UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO, FACULTAD DE QUÍMICA
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL, GRUPO:06 EQUIPO:03
ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE ALBÚMINA DE SUERO BOVINO POR
MÉTODO DE LOWRY Y DIRECTO.
García Carmona Luz María, Hernández Antonio Hilda, Vélez García Norma Leticia
Resumen
La espectroscopia es un método que
determina la cantidad de luz absorbida el
cual nos permite determinar la específicas siendo el método de análisis
concentración de proteínas presentes en
una sustancia. El método directo mide la
absorbancia de las muestras a 280 nm y
no es destructivo, en cambio el método de
Lowry el cual es un método colorimétrico
se mide a 750 nm y es destructivo para la
muestra.
Objetivo:
Aplicar el método de Lowry y método
directo para elaborar una curva de
calibración y medir la concentración de
proteína en una muestra problema.
Hipótesis:
Se podrá determinar la concentración de
una muestra problema de proteína
empleando una curva de calibración.
Resultados:
En la curva de calibración por método de
Lowry y método directo existe una
relación directamente proporcional.
Se determinó la concentración de la
muestra problema 0.0300 µg/µL
obteniéndose concentraciones de 0.0618
a 0.0320 µg/µL.
Las curvas de calibración por el método
de Lowry y directo se ajustan al modelo
lineal, teniendo el mismo coeficiente de
correlación, obteniendo una pendiente
mayor para el método de Lowry.
Conclusión:
Una curva de calibración como la que se
construyó nos permite conocer la
concentración de una muestra problema.
Palabras Clave:
Métodos Espectroscópicos
Curva de calibración
Método de Lowry y Método directo
BSA (Albúmina sérica bovina)
Introducción:
La espectrofotometría es la medida de la
cantidad de energía radiante absorbida
por las moléculas a longitudes de onda
óptico más usado en las investigaciones
biológicas, y el instrumento para realizar
dicho análisis es el espectrofotómetro el
cual mide la cantidad de intensidad de luz
absorbida después de pasar a través de
una solución muestra.
El espectrofotómetro que será empleado
utiliza luz en el rango ultravioleta (185 –
400 nm) y rango visible (400 – 700 nm) de
espectro de radiación electromagnética.
Una de las leyes que rigen la
espectrofotometría es la Ley de Lambert-
Beer, la cual explica que hay una relación
exponencial entre la transmisión de luz a
través de una sustancia y la
concentración de la sustancia, así como
también entre la transmisión y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa: A=*c*l .
Esto es de suma importancia para
conocer la concentración de una proteína
en una muestra biológica, ya que permite
conocer la actividad específica de una
preparación enzimática e incluso para el
diagnóstico de enfermedades.
La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm, la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina y al grupo
indólico del triptófano, tiene la ventaja de
que no es necesario utilizar reactivos y la
muestra no se daña o destruye durante la
determinación. Este fundamento es
empleado por el método Directo.
Mediante el método colorimétrico se usan
reactivos determinantes de color, en
donde miden por colorimetría en espectro
luz visible en donde se emplea curva de
proteína patrón tal es el caso de la
albúmina suero bovino, en este método es
donde la muestra se destruye. Tal es el
caso del método de Lowry, combina la 0.5

Absorbancia a 750 nm
reacción del Biuret con la reducción del
reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU por los 0.4
grupos aromáticos de residuos de tirosina
0.3
y triptófano. Origina compuesto azul
intenso, por lo cual se mide a 750 nm. 0.2 y = 0.1772x + 0.0233
R² = 0.9885
Método: 0.1
Para el método de Lowry se empleó el
0
procedimiento de las páginas 4 y 5
0 0.5 1 1.5 2 2.5
descrito en el Manual de prácticas de Cantidad de albúmina (µg)
Bioquímica Experimental de la Facultad
de Química semestre 2013-1.
Figura 1. Curva de calibración de BSA
Para el método directo se empleó el
empleando método de Lowry.
procedimiento de las páginas 6 y 7
En la figura se muestra una relación
descrito en el manual de Bioquimica
directamente proporcional entre la
Experimental [3].
absorbancia a 750 nm y la cantidad de
albúmina sérica bovina con un coeficiente
Resultados:
de correlación de 0.9885.
Se colocaron dentro del
Tabla 1. Cantidad y concentración de
espectrofotómetro las celdas con BSA en la muestra problema
muestras de BSA, a diferentes empleando método de Lowry.
concentraciones conocidas, a una
determinada longitud de onda 280 nm Muestra Equipo Equipo Equipo Equipo Equipo
(Método directo) y 750 nm (Método de problema 1 2 3 4 5
Lowry), para obtener una absorbancia, y
con estos resultados realizar una curva de
calibración. 1 0.2970 0.2130 0.1650 0.1870 0.2410
En la curva de calibración de Lowry (figura
1) y la curva de calibración por el método 2 0.5310 0.4450 0.3110 0.4090 0.4320
directo (figura 2) se muestra que existe
una relación directamente proporcional. µg de 1.5446 1.0705 0.7997 0.9238 1.2286
Se determinó la concentración de la BSA en
P1
muestra problema 0.0300 µg/µL
µg de 2.8651 2.3798 1.6236 2.1766 2.3064
obteniéndose concentraciones de 0.0618 BSA en
a 0.0320 µg/µL. P2
La curva de calibración por el método de Conc. 0.0618 0.0428 0.0320 0.0370 0.0491
Lowry y directo se ajustan al modelo P1
lineal, teniendo el mismo coeficiente de µg/µL
correlación, obteniendo una pendiente
Conc. 0.0573 0.0476 0.0325 0.0435 0.0461
mayor para el método de Lowry. P2
En las curvas de calibración de la figura 4, µg/µL
se empleó una concentración de BSA 0.1
mg/mL, se aprecia una relación En la tabla 1 se muestra la cantidad y la
directamente proporcional. En la tabla 2 el concentración de una muestra problema
porcentaje de coeficiente de variación de la proteína empleando la curva de
más alto lo presentó la cantidad de 1 µg calibración de la figura 1. La muestra
de BSA. problema tenía una concentración real de
0.0300 µg/µL, siendo los equipos 3 y 4 los
que se aproximaron a este valor.
 0.5

0.4

Absorbancia 750 nm
0.25
Absorbancia a 280 nm

0.2 0.3
y = 0.1772x + 0.0233
R² = 0.9885
0.15 0.2

0.1 0.1
y = 0.0012x - 0.0156 y = 0.0012x - 0.0156
0.05 R² = 0.9885 R² = 0.9885
0
0 50 100 150 200
0
-0.1
0 50 100 150 200 µg de BSA
-0.05
Cantidad de albúmina (µg) Lowry 280 nm
Linear (Lowry) Linear (280 nm)

Figura 3. Curva de calibración de BSA

Figura 2. Curva de calibración de BSA
comparando método de Lowry y
empleando método directo.
método directo. Esta figura muestra una
Se observa que la cantidad de albúmina
gráfica en donde están presentes las dos
es directamente proporcional a la
curvas de calibración de los dos Métodos
absorbancia a una longitud de onda de
empleados, con su respectiva ecuación
280 nm. Cuyo coeficiente de correlación
de la recta, al igual que muestra el
es de 0.9885.
coeficiente de variación de cada una.

0.170
Absorbancia 750 nm

0.120

0.070

0.020

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

-0.030
Cantidad de albúmina (µg)

Equipo 1 Equipo 2 Equipo 3 Equipo 4 Equipo 5

Figura 4. Curvas de calibración de BSA de los 5 equipos empleando método de

Lowry.
Se logra apreciar que la concentración de albúmina en las muestras es directamente
proporcional a la absorbancia, cuando la cantidad de proteína aumenta estas también lo
hacen. Además, se tiene una menor dispersión en los datos a menores cantidades de
albúmina, en cuanto se van adicionando volúmenes más grandes, los datos de los equipos
van variando.
 g/mL a 1.5 mg/mL y para el método
directo de 50 g/mL a 2 mg/mL [6].
Tabla 2. Desviación estándar y En la determinación de la concentración
porcentaje del coeficiente de variación de la muestra problema empleando la
de la curva de calibración por el curva de calibración por el método de
método de Lowry. Lowry los equipos 3 y 4 fueron los que se
aproximaron más a la concentración real
Cantidad de SD %CV de la muestra problema.
albúmina (µg) Conclusión:
0 0.000 ----- Se pudo construir la curva de calibración
para los dos métodos empleados y con
0.5 0.010 53.05 base en ella obtener la concentración de
1 0.045 257.39 la muestra problema.
1.5 0.034 78.15 Referencias:
2 0.015 35.15 1.http://www.fagro.edu.uy/~nutrical/ensen
anza/AVI%20WEB/cursoema/detdePC.p
2.5 0.026 70.68 df consultado el 19 de Febrero del 2018 a
3 0.043 50.27 las 00:23 am
3.5 0.038 48.58 2.https://bioquimexperimental.files.wordpr
La tabla 2 muestra la desviación estándar ess.com/2009/08/revisic3b3n-de-
y el porcentaje del coeficiente de variación mc3a9todos-espectroscc3b3picos-
que presentan las curvas de calibración lgs2.pdf
de la figura 4. Para la cantidad de 1 µg de Consultado el 19 de Febrero del 2018 a
albúmina se presenta una máxima las 05:30 am
variación. 3. Manual de Bioquimica Experimental.
Análisis: Disponible en:
La albúmina sérica bovina (BSA) es una https://bqexperimental.files.wordpress.co
proteína ampliamente utilizada para m/2010/01/seccion1_815121.pdf
construir curvas patrón para la Consultado el 19 de Febrero del 2018 a
determinación de proteínas, algunos las 9:00 am
ejemplos son la determinación de 4. ZÁRATE Et al.Determinación de pH y
proteínas en saliva de pacientes con proteínas totales en saliva en pacientes
aparatología ortodóncica y proteínas en con y sin aparatología ortodóncica fija
leche [4]. (estudio piloto).México:septiembre 2004.
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empleando el método de Lowry y el 5. Curvas de calibración en métodos
método directo se observó que la anliticos. Disponible en:
absorbancia varía en forma directamente http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archiver
proporcional a la concentración de las o/CURVASDECALIBRACION_23498.pdf
proteínas, como lo describe la ley de Consultado el 19 de Febrero del 2018 a
Lambert-Beer. las 10:00 am.
En las curvas de calibración ambos 6.Cuantificación de proteínas: una
métodos presentan un coeficiente de revisión. Disponible en:
correlación de 0.9885. Siendo el método https://biblat.unam.mx/es/revista/biotecno
de Lowry más sensible que el método logia/articulo/cuantificacion-de-proteinas-
directo, ya que su pendiente es mayor [5]. una-revision. Consultado el 19 de Febrero
Se reporta en la literatura que la del 2018 a las 10:30 am.
sensibilidad del método de Lowry es de 1