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BLUMENAU
2004
VERIDIANA CHAPIEWSKY HARMEL
BLUMENAU
2004
PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA COM A
BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri PARA ANÁLISE DE QUALIDADE DE
ÁGUAS SUPERFICIAIS
Por
Presidente: ________________________________________________
Membro: ________________________________________________
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Membro: ________________________________________________
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Testes de toxicidade são experimentos, nos quais organismos vivos são colocados frente à
compostos ou substâncias químicas e suas reações são observadas. A bactéria luminescente
Vibrio fischeri é conhecida e utilizada em testes de toxicidade aguda. Sua manipulação é
pratica e segura, sendo o teste rápido e eficaz.O principal objetivo deste trabalho foi
padronizar o meio de reconstituição utilizado para o ensaio crônico, bem como o teste em si,
perante substâncias referência. As substâncias referência utilizadas foram o cromo VI na
forma de dicromato de potássio, 3,5 diclorofenol e também amostras de água superficial para
observar o comportamento do ensaio. Para fins de comparação, o teste de toxicidade aguda foi
realizado paralelamente com as mesmas amostras. A análise do crescimento relativo de
biomassa foi realizada por espectrofotometria. Ensaios agudos e crônicos com o bioindicador
Daphnia magna também foram realizados com fins de comparação de métodos. O ensaio
crônico se mostrou instável perante as substâncias referências, ocorrendo crescimento
bacteriano. A composição do meio foi variada durante o decorrer dos ensaios levando em
consideração a disponibilidade de fonte de carbono para minimizar o crescimento das
bactérias nos tubos de ensaio. Com o meio reformulado conseguiu-se a manutenção da
luminescência durante o tempo necessário para o ensaio. Os ensaios foram repetidos, mas a
instabilidade do sistema teste continuava. Dependendo da movimentação dos tubos do
termobloco até o luminímetro o valor de luminescência era alterado, variando muito nos
resultados. Os tubos de leitura foram agitados após a leitura de 24 horas por 30 segundos a
156 rpm e uma nova leitura realizada. Os valores de luminescência aumentavam devido a
disponibilidade de oxigênio no meio, mas os resultados se mostraram mais coerentes se
comparados com a leitura 24 horas sem agitação prévia, onde houve muita variação. Esta
observação indica a possível necessidade do ensaio ficar em agitação no período de
incubação, para não haver estratificação dentro do tubo e mantê-lo homogêneo. O método
utilizado para a medição do ensaio crônico com Vibrio fischeri não demonstrou resultados
satisfatórios, ocorrendo grandes variações nas leituras. Por outro lado, usando amostras de
água superficial, verificou-se uma diferença significativa entre os resultados do ensaio
crônico, comparando-se com o ensaio agudo com V. fischeri, e também se comparado com o
bioindicador Daphnia magna.
Biotoxicity assays are experiments, in which living organisms are put into several samples
and their reactions are observed. The luminescent bacteria Vibrio fischeri is known and used
in acute toxicity tests. Its handling is practical and safe, being fast and efficient. The main
objective of this work was to standardize the reactivation solution used for the chronic assay
as well as the test itself, with reference substances. The reference substances used were
chromium VI in the form of K2Cr2O7, 3,5 dichlorophenol and samples of surface water to
observe the behavior of the assay. For comparison reasons, the acute toxicity test was carried
out in parallel using the same samples. The analysis of the relative growth of the bacteria was
accomplished photometrically. Acute and chronic assays with Daphnia magna were also
carried out for methods comparison. The chronic assay showed instability according to the
references substances, based on bacterial growth. The composition of the reactivation solution
varied during the assays, taking into consideration the availability of the carbon source, to
minimize the growth of the bacteria in the test tubes. In an altered reactivation solution the
light-emission was kept constant during the necessary period for the test. The assays were
repeated, but the instability of the test system continued. Depending on the way, the reaction
vials were carried from the incubation block to the measuring instrument, the light-emission
suffered alterations, leaving to greatly varying results of luminescence readings. As a
consequence, after the 24 hours incubation period, the vials were agitated for 30 seconds in a
shaker at 156 rpm, and a new reading were performed. The luminescence values increased
due to oxygen availability in the reactivation solution, but, the results showed to be more
coherent, if compared with the 24 hours without previous shaking reading, where there had
been great variation. This observation shows a possible need of the test to be kept in agitation
during the entire incubation period, so that formation of stratification zones in avoided and the
suspension kept it homogeneous. The method used to measure the chronic assay with Vibrio
fischeri did not show satisfactory results, with great readings variations. However, using
samples of surface water, a significant difference was verified among the results of the
chronic assay, being compared with the acute assay with V. fischeri, and also if compared
with Daphnia magna.
Gráfico 4.1 – Variação dos valores de inibição da luminescência no ensaio crônico 12, após
24 horas de exposição à substância referência cromo VI sem agitação prévia. ....................... 51
Gráfico 4.3 – Perfil da luminescência durante o período de ensaio utilizando o meio composto
por 50% de SSWC e 50% de solução salina 20g/L.(Ensaios 01 e 02) ..................................... 55
Gráfico 4.5 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico com
leitura 24 horas sem agitação prévia, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30,
concentração inicial 2 mg/L). ................................................................................................... 58
Gráfico 4.6 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico, após
agitação, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30, concentração inicial 2mg/L).... 58
Gráfico 4.7 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após 30
minutos com a substância referência cromoVI.(2 mg/L) ......................................................... 59
Gráfico 4.8 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após
24 horas com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24h sem agitação dos tubos,
concentração inicial 5mg/L) ..................................................................................................... 62
Gráfico 4.9 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após
agitação dos tubos com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24, concentração
inicial 5mg/L) ........................................................................................................................... 64
Gráfico 4.10 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após
30 minutos com a substância referência 3,5 diclorofenol.(25mg/L) ........................................ 65
Gráfico 4.11 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio agudo após 30 minutos para as
3 amostras de água superficial, a) amostra 1, b) amostra 2, c) amostra 3. ............................... 67
Gráfico 4.12 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio crônico após 24 horas para as 3
amostras de água superficial.a) amostra 1, b) amostra 2 c) amostra 3. .................................... 69
LISTA DE QUADROS
Quadro 3.1 – Soluções estoque para preparo da água de cultivo (meio M-4)......................... 35
Quadro 3.2 - Volume das soluções estoque necessárias para o preparo de 1000 ml de água de
cultivo. ...................................................................................................................................... 36
Quadro 3.3 - Elementos traços e suas respectivas concentrações para preparo da solução
estoque. ..................................................................................................................................... 37
Quadro 3.4 – Quantidade de macro-nutrientes para a formação das soluções isoladas e sua
quantidade para a posterior formação do Meio M4.................................................................. 38
Quadro 3.5 – Elementos para o preparo das soluções estoque para o meio de cultura (meio
CHU) ........................................................................................................................................ 39
Quadro 4.2 – Valores de concentração em mg/L de Cromo VI que causaram cerca de 20% de
inibição nos ensaios crônicos, com a concentração inicial da amostra de 0,25 gm/L.............. 50
Quadro 4.3 – Valores de concentração de cromo VI em mg/L, que causaram cerca de 20% de
inibição no ensaio crônico, antes e após agitação do sistema teste. ......................................... 51
Quadro 4.8 – Valores da CE20 e Fator de diluição para as amostras de água superficial no
ensaio de toxicidade aguda. ...................................................................................................... 66
Quadro 4.9 – Valores de CE20 e fator de diluição para as amostras de água superficial no
ensaio de toxicidade crônica..................................................................................................... 68
Quadro 4.10 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais
de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância cromo VI.................... 70
Quadro 4.11 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais
de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância 3,5 diclorofenol.......... 71
Quadro 4.12 – Valores agrupados dos ensaios agudos de Daphnia magna com os respectivos
percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para as três amostras de água
superficial. ................................................................................................................................ 72
Quadro 4.13 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada série de
diluição e controle.(agrupamento de três repetições) ............................................................... 73
Quadro 4.14 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada amostra de
água superficial com uma série de diluição.............................................................................. 74
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................................12
2.2 Bioensaios....................................................................................................................... 18
3 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................28
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 79
GLOSSÁRIO .......................................................................................................................... 84
APÊNDICES ........................................................................................................................... 85
ANEXOS ................................................................................................................................. 95
12
1 INTRODUÇÃO
A água, um dos recursos naturais mais significativos aos seres humanos, sofre uma
degradação constante devido aos processos antrópicos instalados no meio ambiente. Esta
possue um ciclo extraordinário de movimentação no sistema, onde devido as suas
propriedades, carrega consigo diversas outras substâncias, poluentes ou não.
Para cada uso previsto, existe uma qualidade de água segundo padronização a ser
exigida. O padrão de qualidade da água e efluentes exigidos está baseado em análises
laboratoriais de parâmetros essencialmente físico-químicos. Muitas vezes esses parâmetros
são insuficientes, sendo que se tornaria impossível a determinação química de todos os
componentes existentes em uma amostra de água, por exemplo, para avaliar seu potencial
efeito aos seres. Como saber se determinada amostra causa efeito sobre a biota existente no
local de seu lançamento? Para se avaliar o efeito de certas substâncias sobre a vida aquática
são necessários ensaios complementares onde são utilizados seres vivos como bioindicadores.
Existem no mercado uma diversidade de ensaios com bioindicadores, sendo
classificados em ensaios agudos e crônicos. Os ensaios agudos demonstram a resposta rápida
dos organismos perante alguma amostra num curto período de tempo. Os ensaios crônicos
demonstram a reposta dos organismos em contato a um longo período de tempo abrangendo
parte do seu ciclo de vida ou mais. Assim sendo, tendo-se uma ferramenta de monitoramento
crônico é possível detectar a presença de alterações em longo prazo de concentrações sub-
letais, pois somente organismos vivos têm capacidade de responder a esses estímulos.
De acordo com Baptista et al.(2000), os parâmetros físico-químicos e biológicos
devem ser complementares e indispensáveis como critérios de avaliação para definir a
qualidade e eficiência do tratamento de efluentes empregado pelas indústrias, e não apenas a
realização de testes de toxicidade aguda, mas também análises mais criteriosas quanto a
toxicidade crônica dos mesmos.
Existem diversos seres que podem ser utilizados como bioindicadores, sendo que a
fácil manipulação e a rapidez na realização de um ensaio são pontos chave para sua aplicação
principalmente no âmbito de mercado. A bactéria luminescente Vibrio fischeri é conhecida e
utilizada em testes de toxicidade aguda onde se observa uma resposta rápida dos organismos
perante a amostra. A manipulação da bactéria é pratica e segura, sendo o teste rápido e eficaz.
Ensaios agudos demonstram a reação direta do bioindicador em contato com a
amostra num curto período de tempo, já ensaios crônicos visam a reação do ser em um
13
1.1 Justificativa
1.2 Objetivos
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Generalidades
no meio ambiente sendo que muitas dessas combinações criadas são tóxicas aos sistemas
vivos.
Tortura et al (2002) descrevem que nos Estados Unidos, industrias geram 265
milhões de toneladas de resíduos perigosos, 80% dos quais vão parar em aterros de resíduos.
Enterrar essas substâncias químicas não as remove do ecossistema, somente as coloca em
outro lugar, onde podem oportunamente penetrar em corpos d’água.
Nos países em desenvolvimento a preocupação com questões ambientais por deveras
fica em segundo plano, sendo que a prioridade é gerar recursos para a sobrevivência no
mercado. Segundo Araújo 1999, o rápido crescimento industrial no Brasil vem gerando sérios
problemas de degradação ambiental, especialmente em áreas costeiras, onde ocorrem,
concomitantemente, as maiores concentrações urbanas e os ambientes mais ricos em termos
de produtividade natural.
A atividade industrial é uma das principais fontes de poluição dos ambientes
aquáticos devido ao lançamento de efluentes líquidos nos corpos receptores. Os efluentes
gerados em áreas industrializadas são formados por misturas complexas de substâncias
químicas, muitas delas tóxicas aos organismos aquáticos. (ROMANELLI, 2002)
Toxicidade é a possível ação que os agentes químicos, que são lançados no meio
ambiente, podem causar efeitos deletérios aos organismos devidos a suas propriedades,
concentrações e combinações. Por exemplo, substâncias que apresentam efeitos sobre as
propriedades químicas e físicas do meio, conseqüentemente podem vir a alterar as condições
de vida dos organismos (Norma DIN, 1994).
Testes de toxicidade consistem em expor organismos teste representativos no
ambiente à várias concentrações de uma ou mais substâncias durante determinado período de
tempo para determinação de seu potencial tóxico, sendo os efeitos detectados através de
respostas nos organismos (CETESB, 1990).
A preocupação crescente envolvendo a contaminação ambiental estimula esforços
rigorosos para estabelecer ensaios de monitoramento fidedignos (EL-ALAWI, 2002).
Somente os sistemas biológicos podem detectar os efeitos tóxicos das substâncias.
Através de testes de toxicidade laboratoriais, o potencial tóxico das substâncias químicas é
colocado contra o sistema de auto proteção dos organismos-teste, que vão reagir de uma
maneira geral a todos os efeitos das substâncias presentes no meio. (Norma DIN, 1994)
18
2.2 Bioensaios
essa mistura. A duração do teste é de 28 dias e para avaliação são utilizados diversos critérios
como morte, efeitos secundários sub-letais.(DELLICADO, 1999)
Daphnia magna e Daphnia pulex (microcrustáceo) – são realizados testes de
toxicidade aguda e crônica, onde os bioindicadores são expostos às substâncias em sistemas
aquáticos estáticos ou correntes, sendo o objetivo final determinar as curvas de “dose/efeito” e
o valor de EC 50 (concentração da substância testada que provoca imobilidade ou redução na
reprodução 50% de uma população durante a exposição contínua num determinado período
de tempo).
Ceriodaphnia dúbia: é uma das espécies utilizadas em testes de toxicidade crônica,
para avaliar a toxicidade de efluentes e águas receptoras em um invertebrado.
Crassostetrea virginica (ostra) – são realizados dois tipos de teste; toxicidade aguda,
onde o critério usado pra avaliação é o crescimento da concha das ostras desde o momento em
que esta é exposta a substância até o final do teste, 96 horas mais tarde. Testes em ostras são
usados para medir a tendência que as substâncias tem para se bioconcentrar nos tecidos dos
moluscos (DELLICADO, 1999).
Segundo Peinado ( 2002) testes que utilizam bactérias até o presente momento são os
mais amplamente utilizados como técnicas de identificação de toxicidade de substâncias e
produtos comerciais. Ao contrário testes de toxicidade que utilizam organismos mais
complexos como por exemplo mamíferos e peixes se comparados, os que utilizam bactérias
são muito mais rápidos e baratos.
De acordo com Cronin (1997) testes de toxicidade com bactérias tendem a seguir
para uma entre cinco categorias de análise que são, crescimento populacional, energia,
consumo de substrato, respiração e bioluminescência. A popularidade dos ensaios com
bactérias é baseada no fato de que elas são parte integral do ecossistema e os ensaios
realizados em sua maioria são rápidos e simples.
Graças a sensibilidade e relevância ecológica, bioensaios com bioindicadores de
ciclo de vida curtos é de interesse em todas as perspectivas ecológicas, particularmente
quando testam amostras instáveis como efluentes. Algas, bactérias e invertebrados aquáticos
são atrativos porque o aumento de suas gerações é em período curto comparados com
organismos superiores como por exemplo peixes (RADIX, 2000).
Segundo Gutiérrez (2000), é importante a determinação da toxicidade de
contaminantes orgânicos ou inorgânicos em efluentes que são descarregados nas estações de
21
bactéria ser alojada por um hospedeiro e assim conseguir um benefício no meio ambiente,
inclusive nutrientes. Assim podemos imaginar que a bactéria que normalmente vive no
intestino de peixes pode aumentar a probabilidade de ser ingerida se ela emitir luz num
ambiente escuro de profundezas enquanto coloniza partículas que os peixes poderiam ver com
mais facilidade e então ingeri-las.
Bactérias marinhas luminescentes podem ser isoladas de intestinos de peixes e
invertebrados, em crescimento saprófito em organismos marinhos mortos (peixes, crustáceos),
principalmente em crescimento simbiôntico nos órgãos leves de peixes, camarões em parte do
plâncton. São muitas as vantagens para o organismo que hospeda as bactérias luminescentes.
Algumas espécies de bactérias luminescentes vivem em associação de simbiose nos
órgãos leves de peixes. Órgãos leves nos peixes consistem em tubos ou canais, densamente
preenchidos extracelularmente com bactérias, que conectam com o exterior por poros do qual
a bactéria pode sair nos intestinos ou na água do mar, dependendo da localização do órgão
leve. A maioria dos órgãos que abrigam bactérias, são internos e são derivados de extensões
do trato intestinal. Provavelmente o objetivo desses órgãos internos leves seria no auxílio aos
peixes numa iluminação controlada por eles. A bactéria Vibrio fischeri vive a densidades
11
muito altas (aproximadamente 10 células/mL). Também ocorre em vida livre no oceano,
mas em densidades bem mais baixas (menores de 102 células/ml).
Durante a iluminação controlada, por exemplo, o peixe elimina sua silhueta, que pode
ser produzida através de baixa produção de luz, emitindo luz de seu lado ventral confundindo
assim seus predadores.
Os órgãos leves externos estão na superfície corporal do peixe, por exemplo, bolsas
especiais embaixo dos olhos. Essas bolsas são usadas para visão, para buscar a presa, e
também para comunicação intraespecífica (comunição entre seres de uma mesma espécie).
A luminescência da bactéria é contínua, por isso os peixes evoluíram uma variedade
de mecanismos para controlar o lançamento de luz. Esses mecanismos incluem a utilização de
telas de pigmentos (melanophotos) que bloqueiam, permitem passagem parcial ou refletem a
luz emitida pelas bactérias. Por exemplo, alguns peixes, que possuem bolsas embaixo dos
olhos podem bloquear a luz puxando tecidos sobre a bolsa, como uma pálpebra. Outros peixes
podem rotacionar a bolsa luminescente para baixo de forma que a luz não saia.
Todas as bactérias luminescentes são filogeneticamente agrupadas com
enterobactérias. As que vivem em oceanos pertencem a três gêneros: Vibrio, Photobacterium
e Alteromonas. Como colocado, podem viver de maneira saprófita, em partes de animais
25
mortos, podem existir livremente em partes do plâncton nos oceanos ou podem viver também
nos órgãos de seus respectivos hospedeiros. (Porém, nenhuma bactéria marinha luminescente
que pertence ao grupo V. harveyi é conhecida por colonizar órgãos leves de peixes, embora
essas bactérias vivam no intestino de animais marinhos como também no mar).
As bactérias luminescentes terrestres e dulcícolas são representadas por Xenorhabdus
luminescens e certas espécies de Vibrio cholerae, respectivamente. Vibrio cholerae habita o
intestino humano a pode causar cólera, mas em geral formas luminescentes não são
conhecidas como causadoras de doenças.
Luciferase
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + H20 + RCOOH + luz
A razão porque a luz é emitida é que durante a reação a molécula flavina se torna
eletronicamente excitada e subseqüentemente apresenta fluorescência com o retorno do
elétron ao seu estado inicial. Dos dois átomos de oxigênio em O2, um se torna reduzido em
água, enquanto o outro é incorporado na função aldeídica, o qual transforma-se em ácido
carboxílico.
O aldeído (RCHO) é regenerado do ácido carboxílico (RCOOH) via redução por
NADPH, catalizado por um complexo redutor de acido graxo consistindo de três proteínas
(uma transferase, uma redutase e uma sintetase). O FMNH2 é regenerado pela redução do
FMN por NADH, catalizado por uma NADH-FMN oxiredutase. Advertindo que o caminho
da luciferina pode ser visto como um desvio que conduz da cadeia respiratória do citocromo.
Qualquer alteração no meio, como a presença de um composto prejudicial, vai alterar
ou inibir os processos, conseqüentemente, reduzir a produção de luz pelas bactérias.
Foi descoberto a algum tempo que certas espécies de bactérias luminosas emitem luz
em suspensão celular somente quando a densidade celular alcança um certo valor “quorum”,
de percepção de presença entre organismos. Esta característica está relacionada ao fato de
que, a bactéria não emitirá luz até que haja acumulação no meio extracelular de certa taxa de
concentração de um sinal espécie-espécie para luminescência, chamado autoindutor. Isto
ocorre em populações com concentrações celulares acima de 10 7 / mL.
Os autoindutores identificados até agora são lactona de N-acil-L-homoserina (acil
HSLs), ou seja, homoserina lactona unida a uma cadeia acila lateral, sendo que a estrutura do
qual pode variar com autoindutores específicos.
Para entender como os autoindutores atuam, é preciso se ter conhecimento dos genes
que são responsáveis pela luminescência. Os genes que codificam a proteína luciferase e o
complexo enzimático de redutase de ácidos graxos, são codificados no operon “lux”, o qual
consiste de no mínimo cinco genes que são requeridos para luminescência (luxCDABE).
LuxAB codifica as subunidades α e β, respectivamente da luciferase (um heterodímero), e
lux CDE codifica as três proteínas do complexo enzimático de redutase de ácidos graxos, que
são necessários para a regeneração do aldeído de cadeia longa. (Dependendo da espécie de
bactéria, outros genes podem existir no operon.)
A expressão desses genes é regulada pelos autoindutores. A regulação do operon lux
em duas bactérias luminescentes, V. fischeri e V. harveye, foi estudada em detalhes. De
maneira interessante enquanto ambas as bactérias utilizam (acyl HSLs) para sentir a própria
densidade, o mecanismo do gene lux de regulação em V. fischeri parece ser diferente do que
em V. harveyi.
Segundo (Reverchon,2002) lactonas de N-acil-L-homoserina (acil HSLs), (ver figura
1), são produzidas por uma variedade de bactérias Gram-negativas que as usam como
indicação dos sinais de “quorum” extracelulares.
A luminescência da bactéria somente ocorre nos órgãos transparentes dos peixes
porque ali, o autoindutor produzido pelas bactérias encontra-se em suficiente concentração
para induzir a luminescência. Este autoindutor age como um sinal de densidade populacional.
27
O O
H O
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Para meio de cultivo sólido adicionou-se 12 g de ágar-ágar por litro de meio de cultivo
líquido.A dissolução foi realizada com auxílio de calor sobre chapa. O meio de cultivo sólido
também foi esterilizado em autoclave a 121oC, durante 15 minutos. Após esterilização o meio
foi transferido na porção de 15 ±3 mL para placas de Petri estéreis de 40 mm de diâmetro.
O meio de proteção é o composto que é adicionado às bactérias após a centrifugação,
que auxilia na manutenção das mesmas durante o período de congelamento. Para preparação
deste meio de proteção foram utilizados:
D-glucose monihidratada (C6H12O6H2O) 33 g
Cloreto de Sódio (NaCL) 2g
L-histidina (C6H9N3O2) 1g
Soro de Albumina Bovina (BSA) 0,25 g
Estes reagentes foram dissolvidos a uma temperatura de 37 º C num volume de 25 mL
de água destilada. O pH foi ajustado para 7,0 + 0,2. Após a total dissolução, o volume foi
ajustado para 50 ml.
O procedimento de cultivo propriamente dito foi realizado transferindo-se uma porção
de bactérias do tubo Epperndorf, já condicionado, com auxílio de uma alça de platina, fazendo
estrias sobre o meio de cultivo sólido, em condições estéreis. Após este procedimento, as
placas foram colocadas em estufa a 20 º C, para incubação, por 2 a 5 dias. As colônias em
crescimento foram identificadas através de observações visuais no escuro.
As colônias de maior luminescência, foram transferidas em condições estéreis para um
frasco Erlenmeyer, contendo meio líquido de cultivo, aproximadamente 150 ml. A abertura
foi tampada com chumaço de gaze, sem proteção de alumínio, para dar condições de entrada
de oxigênio. O meio com as bactérias foi mantido em estufa a 20 º C, estático, por um período
de 24 horas.
Após esse período, uma alíquota de 5 ml foi transferida, em condições estéreis, para os
outros frascos Erlenmeyer, contendo meio líquido. Os frascos foram mantidos em agitação a
156 rpm, numa temperatura ambiente entre 15 e 20 º C no máximo.O tempo de agitação foi de
20 horas +1 hora, conforme norma ISO 11348-1(1998).
Finalizado o tempo de agitação, o meio contendo as bactérias foi centrifugado em
centrífuga refrigerada em uma temperatura de 4 º C + 2 º C, por um tempo de 15 a 20 min em
uma rotação de 3000 rpm. O volume total centrifugado foi anotado para o cálculo da
quantidade de meio de proteção, que foi adicionado posteriormente na solução concentrada de
bactérias.
30
O ensaio crônico, por sua vez, se caracteriza por demonstrar respostas num período de
tempo maior de exposição do organismo perante a amostra testada, período esse que abrange
parte ou todo o ciclo de vida do organismo. No caso da bactéria Vibrio fischeri em
crescimento, são aproximadamente seis gerações que estarão em exposição aos efeitos da
amostra.
Neste ensaio, as leituras foram realizadas antes da adição da amostra, 30 min e 24
horas. A comparação de diferenças de luminescência foi realizada, entre a luminescência do
32
3.2.4 Método G1
Várias técnicas podem ser utilizadas no cultivo de Daphnia sp, desde que sejam
mantidos os padrões de qualidade, sanidade e nutrição dos organismos exigidos na norma
34
NBR 12713 que está em fase de normatização institucional, bem como das normas
internacionais, dentre elas a norma ISO 6341, norma DIN 38412-L30
Para o preparo da água reconstituída que servirá para o cultivo e a diluição da amostra
no momento dos ensaios foram preparadas soluções estoques e armazenadas em recipientes
de vidros ao abrigo de luz. Estas soluções posteriormente combinadas formarão a água de
cultivo e diluição. No quadro 3.1 são apresentados os reagentes para a formação das soluções
estoques.
4 NaHCO3 64 800
MnCl2.4H2O 7 210
LiCl 6 120
RbCl 1 420
5 SrCl2.6H2O 3 040
CuCL2.2H2O 335
ZnCl2 260
CoCl2.6H2O 200
NaNO3 548
H3BO3 5 719
NaBr 32
6 Na2MoO4.2H2O 126
NH4VO3 1,15
KI 6,5
NaSe2O3 4,38
7 Na2SiO3 21 465
Na2EDTA.7H2O 500
8
FeSO4.7H2O 199,1
KH2PO4 286
9
K2HPO4 368
Hidrocloreto de Tiamina 750,0
Cianocabalamina
10 10,0
(Vitamina B12)
D (+) Biotina 7,5
Quadro 3.1 – Soluções estoque para preparo da água de cultivo (meio M-4)
Solução 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Volume (mL) 3,2 0,8 0,8 0,8 0,1 0,5 0,2 5,0 0,5 0,1
Quadro 3.2 - Volume das soluções estoque necessárias para o preparo de 1000 ml de água de
cultivo.
Quadro 3.3 - Elementos traços e suas respectivas concentrações para preparo da solução
estoque.
Quadro 3.4 – Quantidade de macro-nutrientes para a formação das soluções isoladas e sua
quantidade para a posterior formação do Meio M4.
Vários tipos de algas verdes podem ser utilizados para alimentação de Daphnia
magna, como por exemplo, Scenedesmus subspicatus. As algas podem ser cultivadas por
qualquer método que seja adequado ao seu crescimento, desde que tomados os cuidados
necessários para evitar a contaminação por bactérias e fungos.
Recomenda-se o fornecimento diário de alimento às Daphnias, evitando deixar os
organismos por mais de 2 dias consecutivos sem alimentação. A quantidade a ser fornecida
deve ser de aproximadamente 1 mL de suspensão algácea com densidade em torno de 106
células/mL por organismo adulto.
Para o cultivo das algas, foi necessária a preparação de soluções estoque que, foram
utilizados para a formação do meio de cultivo de algas, chamados de meio CHU como
descrito no Quadro 3.5.
Solução
Reagente Quantidade (mg/L)
1 NaNO3 25 000
2 CaCl2.2H2O 2 500
3 MgSO4.7H2O 7 500
4 K2HPO4 7 500
5 KH2PO4 17 500
6 NaCl 2 500
C10H14N2Na2O8.2H2O 50 000
7
KOH 31 000
39
8 FeSO4.7H2O 4 980
9 H3BO3 11 420
ZnSO4.7H2O 8,82
MnCl2.4H2O 1,44
10 MoO3 0,71
CuSO4.5H2O 1,57
Co(NO3).6H2O 0,49
Quadro 3.5 – Elementos para o preparo das soluções estoque para o meio de cultura (meio
CHU)
Neste trabalho os ensaios com Daphnia magna foram realizados com o principal
objetivo de comparação de métodos.
Cada ensaio crônico de toxicidade teve duração de 21 dias. Foram utilizados filhotes
entre 6 a 24 horas, que foram mantidos em observação e alimentação diárias. O ensaio
realizado foi semi-estático sendo necessárias trocas periódicas do meio líquido, no mínimo
duas vezes por semana. Os filhotes produzidos por cada matriz foram retirados e registrados
em tabelas, diariamente no período de 21 dias, duração do teste. (Apêndice F)
A alimentação foi realizada com algas frescas (Scenedesmus subspicatus) no mesmo
padrão de cultura dos organismos. O ensaio foi mantido a uma temperatura de 20 °C + 2°C,
num fotoperíodo de 16 horas luz. Os recipientes do ensaio não podem ser aerados durante o
período do teste. O objetivo do teste é a determinação do efeito da substância no número total
de filhotes vivos por matriz viva no final do teste.
Ikt
Fkt = (1)
Io
Onde:
Fkt é o fator de correção da emissão de luz para os tempos de contato de 15 ou 30
minutos;
Ikt é a intensidade luminosa da suspensão controle após o tempo de contato de 15 ou
30 minutos em unidades de luminescência relativa;
Io é a intensidade luminosa da suspensão controle imediatamente antes da adição do
agente-teste, em unidades de luminescência relativa;
Os valores de Fkt são calculados para as suspensões controle. Após este procedimento,
o Ict (valor corrigido de Io), é calculado para os valores de luminescência inicial.
Ict − Iti
Ht = x100 (3)
Ict
Ht (4)
Tt =
100 − Ht
lg ct = b lg Tt + lg a (5)
Iti
Ht = 100 − (100 x ) (6)
Cti
Segundo a norma NBR 12713, para Daphnia magna, no ensaio agudo, o resultado é
direto ao percentual de inibição da movimentação. Ao final do ensaio é calculada a
porcentagem de imobilidade para cada concentração em relação ao número total de
organismos utilizados no ensaio. Determina-se o fator de diluição pela relação direta na
solução mais diluída onde for observada uma imobilidade superior ou igual 10%,
Conforme a norma OECD TG 211, o número total de filhotes vivos por matriz é
registro necessário para cada béquer do ensaio. A média de produção por replicata para cada
concentração através do número de filhotes por béquer deve ser calculada.
Esta média, então, deve ser comparada com a média dos controles utilizando algum
método estatístico de comparação para verificação da homogeneidade, no caso o método
utilizado foi análise ANOVA para a análise de variação. O teste de comparações múltiplas de
Bonferroni foi utilizado para avaliação da variação entre controle e concentrações, auxiliado
pelo programa estatístico Statgraph (MS-DOS). A última diferença significante deve ser
calculada e informada como representativa da mais baixa concentração de efeito observada, e
também a concentração onde nenhum efeito significativo foi observado.
Para o teste ser considerado válido, os seguintes critérios devem ser seguidos:
• Os organismos devem ser expostos ao teste durante 21 dias;
• A mortalidade dos adultos no controle deve ser menor que 20% no final do
teste;
• A presença de efípios no controle deve ser menor que 20% no final do teste;
• O número médio de filhotes por animal no controle maior que 60.
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Agudo Crônico
Nº Ensaio Concentração Nº Ensaio Concentração
01 0,5 04 0,015
02 0,5 05 0,015
03 0,5 06 0,031
Média 0,5 Média 0,020
Desvio Padrão 0 Desvio Padrão 0,009
Ensaio Crônico
Nº Ensaio Concentração
07 0,083
08 0,083
09 0,041
Média 0,069
Desvio Padrão 0,024
Quadro 4.2 – Valores de concentração em mg/L de Cromo VI que causaram cerca de 20% de
inibição nos ensaios crônicos, com a concentração inicial da amostra de 0,25 gm/L.
30
Inibição da Luminescência (%)
20
10
0
0.0625 0.0833 0.125 0.1667 0.25 0.3333 0.5 0.6667
-10
-20
-30
Concentração CromoVI (mg/L)
Gráfico 4.1 – Variação dos valores de inibição da luminescência no ensaio crônico 12, após
24 horas de exposição à substância referência cromo VI sem agitação prévia.
Ensaios Crônicos
Nº Ensaio Concentração Concentração após agitação
12 Sem inibição
13 0,33 0,66
17 0,06 0,08
Média 0,19 0,37
Desvio padrão 0,19 0,41
Quadro 4.3 – Valores de concentração de cromo VI em mg/L, que causaram cerca de 20% de
inibição no ensaio crônico, antes e após agitação do sistema teste.
52
400
Sem agitação
Tempo de incubação Com Agitação
0 30min 24 h
Luminescência (Irel) 1339,5 1056,16 1840,83 5121,5
Com a limitação dos nutrientes é possível então, neste caso, diminuir o crescimento
bacteriano, mas com a possibilidade de não haver influências na luminescência, que é o fator
verificado para indicação da toxicidade, e não o crescimento.
Os ensaios foram repetidos e foi observada a mesma configuração de valores que
foram obtidos nos ensaios anteriores de teste de meio de reconstituição, sendo que a
luminescência se manteve ao final das 24 horas, mas aumentando quando exposta à agitação
como pode ser observado no gráfico 4.3.
3000
2500
Luminescência
2000
Ensaio 01
1500
Ensaio 02
1000
500
0
0 5 10 15 20 25 30
Tem po (h)
Gráfico 4.3 – Perfil da luminescência durante o período de ensaio utilizando o meio composto
por 50% de SSWC e 50% de solução salina 20g/L.(Ensaios 01 e 02)
80
Tempo 0
60
Tempo 24 horas
40
20
0
0
Concentração Am ostra (%)
Pode-se dizer que com o não aumento, ou até o decréscimo de biomassa no tubo teste,
o efeito dose X resposta neste caso, será contrária do que acontecia nos ensaios preliminares,
com um número menor de organismos, o efeito do agente tóxico será maior.
Mas no teste em questão, o indicativo de toxicidade é a luminescência, e esta se manteve até o
final do ensaio mesmo que a biomassa tenha aparentemente sido reduzida.
Segundo White (2000), as bactérias só emitem luz quando estão a uma concentração
celular, que permite a concentração de um sinal espécie-espécie, o autoindutor. E esta
acumulação só ocorre em populações com concentrações celulares acima de 10 7 / mL.
Se o sistema testado manteve a luminescência até o final do ensaio, isto indica que as
concentrações celulares eram suficientes para haver o acúmulo do autoindutor.
Com esta indicação, pode-se concluir que o meio de reconstituição reformulado é apto
a ser utilizado nos ensaios.
O valor da média de concentração de cromo VI, após a agitação, foi calculado levando
em consideração apenas os ensaios que demonstraram perfis de inibição mais coerentes,
excluindo os ensaios 22 e 33.
O gráfico 4.5, demonstra um perfil de inibição encontrado em um dos ensaios
realizados, no tempo de leitura sem agitação prévia dos tubos. Não houve inibição acima de
20%, até uma concentração inicial de 1mg/L de cromo VI.
58
15
0
0.0833 0.125 0.1667 0.25 0.3333 0.5 0.6667 1
-5
-10
-15
Concentração CromoVI (mg/L)
Gráfico 4.5 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico com
leitura 24 horas sem agitação prévia, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30,
concentração inicial 2 mg/L).
25
Inibição da Luminescência (%)
20
15
10
5
0
-5 0.166667 0.25 0.333333 0.5 0.666667 1
-10
-15
Concentração CromoVI (mg/L)
Gráfico 4.6 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico, após
agitação, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30, concentração inicial 2mg/L).
59
20
Inibição da Luminescência (%)
15
10
0
0.0039 0.0078 0.0156 0.0313 0.0625 0.125 0.25 0.5 1
-5
Concentração Cromo VI (mg/L)
Gráfico 4.7 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após 30
minutos com a substância referência cromoVI.(2 mg/L)
Apesar dos resultados sofrerem variação para uma mesma cinética, e alguns dos
resultados não terem uma coerência lógica, para a substância referência cromo VI, nestes
ensaios com meio de reconstituição reformulado, o teste de toxicidade crônica não se mostrou
mais sensível que o teste agudo.
A partir destes resultados, testou-se o ensaio crônico com a segunda substância
referência, o 3,5 Diclorofenol, para observar o comportamento da substância no sistema,
tendo características químicas diferentes da do cromo VI que é um metal.
O 3,5 diclorofenol foi obtido para a realização dos ensaios com o auxílio do
laboratório da Universidade do Vale do Itajaí, sendo que a venda dessa substância é
controlada.
No ensaio de toxicidade aguda com o bioindicador Vibrio fischeri, a concentração de 6
mg/L de 3,5 diclorofenol deve causar de 20 a 80% de inibição da emissão de luz conforme
norma ISO 11348(1998).
No ensaio de sensibilidade, em termos de porcentagem, os resultados do ensaio agudo
tiveram, em média, 65% de inibição da luminescência, em contato com 6mg/L de 3,5
diclorofenol, ficando dentro dos limites estabelecidos pela norma ISO 11348(1998).
Para os ensaios de toxicidade aguda neste trabalho, foram utilizadas concentrações
iniciais entre 25 e 50 mg/L.
Os valores obtidos nos ensaios com a substância referência 3, 5 diclorofenol que
causaram cerca 20 % de inibição, são apresentados no quadro 4.6. Os valores foram obtidos
através da relação direta do percentual de inibição, com a concentração do agente teste
utilizado no ensaio.
Os ensaios agudos, com o bioindicador Vibrio fischeri, não indicaram variações,
ficando o ponto de inibição estável em relação à concentração utilizada, demonstrando a boa
reprodutibilidade dos resultados.
61
Nº Ensaio Concentração
25 1,56
28 1,56
29 1,56
Média 1,56
Desvio Padrão 0
30
Inibição da Luminescência (%)
20
10
0
0.2083 0.3125 0.4167 0.625 0.8333 1.25 1.6667 2.5
-10
-20
-30
-40
Concentração 3,5 Diclorofenol (mg/L)
Gráfico 4.8 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após
24 horas com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24h sem agitação dos tubos,
concentração inicial 5mg/L)
Seguindo o mesmo padrão dos ensaios com a substância referência cromo VI, nos
ensaios com 3,5 diclorofenol, também houve variações de valores mensurados dentro da
mesma cinética, e nas repetições paralelas, principalmente nas 24 horas sem agitação prévia.
63
Mais uma vez, ficou evidenciado que os valores medidos por luminometria,
dependiam da manipulação dos tubos no momento da medição, o que é uma possível
explicação para grandes oscilações dos valores, como os encontrados no tempo 24 horas sem
agitação.
Apesar da grande variação das medidas no tempo de 24 horas sem agitação do sistema
teste, após a agitação dos tubos (Gráfico 4.9), os valores de inibição traçados formam uma
curva de inibição, sendo possível o cálculo da concentração causadora de inibição. Esse
comportamento também foi observado para a substância referência cromo VI, retomando a
questão do ensaio necessitar agitação durante o período de incubação.
É provável, que no período de 24 horas onde o tubo de leitura fica estático, formem-se
estratificações no próprio meio. As bactérias viriam a decantar, formando uma região mais
densa no fundo dos tubos, que seriam as “nuvens brancas” observadas anteriormente. Após a
reformulação do meio, este fato não foi mais observado com intensidade, mas não significa
que a decantação das bactérias não esteja acontecendo. Nesta decantação das bactérias, poderá
acontecer um déficit de oxigênio nas áreas mais profundas, onde o acúmulo de bactérias é
maior. Quando o tubo é levemente agitado no momento da medição, o oxigênio é
disponibilizado, conseqüentemente havendo um aumento instantâneo de luminescência.
Quando os tubos são agitados no shaker, o sistema teste é homogeneizado e recebe
oxigênio adicional do ar. Com isso, no sistema enzimático, a limitação do substrato oxigênio é
diminuída ou até eliminada.
64
70
-20
Concentração 3,5 Diclorofenol (mg/L)
Gráfico 4.9 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após
agitação dos tubos com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24, concentração
inicial 5mg/L)
80
60
40
20
0
0.0488 0.0977 0.1953 0.3906 0.7813 1.5625 3.125 6.25 12.5
-20
Concentração Cromo VI (mg/L)
Gráfico 4.10 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após
30 minutos com a substância referência 3,5 diclorofenol.(25mg/L)
O sistema teste de toxicidade crônica, com a bactéria luminescente Vibrio fischeri, foi
aplicado a uma matriz complexa de água natural superficial. Três amostras compostas de água
de rio foram sujeitas a bioensaios de toxicidade aguda e crônica com ambos os bioindicadores
usados neste trabalho, e a ensaios físico-químicos.
Para os demais itens analisados, os resultados ficaram dentro dos padrões exigidos
pelo decreto. A princípio, pelos resultados das análises, as amostras não apresentam
características físico-químicas que afetariam o ambiente significativamente.
Quadro 4.8 – Valores da CE20 e Fator de diluição para as amostras de água superficial no
ensaio de toxicidade aguda.
67
No gráfico 4.11, pode-se observar o perfil da curva de inibição nas três amostras. Para
as amostras 1 e 3, foi possível o cálculo de fator de diluição e concentração efetiva, sendo que
para amostra 2 os valores de inibição não ultrapassaram 20% para todas as diluições testadas.
A B
60 60
Inibição Luminescência (%)
50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
-10 -10
Concentração da amostra (%) Concentração da amostra (%)
C
60
50
Inibição Luminescência (%)
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
-10
-20
Concentração da amostra (%)
Gráfico 4.11 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio agudo após 30 minutos para as
3 amostras de água superficial, a) amostra 1, b) amostra 2, c) amostra 3.
Ensaios crônicos com a bactéria luminescente Vibrio fischeri, foram realizados com as
amostras de água superficial utilizando o método G1 na presença do meio de reconstituição
adaptado, demonstrado na secção 4.2.
O ensaio crônico para as amostras de água superficial teve um comportamento
satisfatório. Não houve crescimento demasiado de biomassa bacteriana, e também não houve
aumentos muito acentuados de leitura da emissão de luz após a agitação dos tubos.
68
Quadro 4.9 – Valores de CE20 e fator de diluição para as amostras de água superficial no
ensaio de toxicidade crônica.
No gráfico 4.12, são apresentadas as curvas de inibição para o ensaio crônico. Para a
amostra número 2, que no ensaio de toxicidade aguda, não apresentou inibição acima de 20%,
no ensaio de toxicidade crônica aqui demonstrado, todos os pontos de inibição ficaram acima
de 20%.
As amostras 1 e 3 mostram um perfil coerente de inibição. A amostra 2 não foi diluída
o suficiente para mostrar o perfil de inibição abaixo de 50%.
Apesar dos ensaios 1 e 3 terem fornecido um perfil de inibição coerente, é preciso
tomar cuidado na interpretação dos resultados, devido a elevada variação dos resultados
ocorridos nas repetições paralelas da mesma diluição.
Isso demonstra talvez que a problemática das variações no ensaio crônico, está mais
voltada para o método utilizado para medição da luminescência, do que para a formulação do
meio de reconstituição.
69
A B
100 100
80
60
40 60
20
40
0
0 20 40 60 80 100 120
-20 20
-40
0
-60 0 20 40 60 80 100 120
Concentração amostra (%) Concentração amostra (%)
C
100
Inibição luminescência (%)
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração amostra (%)
Gráfico 4.12 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio crônico após 24 horas para as 3
amostras de água superficial.a) amostra 1, b) amostra 2 c) amostra 3.
Foram realizados ensaios de toxicidade aguda com as substâncias referência cromo VI,
3,5 diclorofenol e com as amostras de água superficial.
70
Nos quadros 4.10 a 4.12 são apresentados os resultados dos ensaios agudos, para as
duas substancias referencias e as amostras de água superficial.
A primeira substância referência testada foi o cromo VI. Para uma concentração inicial
de 4 mg/L de cromo VI, foram realizadas 7 diluições geométricas, chegando-se a um fator de
diluição de 1 parte para 128, ou seja, aproximadamente 0,03 mg/L de cromo VI, na série mais
diluída. As daphnias foram colocadas em contato com as diluições, e após 48 horas os
resultados observados.
Para o ensaio agudo, considera-se o ponto de inibição da movimentação, onde são
encontrados 10% ou mais dos indivíduos imóveis. No quadro 4.10 são apresentados os
resultados para a substância referência cromo VI. Uma concentração de 0,125 mg/l de cromo
VI na amostra, causou inibição de mais de 50% nos indivíduos. A uma concentração de 0,06
mg/L de cromo VI, não são mais observados resultados de inibição significativos.
Expressando o resultado em fator de diluição, este seria no valor de 64.
Para a substância referência cromo VI, no ensaio agudo, o bioindicador Daphnia
magna se mostrou mais sensível, se comparado com Vibrio fischeri. Em média para Vibrio
fischeri, 0,5 mg/L de cromo VI, causaram 20% de inibição nos ensaios de toxicidade aguda. A
mesma quantidade da substância para o bioindicador Daphnia magna, causa 100% de
imobilidade dos indivíduos.
Quadro 4.10 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais
de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância cromo VI.
Os ensaios com a substância referência 3,5 diclorofenol foram realizados nos mesmos
padrões dos ensaios com cromo VI, contendo o mesmo número de série de diluições, sendo
71
que a concentração inicial da amostra foi de 10 mg/L. Os resultados deste ensaio estão
descritos no quadro 4.11.
Quadro 4.11 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais
de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância 3,5 diclorofenol.
Amostra 1
Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem de
diluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)
1 100 0 20 0.00
0 0 0 20 0.00
Fator de diluição: 1
Amostra 2
Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem de
diluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)
1 100 2 18 10.00
0 0 0 20 0.00
Fator de diluição: 1
Amostra 3
Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem de
diluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)
1 100 1 19 5.00
0 0 0 20 0.00
Fator de diluição: 1
Quadro 4.12 – Valores agrupados dos ensaios agudos de Daphnia magna com os respectivos
percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para as três amostras de água
superficial.
A diluição inicial foi de 1 para 128 vezes, sendo que, na primeira série de diluição,
havia uma concentração 0,03 mg/L da substância referência cromoVI. Foram realizadas 4
séries de diluição geométrica onde a menor concentração ficou em 0,004 mg/L de cromo VI
na amostra. Os resultados são apresentados no quadro 4.13.
Em média para as diluições com a substância referência e controle, 90% dos
indivíduos apresentavam-se prenhes no 5º. dia, tendo seus primeiros filhotes no 6º. dia.
Houve diferença no número de filhotes entre as diluições dentre elas e o controle. Este
resultado pode ser observado no quadro 4.14. Utilizando-se do método estatístico ANOVA
podemos confirmar que existe uma diferença significante entre todas as amostras, com um F=
45.364 e P=0,0000.
O objetivo do ensaio é verificar quais séries de diluições diferem perante o controle.
Sendo que para isto utilizou-se o método estatístico de comparações múltiplas Bonferroni,
onde este afirma que todas as amostras diferem com significância do controle.
A mais baixa concentração de efeito observada para este ensaio foi portanto, de
0,004 mg/L de cromo VI. Todas as diluições testadas apresentaram efeitos tóxicos
significativos, sendo que não foi possível a determinação da menor concentração de efeito da
substância teste.
Os resultados obtidos indicam a grande sensibilidade do bioindicador Daphnia
magna para a substância referência cromo VI, se comparado com Vibrio fischeri. A uma
concentração de somente 0,004 mg/L os resultados indicaram um efeito tóxico significativo
no ensaio com Daphnias,enquanto que para Vibrio fischeri esse valor ficou em torno de 0,5
mg/L. Este valor de concentração encontrado no ensaio com Daphnia magna, corresponde, a
faixa de sensibilidade de um equipamento AAS (Absorção Atômica), na quantificação deste
metal.
Diluição
Número total Controle 128 256 512 1024
de filhotes 3004 1210 1382 1318 2092
Média 100.1 40.2 46.0 43.9 69.7
Desvio Padrão 23 13.4 17.9 22.6 23.1
Quadro 4.13 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada série de
diluição e controle.(agrupamento de três repetições)
74
Após os ensaios crônicos com a substância referência cromo VI, foram realizados os
ensaios crônicos com as amostras de água superficial.
Nas amostras de água superficial no ensaio agudo, foi observada morte de pelo
menos 1 animal em alguma amostra, sendo que para o ensaio crônico, estabeleceu-se a
diluição inicial de ½ da amostra para assegurar a sobrevivência dos indivíduos para a
realização do ensaio. Outro fator que levou à diluição da amostra, foi, a característica das
amostras conterem uma alta condutividade, resultado da presença de íons em concentração
elevada. As amostras continham valores mais elevados de cloretos, por serem coletadas numa
região de influência marítima. A diluição da amostra foi necessária, diminuindo a sua
condutividade, para poder ser utilizada com Daphnia magna.
Os resultados do ensaio crônico de toxicidade com o bioindicador Daphnia magna
são apresentados no quadro 4.14.
Através da análise dos resultados ficou definido que não houve diferença estatística
entre o controle e os demais grupos, sendo F= 1.091 e P=0.365. As análises utilizadas
seguiram os mesmos padrões do ensaio com cromo VI, utilizando o teste estatístico ANOVA
e Bonferroni.
Sendo assim, as amostras testadas não influenciaram na reprodução do bioindicador
Daphnia magna.
Comparando os resultados obtidos neste ensaio crônico, o ensaio com o bioindicador
Vibrio fischeri, demonstrou mais sensibilidade para as amostras de água superficial, indicando
resultados de inibição da luminescência.
Quadro 4.14 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada amostra de
água superficial com uma série de diluição.
Com relação aos métodos utilizados nos ensaios crônicos, comparando-os, o ensaio
com o bioindicador Vibrio fischeri demonstrou algumas variações que resultaram do processo
75
5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
REFERÊNCIAS
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas – Projeto NBR 12713, Água - Ensaio de
p.41-47,1999.
BACKHAUS, T. et al. Toxicity testing with Vibrio fischeri: a comparison between the long
term (24h) and the short term (30min) bioassay.Chemosphere, Germany,v.35,n. 12,p. 2925-
2938,1997.
utilizando Daphnia magna, Poecilia reticulata e Vibrio fischeri como bioindicadores. In: III
Safety, Tennessee,v.39,p.65-69,1997.
Toxicologia, Lisboa,1999.
EL-ALAWI, Yousef S. et al. Measurement of short and long term toxicity of polycyclic
FROEHNER, K.; BACKHAUS, T.; GRIMME, L. H.. Bioassays with V. fischeri for the
FROEHNER, K.; MEYER, W.; GRIMME, L. H.. Time-dependent toxicity in the long-term
comparative study between Microtox and activated sludge oxygen uptake inhibition. Water
HERNANDO,M.D. et al; Combined toxicity effects of MTBE and pesticides measured with
Vibrio fischeri and Daphnia magna bioassays. Water Research, 37 Jun., p. 4091-4098,2003.
determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio
LAPPALAINEM, Juha, et al; Automated color correction method for Vibrio fischeri toxicity
test. Comparison of standard and kinetic assays. Chemosphere, Finland, v. 45, p.635-
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PEINADO M.T., et al. Correlation of two bioluminescence ad one fluorognic bioassay for the
detection of toxic chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety, Spain, v. 53, p.170-
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VILLARROEL, M.J; et al. Acute, chronic and sublethal effects of the herbicide propanil on
WHITE, David. The physiology and biochemistry of prokaryotes. 2 ed. New York, Oxford
GLOSSÁRIO
Para clareza das expressões, segue a seguir uma listagem de definição de termos técnicos
APÊNDICES
lgct=blgTt+lga
A=
B=
88
y x
Γt LogTt LogC onc LogG am a G am
aLinR
eg.
G
am maLogdeG
am
maLogconcentração A
justada 0.000
0.000 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600
-0.100
0.031 -1.516 -0.709 -1.5698 0.0269
-0.200
0.077 -1.115 -0.408 -1.4316 0.0370 -0.300
y=0.4592x-1.2442
2
R=0.8931
0.050 -1.305 -0.107 -1.2934 0.0509 -0.400
-0.600
0.070 -1.157 0.495 -1.0171 0.0961
-0.700
0.149 -0.828 0.796 -0.8789 0.1322
-0.800
0.148 -0.830 1.097 -0.7407 0.1817
-0.900
0.266 -0.575 1.398 -0.6025 0.2497 -1.000
C
oncentração C
oncetração
Ht Γt LogTt Ajustada Efetiva
20 0.250 -0.602 1.398 25.03
lgct=blgTt+lga 30 0.429 -0.368 1.908 80.94
40 0.667 -0.176 2.326 211.85
50 1.000 0.000 2.709 512.27
60 1.500 0.176 3.093 1238.71
80 4.000 0.602 4.021 10485.79
A= -1.242 90 9.000 0.954 4.788 61312.50
B= 0.4592
89
A
pêndiceC-PlanilhaExcelutilizadaparaanálisedosresultadosdoensaiocrônicocom
Vibriofisheri
C
ronicosegundoB
ackhaus
Io Lum
inscêncianocontroleantesdaadicãodaam
ostra
H t H t Γt LogTt
Q tdadedefd Concentr.%TempoT=0 T=24h m édiacontro%
inibiçãoM
édia%inib G
ammaLogdeG
am
m
a
C rom om
g/L 1 763.6 18371984.50
B
C C1 771.7 2132 2015.50
% inibição 2 760.8 23032046.50
B
C C2 761 1790
Iti 3 734 1734
B 13.97 14.66 0.172 -0.765
t=10−(10x)
H 0.015625256 0.3906 C 3 77.2 1706 15.36
Cti 0.03125128 0.7813 C
4 754.1 1524
B
4 765.5 1450
24.39 26.22
28.06
0.355 -0.449
5 760.8 1466
B 27.26 27.09 0.372 -0.430
H t efeitodeinibição 0.0625 64 1.5625 C 5 789.5 1473 26.92
Iti lum inescenciadepois24h 6 757.8 1281
B 36.44 30.19 0.432 -0.364
C ti luminescenciadocontroleapós20.125 32 3.125 C 6 780.8 1533 23.94
7 749.3 751.1
B 62.73 60.97 1.562 0.194
0.25 16 6.25 C 7 755.5 822.1 59.21
8 757.6 203.8
B 89.89 88.77 7.904 0.898
0.5 8 12.5 C 8 781.8 248.9 87.65
G ama H
m t 9 770.6 104.6
B 94.81 94.62 17.576 1.245
Tt= 1 4 25 C 9 781 112.4 94.42
100−H t B10 781.1 27.14 98.65 98.65 72.828 1.862
2 2 50 C 10 795.2 27.46 98.64
b 256
FD
CE
20 0.62
90
LogC onc G
am
aLinR
eg.
Logconcentração
G
am ma Loggam C
onc.A
justadaC
oncentraçãoEfetiva
20 0.250 -0.602 -0.204 0.62
30 0.429 -0.368 0.216 1.65
40
50
0.667 -0.176 0.561
1.000 0.000 0.878
3.64
7.55
lgct=blgTt+lga
60 1.500 0.176 1.194 15.64
80 4.000 0.602 1.960 91.17
90 9.000 0.954 2.593 391.58
91
Foto 6 – Acondicionamento dos frascos Becker no ensaio crônico para serem colocados na estufa
92
DadosdeAnálise ToxicidadeagudacomDaphniamagna(Adaptadaadureza200)
ResultadosanalisadosconformeABNT12713 FD(D)noteste: 64
OsvaloresparacálculodoFatordediluiçãosãoconsiderados Pré-diluição: 1
apartirde10%oumaisdeimobilidadedosorganismos FD(D): 64
94
Apêndice F – Planilha utilizada para controle nos ensaios crônicos com Daphnia Magna
o
ExperiênciaN D
ataInício: C
lone: M
édia: TipodeC
om
ida: Substânciateste C
oncentração:
D
ia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
R
enovação
novo
PH
velho
O novo
2m
g/l
velho
novo
p(oC
Tem )
velho
A
lim
entação
o
Nfilhotesvivos
Total
B
equer1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total
o
NA
dultosm
ortos
95
ANEXOS
95
ANEXOS
Número
Relatório de análises 757
Cliente: ***** Data: 19/06/04 página: 1 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258
Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974”
Número de registro: 838
Início da amostragem: 02/06/2004 12:00
Final da amostragem: 03/06/2004 15:30
Data da recepção: 03/06/2004 16:30
Análises Físico-Químicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
A001. pH Sonda n.p. 6,81
A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC
A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 5,36 mg/L
A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 44,3 mg/L
A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L)
A007. Cor aparente - U Fotometria n.p. 224 U Pt/Co
Pt/Co
A014-1. Sólidos Gravimetria n.p. 66 mg/L
suspensos totais - SST
A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (<0,0015 mg/L)
A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 n.d. (<0,23 mg/L)
A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,024 mg/L
A021. Fósforo total Fotometria n.p. 1,60 mg/L
A023. Cianetos - Fotometria 0,2 mg/L n.d. (<0,025 mg/L)
facilmente liberáveis
A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 730 mg/L
A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,122 mg/L
A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d. (< 0,005 mg/L)
A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L)
A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L)
A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,961 mg/L
A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d. (< 0,005 mg/L)
A035. Magnésio Fotometria n.p. 156,4 mg/L
A038-1. Níquel AAS n.p. n.d. (< 0,006 mg/L)
A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L n.d. (0,02 mg/L)
A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L)
A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L)
A047. Detergentes Fotometria 0,5 mg/L 0,475 mg/L
aniônicos
A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (< 0,05 mg/L)
A058. Sulfitos Fotometria n.p. n.d (< 0,1 mg/L)
A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,545 mg/L
A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 1,2 mg/L
A063. Nitrogênio Fotometria 0,5 mg/L 0,127 mg/L
amoniacal
A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (<0,005 mg/L)
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br
96
Número
Relatório de análises 757
Cliente: ***** Data: 19/06/2004 página 2 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Análises Microbiológicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Totais em Água – 5 x 103 / 100mL 3,0 x 104 / 100mL
quantitativo
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Fecais em Água – 1 x 103 / 100mL 1,9 x 103 / 100mL
quantitativo
Observações:
Coletor das amostras: Umwelt
Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão.
A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for
the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998).
Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT.
n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção
n.p. = não previsto no Decreto 14.250
Condições de coleta:
_________________________ _________________________
Nilma J. Furtado Saar Dr. Jörg Henri Saar
Bióloga Responsável Diretor Técnico
CRB: 28324-03D
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br
97
Anexo B – Laudo de análises físico-químicas da Amostra 2
Número
Relatório de análises 758
Cliente: ***** Data: 19/06/04 página: 1 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258
Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974”
Número de registro: 841
Início da amostragem: 04/06/2004 10:00
Final da amostragem: 05/06/2004 14:15
Data da recepção: 05/06/2004 17:00
Análises Físico-Químicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
A001. pH Sonda n.p. 7,07
A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC
A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 4,62 mg/L
A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 51,5 mg/L
A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L)
A007. Cor aparente - U Fotometria n.p. 253 U Pt/Co
Pt/Co
A014-1. Sólidos Gravimetria n.p. 63 mg/L
suspensos totais - SST
A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (<0,0015 mg/L)
A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 0,317 mg/L
A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,039 mg/L
A021. Fósforo total Fotometria n.p. 2,76 mg/L
A023. Cianetos - Fotometria 0,2 mg/L n.d. (<0,025 mg/L)
facilmente liberáveis
A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 540 mg/L
A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,235 mg/L
A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d (< 0,005 mg/L)
A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L)
A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L)
A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,820 mg/L
A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d (< 0,005 mg/L)
A035. Magnésio Fotometria n.p. 219 mg/L
A038-1. Níquel AAS n.p. n.d. (< 0,006 mg/L)
A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L n.d. (< 0,02 mg/L)
A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L)
A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L)
A047. Detergentes Fotometria 0,5 mg/L 0,620 mg/L
aniônicos
A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (<0,05 mg/L)
A058. Sulfitos Fotometria n.p. 0,100 mg/L
A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,607 mg/L
A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 2,0 mg/L
A063. Nitrogênio Fotometria 0,5 mg/L 0,114 mg/L
amoniacal
A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (<0,005 mg/L)
A071. Selênio AAS 0,01 mg/L n.d. (<0,002 mg/L)
A072. Sulfeto de Carbono CG 0,005 mg/L 0,015 mg/L
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br
98
Número
Relatório de análises 758
Cliente: ***** Data: 19/06/2004 página 2 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Análises Microbiológicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Totais em Água – 5 x 103 / 100mL 4,0 x 104 / 100mL
quantitativo
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Fecais em Água – 1 x 103 / 100mL 1,0 x 104 / 100mL
quantitativo
Observações:
Coletor das amostras: Umwelt
Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão.
A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for
the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998).
Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT.
n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção
n.p. = não previsto no Decreto 14.250
Condições de coleta:
_________________________ _________________________
Nilma J. Furtado Saar Dr. Jörg Henri Saar
Bióloga Responsável Diretor Técnico
CRB: 28324-03D
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br
99
Anexo C – Laudo de análises físico-químicas da Amostra 3
Número
Relatório de análises 759
Cliente: **** Data: 19/06/04 página: 1 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258
Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974”
Número de registro: 846
Início da amostragem: 06/06/2004
Final da amostragem: 07/06/2004 14:30
Data da recepção: 07/06/2004 18:00
Análises Físico-Químicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
A001. pH Sonda n.p. 7,37
A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC
A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 5,25 mg/L
A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 51 mg/L
A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L)
A007. Cor aparente - U Fotometria n.p. 181 U Pt/Co
Pt/Co
A014-1. Sólidos Gravimetria n.p. 26,5 mg/L
suspensos totais - SST
A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L)
A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 n.d. (<0,23 mg/L)
A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,018 mg/L
A021. Fósforo total Fotometria n.p. 3,91 mg/L
A023. Cianetos - Fotometria 0,2 mg/L n.d. (<0,025 mg/L)
facilmente liberáveis
A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 525 mg/L
A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L)
A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,270 mg/L
A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d (< 0,005 mg/L)
A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L)
A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L)
A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,677 mg/L
A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d (< 0,005 mg/L)
A035. Magnésio Fotometria n.p. 236,3 mg/L
A038-1. Níquel AAS n.p. n.d (< 0,006 mg/L)
A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L 0,218 mg/L
A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L)
A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L)
A047. Detergentes Fotometria 0,5 mg/L 0,651 mg/L
aniônicos
A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (<0,05 mg/L)
A058. Sulfitos Fotometria n.p. n.d. (< 0,1 mg/L)
A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,681 mg/L
A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 3,2 mg/L
A063. Nitrogênio Fotometria 0,5 mg/L 0,246 mg/L
amoniacal
A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (< 0,005 mg/L)
A071. Selênio AAS 0,01 mg/L n.d. (< 0,002 mg/L)
A072. Sulfeto de Carbono CG 0,005 mg/L n.d. (<0,005 mg/L)
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br
100
Número
Relatório de análises 759
Cliente: **** Data: 19/06/2004 página 2 de 2
Endereço: ***** Piçarras SC
Análises Microbiológicas
Análise Metodologia Padrões de Qualidade Resultado
da Água – Classe 2 –
Decreto 14.250 (SC)
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Totais em Água – 5 x 103 / 100mL 1,5 x 105 / 100mL
quantitativo
M003-2. Coliformes Membrana filtrante
Fecais em Água – 1 x 103 / 100mL 3,0 x 104 / 100mL
quantitativo
Observações:
Coletor das amostras: Umwelt
Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão.
A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for
the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998).
Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT.
n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção
n.p. = não previsto no Decreto 14.250
Condições de coleta:
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Nilma J. Furtado Saar Dr. Jörg Henri Saar
Bióloga Responsável Diretor Técnico
CRB: 28324-03D
UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428
Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: labor@umwelt-sc.com.br