioni
DNA Pol  per la replicazione del DNA mitocondriale
Forcella replicazione eucariotica
Campbell
Sostituzione DNA polimerasi durante la replicazione del DNA negli EUCARIOTI
Switch delle polimerasi
Sliding clamp = pinza

scorrevole, aumenta la
processività della DNA pol
Rimozione inneschi
PROCARIOTI

Capranicoeditore S.p.A. Copyright © 2005
Rimozione inneschi
EUCARIOTI

Capranico editore S.p.A. Copyright © 2005
Karp
Reazione catalizzata dalla DNA ligasi
Alberts
Correzione esonucleasica da parte
della DNA polimerasi I e III durante la
replicazione
attività esonucleasica 3’-5’
AlbertsCopyright © 2005
Watson
L’avanzamento della bolla provoca la formazione di topoisomeri
Karp
Pearson
Replicazione del
DNA negli eucarioti
• Ci sono molteplici origini di
replicazione (repliconi)
• Il momento deve essere
sincronizzato con quello della
divisione cellulare
• Molte proteine ed enzimi
coinvolti
La replicazione si realizza
nella fase S
Campbell
Modello per l’inizio della replicazione negli eucarioti (lievito)
4 diverse DNA polimerasi: ade
ORC = complesso di
riconoscimento
dell’origine che funge da
sito di attacco per molte
altre proteine che
controllano la
replicazione
RAP= proteina attivatrice della

replicazione
RLF = fattori permissivi della
replicazione, alcuni di questi sono
citosolici quindi si deve dissolvere la
membrana nucleare durante la mitosi
Cambell
1
2
3
Problema della replicazione delle estremità nei cromosomi lineari
Accorciamento dei telomeri
coxCopyright © 2005
stampo
stampo
Capranico
T
E
L
O
M
E
R
A
S
I
Karp
Estensione delle estremità
ad opera delle telomerasi
cox
Meccanismo d’azione
telomerasi umana
Problema della replicazione sui

cromosomi lineari
Amaldi Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
I telomeri formano
un’ansa nella cellula
Watson 6° ediz
Watson 6° ediz
Amaldi Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Assemblaggio di un nucleosoma
formazione di un tetrametro
(H3)2.(H4)2 che recluta i due
dimeri H2A.H2B per
completare l’assemblaggio
Proteine adiuvanti
del riassemblaggio
dei nucleosomi
(histone chaperons)
Alcuni nucleosomi figli contengono solo istoni parentali o solo istoni di nuova sintesi; molti
sono ibridi di vecchi e nuovi istoni

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Si forma una bolla

Primer = corto filamento di RNA che si appaia al DNA stampo e dal

DNA pol III Oloenzima = complesso

Oloenzima formato da diverse subunità

Questo modello porta il filamento ritardato ad

DNA polimerasi eucariotiche: circa 14 DNA diverse:

Sliding clamp = pinza

Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli

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attività esonucleasica 3’-5’

RAP= proteina attivatrice della

Problema della replicazione sui

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