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NATAL-RN
2017
STELLA MARIA ANDRADE GOMES BARRETO
NATAL - RN
2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Banca Examinadora:
___________________________________________
NATAL/RN
2017
Dedico este trabalho: a todos os meus familiares, em
especial aWallério e Adna, fonte de entusiasmo e
amor; ao Prof. Márcio Ferrari, sem o qual nada
teria sido possível.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Márcio Ferrari, pelo trabalho que pôs em
minhas mãos, por toda paciência, cumplicidade, dedicação e cobrança, fundamentais
ao desenvolvimento deste trabalho. Por ter me acolhido ainda na Iniciação científica
e me guiado nessa caminhada.
Aos professores, Dra. Patrícia Santos, Dr. Hugo Rocha e Dra. Valéria
Sales pelas contribuições, essenciais para a realização deste trabalho.
Agradeço imensamente a colaboração dos Laboratórios LASID e
BIOPOL em especial as pessoas de Renato, Bartolomeu (Bartô),Gutemberg (Guto),
Thayane, Débora, Lucas, André, Alexandrino, Henrique e Marília.
The processing of the leaves of Agave sisalana provides fiber, with added value
for the sisal industry, and the rest of the plant material, known as by-product, is thrown
and generates environmental impact. Different applications have been attributed,
however, there are no scientific researches that aim to use this product as a cosmetic
raw material. The objective of this research was to obtain and characterize
polysaccharides-enriched fraction (FrE) from the Agave sisalana by-product of, assess
the safety in vitro and in vivo, as well as to evaluate the antioxidant activity in vitro, and
then to develop a nanoemulsion with moisturizer effect. From the liquid portion of the
by-product obtained the crude extract (EB) and two fractions resulting from extractive
process. The EB and the fractions were evaluated for the presence of sugars, proteins
and polyphenols. Safety was evaluated by cytotoxicity and phototoxicity in vitro assays
using the colorimetric method of Neutral Red. Irritability was evaluated by the primary
contact test (patch test). The antioxidant capacity was assessed using the DPPH
scavenging tests and molybdenum method. Different systems were obtained by means
of pseduodiagrama ternary containing, or not, 0.5% FrE. The selected formulations
were submitted to preliminary stability tests and accelerated in different temperatures
conditions for a period of 90 days. The moisturizing efficacy was evaluated by water
content of the stratum corneum and transepidermal water loss for a period of 5 hours.
The samples presented as chemical constituents, sugars, polyphenols and proteins.
The FrE showed no phototoxic potential or cytotoxic, and was not irritating to skin of
volunteers and can be considered an asset with antioxidant property Nanoemulsion
containing 40% oil phase, 50% aqueous phase and 10% surfactants was stable for 90
days.The nanoemulsion was able to significantly increase the water content and
maintain skin barrier function after 5 hours from a single application. The fraction
obtained from the industrial by-product of Agave sisalana demonstrated a promising
profile as raw material for cosmetic skin care with moisturizing and antioxidant
capacity, together with the possibility of adding value to industrial waste, reducing the
damage caused to the environment by disposing of this material.
Abs absorbância
AF Adicionada com a fração enriquecida em polissacarídeos
ANOVA Análise de Variância
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária
A/O Emulsão água em óleo
AQP Aquaporina
ATCC American Type Culture Collection
BHA Butilhidroxianisol
BHT Butilidroxitolueno / Butylhydroxytoluene
BraCVAM Brazilian Center for Validation of Alternative Methods
CAT Capacidade antioxidante total
CCD Cromatografia em camada delgada
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CEUAs Comissões de Ética no Uso de Animais
CIR Cosmetic Ingredient Review
CIUCA Cadastro das Instituições de uso científico de animais
Conab Companhia Nacional de Abastecimento
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COSING European Commision Health and Consumers – Cosmetics
Ingredients and Consumers
DLS Dynamic Light Scattering
DMEM Dulbecco’s Modifield Eagle’s Medium
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidade óptica
DPPH 2,2-difenil-1-pricrilhidrazil
EB Extrato bruto
EC Estrato córneo
CE Concentração efetiva
EC50 Concentração efetiva
ECACC European Collection of Cell Cultures
ECVAM European Center for Validation of Alternative Methods
EDTA Disodium EDTA
EG Estrato granuloso
EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófilo
EL Estrato lúcido
EsB Estrato basal
EsE Estrato espinhoso
EURL - European Union Reference Laboratory for Alternatives to
ECVAM Animal Testing
FrE Fração enriquecida em polissacarídeos
FrP Fração obtida do precipitado
H Homogênea
IC Concentração inibitória
ICCVAM Interagency Coordinating Committee on the Validation of
Alternative Methods
IM Intensamente Modificado
INCI International Nomeclature of Cosmetic Ingredients
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IRCDG International Contact Dermatitis Research Group Guidelines
ISO International Organization for Standardization
LM Levemente modificado
M Modificado
MCTI Ministerio da Ciência, Tecnologia e Informação
MPE Mean Phototoxic Effect
NMF Natural Moisturizing Factor
NRU Neutral Red Uptake
O/A Óleo em água
OECD Organisation for Economic Co-operation and Development
PDI Polidispersividade
pH Potencial hidrogeniônico
PIF Photo Irradiation Factor
PLAS Phase Analysis Light Scattering
PLS Projeto de Lei do Senado
QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship
RENAMA Rede Nacional de Métodos Alternativos
RNA Ácido ribonucleico
SF Separação de fases
SLO Sistema líquido opaco
SLT Sistema líquido transparente
SLTL Sistema líquido translúcido
SVO Sistema viscoso opaco
SVT Sistema viscoso transparente
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TEWL Transepidermal Water Loss
TFA Tensoativos na fase aquosa
TFO Tensoativo na fase oleosa
TS Tensoativos isolados
U.A. Unidades arbitrárias
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UNIC Univesidade de Cuiabá
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UR Umidade relativa
UV Ultravioleta
UVA Ultravioleta A
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 20
2.1 Agave sisalana PERRINE 20
2.1.1 Descrição botânica 22
2.1.2 Composição química do subproduto do beneficiamento
de Agave sisalana 23
2.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE INGREDIENTES
VEGETAIS PARA USO COSMÉTICO 23
2.2.1 Aspectos éticos e legais 24
2.2.2 Métodos alternativos para avaliação da segurança de
ingredientes cosméticos 26
2.3 NANOEMULSÃO 28
2.4 BIOLOGIA DA PELE E ENVELHECIMENTO CUTÂNEO 31
2.5 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE INGREDIENTES E 35
FORMULAÇÕES COSMÉTICAS
2.5.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro 36
2.5.2 Biometrologia cutânia e eficácia clínica hidratante de
produtos cosméticos 39
3 OBJETIVOS 42
3.1 OBJETIVO GERAL 42
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 42
4 MATERIAL, MÉTODOS E CASUÍSTICA 43
4.1 MATERIAL 43
4.2 MÉTODOS 45
4.2.1 Obtenção do subproduto de Agave sisalana (sisal) 45
4.2.2 Obtenção do extrato bruto e da fração enriquecida em
polissacarídeos 45
4.2.3 Caracterização preliminar qualitativa do extrato bruto de
Agave sisalana e suas frações quanto à presença de
açúcares 46
4.2.3.1 Análise cromatográfica por cromatografia em camada
delgada (CCD) 46
4.2.3.2 Determinação da composição monossacarídica do extrato
bruto de Agave sisalana e suas frações 46
4.2.4 Caracterização química do extrato bruto de Agave sisalana
e suas frações 47
4.2.4.1 Dosagem de açúcares totais 47
4.2.4.2 Dosagem de proteínas 47
4.2.4.3 Dosagem de compostos fenólicos 47
4.2.5 Avaliação da segurança do extrato bruto e da fração
enriquecida em polissacarídeos do subproduto 47
4.2.5.1 Avaliação da segurança in vitro 47
4.2.5.1.1 Cultura de células 48
4.2.5.1.2 Avaliação da citotoxicidade 48
4.2.5.1.3 Avaliação da fototoxicidade 49
4.2.5.2 Avaliação da compatibilidade cutânea 49
4.2.5.2.1 Avaliação da irritabilidade primária 50
4.2.6 Avaliação da eficácia in vitro do potencial antioxidante da
fração enriquecida em polissacarídeos 51
4.2.6.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH) 51
4.2.6.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total 51
4.2.7 Desenvolvimento das nanoemulsões 52
4.2.7.1 Preparo das formulações 52
4.2.7.2 Determinação do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) requerido
pela fase oleosa 52
4.2.7.2.1 Análise macroscópica 53
4.2.7.2.2 Centrifugação 53
4.2.7.3 Elaboração do pseudodiagrama ternário 53
4.2.8 Avaliação da estabilidade das formulações 55
4.2.8.1 Análise macroscópica 55
4.2.8.2 Centrifugação 55
4.2.8.3 Determinação de tamanho de gotícula e polidispersividade 55
4.2.8.4 Avaliação da estabilidade preliminar das formulações e
adequação de localização do sistema tensoativo 55
4.2.8.4.1 Estudo de adequação de localização do sistema tensoativo
frente a estabilidade das formulações 56
4.2.8.4.2 Avaliação da estabilidade preliminar 56
4.2.8.5 Avaliação da estabilidade acelerada 56
4.2.9 Avaliação da eficácia hidratante 57
4.2.9.1 Casuística e aspectos éticos 57
4.2.9.2 Avaliação clínica da eficácia hidratante 57
4.2.9.2.1 Avaliação do conteúdo hídrico do estrato córneo 58
4.2.9.2.2 Avaliação da perda de água transepidermal (Transepidermal
Water Loss –TEWL) 58
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 58
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 60
5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E
FRAÇÕES DO SUBPRODUTO DO BENEFIAMENTO DE
Agave sisalana 60
5.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTATO BRUTO E DA
FRAÇÃO ENRIQUECIDA EM POLISSACARÍDEOS DO
SUBPRODUTO DE Agave sisalana 68
5.2.1 Avaliação da citotoxicidade in vitro 68
5.2.2 Avaliação da fototoxicidade in vitro 69
5.2.3 Avaliação da compatibilidade cutânea 70
5.3 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VITRO DO POTENCIAL
ANTIOXIDANTE DA FRAÇÃO ENRIQUECIDA EM
POLISSACARÍDEOS 71
5.3.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). 72
5.3.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total 73
5.4 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES 73
5.4.1 Determinação do equilíbrio hidrófilo – lipófilo (EHL)
requerido pela fase oleosa 73
5.4.2 Pseudodiagrama ternário de fases 75
5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE 78
5.5.1 Estabilidade Preliminar 80
5.5.1.1 Estudo da adequação de localização do sistema tensoativo e
avaliação da estabilidade preliminar das formulações 80
5.5.1.1.1 Determinação do Valor de pH 83
5.5.1.1.2 Determinação do tamanho de gotícula e polidispersividade 83
5.5.1.1.3 Determinação do potencial zeta 84
5.5.2 Estabilidade Acelerada 85
5.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA HIDRATANTE 90
6 CONCLUSÕES 95
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 96
REFERÊNCIAS 97
ANEXO A – Parecer Consubstanciado do CEP 110
APÊNDICE A – TCLE – Teste de irritabilidade primária 112
APÊNDICE B – TCLE – Eficácia clínica 115
18
1 INTRODUÇÃO
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
descartados nos locais de beneficiamento sem que haja tratamento prévio (MARAN;
PRIYA, 2015; SANTOS et al., 2009).
ingrediente cosmético possa vir a ocasionar (BRASIL, 2012). Assim, após a realização
dos ensaios in vitro e in vivo de uma matéria-prima e, diante da evidência da ausência
de riscos, essa pode ser utilizada para o desenvolvimento de formulações e/ou
submetidos a testes de eficácia específicos in vitro e/ou in vivo.
2.3 NANOEMULSÃO
𝛾
∆P = (1)
2r
Onde: γ é a tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa e, r é o raio das gotículas.
Quebra de
gotículas
ceramidas, ácidos graxos livres e colesterol (SMEDEN et al., 2014). Nessa fase, o
núcleo é digerido, o citoplasma desaparece, os lípidos são libertados para o espaço
intercelular, os filamentos intermediários de queratina agregam-se para formar
microfibrilas, e a membrana celular é substituída por um envelope celular de proteína
reticulada com lípidos ligados de modo covalente à sua superfície (WICKETT;
VISSCHER; OHIO, 2015).
O EC é constituído de corneócitos ricos em queratina (queratinócitos
anucleados), originados do processo de diferenciação celular, inseridos em domínios
lipídicos complexos e organizados (BONTÉ, 2011). No interior celular, estão presentes
água e queratina microfibrilar, rodeados por um envelope que consiste de uma
camada densamente reticulada de proteínas, tais como filagrina, loricrina e involucrina
(SMEDEN et al., 2014). Essa camada fornece suporte estrutural e proteção mecânica,
atua como uma barreira antimicrobiana e antioxidante, e participa na regulação da
permeabilidade da pele atuando também como reservatório de conteúdo aquoso
necessário para manutenção dos processos fisiológicos e enzimáticos (RAMOS-e-
SILVA; JACQUES, 2012). A presença de água na pele desencadeia importantes
funções, como a degradação da filagrina (proteína de agregação de filamentos) e
microfibrilas de queratina em peptídeos e aminoácidos, constituintes do fator de
hidratação natural da pele (Natural Moisturizing Factor - NMF). A degradação
proteolítica da filagrina em substâncias do NMF fornece uma forte energia osmótica,
que atrai moléculas de água, essenciais para retenção desse componente nos
corneócitos (BONTÉ, 2011; PONS-GUIRAUD, 2007). Além disso, o conteúdo aquoso
juntamente com o conteúdo lípidico formam um filme hidrolipídico capaz de promover
uma barreira efetiva contra a perda de água proveniente das camadas mais profundas
da pele, denominado de perda de água transepidermal (Transepidermal Water Loss –
TEWL) (BONTÉ, 2011; PONS-GUIRAUD, 2007). Diminuição do conteúdo hídrico,
bem como alterações nos níveis lipídicos da pele, contribuem para o surgimento de
diferentes desordens na função de barreira, como por exemplo, a xerose (pele seca
ou ainda dermatite atópica). A pele seca está diretamente associada com a função de
barreira debilitada, causada pela proliferação e diferenciação epidermica
desequilibada, a síntese lipidica defeituosa e mutações no gene da filagrina e
consequentemente de fatores de hidratação natural inadequados (LU et al., 2014).
Na pele xerótica é observado um aspecto áspero e escamoso, perda da
elasticidade e flexibilidade ocasionando rigidez e fragilidade (BARCO, 2008; BONTÉ,
34
2011; WHITE-CHU; REDDY, 2011). A pele seca pode se manifestar por alterações
endógenas ou exógenas, como os fatores hormonais, genéticos, exposição excessiva
á radiação solar e uso contínuo de produtos de higiene pessoal (PONS-GUIRAUD,
2007).
A utilização de produtos hidratantes proporciona melhor função de barreira
na medida em que fornecem topicamente ingredientes adequados para manutenção
da fisiologia da pele, restaurando o estrato córneo e, consequentemente, fortalecendo
a barreira cutânea (LONDÉN, 2014). Os cosméticos hidratantes podem atuar por
diferentes mecanismos por apresentarem propriedades oclusivas, umectantes, ativos
que promovem a hidratação ativa ou ainda estimular a síntese de aquaporinas
(BONTÉ, 2011; RIBEIRO, 2010).
A ação oclusiva, geralmente desencadeada por substâncias graxas,
promovem a formação de um filme sobre a pele capaz de reduzir a perda de água
transepidermal e, dessa forma, aumentar o conteúdo hídrico presente no EC. Os
umectantes são ingredientes capazes de promover a retenção de água por ligação
química com moléculas de água provenientes da pele ou ainda do ambiente para a
pele, como por exemplo, a ureia, glicerina e os açúcares. Na hidratação ativa, o
ingrediente é capaz de permear a camada córnea e promover a retenção de moléculas
em toda sua extensão (BONTÉ, 2011; RIBEIRO, 2010; WAN et al., 2014). Hidratantes
podem, ainda, estimular a síntese de proteínas transmembranares denominadas de
aquaporinas (AQP) capazes de promover o fluxo de água e outros componentes,
como o glicerol e a ureia, das camadas mais inferiores para a superfície da pele
(BONTÉ, 2011).
Alterações nos níveis de água, diminuição nos níveis de aminoácidos e no
fator de hidratação natural, decaimento na síntese de lipídeos e aquaporinas entre
outros fatores estão associados à pele de idosos, favorecendo a perda de água
transepidermal e tornando-a seca e aspera. Isso explica por que a utilização de
produtos hidratantes é essencial para a manutenção das características fisiológicas
da pele e para prevenir o envelhecimento (BONTÉ, 2011; SCOTTI; VELASCO, 2003).
O envelhecimento cutâneo é um processo complexo que envolve alterações
clínicas resultantes de uma combinação de fatores endógenos e exógenos. Diferentes
teorias têm sido propostas para explicar os mecanismos intrínseco (fisiológico) e
extrínseco do envelhecimento, incluindo a teoria da senescência celular, redução da
capacidade de reparo celular e perda de telômeros, mutações pontuais do ácido
35
de hidrogênio ou, ainda, atuarem como sítio ativos para sequestro de radicais através
da doação de átomos de hidrogênio, caracterizando esses compostos como
moléculas multipotentes (ALIMI et al., 2011).
A capacidade antioxidante total (CAT) de compostos pode ser avaliada por
meio do método molibedênio. Nesse ensaio verifica-se a capacidade dos compostos
antioxidantes doarem elétrons para o molibdato (VI) reduzindo-o a molibdato (V) e
subsequente formação de um complexo verde de fosfato Mo (V) em um pH ácido.
Este complexo adquire uma coloração esverdeada que pode ser mensurada por meio
de espectrofotômetro em um comprimento de onda de 695 nm (PRIETO; PINEDA;
AGUIAR, 1999). A capacidade antioxidante total de xilana oriunda do sabugo de milho
foi apresentada por Melo – Silveira e colaboradores (2012). Utilizando o método
molibedênio, Kocak e colaboradores (2016) demonstraram a capacidade de doar
elétrons do extrato de Salvia cadmica.
Em adição, a avaliação da capacidade antioxidante de compostos pode ser
avaliada em sistemas biológicos pela medida da sobrevivência de células de
leveduras de Saccharomyces cerevisiae expostas a agentes promotores do estresse
oxidativo como por exemplo, a apomorfina, o paraquat e o glutamato monossódico
(GUARIENTI; BERTOLINI; COSTA, 2010). A resposta de S. cerevisiae contra o
estresse oxidativo está bem caracterizada e envolve mecanismos pós-transcricionais
e transcricionais, resultando eventualmente na ativação de estratégias de resposta
enzimática e não-enzimática, podendo dessa forma ser utilizada como uma
ferramenta de previsão da capacidade antioxidante (ODRIOZOLA-SERRANO et al.,
2016). O método não invasivo, ex vivo, de tape stripping é utilizado para determinar a
eficácia antioxidante de formulações aplicadas topicamente in vivo por meio do
percentual de inibição da peroxidação lipídica na camada mais externa da pele
(ALONSO et al., 2009). Essa técnica se caracteriza pela remoção sequencial de fitas
adesivas em uma mesma área, levando a uma quase completa remoção da camada
superficial da pele (DARLESKI et al., 2009). Alonso e colaboradores (2009) avaliaram
a atividade antioxidante de formulações tópicas contendo vitamina A,C, E e o extrato
de peixe, após exposição à radiação ultravioleta. Os resultados demonstraram que as
formulações reduziram os níveis de peroxidação lipídica da pele, indicando a eficácia
na proteção contra danos ocasionados por radicais livres.
39
vidro, que, quando aplicada sobre a pele, forma um campo elétrico que, permiti a
determinação do conteúdo aquoso (BYRNE, 2010).
A avaliação da perda de água transepidermal é de grande utilidade no
monitoramento da função barreira da pele, onde baixos valores de TEWL refletem
uma condição de função de barreira intacta e maiores valores indicam uma função de
barreira alterada (DARLENSKI et al., 2009; MAIA CAMPOS et al., 2012).
O Tewameter® é um evaporímetro de câmera aberta, fundamentado na
medição de um gradiente de pressão de vapor. A sonda consiste em um cilindro oco
posicionado perpendicularmente à superfície da pele. A umidade relativa e
temperatura são medidas por dois sensores localizados em duas distâncias da pele.
A diferença de pressão de vapor entre os pontos é diretamente relacionada com a
perda de água por evaporação da pele. Os dados são processados e expressados
numericamente em g/m²/h (FLUHR; FEINGOLD; ELIAS, 2006).
A avaliação do conteúdo aquoso do extrato córneo juntamente com a avaliação
da função barreira da pele são comumente utilizadas na comprovação da eficácia de
produtos cosméticos hidratantes. Diferentes mecanismos de atuação de formulações
cosméticas podem ser propostos a partir da avaliação desses parâmetros como, por
exemplo, a umectação, promovendo a retenção de água na extensão da pele e a
oclusão, formando um filme capaz de reduzir a perda de água da pele, sendo o
mecanismo de ação dos ativos influenciado pelo tipo de veículo utilizado (DAL’BELO;
GASPAR; MAIA CAMPOS, 2006; DAMASCENO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2015).
De uma maneira geral, existe uma proporcionalidade entre a TEWL e a
hidratação do extrato córneo. Uma elevação inicial da TEWL é observada após
aplicação de agentes hidratantes na superfície da pele, o que não ocorre devido ao
aumento da hidratação do estrato córneo, mas devido à evaporação da água do
produto cosmético em si. Além disso, a hidratação da pele aumenta a espessura do
estrato córneo em nível molecular. Consequentemente, podem indicar prejuízos para
a evaporação da água na área (MELO; MAIA CAMPOS, 2016b).
Além disso, novas ferramentas não invasivas de microscopia e técnicas de
imagem como por exemplo, a microscopia confocal e a ressonância magnética, vem
sendo utilizadas no monitoramento de alterações biomoleculares da pele em tempo
real e assim determinando a eficácia de produtos cosméticos quanto à hidratação da
pele e antienvelhecimento (DRENO et al., 2014).
41
3 OBJETIVOS
4.1 MATERIAL
Para o preparo das formulações foram utilizados:Caprylic/Capric
Triglyceride (Crodamol™ GTCC), Polysorbate 80 (Tween® 80), Sorbitan Monooleate
(Span® 80), Ethylhexyl Palmitate (Crodamol™ OP) doados pela Croda do Brasil Ltda.
(Campinas, Brasil); Isostearyl Neopentanoate (Eschercemol™ 185) cedido pela
Lubrizol do Brasil Aditivos Ldta. (São Paulo, Brasil); Phenoxyethanol, Caprylyl Glycol
(Optiphen™) fornecido pela Ashland Inc. (São Paulo, Brasil), Disodium EDTA (DEG
importação de produtos químicos, São Paulo, Brasil), Butylhydroxytoluene – BHT
(Galena química e farmacêutica Ltda., Campinas, Brasil) e distilled water.
A nomenclatura dos ingredientes foi apresentada de acordo com a International
Nomenclature of Cosmetic Ingredient – INCI (COSING, 2014) seguido pelo nome
comercial de acordo com o fornecedor.
Todas as matérias-primas utilizadas no desenvolvimento das formulações,
citadas acima, são de grau cosmético e constantes nas listas da Cosmetic Ingredient
Review – CIR (CIR, 2014) e na European Commision Health and Consumers –
Cosmetics Ingredients & Substances – Cosing (COSING, 2014). Quando os
ingredientes constam nessas bases de dados, indicam que os mesmos são seguros
para fins cosméticos.
Para a obtenção do extrato bruto e as frações foi utilizado o álcool etílico
(Labsynth produtos para laboratórios Ltda., Diadema, Brasil).
Para as metodologias relacionadas a caracterização preliminar qualitativa do
extrato bruto de Agave sisalana e suas frações foram utilizados os seguintes produtos
e reagentes: ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), piridina
(Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), 1-propanol (Vetec química fina Ltda., Duque
de Caxias, Brasil), água destilada, acetato de etila (Labsynth produtos para
laboratórios Ltda., Diadema, Brasil), solução metanólica de ácido sulfúrico (J. T.
Baker, Hecho, México) a 10% (v/v),solução de timol/sulfúrico (0,5 g timol, 95 mL etanol
e 5 mL ácido sulfúrico 97%), (Merck, Darmstadt, Alemanha), solução etanólica de
ninhidrina 0,2% (p/v) (Vetec química fina Ltda., Duque de Caxias, Brasil). Placas de
sílica gel 60 (0,20 mm) em suporte de alumínio F254 (Machery-Nagel, Duren,
Alemanha) foram utilizadas para as análises em CCD. Os monossacarídeos ácido
galactucurônico, arabinose, galactose, glicose, manose, ramnose e xilose foram
44
utilizados como padrões (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), solução de nitrato
de prata 3,3% (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil).
Para as metodologias quantitativas relativas à caracterização química do
extrato bruto e suas frações foram utilizados: ácido gálico (CAQ Casa da química Ind.
e Com.,São Paulo, Brasil), D-galactose (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil),
albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil) ácido sulfúrico P.A.
(Labsynth produtos para laboratórios Ltda., São Paulo, Brasil), reagente de Bradford
(Bio-Rad, São Paulo, Brasil), reagente de Folin-Ciocalteau (Merck, Darmstadt,
Alemanha), solução de fenol 80% (Quimiobrás indústrias químicas S.A., Rio de
Janeiro, Brasil).
Para avaliação da segurança foram utilizados: meio Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM) (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), penicilina, estreptomicina,
anfotericina, glutamina e soro fetal bovino (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), solução de
tripsina a 0,05%, EDTA (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), tampão fosfato a pH 7,4 e
corante Neutral Red (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil). Para o teste de
segurança in vivo, foram utilizados apósitos (patch test) de 1,0 cm2 (Allergo Chamber,
IPI ASAC Brasil, São Paulo, Brasil)
Na avaliação da eficácia do potencial antioxidante foram utilizados 2,2-difenil-
1-picrilhidrazil (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), álcool etílico (Labsynth
produtos para laboratórios Ltda., Diadema, Brasil), ButylHidroxiTolueno - BHT (Sigma-
Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), fosfato de sódio (Alphatec, Rio de Janeiro, Brasil),
molibdato de amônia (Vetec química fina Ltda., Duque de Caxias, Brasil) e ácido
ascórbico (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil).
Para o teste de eficácia clínica foi utilizado como controle positivo o produto
bruma perfumada Vitória-Régia flor do dia, Lote: K602353, validade: 07/2017
(L’occitane - K&G Indústria e Comércio Ltda, São Paulo, Brasil) e as formulações
desenvolvidas contendo ou não fração enriquecida em polissacarídeos.
45
4.2 MÉTODOS
1 Prensagem
Rotaevaporação Rotaevaporação
Liofilização Liofilização
Fração enriquecida em
Fração do Precipitado (FrP)
polissacarídeos (FrE)
46
Reação Resultado
Sequestro de radicais DPPH (%) = 1- [ Abs amostra /Abs controle negativo] x100(2)
Onde: Abs é a absorbância.
A + B = 100
EHL A x 0,01. A + EHLB x 0,01. B= EHLRequerido(3)
Onde:
A = Porcentagem de tensoativo hidrofílico;
B = Porcentagem de tensoativo lipofílico;
EHLA= Equilíbrio hidrófilo – lipófilo de A;
EHLB = Equilíbrio hidrófilo – lipófilo de B;
EHL R = Equilíbrio hidrófilo – lipófilo resultante ou requerido pela fase oleosa.
4.2.7.2.2 Centrifugação
As amostras (10 g) que não apresentaram separação de fases após 24 horas
de preparo, foram submetidas a 3000 rpm durante trinta minutos (Fanen, mod 206 BL,
Brasil) à temperatura ambiente (25±2°C) (BRASIL, 2005).
2 3
Fa
%) 4 5 6
s
eO
s(
vo
7 8 9 10
leo
ati
sa
so
(%
11
n
12 13 14 15
Te
)
16 17 18 19 20 21
22 23 24 25 26 27 28
29 30 31 32 33 34 35 36
4.2.8.2 Centrifugação
Após a classificação dos sistemas obtidos, os sistemas classificados como SLO
foram submetidas ao teste de centrifugação, conforme descrito no item 4.2.7.2.2.
Determinação do potencial zeta: o potencial zeta foi determinado por Phase Analysis
Light Scattering (PALS) (Malvern, Malvern Zetasizer Nano ZS,Worcestershire, United
Kingdom) em 25 °C. Anteriormente às análises, as formulações foram diluídas com
água destilada numa proporção de 1:200 (v/v) (RIBEIRO et al., 2015). As análises
foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em média e desvio padrão.
horas após sua obtenção) e 30, 60 e 90 dias após exposição a diferentes condições
de temperatura: 4°C ± 2°C (Consul, Mod. CRB36AB, São Paulo, Brasil), temperatura
ambiente (25°C ± 2°C) e 45°C ± 2°C (Odontobrás, mod. ECB1.1, São Paulo, Brasil).
O tamanho de gotícula, o potencial zeta e o valor de pH, foram utilizados como
parâmetros avaliativos da estabilidade (BRASIL, 2005).
Quadro 3 - Descrição das áreas demarcadas nos antebraços dos voluntários para
aplicação das formulações durante o estudo da eficácia hidratante.
Área Descrição
A1 Controle negativo
A2 Veículo
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Onde: EB: extrato bruto; FrP: fração obtida a partir do precipitado do processo de extração e FrE: fração
obtida a partir do sobrenadante do processo de extração.
Onde: (A) Revelação com solução de ácido sulfúrico 10% (v/v); (B) Revelação com solução de
timol/ácido sulfúrico; (C) Revelação com solução de ninhidrina 0,2%. EB: extrato bruto do subproduto
de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do processo de extração do subproduto
de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do processo de extração do subproduto
de Agave sisalana.
Ácido galacturônico
Arabinose x
Galactose x x
Glicose x x x
Manose x x
Ramnose x x
Xilose x
Onde: EB: extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana.
Onde: EB: extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana.
hídrico da pele. A eficácia das proteínas como ativos hidratantes também foi
demonstrada em extratos proteicos de trigo (Triticum vulgare) e soja (Glycine soya)
(GIANETE; MAIA-CAMPOS, 2012).
Rodrigues (2016), utilizando as mesmas metodologias empregadas no
presente estudo, caracterizou o extrato hidroetanólico liofilizado de folhas de
Kalanchoe brasiliensis. O extrato apresentou açúcares (14,61 ± 0,35%), proteínas
(0,12 ± 0,05 %) e compostos fenólicos (4,60 ± 0,07 %). Comparado ao estudo
realizado por Rodrigues (2016), pode-se observar que FrP possui constituição química
semelhante ao extrato de Kalanchoe brasiliensis no que se refere aos grupos de
metabólitos investigados, enquanto EB e FrE apresentam maior concentração de
açúcares totais além da presença de compostos fenólicos. O extrato obtido por esse
autor promoveu aumento do conteúdo hídrico da pele e ainda diminuiu a perda de
água transepidermal, promovendo um efeito barreira, comprovando o potencial
cosmético desses constituintes.
Tais resultados evidenciam o potencial do subproduto de Agave sisalana como
ingrediente cosmético. Outras espécies de Agave têm sido avaliadas como fonte de
compostos bioativos. Ahumada-Santos e colaboradores (2013) avaliaram a
composição química quanto à presença de metabólitos secundários, nas folhas de
seis diferentes espécies de Agave (A. rzedowskiana, A. impressa, A. ornithobroma, A.
schidi-gera, A. angustifólia e A. tequilana). As espécies demonstraram composição
química diferentes entre si e variadas conforme o tipo de solvente utilizado (metanol,
etanol, clorofórmio e água) no processo de extração. Baixas concentrações de
flavonoides foram obtidas nessas espécies enquanto que os triterpenos foram
observados em moderadas concentrações. Agave tequilana tem sido avaliada como
fonte de carboidratos para aplicações nutricionais e de bioenergia (ARRIZON J. et al.,
2010). Além disso, aminoácidos como serina, fenilalanina e lisina também foram
identificados na espécie de Agave salmiana (SANTOS-ZEA et al., 2016)
Outras fontes naturais de carboidratos têm sido avaliadas quanto às
concentrações de polissacarídeos. Fidelis e colaboradores (2014) avaliaram o
conteúdo de polissacarídeos de algas marinhas Gracilaria birdiae e obtiveram
concentrações inferiores a 15%. Polissacarídeos isolados de sabugos de milho
apresentaram concentrações elevadas de carboidratos (70%) (Melo-Silveira et al.,
2012), valor semelhante ao encontrado para FrE, evidenciando novamente o potencial
68
Onde:(A) avaliação da citotoxicidade do extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; (B) avaliação
da citotoxicidade da fração enriquecida em polissacarídeos obtidas do extrato bruto do subproduto de
Agave sisalana. Gráficos plotados pelo programa PHOTOX®.
Onde: (A) avaliação da fototoxicidade do extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; (B) avaliação
da fototoxicidade da fração enriquecida em polissacarídeos obtidas do extrato bruto do subproduto de
Agave sisalana. Gráficos gerados pelo programa PHOTOX®.
diferentes aplicabilidades (LIN et al., 2015; ZHANG; LIU; LIN, 2013; ZHANG; LIU; LIN,
2014; ZUGI´C et al., 2014).
100
Sequestro de radicais DPPH (%)
80
BHT
60 FrE
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
mg/mL
24 horas para cada formulação, bem como os resultados após a centrifugação estão
apresentados na Tabela 6.
Após avaliação macroscópica e centrifugação, as amostras com valor de EHL
14 mantiveram-se estáveis, ou seja, sem sinais evidentes de instabilidade.. Sendo
assim, a amostra de EHL 14 foi definida como a correspondente ao EHL requerido.
Dessa forma, foram escolhidas as proporções de tensoativos hidrofílico e lipofílico o
que possibilitou a preparação das formulações do pseudodiagrama ternário
Fa
%)
%)
70 70
se
se
s(
s(
40 40
vo
vo
Ole
60 60
ole
50 50
ti
ti
o
oa
oa
o
sa
sa
50 50
ns
ns
60 60
(
(%
%)
Te
Te
40 40
)
70 70
30 30
80 80
20 20
90 90
10 10
100 100
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(A) (B)
Fase aquosa (%) Fase aquosa (%)
Onde: (A) = sistemas obtidos sem adição da fração enriquecida em polissacarídeos (veículo); (B) =
sistemas obtidos aditivados de 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos;●= Separação de fases
(SF); ●= Sistemas líquidos transparentes (SLT);●=Sistemas líquidos opacos (SLO); ●= Sistemas
viscosos opacos (SVO); ●=Sistema líquidostranslúcidos (SLTL);●= Sistemas viscosos transparentes
(SVT).
Ethylhexyl Palmitate 16,0 12,0 8,0 4,0 16,0 12,0 8,0 4,0
Isostearyl Neopentanoate 8,0 6,0 4,0 2,0 8,0 6,0 4,0 2,0
Phenoxyetanol (and)
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Caprylic glicol
Sorbitan Monooleate 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9
Dissodium EDTA 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Distilled Water 48,8 58,8 68,8 78,8 48,3 58,3 68,3 78,3
28 NA NA
Onde: AF = formulações aditivadas com fração enriquecida em polissacarídeos; NA= não avaliada;
* = p < 0.05 comparado aos valores de tamanho de gotícula apresentados por suas correspondentes
formulações base (veículo).
Tabela 10 – Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar para as amostras obtidas com tensoativos isolados (TS).
Tamanho Potencial zeta
pH PDI
(d.nm) (mV)
Formulação
Pós estufa Pós estufa Pós estufa Pós estufa
Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0)
(t5) (t5) (t5) (t5)
15_TS 5,01± 0,05 5,17± 0,06 155,80 ± 3,99 158,60± 3,33 0,09± 0,02 0,07± 0,00 * -20,41± 2,58 -16,01± 0,43
21_TS 4,88± 0,32 5,24± 0,11 130,0 ± 1,99 134,0± 1,92 * 0,12± 0,02 0,09± 0,01 -17,33± 1,51 -14,23± 1,13*
28_TS SF SF SF SF SF SF SF SF
36_TS 5,21± 0,04 5,33± 0,06 * 84,69± 1,64 160,01± 15,81* 0,24± 0,00 0,05± 0,03 * -13,57± 1,30 -12,70± 0,75
15AF_TS 4,47± 0,09 4,48± 0,01 155,0± 1,29 158,4± 2,91 0,10± 0,01 0,09± 0,01 -17,67± 0,40 -12,27± 1,88
28AF_TS 4,42± 0,02 4,45± 0,03 113,5± 1,24 133,2± 7,30 * 0,17± 0,00 0,09± 0,01* -13,02± 1,8 -11,30± 0,44
36AF_TS 4,42± 0,02 4,44± 0,01 83,57 ± 2,35 188,07± 7,30 * 0,23± 0,00 0,05± 0,00 * -10,64± 1,73 -10,67± 0,67
Tabela 11 – Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar para as amostras obtidas com tensoativos adicionados na
fase oleosa (TFO).
Tamanho Potencial zeta
pH PDI
(d.nm) (mV)
Formulação
Pós Pós Pós Pós
Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0)
estufa (t5) estufa (t5) estufa(t5) estufa(t5)
28_TFO 5,19 ± 0,05 5,11 ± 0,15 111,74 ± 3,14 113,34 ± 6,16 0,16 ± 0,00 0,10 ± 0,01 -12,52 ± 1,38 -12,69 ± 0,77
36_TFO 5,29 ± 0,04 5,30 ± 0,09 95,97 ± 17,98 144,29 ± 6,14* 0,23 ± 0,01 0,07 ± 0,02* -13,88 ± 1,35 -12,56 ± 1,88
21AF_TFO SF SF SF SF SF SF SF SF
28AF_TFO SF SF SF SF SF SF SF SF
36AF_TFO 4,49 ± 0,03 4,46 ± 0,06 85,49 ± 1,29 169,98 ± 8,88* 0,24 ± 0,01 0,05 ± 0,02* -18,07 ± 6,32 -11,01 ± 1,89
200 200 *
150 150
100 100
50 50
0 0
0 30 60 90 0 30 60 90
(A) (B)
Tempo (dias) Tempo (dias)
Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS. (*) = p < 0.05 comparado aos valores iniciais.
25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 (24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)
Intensidade (percentual)
20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 4°C 15 4°C
10 10
5 5
(A) (B)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)
25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 ( 24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)
Intensidade (percentual)
20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 25°C 15 25°C
10 10
5 5
(C) (D)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)
25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 ( 24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)
Intensidade (percentual)
20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 45°C 15 45°C
10 10
5 5
(E) (F)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)
Onde:(A)= formulação 15_TS para a temperatura de 4°C; (B) = formulação 15AF_TS para a
temperatura de 4°C; (C) = formulação 15_TS para a temperatura de 25°C; (D) = formulação 15AF_TS
para a temperatura de 25°C; (E) = formulação 15_TS para a temperatura de 45°C; (F) = formulação
15AF_TS para a temperatura de 45°C.
88
0,30 0,30
4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C
0,25 0,25
0,20 0,20
PDI
PDI
0,15 0,15
0,10 0,10
0,05 0,05
0,00 0,00
0 30 60 90
(A) 0 30 60 90
(B)
Tempo (dias) Tempo ( dias)
Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS.
20 20
4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C
10 10
Potencial Zeta (mV)
-10 -10
-20 -20
-30 -30
0 30 60 90 0 30 60 90
(A) (B)
Tempo (dias) Tempo (dias)
Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS.
bem como das condições de uso dos equipamentos, aumentando a robustez dos
resultados obtidos.
A Figura 18 apresenta os resultados obtidos quanto ao conteúdo hídrico do
estrato córneo. Inicialmente, os voluntários apresentaram valores de hidratação
inferiores a 40 Unidades arbitrárias (UA), o que, segundo a escala preconizada
descrita no manual do equipamento, equivale a uma condição de pele seca
(COURAGE KHAZAKA, 2014).
70
A1 A2 A3 A4
abc abc abc abc abc
60
ab ab ab
ab a
a
(Unidades arbitrárias)
50 a
Hidratação do EC
40
30
20
10
0
BASAL 1 2 3 4 5
Tempo ( horas)
Onde: a = p-valor < 0,05 para ANOVA + Tukey vs controle negativo; b= p-valor < 0,05 para ANOVA +
Tukey vs veículo; c = p-valor < 0.05 para ANOVA + Tukey vs controle positivo; A1 – Controle negativo;
A2 – veículo; A3- formulação contendo 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos, oriunda do
resíduo industrial de Agave sisalana; A4 -Controle positivo (hidratante comercial).
16
Basal t1 t2 t3 t4 t5
14
12
10
g/m2/h
0
A1 A2 A3 A4
Área tratada
Onde: A1 – Controle negativo; A2 – veículo; A3- formulação contendo 0,5% da fração enriquecida em
polissacarídeos, oriunda do resíduo industrial de Agave sisalana; A4 -Controle positivo (hidratante
comercial); t1 – Após 1 hora; t2 – Após 2 horas; t3 – Após 3 horas; t4 – Após 4horas; t5 – Após 5 horas.
6 CONCLUSÕES
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
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109
ANEXO A
Título da Pesquisa: Avaliação in vivo da eficácia de formulações cosméticas aditivadas com extratos
vegetais por meio de técnicas de bioengenharia cutânea.
Pesquisador: Marcio Ferrari
Área Temática:
Versão: 1
CAAE: 12394613.5.0000.5165
Instituição Proponente:
Patrocinador Principal: Financiamento Próprio
DADOS DO PARECER
Apresentação do Projeto:
Projeto dentro dos padrões científicos, com apresentação clara e bom detalhamento. Procedimentos
com bom rigor e boa técnica.
Objetivo da Pesquisa:
Objetivo Primário:
Desenvolvimento de diferentes formas cosméticas aditivadas com extratos de plantas e avaliação in
vivo da eficácia das mesmas por meio de metodologias de bioengenharia cutânea.
Objetivo Secundário:
Coleta dos espécimes vegetais e subsequente identificação; Avaliação da segurança dos extratos
obtidos; Desenvolvimento de diferentes formas cosméticas contendo os extratos obtidos; Avaliação
clínica do sensorial das formulações; Avaliação da estabilidade preliminar e acelerada das formulações
em estudo; Avaliação in vivo do conteúdo aquoso do estrato córneo; Avaliação in vivo da perda de
água transepidermal; Avaliação in vivo da viscoelasticidade da pele; Avaliação in vivo do micro relevo
cutâneo; Avaliação in vivo do potencial fotoprotetor quanto ao Fator de ProteçãoSolar (FPS) e Fator
de Proteção UVA (FPUVA)
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Riscos:
111
Recomendações: sem
recomendações
Não há pendências
Situação do Parecer:
Aprovado
Assinador por:
Margarete Lovato
( Coordenador )
112
APÊNDICE A
Todos os itens do Termo de Consentimento Livre e esclarecido foram lidos pelo voluntário ou pelo
investigador, em voz alta, para o voluntário;
Você está sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa. Pedimos que entenda detalhadamente todas
as etapas e, se concordar, assine este termo de consentimento;
Esta pesquisa tem por objetivo observar os efeitos da aplicação de uma matéria-prima e/ou produto na
pele e comprovar o não aparecimento de irritação e/ou alergia;
Será aplicado o “teste de contato” no dorso direito e/ou esquerdo, e será removido após 48 horas. As
leituras serão realizadas 30 minutos, 24 e 48 horas após a remoção.
Não molhe o “teste de contato” durante todo o período de aplicação;
Você será previamente avaliado (a) por um médico e acompanhado (a) durante a realização da pesquisa.
Todas as dúvidas que venham a surgir durante e após o trabalho serão prontamente esclarecidas;
Sua contribuição garantirá à comunidade um produto seguro e eficaz;
Conforme legislação em vigor, você não receberá nenhuma quantia em dinheiro;
Você poderá se retirar da pesquisa a qualquer instante se assim desejar, ou se necessário, a critério do
pesquisador;
Sua contribuição voluntária será de grande importância para o nosso trabalho, portanto pedimos que
compareça nos horários e datas indicados durante o decorrer da pesquisa;
Se houver qualquer modificação nos seus hábitos, solicitamos que nos comunique para melhor
interpretação dos resultados;
Não usar qualquer tipo de produto (desodorante ou antiperspirante, talco, óleo para banho, cremes,
loções, perfumes, colônias e medicamentos tópicos) nas áreas próximas à do teste. Caso utilize algum
destes produtos ou faça uso de medicamento sistêmico, avise;
No caso de coceira intensa ou outros sinais fortes de irritação, comunique imediatamente comparecendo
ao local de aplicação do teste ou pelo telefone (084) 3342-9838 (horário comercial) ou (084) 99406-6479
24 horas;
Garantimos que reação adversa provocada pela amostra /produto em teste será acompanhada pelo
médico e/ou especialista responsável pelo projeto e que, se necessário, será fornecida tratamento
adequado, assim como qualquer nova informação que seja relevante você será notificado;
113
Todas as matérias primas utilizadas no produto são aprovadas para uso tópico e não tóxicas. Entretanto,
como qualquer produto, poderá causar reações inesperadas como “vermelhidão”, “inchaço”, coceira e
“ardor” nos locais de aplicação do produto;
Todas as informações obtidas sobre os voluntários são mantidas em sigilo;
Em caso de dúvida ou problema, você poderá entrar em contato com a equipe pelo telefone (084) 3342-
9838 com Stella Maria Barreto.
Uma via deste termo permanecerá no arquivo do Laboratório de Segurança e eficácia de Produtos
Cosméticos e outra de posse do voluntário.
1 Eu,
2
Data de nascimento RG
Casado
Solteiro(a) (a) Separado (a) Judic. Ou Desquitado (a)
3
Divorciado (a) Viúvo (a) União estável
Estado civil
4
Rua, Avenida ou Travessa (por extenso) Número
5
Complemento
6
Bairro Cidade
7
Telefone Endereço eletrônico
Concordo em participar do estudo descrito e declaro ter sido esclarecido sobre todos os itens acima.
114
8 RG
Assintura da testemunha
Data
Data Data
115
APÊNDICE B
PROJE TO DE PESQUISA
As informações estão sendo fornecidas para participação voluntária neste estudo, que
objetiva determinar a hidratação da pele após aplicação de formulação (nanoemulsão) contendo
fração enriquecida em polissacarídeos, oriunda do subproduto do beneficiamento de Agave
sisalana, bem como seu veículo correspondente e controle positivo (hidratante disponível no
mercado).
Caso o (a) senhor (a) tenha livre interesse em participar do estudo, não poderá utilizar
qualquer tipo de produto cosmético no antebraço 24 horas antes do experimento. Nos dias dos
testes de hidratação, terá que permanecer em uma sala climatizada (20 ± 2ºC e 55 ± 5%
Umidade Relativa) por um período inicial de 30 minutos, antes da aplicação das formulações.
Para os experimentos de hidratação terá que permanecer na sala durante seis horas para
avaliações em intervalos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a aplicação das formulações. Será aplicada
uma pequena quantidade do produto atrás da orelha ou na porção anterior do cotovelo para
verificar se o Sr. (a) apresenta sensibilidade a algum componente da formulação.
Não há desconforto algum para o Sr (a), pois as medidas serão realizadas na superfície
da pele sem causar nenhuma dor.
Em qualquer fase da pesquisa, o (a) senhor (a) terá acesso aos profissionais responsáveis
para esclarecimento e eventuais dúvidas (Prof. Dr. Márcio Ferrari, Pesquisador principal –
33249812 ou 999246707 e/ou Farmacêutica Stella Maria Andrade Gomes Barreto – 99406-
6479).
É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento do estudo,
sem qualquer prejuízo.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros voluntários do estudo,
não sendo divulgada a identificação de nenhum voluntário.
O (a) senhor (a) terá o direito de ser mantido (a) atualizado (a) sobre os resultados das
pesquisas.
Não haverá despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo. Não
haverá compensação financeira relacionada à sua participação.
Em caso de algum dano pessoal, diretamente causado pelo produto, o (a) senhor (a) terá
direito a tratamento médico na Instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
116
Os dados e resultados obtidos serão utilizados apenas para esta pesquisa, podendo os
mesmos ser divulgados, mantendo a identidade, em meios científicos.
Declaração do Participante
______________________________________________Data:_______________
Assinatura do participante/representante legal
______________________________________________ Data:_______________
Assinatura da testemunha
_______________________________________________Data:________________
Assinatura do responsável