Práctica 4.

Cromatografía en capa fina y en papel

Introducción
La cromatografía, aunque fundamentalmente una técnica de separación, es
mayormente empleada en análisis químico. Sin embargo, en cierta medida,
también es usada para propósitos de preparación, especialmente para el
aislamiento de cantidades relativamente pequeñas de materiales que tienen,
comparativamente, alto valor intrínseco. La cromatografía es probablemente la
más potente y versátil técnica disponible para el analista moderno. En un
proceso sencillo se puede separar una mezcla en sus componentes
individuales y al mismo tiempo proporcionar una estimación cuantitativa de
cada componente. Las muestras pueden ser gaseosas, líquidas o sólidas y
pueden variar en complejidad, de una mezcla simple de dos enantiómeros a
una mezcla de varios componentes que contienen gran diversidad de especies
químicas. Además, el análisis puede llevarse a cabo en un instrumento muy
costoso y complejo o en una simple y barata placa de capa fina, los principios
que los rigen son los mismos.

Proceso de Adsorción
La adsorción es un proceso por el cual moléculas de gas, líquido o sólido en
solución, llamados soluto, interactúan con las moléculas de la superficie de un
sólido, llamado adsorbente. La adsorción es estrictamente un proceso
superficial que depende de las fuerzas electrostáticas entre el adsorbente y la
muestra. Estas fuerzas se derivan de las interacciones dipolo-dipolo, ión-
dipolo y enlaces por puente de hidrógeno. La superficie del adsorbente dista
mucho de ser perfectamente lisa, ésta tiene discontinuidades, hendiduras y
crestas con centros de densidad de carga positiva y negativa. El soluto se une
al adsorbente a través de la atracción electrostática de sus centros de densidad
de carga y los de la superficie del adsorbente. Los lugares en la superficie del
adsorbente donde la muestra se une se llaman sitios de unión. Los iones y las
moléculas con momentos dipolares permanentes se unen fácilmente al
adsorbente.

Interacción dipolo-dipolo Enlace por puente de H

δ- soluto O
soluto
δ+ H

δ- OH OH
δ-
δ+ δ+ Si Si
Adsorbente O

Para entender como se lleva a cabo la separación sobre la superficie de los

adsorbentes, se deben analizar las interacciones entre el adsorbente y los
solutos y entre el adsorbente y la fase móvil. Se asume que la fase móvil
disuelve por igual todos los constituyentes de la muestra a analizar y que tiene
la misma afinidad por todos los constituyentes. Por lo tanto, las interacciones

1
entre la fase móvil y los diferentes solutos pueden considerarse muy similares y
no desempeñan un papel crucial en la separación.

La figura siguiente esquematiza las interacciones que ocurren en la superficie

de los adsorbentes. Una muestra está constituida por dos componentes,
representados por triángulos y óvalos. Las moléculas de solvente, fase móvil,
están representadas por círculos. Debido a que el número de sitios de unión en
el adsorbente son limitados, las moléculas de soluto y de la fase móvil
compiten por estos lugares, entre más fuerte es la interacción mayor será la
unión con estos sitios. En la figura, se representa la fuerza de la interacción de
cada una de las moléculas presentes por medio de líneas, entre más fuerte es
la unión más gruesa es la línea.

Dirección de la fase móvil

a) Sitios de unión

adsorbente

soporte

b)

c)

Conforme se desarrolla el cromatograma la fase móvil que está cerca de la

superficie del adsorbente compite por los sitios de unión con las moléculas de
soluto. Si la interacción entre la fase móvil y el adsorbente es más fuerte que la
interacción entre adsorbente y soluto, como es el caso de los triángulos, la fase

2
móvil desplaza las moléculas de soluto de los sitios de unión moviendo las
moléculas sobre la superficie del adsorbente. Conforme la fase móvil corre
sobre la superficie del adsorbente, las moléculas de soluto son desplazadas a
nuevos sitios de unión. Debido a que la fase móvil tiene una interacción más
fuerte con el adsorbente, los triángulos no se unen de manera efectiva y son
transportados a lo largo de la superficie a una alta velocidad. Al término de la
corrida del cromatograma los triángulos quedan cerca de la línea final del
solvente.

Si la interacción entre el soluto y el adsorbente es más fuerte que la interacción

entre la fase móvil y el adsorbente, la fase móvil mueve el soluto en la dirección
del flujo como resultado de la acción de masa, ya que es mayor el número de
moléculas de la fase móvil que el número de moléculas del soluto, por lo tanto,
eventualmente la fase móvil desplaza al soluto de los sitios de unión, aún si el
soluto tiene una mayor afinidad por el adsorbente. Sin embargo, entre más
fuerte sea la interacción entre el soluto y el adsorbente, es más difícil para el
solvente mover al soluto. Es el caso de los óvalos en la figura, los cuales tienen
la afinidad más fuerte con el adsorbente y durante el desarrollo del
cromatograma permanecen muy cerca de la posición original donde fueron
colocados.

Selección de las condiciones.

El éxito de una separación comatográfica depende de la selección de las fses
estacionaria y móvil. La alúmina y la sílica gel son los adsorbentes más
comúnmente usados. Existen otras fases estacionarias que ocasionalmente se
usan para aplicaciones muy específicas.

La fuerza de adsorción o adsorptividad de la fase estacionaria está

determinada no sólo por la naturaleza química del adsorbente sino por su
taamaño de partícula y la cantidad de agua que contiene. El agua está unida al
adsorbente covalentemente y no a través de enlaces por puente de hidrógeno.
Cuando la alúmina y la sílica gel reaccionan con agua, las moléculas de agua
son incorporadas a sus estructuras químicas como grupos hidroxilo (-OH). El
adsorbente puede también tener en los sitios de unión moléculas de agua que
no están unidas covalentemente sino mediante enlaces por puente de
hidrógeno, esta agua decrece la capacidad de adsorción del adsorbente y debe
ser removida a través de calentar el adsorbente, este procedimiento se llama
activación.

El otro parámetro que juega un papel importante en la separación es la

polaridad de la fase móvil. Las constantes dieléctricas de los solventes se
toman como un indicador de su polaridad, sin embargo, otros índices basados
en separaciones cromatográficas se han desarrollado.

Es muy común el uso de mezclas de solventes. La polaridad de la fase móvil

puede cambiarse con un amplio rango de solventes de diferentes polaridades.
Por ejemplo, mezclas de hexano y cloruro de metileno con una proporción
creciente de este último provee una serie de solventes con una polaridad
creciente.

3
Existen algunas reglas a aplicar para la selección del solvente y el adsorbente:
La polaridad del solvente debe ser similar a la polaridad del soluto y la
actividad del adsorbente debe ser baja para solutos altamente polares y alta
para solutos no polares.

Solvente Constante
dieléctrica
hexanos 1.89
ciclohexanos 2.02
tolueno 2.38
diteil éter 4.34
etil acetatoa 6.02
cloruro de metilenoa 8.93
acetona 20.7
metanol 32.7
agua 80.1
a
Con base en datos cromatográficos, el
acetato de etilo es considerado más polar
que el cloruro de metileno.

La separación en cromatografía de adsorción está basada en las diferencias de

polaridad y la habilidad de formar enlaces por puente de hidrógeno de los
compuestos orgánicos a separar. Los compuestos capaces de donar un enlace
por puente de hidrógeno se adsorben más fuertemente que aquellos
compuestos similares sin ésta capacidad.

PARTE A SEPARACIÓN DE COLORANTES DE ALIMENTOS POR

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Procedimiento.
1. Corte una pieza rectangular de papel Whatman No. 1 para cromatografía
6,5 x 4 cm
2. Dibuje una línea con lápiz, aproximadamente a 1,0 cm del lado mas angosto
(ver figura 1-a)
3. Haga cuatro marcas con lápiz en la línea, a intervalos equidistantes e
identifique cada marca con la inicial del colorante. (previo a la aplicación de
muestra)
4. Diluya en agua un poco de colorante para alimentos de cada uno de los
cuatro colores a trabajar
5. Usando micropipetas o capilares por separado para cada muestra, coloque
una gota de cada color en cada marca y deje secar. (figura 1-a, aplicación
de la muestra)
6. Diluya 5 ml de alcohol isopropílico con 2,5 ml de agua en un matraz
Erlenmeyer pequeño y transfiera esta solución a un vaso de precipitados
(150 ml), evitando salpicar las paredes. Asegúrese que el nivel del solvente
quede abajo de la muestra aplicada. (figura 1-b)

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 Límite del solvente

a b c d

Placa inicial Placa dentro de la cámara de A medida que el disolvente se Un buen disolvente
Línea a lápiz desarrollo desplaza, hace que la muestra causa una buena
Aplicación de muestra Nivel del disolvente aplicada se mueva también separación de los
componentes de la
mezcla

Figura 1

Distancia
recorrida por
el disolvente
muestra
Centro de masa

Distancia
Distancia recorrida por la muestra Rastro
Rf  recorrida por
la muestra
Distancia recorrida por el solvente

Figura 2

7. Coloque el papel dentro del vaso de precipitados (cámara de desarrollo) y

tápelo con papel aluminio o un vidrio de reloj y permita que el disolvente
eluya durante 30-40 min, o hasta que el disolvente llegue a aprox. 0.5 cm
del borde superior. (ver figura 1-d)

NOTA IMPORTATE
¡NO MUEVA LA CAMARA DE DESARROLLO NI LA
CROMATOPLACA MIENTRAS REALICE LA ELUCION!

5
8. Saque el cromatograma y déjelo secar.

9. Calcule los factores de reparto (Rf) dividiendo la distancia que recorrió cada
muestra entre la distancia que recorrió el solvente para cada colorante.
(Figura 2)

PARTE B ANÁLISIS DE ANALGÉSICOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA

EN CAPA FINA (CCF) O CAPA DELGADA

Procedimiento.
1. Limpie y seque varios (2 o 3) portaobjetos.

2. En un matraz Erlenmeyer pese el adsorbente y adicione agua. El

adsorbente usado en este experimento es sílica gel, la relación de gel: agua
es de 1: 2. Pese 2.5 g de sílica gel HF - 254 y mézclelos con 5 g de agua
destilada, agitando durante un minuto hasta que todo el polvo este mojado
y proceda a la aplicación, este material debe usarse rápidamente porque el
gypsum* presente hace endurecer la mezcla.

*Los materiales adsorbentes mas comúnmente utilizados en CCF son el

oxido de aluminio (alumnina G) y gel de sílice G (ácido silícico). La G indica
la presencia de yeso (sulfato de calcio). El yeso húmedo se vuelve una
masa rígida (CaSO4.2H2O) lo que permite unir al adsorbente y adherirlo a
las placas del vidrio. Generalmente se adiciona en un 10-13%.

3. Extienda la mezcla usando un gotero o con una pipeta Pasteur. Primero

aplíquelo por las orillas del portaobjetos dejando aproximadamente un cm
para sujetarla. Inmediatamente rellene el centro desde el fondo hacia arriba
tratando de extender la mezcla. Si se requiere adicione un poco de agua a
la mezcla y revuelva bien.

4. Deje secar durante 15-30 min hasta que el agua de la superficie haya
desaparecido. Después active la placa en una estufa a 105 oC durante 30
min.

5. Tome dos tabletas de un medicamento desconocido (el compuesto será

proporcionado por el maestro), pesan aproximadamente 1 g, pulverícelas en
un mortero. Transfiera el polvo a un tubo de ensaye y añada 5 ml de
metanol. Agite fuertemente y deje precipitar el excipiente. Márquelo como
“MEZCLA DESCONOCIDA” (este paso lo realiza sólo un equipo para todo
el grupo)

6. Prepare las disoluciones estándar ó patrón de cafeína, ácido acetilsalicílico,

acetaminofén e ibuprofeno a una concentración de 1g / 5 ml de una mezcla
50:50 de cloruro de metileno y etanol. Si no se encuentran las soluciones
patrón entonces use tabletas de los medicamentos que contengan estos
analgésicos. (Cada equipo preparará un estándar diferente)

6
7. Aplique con un capilar o micropipeta una gota de cada solución patrón y una
gota de la mezcla problema a 1,0 cm del borde de la placa, a una distancia
de separación razonable. Anote en su bitácora el orden en que haga las
aplicaciones. (figura 1-a)

8. Prepare el disolvente de desarrollo o de elusión, ácido acético glacial 0,5%

en acetato de etilo. Transfiera una pequeña cantidad (hasta que el volumen
llegue aproximadamente a medio centímetro de alto en la cámara). Sumerja
la placa en la cámara cromatográfica (vaso de precipitados de 50 ml), tape
lo mas herméticamente posible y permita que el disolvente eluya hasta un
nivel entre 0.5 y 1 cm antes del borde superior. Marque la distancia
recorrida por el solvente.

9. Saque la placa y déjela secar al aire. Ilumine la placa con luz UV, marque
las manchas que observe y mida la distancia recorrida. Enseguida revele
también con Iodo. Coloque algunos cristales de yodo en un frasco con tapa,
coloque la placa dentro, tape y espere unos minutos hasta que las manchas
reaccionen con el Iodo y se observen a simple vista. La mayoría de los
compuestos orgánicos reaccionan con el Iodo dando compuestos con
diferentes tonalidades entre los colores amarillo-naranja-café.

10. Calcule el factor de reparto (Rf) para cada una de las manchas.

10. Repita la aplicación sobre cromatoplacas comerciales. Recorte una pieza

rectangular de aprox. 6,5 x 4 cm (¡Cuidado de no maltratar las orillas!), o
bien a un tamaño que ajuste al tamaño del vaso de precipitados que vaya a
usar como cámara reveladora. Repita todo el proceso.

11. Determine por comparación de los Rf de cada estándar y por las

características observadas al revelar con UV y Iodo, los componentes de la
“MEZCLA DESCONOCIDA”.

7
Cromatografía en papel y capa fina.

1) Nombre dos sustancias que son comúnmente usadas como soportes

sólidos en la técnica de cromatografía en capa fina:
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________

2) ¿Que aseveración describe mejor la interacción entre el soporte sólido y los

grupos funcionales en la muestra?
a) Entre mas polar es el grupo funcional, mas débil es su enlace con en
soporte sólido
b) Entre menos polar es el grupo funcional, mas fuete es el enlace con el
soporte sólido
c) Entre mas polar es el grupo funcional, mas fuerte es el enlace con el
soporte sólido
d) No es la polaridad sino la capacidad de elusión lo que determina la
naturaleza de su interacción

3) Mencione dos métodos de visualización usados comúnmente para

determinar las manchas invisibles en las placas de cromatografía de capa
fina

4) ¿Que ecuación matemática es usada en cromatografía de papel y de capa

fina para calcular el valor Rf de un componente en una mezcla?

Rf =

5) Considere una muestra que contiene un hidrocarburo, un ácido orgánico y

un alcohol, todos de estructura similar. Prediga los valores relativos Rf
para estos compuestos cuando son eluídos con una mezcla de solventes
diclorometano – ciclohexano sobre una placa para cromatografía fina.

Tiene el valor Rf más alto__________________________________

Tiene un valor Rf medio ___________________________________
Tiene el valor Rf más bajo__________________________________

6) La cromatografía en capa fina puede usarse para:

a) Determinar el numero de componentes en una mezcla
b) Monitorear el progreso de una reacción
c) Establecer que dos compuestos son idénticos
d) Monitorear una separación de cromatografía en columna
e) Todas las anteriores

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7) Si el valor Rf de un componente desconocido corresponde al valor Rf de
una sustancia pura conocida obtenido bajo las mismas condiciones ¿Puede
decirse entonces que ambos Rf son la misma sustancia?

Cierto _____ falso _____

8) Aunque el papel consiste principalmente de celulosa pura, la celulosa por si

misma no funciona como fase estacionaria. Es el agua absorbida sobre la
celulosa la que funciona como fase estacionaria.
Cierto____________ falso ____________.

9) Los compuestos en una mezcla que son altamente solubles en agua, o

aquellos que tiene gran capacidad para formar enlaces de hidrógeno, son
los que eluyen fácilmente es decir se mueven mas rápidamente en la placa
de cromatografía en papel y capa fina
Cierto____________ falso _____________.

10)La cromatografía en papel se aplica mayormente a compuestos altamente

polares o a aquellos que son polifuncionales.

Cierto ____________ falso ____________.