Propuesta biotecnológica

a) Idea o propuesta original, novedosa.

Producción de pectinasas por Erwinia a partir del mesocarpo de maracuyá
(Passiflora edulis f. Flavicarpa Deg).

Pregunta de investigación que se formularon

Esta no debe responder si o no.
(b) Planteamiento del problema a resolver y justificación de la idea
En los últimos años el maracuyá ha registrado una mayor aceptación en los
mercados internacionales, ya que éste es altamente empleado tanto en la
preparación de cocteles y bebidas exóticas como en la preparación de bebidas
medicinales (Marín, 2015). La demanda mundial del Maracuyá se basa en la
utilización del jugo concentrado como ingrediente, principalmente por su particular
sabor fuerte, el mismo que ayuda a disminuir el aroma de algunas vitaminas de
fuerte sabor Casa-Luker (2010). En Colombia, se produjo en 2015
aproximadamente 51.922 t.año-1 (DANE, 2015) de maracuyá y se utiliza
principalmente en la producción de jugos, pulpas y concentrados (Pantoja, Hurtado
y Martínez, 2016). Cíclicamente se presenta baja oferta de fruta para la industria por
reducidas áreas de siembra y competencia por precios con el mercado Fresco
(Casa-Luker, 2010).
Se estima que los residuos del procesamiento de maracuyá alcanzan entre un 61-
86% de la cantidad de frutas procesadas (Malacrida & Neuza, 2012). Según el
DANE (2012) de la transformación industrial de maracuyá resultan 37.008 toneladas
de residuos anuales, siendo el 28% equivalente a la pulpa más las semillas y el 62%
restante, a las cáscaras, es decir, 22944.96 toneladas de cáscara se desperdician
anualmente en Colombia. Pantoja, Hurtado y Martínez (2016), exponen que estos
residuos pueden ser aprovechados para la obtención de productos de interés en la
industria generando un valor agregado y mitigando la contaminación ambiental, que
estos pueden generar cuando no son manejados adecuadamente. Entre los
productos considerados de interés están pectinas, aromas naturales, aceites
vegetales, entre otros compuestos (Leao, Sampaio, Pagani y Da Silva, 2014).
Marín (2015) afirma que la pectina es un componente utilizado comúnmente como
agente gelificante y estabilizador de propiedades de alimentos, y éste en su mayoría
es importado por las empresas nacionales que lo necesitan, además de que suele
ser de origen sintético. Menciona además que tanto de la cascara como del
mesocarpio del maracuyá se puede extraer pectina, que tiene como beneficio por
un lado que es de origen natural y segundo que se podría generar un
aprovechamiento de estas partes del maracuyá que no es usada para otras
aplicaciones, dándole un valor agregado y un incremento en ganancia a los
cultivadores de esta fruta. Según Casa-Luker (2010), el 62% del fruto de maracuyá
es corteza. Algunos autores aseguran que el rendimiento del proceso de extracción
de pectina en maracuyá ha mostrado ser de entre 20 al 25% del peso de la cascara
en seco (Marín, 2015).

Según la gobernación de Antioquia (2014), Urabá cuenta con 96.318,28 hectáreas

aptas para el cultivo de maracuyá, que representa el 69% del total de área del
departamento apta para este cultivo. Si bien, la producción de maracuyá en la zona
es destinada a la venta de fruta en fresco, el desarrollo de nuevas alternativas de
aprovechamiento de la fruta y de sus residuos haría más atractivo y rentable la
explotación de esta passifloraceae en la región de Urabá por la diversificación de
mercados que ello representaría.
(c) Metodología necesaria para el desarrollo de la idea biotecnológica (recuerden
que es una metodologia "ideal" quiero que utilicen técnicas moleculares si se
pueden y que traten de crear protocolos si se puede),
Selección de materia prima:
Se aprovecha el material que se encuentre con <50% de sobremaduración.
Proceso de extracción
- Lavado de Materia Prima
Se hace el corte de la parte sobremadurada de los frutos que así lo requieran y se
extrae mecánicamente el exocarpo del fruto (cáscara) dejando expuesto el
mesocarpo, posteriormente se hace un lavado con agua de acueducto inicialmente
y por último con agua destilada por inmersiones de 1 minuto.
- Trituración
Los mesocarpos se cortaron en pequeños pedazos para aumentar la superficie de
contacto de la muestra.
- Inactivación enzimática
El material triturado se agregó al agua hirviendo (100°C) por 15 minutos para
inactivar las enzimas Pectinesterasa y Poligalacturonesterasa que degradan la
pectina (Domínguez et al, 2011).
- Extracción en medio ácido
Se pesan 100 gramos materia prima inactivada y se agregan en recipientes con 600
mL de agua destilada, se establece el pH agregando Ácido Clorhídrico [5 N] y
controlando el pH utilizando un pH-metro digital hasta llegar al valor de interés (1.5
– 3.0) se coloca en baño maría a temperaturas prestablecidas (80 - 100 °C)
controladas con un termómetro, durante el tiempo previamente establecido (45 - 75
minutos).
- Filtrado y concentrado
Después del proceso de extracción, se deja enfriar el recipiente a temperatura
ambiente, se filtra separando las cáscaras del líquido y se somete a evaporación de
solvente para concentrar la solución hasta aproximadamente 1/5 del volumen inicial.
- Precipitación
Se añadió alcohol etílico al 96% a la solución concentrada, formando un gel
precipitado, se filtró el gel mecánicamente y se purificó la pectina repitiendo el
proceso mencionado 4 veces.
- Secado
La pectina obtenida y purificada se somete a secado a 60°C en estufa de
desecación hasta obtener un peso constante, posteriormente se pulveriza para
guardarlo en una zona libre de humedad, almacenándose de esta manera la Pectina
de Maracuyá Pulverizada.
Obtención y aislamiento de Erwinia para su identificación
Se recolectan muestras de piña (hojas y fruto) con presencia de pudrición blanda,
causada probablemente por Erwinia (olor característico). Una vez colectadas, estas
muestras, se hacen cortes de las zonas afectadas y éstas se someten a licuado con
agua estéril.
Identifación Erwinia
Se extraen muestras del anterior licuado y se depositan cloruro de sodio (5g),
peptona caseína (10g), agua destilada (1L) y agar (20g), enriquecido con Pectina
de Maracuyá Pulverizada. Luego de 72 horas y a una temperatura de 28°C, se
extraen muestras de 100 mg para realizar una descripción física, pruebas de
identificación de Erwinia y determinación de la pureza de la bacteria.
Pruebas físicas

Tinción de Gram: Se realiza cuando los aislamientos tengan entre 24 y 48 h de

desarrollo. Se extiende en un portaobjetos y se seca (dejándola secar a temperatura
ambiente o con un mechero, con cuidado de no quemar las bacterias). El siguiente
paso es fijar la muestra en el portaobjetos mediante la aplicación de metanol durante
un minuto. Posteriormente se aplica el tinte de violeta de genciana (cristal violeta)
al portaobjetos y se deja reposar un minuto. Este colorante puede atravesar
cualquier tipo de pared bacteriana por lo que tiñe tanto, bacterias gram positivas
como gram negativas.
Luego se enjuaga la muestra con agua y se aplica lugol, de forma que cubra toda la
muestra y se espera durante un minuto. El lugol lo que hace es fijar el colorante
violeta de genciana aún más a la muestra. Luego, el portaobjetos debe lavarse con
una mezcla de alcohol y acetona durante 30 segundos, en este momento, es cuando
finaliza realmente la tinción de Gram, ya que esta mezcla de alcohol y acetona lo
que hace es disolver los complejos de lugol y violeta de genciana. Las bacterias
deben mostrar una coloración rojiza, debido a que la literatura reporta que Erwinia
es una bacteria gram negativa, las cuales corresponde a esa tinción.
Prueba de la Catalasa: se procede a colocar una gota de agua oxigenada sobre un
portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur, luego se suspende el
microorganismo y el desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica
que la prueba es positiva, es decir que se comprueba que el microorganismo es una
bacteria debido a que la catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las
bacterias aerobias.
Prueba de oxidasa: Se procede a colocar sobre papel filtro una porción de inoculo
bacteriano obtenidos desde las placas de agar pectona; sobre el papel filtro se
aplica reactivo de oxidasa y se espera un par de segundos para ver el resultado; en
el caso de Erwinia este debe ser oxidasa (-), es decir, no hay cambio de color. La
respuesta positiva en esta prueba implica la aparición de color rosado y se descarta
la presencia de Erwinia (PEROMNELON Y VAN DER WOLF, 1998).
Aislamiento y extracción de colonias
Luego de la verificación, se hacen extracciones de las distintas colonias que se
formen en el medio de cultivo, y se depositan en cajas de Petri individuales con el
mismo medio de cultivo enriquecido con pectina de maracuyá. Se dejan en este
medio durante una semana con adición constante de pectina de maracuyá. Luego
de una semana se realizan las mediciones de los halos, y se seleccionan las
colonias con los halos de mayor diámetro, esto como prueba de mayor asimilación
de esta fuente de pectina.
Multiplicación de Erwinia (productor de peptinasas)
Estas colonias puras de mayor crecimiento se continúan multiplicando con el mismo
medio de cultivo durante una semana para asegurar su multiplicación.
Aislamiento de Erwinia para producir pectinasas
El aislamiento Erwinia (productor de pectinasas) se lleva a cabo en medio sólido
Agar nutritivo enriquecido con sales (ANES). Para ello se realiza una suspensión de
25g de la mezcla (Erwinia incubada + licuado mesocarpo de maracuyá) en 250 mL
de agua destilada, se agita y se realizan diluciones seriadas hasta 10 y se les
somete a un tratamiento térmico de 85°C durante 10 minutos en baño de agua.
Luego, se realiza la siembra en superficie (0,1mL de la dilución tratada), se incuba
a 28°C hasta 72 horas. (preguntar profe) temperatura de crecimiento erwinia
Medio para la producción de pectinasas
El medio conteniendo pectina como única fuente de carbono está caracterizado por
(g/1000 mL de agua destilada):
2 pectina de maracuyá (extraído del secado);
1 extracto de levadura
Se autoclavó olla gigante donde se esteriliza por vapor a presión, en este caso por
15 minutos a 15 lb/15 min.; se sirvió en placas estériles y se dejó solidificar. Se
realizó control de esterilidad durante 24 horas.
Erwinia (productores de Pectinasas) (Selección primaria de pectinasas)
En el medio de cultivo anteriormente mencionado se sembró por puntura los cultivos
de Erwinia de las colonias seleccionadas. Se incuban a 30°C por 24, 48 - 72h. Luego
se añaden alícuotas de una solución Lugol y se observó la presencia de halos de
hidrólisis de pectina. Se seleccionaron aquellos cultivos de Erwinia que
presentaron mayor halo de hidrólisis de la pectina, es decir los cultivos que
presentaron mayor relación diámetro de halo/diámetro de colonia.
Obtención de los extractos crudos de pectinasa de Erwinia
Se siembran los cultivos puros de Erwinia seleccionados previamente (inóculo al
5%) en caldo YEPD modificado (g/1000 mL de agua destilada):
5 pectina, 5,0 (maracuyá)
1 Peptona de soja
1 Peptona de carne
1 Extracto de levadura
A un pH de 6,5. Los cultivos se incuban en agitación intermitente durante 24–96
horas a temperatura ambiente (30°C). Luego, se centrifugan a 5.000 rpm durante
10 min y el centrifugado obtenido corresponde al extracto crudo de pectinasa de
Erwinia.
Determinación de actividad de pectinasa en los extractos crudos.
Se determina la actividad de pectinasa por la cuantificación de los azúcares
reductores liberados desde una solución de pectina (0,5% de pectina en buffer
fosfato, pH 6,5) usando el reactivo ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). Se trabaja con
un Factor obtenido con solución de Equivalente reductor (glucosa estándar
1mg/mL). Lo anterior lo hacen por electropotrometría – buscar DNS por
electrofotometría
La mezcla de reacción contiene 0,45 mL de sustrato y 0,05 mL de extracto crudo
enzimático. Dichas soluciones se incubaron a 30 ºC durante 30 min y la reacción se
detiene mediante la adición de 0,5 mL del reactivo DNS y posterior inmersión en
baño de agua hirviente por 15 min.
Después del enfriamiento, se adiciona 1,5 mL de ADE a cada muestra y se mide la
absorbancia a 570 nm. La determinación se lleva a cabo por triplicado. Una unidad
de pectinasa fue definida como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 μmol
de Equivalente reductor (glucosa) por minuto bajo las condiciones del ensayo, 30°C,
pH 6,5.

Buscar fundamento del DNS

(d) impacto ambiental,
(e) Impacto social-económico,
(f) Bibliografía usada
Casa-Luker. (2010). Agroindustria y mercadeo del maracuyá. Recuperado de
http://www.asohofrucol.com.co/archivos/biblioteca/biblioteca_160_AGROINDUSTR
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