Farmaka

Suplemen Volume 15 Nomor 2 119

DETEKSI BAKTERI Klebsiella pneumonia

Nimas Tika Inas Tarina, Sri Agung Fitri Kusuma
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran
Jl. Raya Bandung-Sumedang KM. 21, Jatinangor 45363
Telepon (022)7796200, Faksimile (022)7796200
E-mail : fmunpad@telkom.net

Abstrak

Klebsiella pneumoniae merupakan salah satu jenis bakteri patogen oportunis gram negatif yang
dapat menyebabkan infeksi pernapasan, infeksi saluran kemih, infeksi nosokomial, bahkan
kematian hingga 10% pada manusia. Bakteri jenis ini mudah ditemukan di cairan tubuh manusia,
antara lain darah, urin, dan dahak. Telah banyak metode yang telah digunakan dan dibuktikan
dalam penelitian untuk mengidentifikasi keberadaan bakteri ini, namun di antara metode tersebut
terdapat salah satu metode yang lebih baik dibandingkan metode lainnya berdasarkan faktor
spesifisitas, sensitifitas, waktu pengujian, hasil positif palsu, serta keakuratan hasil yang
diperoleh. Dari berbagai metode identifikasi, seperti SPC (Standard Plate Count), western blot,
Epsilometer test, dan PCR, maka disimpulkan bahwa metode PCR real time merupakan metode
yang paling baik digunakan untuk identifikasi bakteri Klebsiella pneumoniae.
Kata kunci: Klebsiella penumoniae, identifikasi, PCR real time

Abstract

Klebsiella pneumoniae is one kind of the negative-gram opportunic pathogenic bacteria which is
cause respiratory infection, urinary tract infection, nosochomial infection, and death up to 10%
in human. This bacteria easily found in human biologic fluid, such as blood, urine, and sputum.
There have been many methods used and proved experimentally to identify this bacteria, but
there is a method that better to used than the other methods based on factors of specificity,
sensitivity, time needed, false positive result, also accuracity. From those methods, such as SPC,
western blot, Epsilometer test, and PCR, inferred that PCR real time method is the best method
used to identify Klebsiella pneumoniae.
Keywords: Klebsiella penumoniae, identification, PCR real time

PENDAHULUAN Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri

Klebsiella pneumoniae merupakan
bakteri gram negatif (-), berbentuk batang
pendek, memiliki ukuran 0,5-0,5 x 1,2 µ.
Bakteri ini memiliki kapsul, tetapi tidak
membentuk spora. Klebsiella pneumoniae
tidak mampu bergerak karena tidak memiliki
flagel tetapi mampu memfermentasikan
karbohidrat membentuk asam dan gas.
Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen,
fakultatif anaerob. Klebsiella pneumoniae
dapat memfermentasikan laktosa. Spesies
Klebsiella pneumoniae menunjukkan
pertumbuhan mucoid, kapsul polisakarida
yang besar dan tidak motil1.
Pneumonia menjadi penyebab
kematian nomor 6 di Indonesia, nomor 9 di
Brunei, nomor 7 di Malaysia, nomor 3 di
Singapura, nomor 6 di Thailand, dan nomor
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 120

3 di Vietnam. WHO menyebutkan bahwa menyebabkan resistensi terhadap antibiotik

penyebab kematian tertinggi akibat infeksi di penisilin, sefalosporin, dan aztreonam3.
dunia adalah infeksi saluran napas akut. Kapsul polisakarida yang mengelilingi
Secara historis, Klebsiella pneumoniae bakteri ini melindungi terhadap aksi
digambarkan sebagai agen Friedlander’s fagositosis dan bakterisidal serum dan dapat
pneumoniae, yaitu radang paru-paru berat dianggap sebagai faktor virulensi terpenting
dari pneumonia lobar dengan angka dari Klebsiella pneumoniae3.
kematian yang tinggi. Klebsiella Klebsiella pneumoniae dapat
pneumoniae masih menjadi salah satu menyebabkan pneumonia, yang menyerang
penyebab utama pneumonia komunitas di jaringan paru-paru (alveoli). Klebsiella
beberapa negara2. pneumoniae yang menyebabkan penyakit
Beberapa jenis Klebsiella paru-paru memberikan penampakan berupa
pneumoniae dapat diobati dengan antibiotik, pembengkakan paru-paru sehingga lobus kiri
khususnya antibiotik yang mengandung dan kanan paru-paru menjadi tidak sama,
cincin beta-laktam1,2. Antibiotik tersebut, di demam (panas-dingin), batuk-batuk
antaranya adalah meropenem, (bronkhitis), penebalan dinding mukosa dan
kloramfenikol, siprofloksasin, dan ampisilin. dahak berdarah. Selain itu, bakteri ini juga
Dari hasil penelitian diketahui bahwa bakteri dapat menyebabkan infeksi saluran kemih,
ini memiliki sensitivitas 98,4% terhadap dan infeksi nosokomial3. Sejauh ini, cara
meropenem, 98,2% terhadap imipenem, untuk mencegah penularan penyakit dengan
92,5% terhadap kloramfenikol, 80% cara menjaga sanitasi dan pola hidup yang
terhadap siprofloksasin, dan 2% terhadap baik, di samping mengonsumsi antibiotik.
ampisilin. Namun, saat ini bakteri ini telah Klebsiella pneumoniae bisa
resisten terhadap beberapa antibiotik3. didapatkan dari sampel darah, urin, cairan
Klebsiella pneumoniae dapat pleura, dan luka untuk pewarnaan Gram.
menghasilkan enzim betalaktamase sehingga Berbagai metode yang telah ada dilakukan
dapat menghidrolisis cincin betalaktam yang untuk mendeteksi keberadaan bakteri jenis
terdapat pada antibiotik betalaktam dan ini, di antaranya adalah pewarnaan gram,
menyebabkan resistensi terhadap antibiotik difusi cakram, PCR, SPC, western blot, kit
tersebut. Selain itu, Klebsiella pneumoniae diagnostic, dan Epsilometer test. Namun,
juga memiliki enzim urease dan enzim sitrat dari metode konvensional dan instrumental
permiase serta enzim ESBL (Extended tersebut perlu dipilih satu metode yang
Spektrum Beta Lactamase) sehingga paling baik dan cocok untuk mendeteksi
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 121

Klebsiella pneumoniae ini agar dapat pertumbuhan dan penyebaran bakteri ini pun
memudahkan dalam proses identifikasi dapat dihambat agar menurunkan prevalensi
Klebsiella pneumoniae sehingga penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini.
METODE dengan cara memotong horizontal gel
Pertama, dengan metode protein yang dimaksud. Lalu, setiap
konvensional menggunakan kultur bakteri. potongan dipotong kembali vertikal dan
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan dimasukkan ke dalam membran dialisis
sampel mengandung Klebsiella pneumoniae berisi buffer elektroforesis. Hasil elusi
kemudian dikultur pada media biakan agar didialisis selama 48 jam dengan cairan H2O
selektif bakteri gram negatif (McConkey pada 24 jam pertama dan PBS pH 7,4 pada
Agar dan EMB Agar) dengan tujuan seleksi 24 jam kedua masing-masing pada suhu 4oC.
bakteri gram negatif dan positif dapat Hasil elektroforesis diamati dan
teridentifikasi pertumbuhannya melalui dibandingkan dengan standard sebagai
seleksi media agar. Kemudian, diinkubasi kontrol positif1,9.
pada suhu 25-30oC yang merupakan suhu Metode selanjutnya adalah
optimal bagi pertumbuhan bakteri gram menggunakan kit diagnostic bernama
negatif selama 1-2 hari, kemudian koloni Primerdesign genesig Kit for K.
yang timbul diamati dan dianalisis pneumoniae. Kit ini ditujukan untuk
menggunakan SPC (Standard Plate Count). identifikasi seluruh jenis isolat Klebsiella
Hasil positif menunjukkan adanya koloni pneumoniae, termasuk jenis baru Klebsiella
bakteri berwarna merah muda2, 16. yang memiliki strain mirip dengan yang
Selanjutnya, metode imunositokimia, sudah ada. Konten dari kit ini adalah primer
yaitu dengan tahapan awal mengisolasi spesifik (150 reaksi coklat), template kontrol
protein dari outer membrane protein positif (merah), RNAse/DNAse bebas air
Klebsiella pneumoniae dengan cara (putih), dan template buffer (kuning).
penambahan PBS dan NOG 0,5%, kemudian Metode ini menggunakan prinsip PCR real
disentrifugasi 12000 rpm dan diambil time, yaitu dengan menggunakan primer
supernatannya. Selanjutnya, dilakukan forward dan reverse yang dihibridisasi
metode SDS-PAGE untuk menentukan terhadap bakteri, serta campuran
spesifitas bakteri ini dengan mengandung zat fluorogenik yang
membandingkan hasilnya dengan bakteri mengandung DNA probe berlabelkan 5’-dye
lain. Selanjutnya, dilakukan elektroelusi dan 3’-quencher. Selama proses PCR, probe
untuk mendapatkan protein sampel murni dibelah dan dye-quencher dipisahkan.
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 122

Hasilnya berupa fluororesensi yang dapat Metode selanjutnya yang terbukti

dideteksi pada platform PCR. Hasil positif dapat dilakukan untuk identifikasi KPC,
ditunjukkan dengan perbandingan dengan yaitu menggunakan senyawa berbasis asam
standard atau primer dan menunjukkan hasil boronat (BA). BA pada awalnya
yang serupa pada panjang gelombang diperkenalkan pada tahun 1980an sebagai
tertentu4. inhibitor reversibel dari β-laktamase kelas C
Epsilometer test dilakukan dengan dan telah digunakan dalam tes cakram
uji chi square dan dilakukan perbandingan kombinasi untuk identifikasi isolat penghasil
dengan metode difusi cakram2,16. AmpC11-13. Baru-baru ini, beberapa disc test
Selain itu, terdapat pula metode uji (tes cakram) yang menggabungkan senyawa
Hodge5 dan uji menggunakan senyawa asam BA, asam fenilolidat, dan 3-aminophenyl
boronat11 untuk mendeteksi KPCs ini. boronic acid (APB), terbukti sangat sensitif
HASIL dana spesifik untuk mendeteksi produksi
Metode yang dapat digunakan untuk KPC.
identifikasi Klebsiella pneumonia Tsakris dkk14 menguji cakram berisi
carbapenem (KPCs) adalah metode genotip 400 µg asam fenilolidon sebagai
uji Hodge yang dimodifikasi5. Uji inaktivasi penghambat dan beberapa β-laktam sebagai
carbapenem ini memiliki sensitivitas dan substrat antibiotik terhadap 57 isolat
spesifitas yang dapat diterima untuk penghasil KPC. Mereka menemukan
produksi carbapenemase5. Namun, metode diameter zona inhbisi yang mengalami
ini bukan merupakan uji fenotipik yang ideal peningkatan secara signifikan (≥5 mm) bila
untuk KPC karena interpretasi data yang digunakan dalam kombinasi dengan
cukup sulit terhadap beberapa isolat dan sefepime dan semua karbapenem (imipenem,
terdapat hasil positif palsu dari beberapa meropenem, dan ertapenem) dibandingkan
penelitian sebelumnya yang telah dengan zona yang dihasilkan oleh cakram β-
dilakukan5,6,7. Hasil positif palsu tampaknya laktam saja14,15.
paling umum terjadi pada isolat yang Meropenem, imipenem, dan
menghasilkan spektrum BX, spektrum CTX- sefepime adalah substrat antibiotik yang
M (ESBLs), dan hiperproduksi AmpC β- paling sensitif dan spesifik (100% untuk
laktamase6,8-10. Maka dari itu, pada area semua), sedangkan meropenem
isolat penghasil ESBL lazim, metode menunjukkan perbedaan terbesar dalam zona
alternatif mungkin terbukti dapat lebih inhibisi.
bermanfaat.
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 123

Karena tingginya prevalensi strain

penghasil KPC yang juga membawa gen
ESBL, kelompok peneliti yang sama
meneliti BA-based double-disc synergy tests
(DDSTs) untuk mendeteksi gen ESBL pada
produsen KPC16. Mereka menemukan bahwa Spesifisitas uji PCR real-time untuk
CLSI ESBL yang dimodifikasi mengandung K. pneumoniae dengan primer yang spesifik
BA dan kalvulanat sebagai inhibitor untuk gen 16S rRNA diselidiki dengan
dikonfirmasi paling akurat (100% spesifik menguji 1 ng DNA yang dimurnikan dari
dan sensitif) untuk 118 strain yang masing-masing dari 65 organisme kontrol
mengandung ESBL. negatif Amplifikasi Pseudomonas
Metode lain yang dapat digunakan aeruginosa, Streptococcus spp.,
untuk identifikasi bakteri Klebsiella Staphylococcus aureus, Enterococcus
pneumonia, yaitu menggunakan instrumen faecalis, Haemophilus influenzae, dan
PCR real time assay. Sensitivitas metode ini Neisseria meningitidis tetap negatif saat diuji
dioptimalkan untuk 10 fg DNA KPC yang pada semua konsentrasi (10 ng sampai 1 fg),
dimurnikan. Elektroforesis gel agarosa dari sedangkan nilai CT untuk Klebsiella
amplikon menunjukkan bahwa intensitas oxytoca, Escherichia coli, dan Enterococcus
pita berkorelasi baik dengan konsentrasi faecium Lebih besar dari 29 pada
17
amplitam yang dihitung . konsentrasi 1 ng / μl. Sebagai perbandingan,
nilai CT ≤13 dicapai untuk K. pneumoniae
pada konsentrasi yang sama dengan 1 ng /
μl. Pada elektroforesis gel agarose dari
campuran PCR yang berasal dari organisme
Optimasi sensitivitas PCR real-time
kontrol negatif, tidak ada amplikon yang
yang dilakukan dengan menggunakan strain pernah diamati. Urutan target ditunjukkan
tipe K. pneumoniae (ATCC 13883)
sangat spesifik untuk K. pneumoniae, karena
menghasilkan kurva regresi linier pada 107 gagal mendeteksi bakteri lain yang diketahui
sampai 1 genomik setara (10 ng sampai 1 fg
menyebabkan bakteremia18.
DNA) dengan tingkat kesalahan <1% dan
Sebuah koefisien korelasi pada -118.
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 124

Pengujian berbasis PCR terhadap

259 sampel darah secara real-time PCR
menunjukkan sensitivitas 100% (146 dari
146) dan spesifisitas 100% (113 dari 113).
Tidak ada kontaminasi yang diamati
sewaktu-waktu selama penelitian
Untuk uji sensitifitasnya, batas
berlangsung. Tidak ada sinyal positif palsu
deteksi kekeruhan real-time dan deteksi
yang terdeteksi saat kontrol negatif (yang
visual adalah 0,1115 pg / μl, yang 100 kali
terdiri dari air steril, primer, dan probe)
lipat lebih sensitif daripada pengujian PCR
dalam kapiler reaksi18. Berbeda dengan
tradisional20.
metode PCR konvensional, dimana metode
Namun, kelemahan metode LAMP
tersebut kurang sensitif terhadap kontaminan
adalah bahwa ia memiliki tingkat hasil
karena penanganan postamplifikasi
positif positif yang relatif tinggi. Hal ini
dieliminasi19. Pendekatan berbasis PCR real-
karena efisiensi amplifikasi uji LAMP
time untuk identifikasi K. Pneumoniae
sangat tinggi, dan 20 μg DNA spesifik dapat
menghasilkan penghematan waktu yang
disintesis dalam campuran reaksi 25 μl
signifikan dibandingkan dengan identifikasi
dalam waktu 60 menit20.
biokimia K. pneumoniae tradisional dari
Metode epsilometer dan difusi
BACTEC 9240 kultur darah positif.
cakram memiliki perbandingan hasil
Uji lainnya yaitu menggunakan
spesifitas yang jauh berbeda, yaitu E-test
metode LAMP assay (loop-mediated
memiliki hasil 66,67%, sedangkan difusi
isothermal amplification). K. pneumoniae
cakram memiliki hasil 100%. Maka dari itu,
ATCC BAA-2146 digunakan sebagai
dapat dikatakan bahwa metode epsilometer
kontrol positif dan air suling ganda sebagai
kurang efektif digunakan untuk mendeteksi
kontrol negatif saat mengevaluasi
K. pneumoniae.
spesifisitas LAMP untuk mendeteksi K.
SIMPULAN
pneumoniae. Semua strain lainnya, termasuk
Berdasarkan beberapa metode
kontrol kosong, diuji negatif, menunjukkan
identifikasi bakteri Klebsiella pneumoniae
bahwa uji LAMP spesifik untuk K.
yang telah ada, maka disimpulkan bahwa
Pneumoniae20.
metode menggunakan instrumen PCR real
time merupakan metode yang paling baik
dimana memiliki beberapa kelebihan
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 125

4
dibandingkan dengan metode lainnya, di Genesig. 2016. Quantification of Klebsiella
pneumoniae genomes. Genesig
antaranya adalah membutuhkan waktu
Standard Kit Handbook HB 10.04.08
5
pengujian yang singkat, sensitivitas dan Carvalhaes, C.G., Picao, R.C. & Nicoletti,
A.G., 2010. Cloverleaf test (modified
spesifisitas yang tinggi untuk bakteri KPC,
Hodge test) for detecting
diperoleh hasil berupa data spesifik berupa carbapenemase production in
Klebsiella pneumoniae: be aware of
grafik sehingga dapat dikatakan lebih akurat,
false positive results. J Antimicrob
serta tidak didapatkan hasil positif palsu. Chem , 65, pp.249-51.
6
Coudron, P.E., 2005. Inhibitor-based
SARAN
methods for detection of plasmid-
Metode PCR real time mediated AmpC β-lactamases in
Klebsiella spp., Escherichia coli, and
memungkinkan untuk mendeteksi lebih
Proteus mirabilis. J Clin Microbiol,
banyak patogen dengan menggunakan 43, pp.4163-7.
7
Dong, D. et al., 2015. Survey and rapid
instrumen PCR real time multiplex dimana
detection of Klebsiella pneumoniae
metode ini dapat menjadi teknologi yang in clinical samples targeting the rcsA
gene in Beijing, China. Front
sesuai untuk diterapkan di laboratorium
Microbiol, 6, p.519.
8
diagnostik rutin dan laboratorium yang Kurupati, P., Chow, C., Kumarasinghe, G.
& Poh, C.L., 2004. Rapid Detection
menghadapi tingkat isolasi yang tinggi untuk
of Klebsiella pneumoniae from
Klebsiella pneumonia atau pada situasi Blood Culture Bottles by Real-Time
PCR. J. Clin. Microbial., 42(3),
wabah.
pp.1337-40.
9
DAFTAR PUSTAKA Lee, K., Chong, Y. & Shin, H.B., 2001.
Modified Hodge and EDTA-disk
1
Anderson, K.F., Lonsway, D.R. & Rasheed, synergy tests to screen metallo-β-
J.K., 2007. Evaluation of methods to lactamase-producing strains of
identify the Klebsiella pneumoniae Pseudomonas and Acinetobacter
carbapenemase in species. Clin Microbiol Infect, 7,
Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol, pp.88-91.
10
45, pp.2723-5. Logan, J.M.J., Edwards, K.J., Saunders,
2
Anderson, K.F., Patel, J.B. & Wong, B., N.A. & Stanley, J., 2001. Rapid
2009. Characterization of identification of Campylobacter spp.
Enterobacteriaceae with a false- by melting peak analysis of biprobes
positive modified Hodge test, in real-time PCR. J. Clin. Microbiol.,
Abstracts of the Forty-ninth 39, pp.2227-32.
11
Interscience Conference on Moland, E.S., Hanson, N.D. & Overman,
Antimicrobial Agents and S.B., 2009. Concerns about KPC
Chemotherapy. American Society for screening and confirmatory tests,
Microbiology, pp.719-41. Abstracts of the Forty-ninth
3
Beesley, T., Gascoyne, N. & Knott- Interscience Conference on
Hunziker, V., 1983. The inhibition of Antimicrobial Agents and
class C β-lactamases by boronic Chemotherapy. American Society for
acids. Biochem J, 209, pp.229-33. Microbiology, pp.729-40.
Farmaka
Suplemen Volume 15 Nomor 2 126

12
Nordmann, P., Cuzon, G. & Naas, T., possessing Enterobacteriaceae. J Clin
2009. The real threat of Klebsiella Microbiol, 47, pp.3420-6.
20
pneumoniae carbapenemase- Yagi, T., Wachino, J. & Kurokawa, H.,
producing bacteria. Lancet Infect 2005. Practical methods using
Dis, 9, pp.228-36. boronic acid compounds for
13
Nouvellon, M. et al., 1994. Clonal identification of class C β-lactamase-
outbreaks of extended-spectrum β- producing Klebsiella pneumoniae
lactamase-producing strains of and Escherichia coli. J Clin
Klebsiella pneumoniae demonstrated Microbiol, 43, pp.2551-8.
by antibiotic susceptibility testing, β-
lactamase typing, and multilocus
enzyme electrophoresis. J. Clin.
Microbial., 32, pp.2625-27.
14
Pasteran, F., Mendez, T. & Guerriero, L.,
2009. Sensitive screening tests for
suspected class A carbapenemase
production in species of
Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol,
47, pp.1631-9.
15
Pedersen, G., Schonheyder & Sorensen,
1997. Antibiotic therapy and
outcome of monomicrobial gram-
negative bacteremia: a 3-year
population-based study. Scand. J.
Infect. Dis., 29, pp.601-06.
16
Podschun & Ullmann, 1998. Klebsiella
spp. As Nosocomial Pathogens:
Epidemiology, Taxonomy, Typing
methods, and Pathogenicity Factors.
Clinical Microbiology Reviews, 10,
pp.589-603.
17
Tsakris, A., Kristo, I. & Poulou, A., 2008.
First occurrence of KPC-2-
possessing Klebsiella pneumoniae in
a Greek hospital and
recommendation for detection with
boronic acid disc test. J Antimicrob
Chemother, 62, pp.1257-60.
18
Tsakris, A., Kristo, I. & Poulou, A., 2009.
Evaluation of boronic acid disk tests
for differentiating KPC-possessing
Klebsiella pneumoniae isolates in the
clinical laboratory. J Clin Microbiol,
47, pp.362-7.
19
Tsakris, A., Poulou, A. & Themeli-
Digalaki, K., 2009. Use of boronic
acid disk tests to detect extended-
spectrum β-lactamases in clinical
isolates of KPC carbapenemase-