Identificación de mutaciones en el gen PAH en un

paciente Catalán
Noemí Pelegrín, Carla Sánchez, Mireia Seró, Gisela Zamorano.

Estudio realizado por LAPZSSS Laboratorios, en el Centro Jesuïtes el Clot, Barcelona (España). Tel.
93 352 50 52-ex.279 Correo electrónico: lapzsss1@gmail.com

ABSTRACTO

Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive inborn error of phenylalanine metabolism caused by

deficiency in the enzyme phenylalanine hydroxylase that converts phenylalanine into tyrosine. If left
untreated, PKU results in increased phenylalanine concentrations in blood and brain, which cause severe
intellectual disability, epilepsy and behavioural problems. PKU management differs widely across Europe
and therefore these guidelines have been developed aiming to optimize and standardize PKU care. In this
study we realize the pertinent tests to detect what happened to our patient, in this case it was diagnosed of
Phenylketonuria. By genetic analysis, we have detected two mutations: an INV 10-11 and other mutation in
the exon 11. These cause a disorder in the gene PAH (that works correctly thank you also to a coenzyme
tetrahydrobiopterin (BH4), which concerns the reaction of the formation of the amino acid tyrosine). The PAH
(Phenylalanine hydroxylase) is capable of transforming the phenylalanine in tyrosine, normalizing the levels
of these enzymes in blood and urine.

KeyWords: Phenylketonuria, PAH, gene mutation, phenylalanine hydroxylase, tyrosine, tetrahydrobiopterin,

Mutation analysis.

INTRODUCCIÓN variantes diferentes alélicas sabidas para afectar

2,14
la actividad enzimática en este lugar. Cada
Fenilcetonuria (PKU, OMIM 261600) es el error exón, y la mayor parte de los intrones, tienen al
innato más común de metabolismo de 3
menos una mutación conocida. Es una
aminoácidos en caucasianos, que afecta a 1 de enfermedad rara de causa desconocida por la
cada 10000 individuos neonatos (portadores cual aún no se sabe porque se generan
17,11
1/50). Es una enfermedad metabólica mutaciones.
16 Realizaremos un estudio a un neonato que
hereditaria autosómica recesiva. El gen que
sospechamos que padece Fenilcetonuria y
codifica por PAH está localizado en el cromosoma
12 (región q22-24.1) y consiste en 13 exones y 12 queremos descubrir si es el primer caso en
1 Cataluña en el año 2003 y qué mutaciones
intrones, compuesta por 100 kb . Hay más de 700
presenta para padecer esta enfermedad.
Historia de la PKU
La PKU fue descrita por primera vez por Asbjørn
Følling, un médico noruego que descubrió un
trastorno metabólico, el cual puede ser asociado
con retraso mental y rasgos
fenotípicos especiales, que denominó oligofrenia
fenilpirúvica. Desde entonces, se ha progresado
mucho en el conocimiento de la enfermedad, en
el diagnóstico precoz y especialmente en el
tratamiento de la misma. Fue Bickel, en 1953,
quién demostró por primera vez que los pacientes
con este diagnóstico tratados pronto con una
dieta baja en fenilalanina no presentaban las
Phenylketonuria (PKU)
La PKU es un error del metabolismo de la
fenilalanina, que no puede convertirse en tirosina
porque falla la enzima que facilita esta
10
reacción, la PAH (Phenylalanine hydroxylase) .
Esto causa una acumulación de la fenilalanina en
todos los tejidos y células del organismo que se
traduce en una elevación de su concentración en
sangre y orina. No sólo se acumula la fenilalanina
sino también unos compuestos que se forman a
partir de ella, las fenilcetonas, que se eliminan por
la orina y son las que dan el nombre a la
5
enfermedad .
Figura 1. Fenilalanina caminos metabólicos.
Representación esquemática del camino normal Phe
metabólico en (a). Mientras que (b), es el camino alternativo
de metabolismo Phe, debido a anormalidades.
Clasificación de la PKU
La concentración en sangre de la fenilalanina es
elevada por su poca capacidad en convertirse en
tirosina, reacción que hace la PAH (fenilalanina
10,13
hidroxilasa) . El rango
complicaciones neurológicas propias de la
enfermedad y se evitaba el deterioro neurológico
hasta entonces irreversible. Estas importantes
observaciones motivaron que Guthrie, en 1963,
ideara una prueba sencilla que permitió el
diagnóstico precoz en las primeras semanas de
vida, para poder tratar rápidamente el trastorno
metabólico y evitar el daño neurológico. A partir
de los años 60 aparecieron los primeros
programas de detección precoz de la enfermedad
mediante la determinación de fenilalanina en la
muestra de sangre seca recogida sobre papel de
filtro.
normal está por debajo de los 360µmol/L.
Distinguimos cuatro tipos de PKU según su
concentración de fenilalanina en sangre del
paciente, los cuales son:
PKU clásica, PKU moderada, PKU leve y HPA
1
(hiperfenilalaninemia) leve.
Tabla 1. Clasificación de PKU según la concentración de
fenilalanina en sangre del paciente.
Phenylalanine hydroxylase (PAH)
La fenilalanina es un aminoácido, molécula simple
que forma parte de las proteínas. La fenilalanina
tiene su propia vía metabólica, por la cual es
capaz de formar un aminoácido muy parecido a
ella, la tirosina, gracias a la acción de una enzima,
5
la fenilalanina hidroxilasa (PAH) . La PAH para
funcionar correctamente requiere la ayuda
indispensable de una coenzima, la
1
tetrahidrobiopterina (BH4) .
Figura 2. Estructura básica del gen PAH. Longitud del cromosoma 12
(12q23.2).
1
Alimentación en la PKU
Los principios básicos que orientan la
alimentación en el niño PKU son los mismos del
niño sano. Se diferencian en que en el niño PKU
se restringe la fenilalanina buscando el equilibrio
entre su defecto y su exceso. Por lo tanto el niño
PKU necesita los mismos aportes nutricionales
(proteínas, hidratos de carbono, lípidos, vitaminas
y oligoelementos). En el lactante se acepta que el
reparto de nutrientes debe ser: proteínas 10%,
lípidos 35% e hidratos de carbono 55%,
Figura 3. Árbol genealògico. Paciente estudio (IV. 000331)
respectivamente. Dichas proporciones varían con
la edad, pasando a ser en el niño mayor de 15%,
30% y 55%, respectivamente. Es importante que
no exista un exceso de fenilalanina, ya que este Análisis del talón
exceso interfiere en la producción de las El primer análisis que se realiza a las 48 horas de
5
sustancias . nacer es la prueba del talón, que permite detectar
enfermedades metabólicas tales como
Problemas que presentan individuos no hipotiroidismo, hiperplasia suprarrenal o
hemoglobinopatías, hiperfenilalaninemias y
tratados
fenilcetonuria.
Los niños con PKU son aparentemente normales
Es indispensable precisar de etiquetas
al nacimiento, aunque durante las primeras
identificativas del neonato, ficha de cribado (papel
semanas pueden presentar vómitos e irritabilidad.
de filtro) y guantes, gasas y desinfectante
Es durante el primer año de vida que el retraso 6
psicomotor se va haciendo evidente y a partir de (Clorhexidina 2% o alcohol 70%) .
los 2-3 años la gran mayoría presentan ya un
déficit cognitivo severo. Pueden presentar
Método Salting Out (extracción de DNA)
además epilepsia, torpeza motriz y temblor. Son
Ésta técnica consiste en la primera eliminación de
frecuentes también los trastornos de conducta
eritrocitos de la muestra de sangre, luego
como hiperactividad muy marcada y rasgos
5 mediante la lisis celular liberaremos el DNA
autistas . celular con el fin de obtener DNA purificado.
Necesitamos: Muestra de sangre, tampón de lisi
MATERIALES Y MÉTODOS
de eritrocitos (NH4Cl, KHCO3, EDTA <pH 7,4>),
tampón de lisi celular (EDTA <pH 8>, SDS 10%),
Pacientes solución salina (0,9% NaCl) ,
El Hospital Sant Joan de Déu es centro de cloroformo, fenol, alcohol isoamílico, isopropanol,
referencia para la fenilcetonuria en Cataluña con 2
el qual estamos estrechamente relacionados. etanol 70% analitico .
Durante 10 años han controlado
Mesura de la concentración de DNA
a los pacientes catalanes con esta enfermedad y
Miraremos la calidad (pureza de la muestra) y
hemos detectado en este periodo 23 pacientes
cantidad del DNA que hemos obtenido mediante
(10 machos y 23 hembras) en la comunidad
un espectrofotómetro. Valores entre
Catalana cuyo valor de fenilalanina en sangre
5 1,8 y 2 en la relación de Abs260/Abs280 son
eran entre 360-1200µmol/L . Nos centramos en
indicativos de pureza, ratios inferiores es
el estudio del paciente 000331 ya que era el 1
indicativo de contaminación proteica .
único neonato diagnosticado en 2003, con
valores superiores a 600µmol/L y cuyos padres Diseño de los cebadores (primers)
eran portadores. Realizamos este estudio para
En el diseño de los cebadores se tuvieron en
averiguar el tipo de mutación o mutaciones que
cuenta la longitud, la temperatura de Melting,
presenta en el gen PAH, gen que interviene en
la Fenilcetonuria nuestro paciente 000331.
 Las condiciones utilizadas por la reacción de
el contenido de G+C, las secuencias repetitivas
secuenciación son las mismas que las de la PCR.
de G o C en regiones 3’, en terminaciones 3’ evitar
complementariedad de bases (eludir formar
RESULTADOS
dímeros), entre otras.
Una vez hechas las secuencias comprobamos la
Los análisis genéticos nos permitieron la
especificidad de estas (mediante el programa
identificación de los intrones 10 y 11 y el exón 11
Primer-Blast) y a posteriori confirmamos que
del gen PAH en nuestro paciente con PKU. Los
nuestros cebadores no contiene ningún
cuales fueron alineados con la secuencia de
polimorfismo que nos dificulte la hibridación
1 cDNA (GI: 209364518) del gen PAH en el
(mediante el programa SNP check) . GenBank. Identificamos dos mutaciones en
heterocigosis en el exón 11 (c.1068C>A) y otra
Reacción en cadena de la polimerasa
mutación (inversión) en el intrón 10-11 (c.1066-
(PCR)
11g>a).
A partir del DNA purificado realizamos la PCR.
Ésta técnica nos permitirá obtener un gran
número de copias y de esta manera nos permitirá
amplificar la región a estudiar
La Master Mix de la PCR consiste en:10X buffer,
2+
2,5 mM Mg , 0,2 mM dNTP, 0,5 µM Primer, 1 U
4
Taq polimerasa y a parte 1µl de muestra de DNA.
Las condiciones utilizadas son: desnaturalización
a 94ºC 3 minutos, seguido de 25 ciclos de
amplificación a 94ºC durante 30 segundos y
temperatura de hibridación 64ºC durante 30
segundos, con una extensión final de 72ºC
durante 5 minutos Figura 4. INV(10-11G>A) En heterocigosis
2
.

Electroforesi en gel de agarosa

Los productos de PCR serán detectados
mediante la técnica de la electroforesis que nos
permite separar productos amplificados según su
peso molecular mediante un campo eléctrico. La
separación se realiza sobre una matriz porosa en
gel al 2%, que separaremos de 2 a 0.1 kb.
Componentes gel agarosa: 2 g de agarosa 100 ml
TBE (TBE: tampón formado por Tris, borato y
EDTA) 50 ml 5 µl Bromuro de etidio. Mediante un
transiluminador de luz ultravioleta observamos el Figura 5. Mutación exón 11 en heterocigosis
patrón de bandas.

Previamente a la secuenciación, realizamos el

Secuenciación por el método Sanger diseño de los primers para poder realizar la PCR
Los productos de PCR serán secuenciados y 4
de la muestra de nuestro paciente.
comparados con las secuencias del DNA
20
genómico humano en el GenBank para
identificar mutaciones. La secuenciación nos
permitirá determinar la secuencia de nucleótidos
en nuestro fragmento de ADN. La cantidad de
Figura 6. Diseño de primers para el genotipaje.
secuencia (reads) que podemos leer mediante el
método Sanger es de 500-1000 pares de bases.

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa. Carril 1
(Marcador de peso molecular),Carril 2 (control negativo),
Carril 3 (control positivo), Carril 4 (muestra del paciente).
En el gel de electroforesis observamos
amplificación de la muestra del paciente. Esta
presenta heterocigosis (dos bandas una de 400
pb y otra de 500 pb).
Anteriormente, realizamos la extracción de DNA
y la cuantificación de este. La ratio de A260/A280
nos indicó un parámetro de 1,9 de pureza de la
muestra.
En la primera etapa del estudio, previamente a
todas estas fases, realizamos una extracción de
sangre y mediante la prueba del talón que nos dio
positiva y para descartar falsos positivos, también
realizamos un análisis de sangre y orina. A partir
de estos resultados confirmamos que nuestro
paciente presentaba la enfermedad ya
esmentada (PKU).
Mediante la concentración de sangre también
pudimos determinar que el paciente padecía PKU
moderada.
Figura 8. Fenilalanina sangre seca (umol/L). Control del
paciente de estudio (000331) durante un año.
DISCUSIONES
Mediante la prueba del talón confirmamos que
nuestro paciente padecía PKU. Posteriormente se
realizaron pruebas de sangre y orina que
corroboraron nuestros resultados; nos dieron
positivas. Estas se hicieron para descartar falsos
positivos y para averiguar el tipo de grado de PKU
que presentaba nuestro paciente, PKU
moderada.
Nuestro estudio quiso centrarse en saber qué
mutaciones estaban implicadas en el gen PAH
que causaban la PKU. Para ello realizamos
estudios genético-moleculares. Mediante la
sangre extraída de nuestro paciente efectuamos
una amplificación del DNA, la cual presentaba
una ratio de 1,9 de pureza de la
muestra, dentro de los parámetros establecidos.
Realizamos un mapeo en el gen PAH,
amplificando primero los exones donde se
localizan las mutaciones más frecuentes en
España y al no detectarlas proseguimos con el
resto de los exones. Usamos los primers
4
utilizados en distintos estudios. Al amplificar el
exón 11, observamos en el gel de agarosa un par
de bandas, una a 400 y otra a 500 pb. I el paciente
control (positivo) también las presentaba en
heterocigosis, dándonos información de que los
dos alelos eran distintos. Seguidamente hicimos
la secuenciación del gen usando los mismos
primers con los que hicimos la amplificación. Con
el fin de detectar la mutación causal. En la
secuenciación observamos dos mutaciones, una
en el exón 11 (c.1068C>A) nonsense y otra en el
intrón INV 10-11(c.1066-11g>a). Estas
mutaciones están relacionadas con la afectación
de la enzima que convierte la fenilalanina en
tirosina.
Al determinar las mutaciones de nuestro estudio
las comparamos con exhaustivas investigaciones
16, 17 4
realizadas en España y en China, ya que
en Europeos no se había encontrado aún la
mutación en el exón 11 y creíamos en un principio
que era de novo pero encontramos un estudio en
4
Asia que ya lo habían publicado.
CONCLUSIONES
Existen más de 500 mutaciones conocidas en
este gen que causan la PKU.
En este estudio se han identificado y
caracterizado mutaciones en genes asociados a
errores metabólicos causantes de la PKU,
mediante técnicas empleadas en estudios
genético-moleculares.
Nuestro objetivo era determinar qué mutación/es
eran causales de la fenilcetonuria
y en qué región/es del gen PAH se produce la concluir que la mutación en el exón 11 prevalezca
afectación. en pacientes Caucásicos.

Se compararon nuestros resultados con patrones AGRADECIMIENTOS

ya existentes en otras poblaciones caucásicas.
En el caso de la inversión 10-11, la mutación Agradecemos la colaboración al Hospital Sant
concuerda con la ya existente en pacientes
17
Joan de Déu por la contribución en nuestro
Andaluces, España. En cambio, la mutación en estudio, a nuestras mentoras y al grupo Capga
el exón 11, coincide con la ya existente en por su supervisión y aporte de conocimientos.
4
pacientes de China, Asia. Debido a la limitación
de la muestra empleada (sólo un paciente de
estudio) no podemos

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