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FACULTADDE
FACULTAD DECIENCIAS
CIENCIASBIOLÓGICAS
DE LA VIDA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
GUÍA Nº 3:
MICROSCOPIA II
INTRODUCCIÓN
Cuando las ondas de luz son emitidas desde una fuente coherente (como un láser), las ondas
están en fase, o sea, los picos y los valles de las ondas coinciden. Esto tiene el efecto de
reforzar las ondas y crear una mayor amplitud, que percibimos como un aumento en el
brillo. Sin embargo, cuando las ondas de luz están fuera de la fase, se interfieren entre sí
reduciendo la amplitud y el brillo.
Cuando las ondas de luz pasan de una sustancia a otra, se curvan o se difractan y sus
trayectorias cambian ligeramente. Esta difracción altera las relaciones de la fase de las
ondas, dando como resultado cantidades variables de interferencia. La cantidad de
interferencia producida cuando la luz atraviesa las diferentes estructuras de una célula no es
grande, y el contraste que se detecta es escaso cuando la célula se observa con un
microscopio óptico común, lo cual por su puesto es la razón por la cual las células deben
teñirse. Sin embargo, en los microscopios de contraste de fase y de interferencia diferencial,
sistemas ópticos especialmente diseñados intensifican la escasa interferencia y
proporcionan un mayor contraste. La resolución de estos microscopios es limitada, como
ocurre en un microscopio óptico común, pero suministran una perspectiva diferente de la
célula viva, mostrando aspectos difíciles de detectar en otro sistema.
Otra técnica usada frecuentemente en las células vivas es la microscopia de campo oscuro,
en la cual el haz de iluminación llega a la muestra desde el costado y los sistemas de lentes
detectan la luz reflejada por el espécimen, que aparece como un objeto brillante
contra un fondo oscuro. Los rasgos de las células que son visibles en estas
fotomicrografías, a menudo adquieren un gran relieve.
Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de
volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio.
La placa base fabricada en vidrio óptico especial tiene el tamaño de un portaobjetos (Fig.1
A). Las ranuras fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas
exteriores y 3 campos pequeños interiores. A diferencia de las zonas exteriores, que se
utilizan para rotulación, los campos interiores están esmerilados y pulidos (Fig.1 B). En el
campo central (= fondo cámara) están grabadas dos cuadrículas de recuento separadas una
de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central es usualmente 0,1 mm
más bajo (= profundidad cámara) que ambos campos adyacentes. Entre el campo central y
el cubreobjetos ya colocado existe por tanto una ranura de 0,1 mm. La limitación lateral del
volumen a contar se forma mediante las superficies imaginadas por la proyección vertical
sobre las líneas exteriores de la cuadrícula de recuento.
Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados, el número de glóbulos por cuadrado será
“a / n”, y si en un cuadrado de volumen 1/250 mm3 hay “a / n” glóbulos rojos, en 1 mm3
habrá X.
= 250/
Siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200,
respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de
glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).
3
= 250/ = /
3. Tenga en cuenta que la grilla central mide 1mm x 1mm de área, la cual se subdivide
en 25 cuadrados y cada uno de estos cuadrados mide 1/5 mm x 1/5 mm.
Para acelerar el conteo, se cuenta el número de glóbulos rojos (a) en los 5 cuadrados
(n) coloreados de rojo para calcular el nº glóbulos rojos/μl.
1μl (microlitro) = 1 mm3)
Describa este cambio observando con el objetivo 40X y realice un dibujo de la muestra
observada en campo claro y otro dibujo de la muestra observada en campo oscuro. Ambos
dibujos deben estar dentro de un círculo de 8cm de diámetro, indicando a un costado de
éste, título de muestra; tipo de muestra (temporal o permanente); tinción; aumento objetivo;
aumento total y observaciones. Anote los nombres de las estructuras identificadas en su
observación.
B.-Reglilla
La calibración se realiza usando un portaobjeto especial como patrón, que posee una lámina
de vidrio en la cual existe grabada una línea graduada de 1 mm de largo.
Fig. 3: Reglilla en forma de cruz, situada en el ocular.
2) Saque una alícuota de 1µl de la suspensión de células y llévelos a 300 µl con suero o
PBS (ver preparación más abajo). Agite bien para obtener una mezcla homogénea.
Microscopios.
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 cámara Neubauer con cubre objeto.
1 círculo negro para generar campo oscuro.
Un frotis de sangre.