Desarrollo de vectores de transformación de cloroplastos y una nueva región objetivo en el

genoma del plástido del tabaco.

Abstracto.

Los vectores de transformación de Plastid se usan para la expresión de alto nivel de deleción
de las proteínas recombinantes industrialmente importantes en las plantas. En el presente
estudio, se desarrollaron nuevos vectores para la transformación de plástidos. Uno de estos
vectores se dirige a transgenes en un nuevo sitio en el genoma del cloroplasto. Las regiones
intergénicas de trnfM-trnG, ndhB-trnL y rrn16-trnV se seleccionaron como sitios para la
inserción transgénica. El cloroplasto de tabaco se transformó con éxito con vectores
diseñados, y las plantas transplastómicas acumularon proteínas recombinantes de hasta un 5-
6% de proteína soluble total que permaneció localizada en los cloroplastos. Aunque los
vectores se diseñaron usando el genoma de plástidos de Nicotiana tabacum, las regiones
flanqueantes utilizadas en dos vectores muestran un alto nivel de homología con los genomas
de cloroplastos de otras especies de plantas, por lo que podría ser posible usarlos para la
transformación de un rango más amplio de plantas especies.

Introducción

La transformación de cloroplastos es una alternativa atractiva a la transformación de genes

nucleares. Las ventajas de la tecnología incluyen la expresión de alto nivel de proteínas
recombinantes, la posibilidad de expresar múltiples proteínas a partir de ARNm policistrónicos,
la contención de genes mediante la falta de transmisión de polen y la ausencia de efectos de
posición en plastos debido a la integración del transgén en ubicaciones bien definidas por
recombinación homóloga (Maliga 2004; Bock 2007). Un buen número de proteínas
terapéuticas, antígenos y enzimas industrialmente valiosas se han producido en los
cloroplastos

(Daniell 2006, Bock 2007, Grevichb y Daniell 2005).

Los genes relacionados con los caracteres agronómicos, como la resistencia a insectos,
herbicidas y la tolerancia a la sal también se han expresado en plantas de cultivo (Hou et al.,
2003; Dufourmantel et al., 2005, 2007; Kumar et al., 2004a). La integración del transgén en el
genoma del cloroplasto se produce por recombinación homóloga entre secuencias
flanqueantes en vectores y en el genoma del plástido. Los vectores de transformación de
cloroplastos llevan secuencias flanqueantes izquierda y derecha, cada una con un tamaño de *
1-2 kb del genoma del plástido huésped (Wang et al., 2009). La identificación de regiones
transcripcionales inactivas y secuencias reguladoras que ayudan a la expresión óptima del
transgén es el primer paso en la construcción del vector del cloroplasto. El tabaco se usa con
frecuencia en la expresión de diversas proteínas en cloroplastos. En el presente estudio,
hemos desarrollado nuevos vectores de transformación de cloroplastos, uno de los cuales se
dirige a una nueva región en el genoma del cloroplasto, con la posibilidad de un rango de
huéspedes más amplio. Estos vectores se evaluaron para determinar la eficiencia de
transformación y la expresión transgénica.

materiales y métodos
Construcción de vectores de transformación de cloroplastos Para la construcción de vectores
de transformación de cloroplastos, los elementos necesarios para la transformación de
plástidos se insertaron en el pSK? vector de clonación. Las secuencias de DNA de plastidio de
tabaco que abarcan los nucleótidos 36,631-40,210, 143,921-147,330 y 138,361-141,770 del
genoma de plátano de N. tabacum (EMBL-Z00044) se seleccionaron como regiones
flanqueantes en vectores designados como pRM05, pRM15 y pRM22 (Fig. 1), respectivamente.
El ADN del cloroplasto aislado de hojas de tabaco (Palmer 1986) se usó como molde para la
amplificación por PCR de las secuencias flanqueantes seleccionadas. Estas regiones se
amplificaron por PCR como regiones flanqueantes izquierda y derecha de * 1,6 kb cada una,
para hacer sitios de inserción en las regiones intergénicas trnG-trnfM, ndhB-trnL y rrn16-trnV,
respectivamente (figura 1). Las amplificaciones por PCR se realizaron con los cebadores
respectivos (Tabla 1) usando la polimerasa de ventilación profunda (New England Biolabs). La
amplificación se realizó en un termociclador programado para 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC, 2
minutos a 58ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 34 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58ºC.
? C, y 2 min a 72? C. Se realizó un paso de extensión final durante 7 minutos a 72ºC. Entre las
dos regiones flanqueantes de cada vector, se clonaron los casetes de expresión atpA: aadA:
rbcL y Prrn-T7g10: Eyfp: TpsbA (figura 1). El cassette de expresión atpA: aadA: rbcL consiste en
el gen aadA resistente a espectinomicina (Svab y Maliga 1993) flanqueado por el promotor
atpA junto con su 50UTR y 30UTR rbcL (Barnes y otros 2005) de Chlamydomonas reinhardtii.

El cassette de expresión Prrn-T7g10: Eyfp: TpsbA consiste en el promotor del gen 16S rRNA del
tabaco, un sitio de unión al ribosoma (RBS) del bacteriófago T7gene 10 líder G10L (Peter y
Shaukat 1989), seguido del gen Eyfp que codifica el amarillo mejorado proteína fluorescente
(EYFP) (Takeharu et al., 2002) y el terminador del gen psbA del plástido del tabaco. Se
siguieron los procedimientos estándar para Clonación de ADN (Sambrook et al., 1989).

Transformación de cloroplastos y regeneración de plantas de tabaco transplastómicas

La transformación con cloroplastos se llevó a cabo tal como se describió previamente (Svab y
Maliga 1993), usando el sistema de suministro biológico de partículas PDS 1000 / He (Bio-Rad,
EE. UU.). Hojas completamente expandidas de Nicotiana tabacum L. cultivadas in vitro L. cv.
Las plantas de Petite Havana (tabaco) se bombardearon con partículas de oro de 0,6 lm
recubiertas con ADN de plásmido (Bio-Rad) usando discos de ruptura de 900 psi (Bio-Rad). La
preparación de partículas de oro y el recubrimiento del ADN del plásmido se llevaron a cabo de
acuerdo con el protocolo modificado de Sawant et al. (2000)

Brevemente, las partículas de oro se precalentaron a 65 ° C durante la noche, y se lavaron con

isopropanol y agua estéril. Se resuspendieron en 50% de glicerol y se recubrieron con ADN de
plásmido. Las hojas bombardeadas se cortaron en discos de 1 cm2 y se incubaron en medio de
regeneración de tabaco que contenía sales de MS (Murashige y Skoog 1962), vitaminas de RT
(Khanna y Staba 1968), BAP 1.0 mg L-1, NAA 0.1 mg L-1, 0.8 % de agar, y dihidrocloruro de
espectinomicina (300 mg L-1).

Los brotes resistentes a espectinomicina obtenidos de discos de hojas se sometieron a rondas

adicionales de selección de antibióticos. Estos brotes homoplásmicos se transfirieron a medio
de enraizamiento de tabaco que contenía sales de MS, 3% de sacarosa, 0,8% de agar y
espectinomicina dihidrocloruro (100 mg de L-1). Después de la formación de la raíz, las plantas
se transfirieron a la tierra y se cultivaron en condiciones de invernadero. Las eficiencias de
transformación obtenidas se calcularon como el número total de eventos 9 100 / número total
de placas bombardeadas (Kumar et al., 2004b).
PCR y análisis de transferencia Southern

El ADN genómico total se extrajo de hojas de tabaco mediante el método CTAB (Murray y
Thompson 1980) y se usó para PCR y análisis de transferencia Southern. Las plantas que crecen
en medios que contienen espectinomicina se analizaron primero mediante el método de PCR
usando cebadores específicos para el gen marcador de selección aadA y el gen informador
Eyfp (figura 2, tabla 1). Para confirmar la integración de transgenes en sitios específicos de
plastoma de tabaco, se usaron cebadores de la región codificadora YFP, es decir, P4 y las
regiones flanqueadoras derechas de los vectores correspondientes, es decir, P5, P6 o P7 (figura
2; tabla 1) para Amplificación por PCR Las amplificaciones por PCR se realizaron con ADN
polimerasa Taq (Genei, India). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador
programado para 1 ciclo de 5 min a 94 ° C, 2 min a 60 ° C, y 2 min a 72 ° C, seguido de 35 ciclos
de 1 min a 94 ° C, 1 min a 60 ° C ? C, y 2 min a 72? C. La integración del transgén en sitios
definidos en el genoma del cloroplasto y su condición homoplásmica se evaluó adicionalmente
por análisis de transferencia Southern. Se esperaba que las sondas específicas, es decir, las
sondas 1, 2 y 3 (figura 2), detectasen fragmentos de 3,5, 1,7 y 4,5 kb con fragmentos de tipo
salvaje, y de 6,5, 4,7 y 7,5 kb con tabaco transplastómico plantas en condición homoplásmica,
planteadas con vectores, es decir, pRMYFP05, pRMYFP15 y pRMYFP22, respectivamente (Fig.
2). El ADN genómico total de las líneas transplastómicas y las plantas no transformadas se
digirieron con la enzima de restricción Bgl II. El ADN digerido se sometió a electroforesis en
geles de agarosa al 0,8% y se transfirió a Hybond N? Membranas de nailon (Amersham
Biosciences, EE. UU.) Tal como se describe (Sambrook et al., 1989). Las secuencias de ADN
específicas se detectaron mediante hibridación con sondas de ADN marcadas con 32P, es
decir, sondas 1, 2, 3 derivadas de las regiones flanqueantes de los respectivos vectores (figura
2). Las sondas fueron generadas por cebado aleatorio. La prehibridación y la hibridación se
llevaron a cabo a 65 ° C en la solución de hibridación de Church (Church y Gilbert 1984)
durante 2 y 16 h, respectivamente. Después de la hibridación, las membranas se lavaron
durante 15 minutos a temperatura ambiente en 2% de SSC, 0.1% de SDS, luego durante 15
minutos en la misma solución a 65ºC. El lavado final se administró durante 15 min en 0,2% de
SSC, 0,1% de SDS a 65 ° C. Las membranas lavadas se expusieron a una pantalla de fósforo y se
escanearon en un escáner Fuji Film BAS-1800II Imaging Plate Scanner. 78 Plant Biotechnol Rep
(2012) 6: 77-87 123
Fig. 1 Secuencias flanqueantes utilizadas en la construcción de vectores y vectores finales de
transformación de cloroplastos. i, ii y iii son regiones de genoma de tipo silvestre (W-ctDNA)
usadas para la construcción de vectores básicos RM05, RM15 y RM22, respectivamente. 05LFR
y 05 RFR, 15LFR y 15RFR y 22LFR y 22 RFR son regiones de flanco izquierdo (LFR) y regiones de
flanco derecho (RFR) de los vectores RM05, RM15 y RM22, respectivamente. MCS es un sitio
de clonación múltiple. RMYFP05, RMYFP15 y RMYFP22 son vectores finales de cloroplastos. El
gen marcador seleccionable aadA es dirigido por el promotor atpA (PatpA) y el terminador rbcL
(TrbcL), el gen Marker Eyfp es dirigido por el promotor 16SrRNA (Prrn) y terminador psbA
(TpsbA).

Análisis de proteínas

La proteína soluble total se extrajo de hojas maduras en un tampón de extracción que

contenía Tris HCl 50 mM, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, PVP 1%, PPC (Sigma) y pH 7,5. La proteína
se cuantificó de acuerdo con Bradford (1976). Para inmunotransferencia, las muestras de
proteína se resolvieron en 12% de SDS-PAGE (Laemmli 1970) y se transfirieron a membrana de
PVDF usando un aparato de transferencia de electrones (I-blot; Invitrogen). La membrana se
hibridó con A.v. de longitud completa. Anticuerpo policlonal (Clonetech; n.º 632460) seguido
de IgG de conejo conjugado con ALP (Sigma), y la transferencia se sometió al desarrollo de
color ALP. Los pesos moleculares se determinaron cargando un marcador preteñido
(Fermentas) en una de las líneas del gel. La proteína YFP se cuantificó en inmunoblots
mediante análisis densitométrico (Fluor-STM MultiImager; Bio-rad).
Microscopia confocal

Se observaron secciones foliares de plantas transplastómicas en el microscopio confocal

invertido con el observador Axio. Módulo de escaneo Z1, LSM 510 META (Zeiss, Jena,
Alemania). Se utilizaron objetivos Plan-Apochromat 40x / DIC-II con NS fijo: 0,55 para la
observación. La fluorescencia YFP se controló con un filtro de emisión de paso de banda de
505 a 530 nm (línea de excitación de 514 nm). Las imágenes se importaron como archivos Tif
de 16 bits y se procesaron en Microsoft Office Powerpoint 2007.

Confirmación de herencia materna de transgenes

Las plantas de tabaco de tipo salvaje se polinizaron cruzadamente con polen de plantas
transplanticas. Las plantas transplastómicas fueron autopolinizadas. Las semillas desarrolladas
a partir de estas plantas se esterilizaron superficialmente con 90% de EtOH durante 1 minuto y
50% de lejía comercial durante 10 minutos, y luego se enjuagaron tres veces con agua
esterilizada. Estos se colocaron para la germinación en un medio que contenía sales de MS
(Murashige y Skoog 1962), 3% de sacarosa, 0,6% de agarosa y espectinomicina 100 mg de L-1.

Resultados

Construcción de vectores de transformación de cloroplastos

Los vectores básicos iniciales, designados como pRM05, pRM15 y pRM22, consisten en * 3.4 kb
respectivas regiones seleccionadas del genoma del cloroplasto como regiones flanqueantes
izquierda y derecha (figura 1). Clonación adicional de casetes de expresión de un gen marcador
seleccionable aadA y un gen marcador visible Eyfp entre dos regiones flanqueantes de
vectores básicos

dio como resultado vectores de transformación de cloroplastos finales. Estos se designaron

como pRMYFP05, pRMYFP15 y pRMYFP22 (Fig. 1). Estos vectores se dirigen a transgenes en las
regiones intergénicas trnfM-trnG, ndhB-trnL y rrn16-trnV, respectivamente, en el genoma del
cloroplasto mediante recombinación homóloga (figura 1). La expresión de los genes aadA y
Eyfp se confirmó inicialmente en E. coli (datos no mostrados).

Transformación de cloroplastos y herencia materna de transgenes

Después de 3 semanas de selección, comenzaron a aparecer manchas verdes resistentes a los

antibióticos en segmentos de hoja blanqueados que fueron bombardeados con vectores
desarrollados (Fig. 3). En una incubación adicional en el medio de selección, se desarrollaron
callos verdes y brotes de brotes a partir de estos discos foliares. Brotes resistentes a
antibióticos desarrollados dentro de 3-4 meses desde el bombardeo (Fig. 3). Estos supuestos
brotes transplastómicos se cribaron para determinar la presencia de transgenes por el método
de PCR como se describe en "Materiales y métodos". Los clones positivos para PCR se
sometieron nuevamente a rondas de selección repetidas en espectinomicina (500 mg / l) de
medio de regeneración para establecer la condición homoplásmica de los cloroplastos
transformados. Las plantas transplastómicas crecieron normalmente y completaron su ciclo de
vida. Las eficiencias de transformación obtenidas con los vectores se muestran en la Tabla 2.

En los experimentos de germinación de semillas, las plántulas de plantas transplastómicas

autopolinizadas permanecieron verdes, mientras que las plantas cruzadas con plantas de tipo
silvestre se blanquearon (Fig. 3IV). Estas

los resultados indicaron que los transgenes no se transmitieron a través del polen, sino que se
heredaron por vía materna. Todas las plántulas de plantas autopolinizadas se mantuvieron
verdes sin ninguna mezcla de plántulas blanqueadas, lo que indica una condición
homoplásmica de cloroplastos transformados.
Fig. 2 Posiciones de cebadores de PCR y sondas de Southern blot. i, ii y iii ADN de cloroplasto
transformado con los vectores pRMYFP05 (T-ctDNA RMSYFP05), pRMYFP15 (T-ctDNA
RMSYFP15) y pRMYFP22 (T-ctDNA RMSYFP22), respectivamente, y sus correspondientes
regiones de plastoma de tipo salvaje (W-ct DNA ) P1, P2, P3, P4, P5, P6 y P7 son posiciones de
apareamiento de cebador de PCR; Las longitudes de amplificación de PCR se muestran como
líneas de puntos. Las sondas 1, 2 y 3 son posiciones específicas de la sonda para Southern
blotting. Los sitios de la enzima de restricción Bgl 2 se muestran junto con el tamaño esperado
de la longitud del fragmento de restricción en el planstoma de tipo silvestre y transformado
Fig. 3 Regeneración de plantas de tabaco transplastómicas y herencia materna de

transgenes (I) Discos de hojas bombardeadas en la selección, puntas de flecha que indican
sectores resistentes a verde en discos de hojas blanqueados. (II) Regeneración de callos verdes
resistentes y brotes de discos de hojas blanqueados en medio de selección. III Plantas de
tabaco transplastómicas que crecen en invernadero; C control planta no transformada, y5, y15
e y22 son plantas transplastómicas planteadas con vectores pRMYFPO5, pRMYFP15 y
pRMYFP22, respectivamente. IV Análisis de germinación de semillas en la selección de
espectinomicina; una planta de semillero de plantas transplastómicas autopolinizadas; b
plántula de plantas de tipo salvaje polinizadas cruzadas con polen de plantas transplastómicas.
Confirmación de la transformación del cloroplasto y su condición homoplásmica

La transformación del cloroplasto se confirmó inicialmente por el método de la PCR, utilizando

los cebadores específicos del gen AadA y Eyfp que produjeron tamaños esperados de bandas
(Fig. 4I, II). Estos resultados indicaron que las plantas de tabaco se transformaron con los genes
aadA y Eyfp. Una segunda PCR con cebadores cebadores a la región 30 de Eyfp (P4) y las
regiones flanqueantes derechas (P5, P6 y P7) de respectivos vectores amplificaron los
fragmentos esperados * 1,4-kb (figura 4III). Estos resultados indicaron que los transgenes se
insertaron en sitios deseados en el genoma del cloroplasto. En el análisis de hibridación
Southern, se detectaron bandas individuales de tamaños esperados mediante sondas
específicas con plantas de tipo silvestre y transplastómicas (Fig. 4IV). La presencia de ambas
bandas, que se esperaba con plantas de tipo salvaje y transplastómicas, en una muestra
indicaría su condición heteroplásmica. Estos resultados confirmaron la inserción de transgenes
en sitios deseados en el genoma del plástido sin integración inesperada, y la condición
homoplásmica de los transplastomas.

Localización de cloroplastos y acumulación de proteína recombinante

Para determinar la acumulación de yfp recombinante en plantas transplastómicas, se realizó

un análisis de inmunotransferencia en el tejido foliar. Se desarrolló una banda única de * 27
kDa en la transferencia como se esperaba (figura 5a). El análisis densitométrico de
inmunoblots reveló que la proteína YFP se acumulaba hasta el nivel de * 5%, * 6% y * 6% de
proteína soluble total (TSP) en hojas de plantas transplastómicas planteadas con vectores
pRMYFP05, pRMYFP15 y pRMYFP22, respectivamente. Para confirmar aún más la expresión y
localización de la proteína YFP en cloroplastos, se realizaron observaciones microscópicas
confocales. La microscopía confocal de las secciones foliares mostró una localización específica
de la YFP en los cloroplastos (Fig. 5b).

Discusión

Los vectores diseñados se dirigen a transgenes en la gran región de copia única (LSC, es decir,
trnfM-trnG intergénica y región de repetición invertida (IR), es decir, ndhB-trnL y rrn16-trnV
del cloroplasto se han usado comúnmente en vectores de transformación de cloroplastos para
un alto rendimiento de expresión de proteínas en plantas (Maliga 2004; Wang et al., 2009). Las
restantes regiones transcripcionales silenciosas espaciadoras y algunas de las regiones
informadas en el genoma del cloroplasto se seleccionaron como sitios diana para la inserción
transgénica (datos no mostrados). Las secuencias flanqueantes (* 3,4 kb) en estos sitios diana
se analizaron con BLAST para descubrir el grado de homología con otras especies de plantas.
Las regiones flanqueantes usadas en los vectores pRMYFP15 y pRMYFP22 mostraron un alto
nivel de homología con una amplia gama de especies de plantas. el caso de pRMYFP15 varió de
99% (S. tuberosum; Gene bank: DQ386163.2) a 95% (V. vinifera; Gene bank: DQ424856.1), y en
el caso de pRMYFP22, fue de 99% (S. tuberosum; Banco de genes: DQ386163.2) a 96% (V.
vinifera; Banco de genes: DQ424856.1), respectivamente. Las secuencias flanqueantes
utilizadas en el vector pRMYFP05 tenían un menor nivel de homología, es decir, 97% (S.
tuberosum; Gene bank: DQ386163.2) a 90% (V. vinifera; Gene bank: DQ424856.1). Estas
secuencias se dirigen a transgenes en la región intergénica trnfM-trnG. La orientación de
transgenes en la región trnfM-trnG se ha informado anteriormente (Bock y Maliga 1995, Ruf et
al., 2001). Sin embargo, las eficiencias de transformación de los vectores dirigidos a esta región
nunca se habían comparado. El vector diseñado por nosotros, es decir, pRMYFP05 que porta
esta región intergénica, se usó como un control positivo para asegurar la transformación
exitosa de cloroplastos y la comparación de la eficiencia de transformación en nuestros
estudios. El vector pRMYFP22 se dirige a transgenes en la región intergénica rrn16-trnV.

También se informó sobre la orientación de transgenes en esta región, donde se usaron

secuencias de plastidios de 6,2 kb de longitud que contenían esta región en vectores (Staub y
Maliga 1992, 1993). Los vectores usados en estos informes portan mutaciones puntuales
localizadas en genes flanqueantes, es decir, genes 16S rDNA y rps12 para proporcionar
resistencia a especitomicina y estreptomicina. La eficiencia de la transformación nunca se ha
comparado utilizando vectores que transporten esta región. Esta región completa de 6,2 kb
cubre regiones intergénicas informadas anteriormente, es decir, trnA-trnI (Daniell y col., 1998)
y rps12-trnV (Zoubenko y cols., 1994). Debido a esto, la comparación de la eficiencia de
transformación usando vectores que contienen esta región completa (6,2 kb) puede no dar
una conclusión significativa. Por lo tanto, hemos seleccionado solo secuencias de plástidos de
3,4 kb que contienen la región intergénica de rrn16-trnV para la construcción del vector
(pRMYFP22), que mostró un alto nivel de homología entre diversas especies de plantas. El gen
marcador de selección de antibióticos aadA utilizado en nuestros vectores diseñados
proporciona una mayor frecuencia de transformación que la de las mutaciones puntuales
(Svab y Maliga 1993). Estas características son beneficiosas para lograr nuestro objetivo,
explotar nuevas regiones que tienen un alto nivel de homología entre una amplia gama de
especies de plantas, por lo tanto, un amplio rango de hospedadores de nuestros vectores. Esto
también sirvió como un control positivo y para la comparación de la eficiencia de
transformación en nuestros experimentos.
Fig. 4 PCR y análisis de transferencia Southern i Amplificación por PCR con cebadores
específicos del gen aadA; carril M marcador de ADN, carril? plásmido positivo, carriles 1-3, 4-6
y 7-9 son líneas transplastómicas generadas con los vectores pRMYFP05, pRMYFP15 y
pRMYFP22, respectivamente; carril C planta no transformada. ii Amplificación por PCR con
cebadores específicos del gen yfp, marcador de ADN del carril M, carril de planta sin
transformar del carril C plásmido positivo, carriles 1-2, 3-4 y 5-6 líneas transplastómicas
planteadas con vectores pRMYFP05, pRMYFP15, pRMYFP22, respectivamente. iii Amplificación
por PCR con apareamiento de pares de cebadores a 30 regiones del gen yfp (P4) y región
flanqueante derecha, es decir, P5, P6 y P7 de los vectores correspondientes; carril M marcador
de ADN, carril C planta no transformada, carril positivo plásmido, carriles 1-2, 3-4 y 5-6 son
líneas transplastómicas planteadas con pRMYFP05, pRMYFP15, pRMYFP22 vectores,
respectivamente. iv Análisis de transferencia Southern. El ADN genómico total del tabaco de
tipo silvestre (c) y de líneas transplastómicas generadas con los vectores pRMYFP05,
pRMYFP15 y pRMYFP22 se digirieron con Bgl II, y las membranas independientes se hibridaron
con sondas específicas para las regiones flanqueantes usadas en los vectores
correspondientes. una planta de tipo salvaje Lane C, carriles 05-1 y 05-2 líneas
transplastómicas independientes planteadas con el vector pRMYFP05. b Planta silvestre de
Lane C, carriles 15-1 y 15-2 líneas transplastómicas independientes planteadas con el vector
pRMYFP15. c Planta tipo salvaje Lane C, carriles 22-1 y 22-2 líneas transplastómicas
independientes planteadas con el vector pRMYFP22.
El gen marcador de selección aadA utilizado en nuestros vectores fue dirigido por señales de
expresión de Chlamydomonas. El uso de elementos reguladores heterólogos limita la
recombinación entre las secuencias reguladoras de plastidios introducidas y nativas evitando la
duplicación de secuencias en el plastoma que puede conducir a la eliminación de secuencias
entre las repeticiones directas mediante recombinación homóloga (Iamtham y Day 2000; Kode
et al., 2006). Para la expresión de alto nivel del transgén en el cloroplasto, se usó un promotor
de operón de rRNA de promotor de plastid más fuerte (Prrn) en nuestros vectores (Stern et al.,
1997; Baumgartner et al., 1993). La acumulación de proteína del transgén depende de los
elementos 50-UTR insertados aguas arriba de los genes de interés. La acumulación de
proteínas del mismo promotor (Prrn) puede variar hasta 10.000 veces dependiendo de la
elección de las señales de control de la traducción (Kuroda y Maliga 2001; Zou et al., 2003). El
50UTR del gen 10 del bacteriófago T7 líder G10L (T7g10) se eligió para la expresión
transgénica. Se ha demostrado que esto mejora la traducción de transgén en cloroplastos
(Staub et al., 2000; Kuroda y Maliga 2001). La región 30 reguladora es importante para la
estabilidad del ARNm (Monde et al., 2000). Los casetes de terminación utilizados más
comúnmente se derivan de los genes psbA, rbcL y rps16 del plastidio (Eibl et al., 1999; Maliga
2003). El 30UTR de tabaco psbA se usó en nuestro casete de expresión.
Fig. 5 Análisis de expresión de proteína recombinante. un análisis de Western blot. El marcador
de proteína teñido previamente se cargó para la determinación del peso molecular; proteína
EYFP recombinante purificada de 20 y 50 ng se cargaron como patrones; Se cargaron en gel 10
g de proteína de hoja de tipo salvaje (C) y líneas transplastómicas (pRMYFP05, pRMYFP15 y
pRMYFP22). b Imágenes microscópicas confocales de tejido foliar que muestran fluorescencia
YFP, (a) I y (b) I autofluorescencia de clorofila (a) II y (b) II fluorescencia YFP en cloroplastos (a)
III y (b) III imágenes fusionadas de I y II, las puntas de flecha indican la localización de la
fluorescencia YFP en cloroplastos de células estomáticas protectoras.

Las eficiencias de transformación obtenidas con nuestros vectores desarrollados fueron iguales
a 1 evento por 2 placas bombardeadas a 1 evento por placa bombardeada, que fueron
comparables con las informadas anteriormente (Daniell et al., 1998). La proteína
recombinante se acumuló hasta el nivel de 5-6% de TSP en plantas transplastómicas; los
niveles de expresión podrían aumentar aún más mediante el uso del gen optimizado con
codón de cloroplasto. La expresión del gen bacteriano alto AT del fragmento C de toxina
tetánica en los cloroplastos resultó en una mayor acumulación (25% de TSP) de proteína que
en el gen sintético alto en GC (10% de TSP) (Tregoning et al., 2003). Dado que las secuencias
flanqueantes utilizadas en los vectores pRMYFP15 y pRMYFP22 muestran un alto nivel de
homología con diversas especies de plantas, estos vectores pueden funcionar posiblemente
para un rango de hospedadores más amplio sin la necesidad de desarrollar vectores
específicos de especie. Los vectores diseñados para la transformación del genoma del plástido
del tabaco se utilizaron con éxito para la transformación del plástido de patata y tomate
(Sidorov et al., 1999; Ruf et al., 2001) y los vectores empleados para la transformación del
tabaco y lesquerella en cloroplastos contenían las secuencias flanqueantes de Petunia. lechuga
o Arabidopsis (DeGray et al., 2001; Skarjinskaia et al., 2003; Ruhlman et al., 2010). En todos
estos casos, la transformación se logró en especies estrechamente relacionadas. Esto indica
que los vectores con un amplio rango de huéspedes funcionarán cuando exista un nivel
suficiente de homología con el de otras especies de plantas. Los estudios de transformación de
cloroplastos en Chlamydomonas reinhardtii indicaron que una similitud de secuencia de al
menos 150-200 pb es suficiente para niveles más altos de recombinación homóloga (Newman
et al., 1990, 1992, Suzuki et al., 1997). Por lo tanto, se sugiere que el nivel de homología de las
secuencias flanqueantes utilizadas en nuestros vectores es suficiente; sin embargo, necesita
ser probado. Para este propósito, otros experimentos para la transformación de cloroplastos
de diversas especies de plantas con nuestros vectores portadores de varios genes útiles están
en progreso en nuestro laboratorio (datos no mostrados).