HPLC

Principles of Instrumental Analysis

Skoog, West, Holler, Nieman
Thomson Learning; ISBN: 0030020786

Departamento de Química Química Analitica 1

HPLC o que é?

High Pressure Liquid Chromatography

High Performance Liquid Chromatography

High Price Liquid Chromatography

High Problems Liquid Chromatography

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Departamento de Química Química Analitica 3
 Porque é que apareceu?

¾ Resinas Soft
¾ Resinas Hard
¾ Tamanho das partículas da resina
¾ Homogeneidade da resina
¾ Microprocessadores
¾ Métodos de Detecção
¾ Reproductibilidade
¾ Rapidez do Método
¾ Automatização
¾ Os sistemas de tratamento de dados

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Efeito do tamanho da partícula, do empacotamento e do caudal
na altura dos pratos teóricos, H, na cromatografia líquida.

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Equipamento de HPLC

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As curiosidades dos HPLC
¾ As seringas
¾ Os loops
¾ As dimensões internas da tubagem
¾ O corte das tubagens metálicas
¾ Os cones dos parafusos
¾ O desarejamento
¾ Backpressure
¾ Os caudais
¾ A lavagem exterior dos pistons das bombas
¾ As paragens dos sistemas
¾ Os problemas e o troubleshoting
¾ Os limites de detecção (10-12)
¾ Os auto-samplers

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Válvula de injecção para HPLC
detector de ultra-violeta

Existem “loops” de diferentes tamanhos, desde 2µl a 5 ml.

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Cuidados a Ter
¾ Pressão máxima de trabalho (depende das colunas)
¾ Pureza dos Reagentes
¾ Limpeza
¾ Bolhas de ar
¾ Corrosão

Modos de funcionamento

Eluição isocrática – a eluição é feita com um só solvente ou com uma

mistura constante de solventes.
Eluição com gradiente – variação contínua da composição do solvente.

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 Separação de uma mistura
de compostos aromáticos

eluição isocrática

eluição por gradiente

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Condições iniciais na cromatografia de fase reversa

¾ fase estacionária: C8 ou C18

¾ coluna: 0.46 x 15 cm (partículas 5 µm)
0.46 x 7.5 cm (partículas entre 3 e 5 µm)
¾ caudal: 2.0 ml/min
¾ fase móvel: CH3CN / H2O para solutos neutros
CH3CN / tampão fosfato (25-50 mM, pH 2-3) para solutos iónicos
5% - 100% CH3CN em H2O para eluição com gradiente
¾ temperatura: 35º - 40 ºC
¾ tamanho da amostra: 25 – 50 µl contendo ≈ 25 – 40 µg de soluto

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Optimização da fase móvel

¾ Combinações de acetonitrilo, metanol e tetrahidrofurano (THF) com

água (ou num tampão aquoso) originam uma gama suficientemente vasta
de interacções dipolares ou ligações de hidrogénio com os solutos de
modo a permitir a separação de um vasto número de compostos em
cromatografia de fase reversa.
¾ A primeira mistura de solventes a tentar é acetonitrilo com água. O
acetonitrilo tem uma baixa viscosidade o que permite trabalhar a
pressões relativamente baixas e permite a detecção na zona do ultra-
violeta a cerca de 190 nm.
¾ O metanol é a segunda escolha uma vez que possue uma viscosidade
mais elevada.
¾ O THF é a terceira escolha pois é lentamente oxidado e o seu
equilíbrio com a fase estacionária é lento.

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¾ Muitas vezes recorre-se ao método do “triângulo”, que está
ilustrado no acetato seguinte. Neste método a optimização da
separação é atingida com uma combinação de dois ou três
solventes orgânicos.

¾ Existem vários “softwares” comerciais que permitem uma

simulação do método do triângulo, permitindo a selecção das
condições otpimas num tempo relativamente curto.

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 Aplicação do método do triân-
gulo, para separar 7 compo-
nentes aromáticos.
A – 30% acetonitrilo/70% tampão
B – 40% metanol/60% tampão
C – 32% THF/68% tampão
Os pontos D, E, F têm condições
intermédias dos vértices:
D – 15% acetonitrilo/20% metano/
65% tampão
E – 15% acetonitrilo/16% THF/ 69%
tampão
F – 20% metanol/16% THF/64 %
tampão
O ponto G é obtido por média dos 3
vértices:
G – 10% acetonitrilo/13% metanol/
11% THF / 66% tampão

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Gráfico que mostra a percentagem de volume de solventes
que possuem a mesma força de eluição

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Um Detector fora do habitual – Diode Array

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 Uma Aplicação de Elevada Resolução

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Uma aplicação do “arco-da-velha”

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UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography (Waters)

A Technique Built Around

a Novel Chemistry.
Com uma fase estacionária
com partículas de 1.7 µm,
capaz de suportar ainda mais
altas pressões, a UPLC
estende a teoria e os
princípios do HPLC. Estas
partículas conseguem cumprir
a promessa de um aumento
de eficiência para vários
caudais. Consegue-se, assim,
um novo nível de Velocidade,
Resolução e Sensibilidade.

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