Materiales y Métodos

Obtención de muestras de agua

75 muestras de agua fueron obtenidas según la norma Chilena NCh 411/96, de 2

plantas de tratamiento de aguas servidas (Ptas) en la Región Metropolitana (La
Farfana y El Trebal) en los años 2010 (47 muestras), 2016 (16 muestras) y 2017 (12
muestras).

La planta del Trebal posee un caudal de 5500 a 6600 l/s mientras que la planta La
Farfana posee un caudal de 8800 l/s, representando así un 80 a 85% del agua
tratada en toda la región metropolitana (1).

Las partículas virales se concentraron por ultracentrifugacion, a partir de 42 ml de

muestra, resuspendiendo el pellet obtenido en 200 uL de Buffer Fosfato Salino
(PBS), el protocolo utilizado es descrito por Fumian y Cols et al. 2010 (2).

Extracción de ácidos nucleicos

Se extragh hg jo los ácidos nucleicos virales utilizando el kit High Pure Nucleid Acid
Viral kit (Roche, Germany) realizando la elución en 50ul, posteriormente
almacenado a -20 grados Celsius hasta su utilización.

Se realizó la síntesis de ADN Complementario (cDNA) utilizando 10ul de la

extracción anteriormente mencionada, utilizando M-MLV 5X Reaction Buffer
(Promega), M-MLV Transcriptasa reversa (Promega), Ramdon primer (Promega),
rRNAsyn(Promega), utilizando el protocolo señalado por el proveedor (Promega,
USA).
Detección y cuantificación de HAV

Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real

cuantitativa (qPCR) utilizando el kit Brilliant II QRT-PCR 1-Step Master Mix ( Agilent
Technologies) utilizando partidores y sondas descritas por Costafreda et al.,
2006.(3) Se empleó el partidor Fw: HAV68 (5-TCACCGCCGTTTGCCTAG-3) y Rv:
HAV240 (5-GGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3) y sonda taqman 6-FAM HAV150
(5-TTAATTCCTGCAGGTTCAGG-3).
Amplificando un fragmento de 172 pares de bases de largo, en la región 5´NCR,
siendo esta, la región más conservada (Costafreda et al., 2006.) (3) (amplificando
en la posición 69 a 241 basado en la secuencia NC_002058.3).
Se utilizó 2X QRT-PCR master mix, partidor Fw a 0.5uM y Rv a 0.9uM y sonda a
0.12uM, 2 uL de ADN con un volumen final de 25 uL. La amplificación fue realizada
en el equipo Rotor-Gene (Qiagen, Germany), utilizando el siguiente protocolo de
amplificación: 95°C por 10 minutos y luego 45 ciclos de 95°C por 20 segundos, 52°C
por 45 segundos y 72°C por 30 segundos. La adquisición de fluorescencia fue
utilizando el canal verde (510nm), al final de la etapa de alineamiento en cada ciclo.
Para realizar la cuantificación se hizo una curva estándar, utilizando diluciones
seriadas, de un plásmido de concentración conocida, que contenía la región de
interés.
Para la cuantificación, el análisis estadístico se realizó en el software
GraphPadPrism 6.04 (GraphPadPrism Software inc., California, USA).

Todas las reacciones fueron controladas utilizando controles positivos y negativos

en cada paso.

Caracterización molecular de Hepatitis A

Las muestras positivas, fueron seleccionadas y amplificadas con partidores

específicos para un fragmento de 220 pb de la región VP3-VP1, utilizando PCR
semi-nested con los partidores descritos por Manso et al. 2010. (4) HAV1 (5-
GCTCCTCTTTATCATGCTATGGAT-3), HAV 2 (5-
CAGGAAATGTCTCAGGTACTTTCT-3) y semi-nested HAV 2 y HAV3 (5-
ATGTTACTACACAAGTTGGAGAT-3.
Se utilizó el mix 5X Go tag Flexi Buffer, 10 uM de dNTPs, 2,5 uM de MgCl2, 0.4uM
de cada partidor, y 1U de Go taqFlexi DNA Pol (Promega, USA) con un volumen
final de 25uL, todo esto utilizando el termociclador Applied Biosystems 2720, bajo
las siguientes condiciones: 95°C por 2 minutos y 40 ciclos de 95°C x 30 segundos,
52°C x 30 segundos y 72°C por 30 segundos, y la PCR Semi-Nested 95°C por 2
Minutos y 40 ciclos de 95°C x 30 segundos, 50°C x 30 segundos y 72°C por 30
segundos.
El producto de pcr amplificado, fue purificado con: EZNA Gel Extraction Kit, Omega
bio-tek y clonado en el vector pGEMt Easy Vector (Promega, USA), realizando
transformación en Bacterias Escherichia Coli JM109 (células competentes)
(Promega, USA).
Fueron seleccionadas y clonadas 12 muestras positivas correspondiente a, 3 del
2010 (Abril, Julio y noviembre), 3 del 2016 (Noviembre y 2 muestras de Diciembre),
y 6 del año 2017 (2 muestras de enero, 1 de Febrero, Abril, Mayo y Junio). Se
extrajeron 5 clones de cada muestra al azar (60 clones en total) utilizando el kit
E.Z.N.A plasmid DNA minikit II, (Omega) y se envió a secuenciar a Macrogen Inc.
(Seoul, Korea) usando los partidores universales T7 y SP6.
Todas las reacciones fueron controladas utilizando controles positivos y negativos
en cada paso.

Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron alineadas y cortadas excluyendo la

zona de los partidores, en el software BioEdit Sequence Alignment Editor v7.2.5
incluyendo 32 cepas de referencia para evaluar genotipos. El análisis filogenético y
los cálculos de distancias fueron realizadas en el software Mega 7.0 (8) utilizando
el método Neighbor-Joining(5) (con Bootstrap de 1000 repeticiones(6)) y la distancia
evolucionaria utilizando el metodo Kimura 2-parametros.(7)
Resultados

Detección y cuantificación de HAV

Del total de 75 muestras analizadas, 46 resultaron positivas para la presencia de

HAV por qPCR, correspondiendo a un 61,33% del total, específicamente en la
planta La Farfana, 14 de 21 muestras en los afluentes (66.66%) y 11 de 18 muestras
en los efluentes (61,11%) y en la planta el Trebal 10 de 18 para los Afluentes
(55,55%) y 11 de 18 para los Efluentes (61.11%). Existiendo una gran similitud
entre el porcentaje de muestras positivas entre las distintas plantas y los distintos
años analizados (Tabla 1).
La técnica de qPCR obtuvo un coeficiente de correlación de r: 0.9936 y una
ecuación Y, Y= -3.390*X+39.26 con un rango dinámico comprendido entre
3.3015X10^10 hasta 3.3015 copias por reacción, representado en color amarillo, un
intervalo de confianza del 95% (figura1). Analizando también el grafico de
residuales, podemos concluir que el error en cada determinación aleatorio y no
existe sesgo ya que la dispersión de los datos obtenidos se distribuyen de manera
equilibrada bajo y sobre la línea 0. (Figura 2)

Análisis Filogenético de las muestras positivas

Para determinar el genotipo que circula en las muestras de los distintos años, se
amplifico correctamente una región de 220 pb (Manso et al. 2010), de las 46
muestras positivas se seleccionaron 12, abarcando de manera representativa los
años 2010, 2016 y 2017. Las muestras fueron clonadas y se seleccionaron 5 clones
de cada una para secuenciar, agregando así al análisis 26 cepas de referencia,
obtenidas de GenBank correspondiente a 12 secuencias del genotipo IA, 4
secuencias del genotipo IB, 1 secuencia del genotipo IIA, 1 del genotipo IIB, 4 del
genotipo IIIA, 3 del genotipo IIIB y 1 del Genotipo V, correspondiente a virus HAV
de Simio (tabla 3). Además a modo de referencia, se agregaron 4 cepas descritas
en el año 2002 en Valdivia, Chile y 1 secuencia descrita en Barcelona, España, esto
debido a su alta similitud con las muestras obtenidas.

Cabe señalar que de los 60 clones enviados a secuenciar, 54 contenían el inserto

de intereses, por lo que los posteriores análisis filogenéticos contendrán las 54
muestras y 31 secuencias de referencia.
Se realizó una matriz de divergencia con las 54 secuencias que contenían el
producto de pcr de interés, mostrando una distancia media de un 3,57% (desde 0%
hasta 9.3%) en donde sí se desglosa por año, el año 2010 posee una distancia
media de 0.83%(desde 0% hasta 1.16%), el 2016 un 0.8%(desde 0% hasta 2.34%)
y el 2017 un 4.38% (desde 0% hasta 9.3%). En cuanto a la agrupación en el árbol
filogénico, todas las muestras agrupan en el clúster correspondiente al Genotipo IA,
pero estas se diferencian claramente en dos grupos bien diferenciados, las
muestras del año 2010 y 2016, además de 15 de las 28 del 2017 agrupan en un
solo clúster bien definido, incorporándose allí, las secuencias de referencia del
grupo IA, y las secuencias de Valdivia, Chile, quedando en un clúster distinto 13
muestras correspondiente a los meses de febrero, marzo, abril y mayo del año 2017
(Figura 3). Estas últimas poseen una divergencia entre 7.5% y 9.3% con respecto
al resto de las muestras analizadas. (Tabla 4)

Tabla 1
Figura 1:

La técnica de qPCR obtuvo un coeficiente de correlación de r: 0.9936 y una ecuación Y, Y= -

3.390*X+39.26 con un rango dinámico comprendido entre 3.3015X10^10 hasta 3.3015 copias por
reacción, representado en color amarillo, un intervalo de confianza del 95% y cada punto representa
la media de los valores de Ct.

Figura 2

El gráfico de residuales indica la relación del error estándar de las determinaciones con respecto a
la media de cada valor, representada por la línea punteada, graficada sobre el punto 0 de las
ordenadas. Esta línea indica 0 desviación respecto de la media. La dispersión de los datos obtenidos
se distribuyen de manera equilibrada arriba y debajo de la línea 0, por lo tanto el error contenido en
cada determinación es aleatorio y no existe sesgo (caso en el cual los errores estarían distribuidos
de manera no homogénea).

Concentración de HAV en muestras por qPCR

Figura 3: Árbol Filogenético

The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method [5]. The optimal tree with the sum of
branch length = 1.09960602 is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered
together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches [6]. The tree is drawn to scale,
with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree.
The evolutionary distances were computed using the Kimura 2-parameter method [7] and are in the units of the
number of base substitutions per site. The analysis involved 65 nucleotide sequences. All positions containing
gaps and missing data were eliminated. There were a total of 175 positions in the final dataset. Evolutionary
analyses were conducted in MEGA7 [8].
Tabla 3

Tabla 4
Bibliografía:

1) Superintendencia de servicios sanitarios. Info el trebal y la farfana:

http://www.siss.gob.cl/577/w3-article-5059.html
2) Detection of rotavirus A in sewage samples using multiplex qPCR and an
evaluation of the ultracentrifugation and adsorption-elution methods for virus
concentration. Fumian et al 2010.
3) Development, Evaluation, and Standardization of a Real-Time TaqMan Reverse
Transcription-PCR Assay for Quantification of Hepatitis A Virus in Clinical and
Shellfish Samples . Costafreda et al 2006.

4) Genotyping of hepatitis A virus detected in bivalve shellfish in Galicia (NW Spain)

Manso et al. 2010

5) Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
6) Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the
bootstrap. Evolution 39:783-791.
7) Kimura M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base
substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of
Molecular Evolution 16:111-120.
8) Kumar S., Stecher G., and Tamura K. (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets.Molecular Biology and Evolution
33:1870-1874