PERWANAAN BAKTERI SECARA GRAM DAN PENGUKURAN SEL

BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM

DISUSUN UNTUK MEMENUHI TUGAS MATAKULIAH

MIKROBIOLOGI
Yang dibimbing oleh Dr. Endang Suarsini M.Ked

Disusun oleh :
Kelompok 4 / Offering A
1. Adek Larasati S (160341606007)
2. Agrintya Indah M (160341606041)
3. Mamik Rizkiatul L (160341606051)
4. Novela Memiasih (160341606093)
5. Racy Rizki A (160341606056)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
FEBRUARI 2018
 A. TUJUAN
1. Agar mahasiswa dapat melakukan pewarnaan gram
2. Agar mahasiswa dapat mengidentifikasi bakteri biakan berdasarkan
pewarnaan gram
3. Agar mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroba
4. Agar mahasiswa dapat menentukan ukuran bakteri biakan

B. DASAR TEORI
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Hadiutomo, 2009).
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat
warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu, bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
(Waluyo, 2004).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu
merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri. Pewarnaan ini
digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak
berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah.
Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi
dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain
crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay, 2009).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan
ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup
banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan
yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat
terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada
suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu
mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo, 2006). Untuk pewarnaan yang
mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan
preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan
dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri karena sel bakteri lebih jelas terlihat
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga juga dapat
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme
bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang 7 (basil), dan
spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada
coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur
(stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8
(Lay, 2009).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar
yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan
penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami
kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini
berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat
memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,
2009).
Ciri-ciri gram negative:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi
layer
2. Dinding sel nya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10%
dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
1. Struktur dindingnya tebal
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
3. Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu
Kristal - Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
5. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Bentuk tubuh bakteri itu terpengaruhi oleh keadaan medium dan oleh usia.
Maka untuk membandingkan bentuk serta ukuran sel bakteri perlu diperhatikan
bahwa kondisi bakteri itu harus sama, temperatur dimana piaraan itu disimpan
harus sama, penyinaran oleh sumber cahaya apapun harus sama, dan usia piaraan
itu juga harus sama. Pada umumnya, bakteri dari piaraan yang masih muda, yaitu
sekitar 6 sampai 12 jam, itu nampak lebih besar daripada bakteri berasal dari
koloni yang lebih tua (Sutedjo, 2006).
Sel bakteri sangat beragam panjangnya, sel beberapa spesies dapat berukuran
100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Satuan ukuran bakteri
adalah mikrometer (µm), yang setara dengan 1/1000 mm atau 10-3 mm. Bakteri
yang paling umum dipelajari di dalam praktikum mikrobiologi berukuran kira-
kira 1,0 x 2,0-5,0 µm. Bentuk batang yang berukuran rata-rata seperti bakteri
tifoid dan disentri mempunyai lebar 0,5 sampai 1 µm dan panjang 2 sampai 3 µm.
Sel beberapa spesies bakteri amat panjang, panjangnya dapat melebihi 100 µm
dan diameternya berkisar dari 0,1 sampai 0,2 µm. Sekelompok bakteri yang
dikenal sebagai mikroplasma, ukurannya khas amat kecil-demikian kecilnya
sehingga hampir-hampir tak tampak di bawah mikroskon cahaya. Mereka juga
pleomorfik, yaitu morfologinya amat beragam. Ukurannya berkisar dari 0,1
sampai 0,3 µm (Black, 2012).
Pengukuran yang tepat sel mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara
menyisipkan suatu mikrometer okuler pada lensa okuler mikroskop yang
digunakan untuk mengamati sel tersebut. Mikrometer okuler pada umumnya
merupakan suatu piringan kaca bundar pada salah satu permukaannya terukir
skala pengukuran. Sebelum digunakan untuk mengukur sel, mikrometer okuler ini
terlebih dahulu harus ditera terhadap mikrometer pentas yang sudah memiliki
skala yang pasti (Ratna, 2010).

C. ALAT DAN BAHAN

Alat:
1. Mikroskop
2. Kaca benda
3. Pinset
4. Kawat inokulasi lurus
5. Mangkok dan kawat pewarna
6. Lampu spiritus
7. Mikrometer okuler
8. Mikrometer obyektif
9. Kertas lensa

Bahan:
1. Biakan murni bakteri dalam media agar miring 1x24 jam
2. Air kran dalam botol prncuci
3. Akuades steril
4. Kertas hisap
5. Minyak emersi
6. Xylol
7. Reagen pewarna Gram: Amonium oksalat kristal violet, Safranin, Iodium,
Alkohol 95%
D. PROSEDUR KERJA
1. Pewarnaan Bakteri Secara Gram

Disediakan kaca benda bersih, dipanaskan di atas nyala api spiritus dengan
menggunakan pinset, kemudian dibiarkan dingin dengan cara meletakkan di atas
kertas tisue.

Diteteskan akuades steril 1 tetes menggunakan pipet tetes.

Bakteri diambil dari biakan murni menggunakan kawat inokulasi lurus sebanyak 1
ujung jarum, kemudian diletakkan pada akuades dan diratakan menggunakan ujung
kawat inokulasi.

Sediaan bakteri dibiarkan mengering sendiri, hal ini berarti kita telah membuat
sediaan bakteri secara olesan kering udara.

Dilakuakn fiksasi dengan panas, caranya dengan melewatkan sediaan di atas lampu
spiritus.

Dilakukan pewarnaan dengan menggenangi sediaan menggunakan reagen amonium

oksalat kristal violet selama 3 menit.

Dibilas dengan air kran yang mengalir perlahan, kemudian dikeringkan dengan
menekan kerta hisap.

Sediaan digenangi dengan iodium selama 1 menit. Dibilas lagi dengan air kran, lalu
dikeringkan.

Sediaan digenangi di dalam alkohol 95% selama 30 detik sambil digoyang-

goyangkan, dan kemudian ditekan dengan kertas hisap sampai kering.

Sediaan digenangi dengan pewarna safranin selama 30 detik. Lalu dibilas dengan air
kran sampai tidak tampak lagi, adanya warna di dalam air bilasan, kemudian
dikeringkan dengan kertas hisap.

Sediaan yang telah kering diamati di bawah lensa mikroskop, mula-mula dengan
pembesar lemah, kemudian dilanjutkan pembesaran kuat 1000x dengan diberi
minyak emersi di atas sediaan.
 2. Pengukuran Sel Bakteri

Skala mikrometer okuler ditera dan mikrometer okuler dipasang ke dalam lensa
okuler mikroskop dengan membuka bagian atas lensa okuler.

Mikrometer obyektif dipasang di atas meja sediaan mikroskop.

Pembesaran yang lemah diamati terlebih dahulu, kemudian dengan memutar

penggerak mikro kedudukan lensa okuler diatur sedemikian rupa sehingga
didapatkan bayangan garis skala dari kedua mikrometer yang paling jelas.

Dilakukan pengubahan lensa obyektif sampai pada pembesaran kuat (umumnya sel
bakteri dan khamir, pada pembesaran 1000X, sedang sel jamur bisa diukur pada
pembesaran 450X), penggerak mikro diputar untuk memperoleh bayangan dari
mikrometer obyektif yang paling jelas.

Posisi garis pada mikrometer obyektif diatur sedemikian rupa sehingga dua garis
pada mikrometer obyektif dan mikrometer okuler berhimpit.

Jumlah skala mikrometer okuler dan mikrometer obyektif yang berada di antara dua
garis mikrometer okuler yang berhimpit dihitung.

Jarak satu skala mikrometer okuler ditera dengan rumus:

Jarak 1 skala mikrometer okuler = a x 0,01 mm / n

Mikrometer obyektif diambil dari meja mikroskop, lalu diganti dengan preparat
mikoba yang akan diukur.

Posisi sel pada preparat diatur sehingga berada pada daerah skala mikrometer okuler.
Caranya adalah dengan preparat diletakkan persis di daerah tengah lingkaran
pandang, di samping juga dapat disertai memutar lensa okuler.

Pengukuran dilakukan minimal 3 kali. Pengukuran terhadap sel bakteri berbentuk

basil meliputi diameter dan panjang, ukuran spora dalam milimeter.

Ukuran mikroba dicatat dengan skala mikrometer okuler, kemudian ukuran

sebenarnya ditentukan.
 E. HASIL PENGAMATAN
Berikut merupakan data hasil pengamatan yang telah dilakukan:
No. Koloni Bentuk Sel Warna Sel Sifat Gram Ukuran Sel

A Cocus Merah Negatif 2,4 μm

B Cocus Ungu Positif 2,4 μm

F. ANALISIS DATA
Pada percobaan ini untuk mengetahui bakteri yang diamati masuk kedalam
golongan bakteri gram positif atau bakteri gram negative, maka dilakukan
pewarnaan dengan menggunakan beberapa reagen yaitu reagen ammonium
oksalat Kristal violet, safranin, iodium, dan alcohol 95%. Setelah dilakukan
pewarnaan dengan reagen-reagen tersebut diketahui bahwa pada koloni A yang
berbentuk cocus menunjukkan warna merah pada sel bakterinya, hal ini
menunjukkan bahwa bakteri A memiliki sifat gram negative. Pada koloni B yang
juga berbentuk cocus, menunjukkan warna yang berbeda yaitu ungu, yang
menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki sifat gram negative.
Setelah dilakukan pengidentifikasian bakteri berdasarkan pewarnaan gramnya,
dilakukan pengukuran diameter dari sel bakteri tersebut. Sebelum melakukan
pengukuran, dilakukan peneraan mikroskop dengan menggunakan micrometer
okuler dan objektif pada perbesaran 1000 kali, sehingga didapatkan hasil peneraan
sebagai berikut:
25 skala okuler = 3 objektif
25 skala okuler = 3 x 0.01 mm
3 𝑥 0.01 𝑚𝑚
1 skala okuler = 25

= 12 x 10-4 mm
= 1,2 µm
Berdasarkan hasil peneraan tersebut, dilakukan pengukuran sel bakteri dan
diketahui bahwa koloni A dan koloni B yang berbentuk cocus keduanya memiliki
ukuran sebesar 2.4 µm.
 G. PEMBAHASAN
Pada praktikum pewarnaan bakteri secara gram dan pengukuran sel bakteri ini,
bakteri diambil dari koloni murni pedang dan koloni murni duri. Koloni A yang
diambil dari koloni murni pedang, setelah dilakukan pewarnaan gram diketahui
bakteri yang ada di koloni tersebut berbentuk coccus, berukuram 2,4 mm,
berwarna sel merah. Sedangkan koloni B yang diambil dari koloni murni duri,
setelah dilakukan pewarnaan gram diketahui bakteri yang ada di koloni tersebut
berbentuk coccus berukuran 2,4 mm, berwarna ungu. Perbedaan warna ini
diakibatkan oleh adanya pewarnaan gram. Menurut Rostinawati (2008)
pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk
membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.
Koloni A yang berwarna merah mengindikasikan sifat bakteri sebagai gram
negatif sedangkan koloni B yang berwarna ungu mengindikasikan sifat bakteri
sebagai gram positif. Sejalan dengan Fitri dan Yasmin (2011) yang menyatakan
bahwa bakteri gram positif pada pewarnaan Gram berwarna ungu disebabkan
kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi
larutan pemucat aseton alkohol, sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah
sebab kompleks tersebut larut pada saat pemberian larutan pemucat aseton alkohol
sehingga mengambil warna merah safranin.
Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negatif menunjukkan
bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut.
Bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan
peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negatif memiliki struktur
dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri dan Yasmin, 2011).
Ditambahkan oleh Zuhud dkk (2001) bahwa mikroba gram negatif memiliki
sistem seleksi terhadap zat-zat asing yaitu pada lapisan lipopolisakarida.
Sedangkan struktur dinding sel mikroba gram positif relatif lebih sederhana.
Menurut Iskandar dkk (2009), dinding sel mikroba gram positif banyak
mengandung teikoat dan asam teikoronat serta molekul polisakarida sedangkan
dinding sel bakteri gram negatif berisi tiga komponen yaitu lipoprotein membran
terluar yang mengandung molekul protein yang disebut porin dan
lipopolisakarida.
 Proses perakitan dinding sel mikroba diawali dengan pembentukan rantai
peptida yang akan membentuk jembatan silang peptida yang menggabungkan
rantai glikan dari peptidoglikan pada rantai yang lain sehingga menyebabkan
dinding sel terakit sempurna. Jika ada kerusakan pada dinding sel atau ada
hambatan dalam pembentukannya dapat terjadi lisis pada sel mikroba sehingga
mikroba segera kehilangan kemampuan membentuk koloni dan diikuti dengan
kematian sel mikroba (Ajizah dkk, 2007).
Sebelum melakukan pengukuran bakteri maka lensa pada mikroskop ditera
terlebih dahulu. Peneraan skala okuler dilakukan karena ukuran skala mikrometer
okuler pada pembesaran yang berbeda, tidak sama. Peneraan skala mikrometer
okuler dilakukan dengan memasang mikrometer okuler dalam lensa okuler dan
memasang lensa objektif pada meja sediaan mikroskop. Harga skala mikrometer
objektif sudah terukur yaitu 1 skala ialah 0,01mm. Setelah dilakukan peneraan
pada mikroskop dengan bantuan mikrometer okuler dan objektif pada perbesaran
1000x didapatkan hasil peneraan yaitu 1 skala mikrometer okuler ialah 1,2 μ.
Penggunaan perbesaran 1000x ini membutuhkan minyak emersi untuk
mengurangi indek bias. Sampel dari koloni murni A dan B memiliki ukuran yang
sama yaitu 2 skala okuler sehingga menghasilkan ukuran diameter bakteri coccus
2,4 μ. Hasil pengamatan sejalan dengan Dwidjoseputro (1989) bahwa pada
umumnya bakteri itu kecil sekali, sehingga kita memerlukan mikroskop untuk
dapat mengamatinya. Coccus ada yang berdiameter 0,5 μ, ada pula yang
diameternya sampai 2,5 μ. Menurut Campbel dan Reece (2009), umumnya
prokariot merupakan makhluk hidup uniseluler yang memiliki diameter 0.5–5 μm.
 H. KESIMPULAN
Berikut merupakan kesimpulan dari praktikum ini:
1. Pewarnaan gram dilakukan dengan menggunakan biakan murni koloni A dan
B yang diberi beberapa reagen seperti amonium oksalat kristal violet, iodium,
alkohol 95%, dan safranin. Reagen-reagen tersebut akan memberikan warna
pada dinding bakteri yang dapat digunaakan untuk mengamati sifat gram,
ukuran sel, warna sel, dan bentuk sel bakteri dibawah mikroskop dengan
perbesaran 1000x.
2. Bakteri koloni A menunjukkan memiliki bentuk sel kokus, warna sel merah,
memiliki sifat gram negatif. Bakteri koloni B menunjukkan memiliki bentuk
sel kokus, warna sel ungu, memiliki sifat gram negatif.
3. Dalam melakukan pengukuran sel mikroba, terlebih dahulu harus melakukan
peneraan, hasil peneraan yang telah dilakukan yaitu menunjukkan 1 okuler =
1,2 µm.
4. Ukuran bakteri koloni A sebesar 2,4 µm dan ukuran bakteri koloni B sebesar
2,4 µm.
 I. LAMPIRAN

Biakan Murni Bakteri Reagen Pewarna Gram

Pewarnaan Biakan Bakteri Proses Pembilasan Air

dengan Reagen Amonium yang Dilakukan Setelah
Oksalat Kristal Violet Pewarnaan

Koloni Bakteri Gram Positif Koloni Bakteri Gram Negatif

yang memiliki bentuk kokus yang Memiliki bentuk kokus
Perbesaran 1000x Perbesaran 1000x
DAFTAR RUJUKAN

Ajizah, A., Thihana dan Mirhanuddin. 2007. Potensi Ekstrak Kayu Ulin
(Eusideroxylon zwageri T et B) Dalam Menghambat Pertumbuhan
Bakteri Staphylococcus aureus Secara In Vitro. Jurnal Ilmiah. 4(1): 37-
42.

Black, Jacquelun G. 2012. Microbiology: Principles and Exploration Eight

Edition. USA: Unites States of America.

Campbell, N, A, Reece, J, B. 2009. Biology 8th Edition. San Francisco: Pearson

Benjamin Cummings.

Dwidjoseputro, D. 1989. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit

Djambatan.

Fitri, L, Yasmin, Y. 2011. Isolasi dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri

Kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi Volume 3,
Nomor 2.

Hadiutomo. 2009. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.

Iskandar Y, Rusmiati D, dan Dewi RR. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstra
Etanol Rumput Laut Eucheuma cottonii Terhadap Bakteri Escherichia
coli dan Bacillus cereus. Pustaka Ilmiah Universitas Padjajaran.

Lay, Bibiana.W. 2009. Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali.

Ratna Siri. 2010. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek: Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.

Rostinawati, T. 2008. Skrining dan Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim Kitinase

Dari Air Laut di Perairan Pantai Pondok Bali. Penelitian Mandiri.
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran Jatinangor.

Sutedjo, Mul Mulyani. 2006. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rineka Cipta.

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

Zuhud, E. A. M., W. P. Rahayu, C.H. Wijaya dan P. P. Sari. 2001. Aktivitas

Antimikroba Ekstrak Kedawung (Parkia roxburghii G. Don) Terhadap
Bakteri Patogen. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. Vol XII No.1:6.