LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI

No. Praktikum : 04
Hari/Tanggal : Rabu, 08 Juli 2015
Judul : Identifikasi dan Pewarnaan Bakteri
Tujuan : Mengetahui jenis-jenis bakteri
Kelompok : 07
Nama : Putry Wulanndary
Rika Dewi Andani
Riski Kristian Igo
Rizki Nurbaiti
Rofiqoh Khalidazia
Rosana

DASAR TEORI
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tesebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri, sehingga bakteri dapat terlihat
jelas dan mudah diamati.
Zat warna menyerap dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme
dengan lingkungannya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat pewarna memungkinkan
pengamatan struktur spora, flagella dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan
gtanula fosfat. Selain itu, dengan pewarnaan dapat menunjukkan distribusi dan susunan
kimia bagian-bagian sel, membedakan mikrob satu dengan yang lain, menentukan pH
dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler (Waluyo, 2008).

Zat Warna
Pada umumnya zat warna yang digunakan adalah senyawa-senyawa garam yang
salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri ion bermuatan positif dan ion bermuatan
negative. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan mikroba tersebut.

1
Sel-sel bakteri mempunyai muatan yang agak negative bila pH lingkungannya
mendekati netral. Muatan negative dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan
positif dari ion zat warna, misalnya metilen blue, sehingga hasilnya sel tersebut akan
berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabuangan
antara zat warna dengan sel bakteri (Waluyo, 2008)
Zat warna data dibagi menjadi dua golongan yakni pewarnaan yang berrsifat
basa atau asam. Pada zat warna basa merupakan bagian yang berperan dalam
memberikan warna yang dinamakan kromatotrof dan mempunyai muatan positif.
Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negative dalam sel,
sehingga miroorganisme terlihat dengan jelas. Zat warna asam yang bermuatan negative
umumnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroba, tetapi biasanya digunakan utuk
mewarna latar belakang sediaan pewaranaan. Zat warna yang bermuatan negative ini
tidak dapat berikatan dengan muatan negative yang terdapat dalam struktur sel. Kadang
kala zat warna negative ini digunakan untuk mewanai bagian sel yang bermuatan
positif. Muatan dan daya ikat zat warna teradap struktur dapat berubah tergantung OH
sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Waluyo, 2008).
Prosedur pewarnaan yang mengahsilkan pewarnaan mikroba dinamakan
pewarnaan positif. Dalam prosedur ini dapat digunakan zat warna basa yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatn negatif. Sebaliknya pewarnaan negatif
yang diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroba yang tidak berwarna
(Waluyo, 2008).
Pewarnaan bakteri memiliki beberapa tujuan diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba.
3. Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel dan vakuola.
4. Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna.
(Waluyo, 2008)

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan

Pewarnaan sel miroorganisme umunya menggunakan lebih dari satu macam zat
warna. Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor lain, seperti;

2
1. Fiksasi
Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan pemanasan atau
dengan freeze driying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan kimia
seperti sabun, fenol dan formalin. Fungsi fiksasi sebelum pewarnaan yaitu:
a. Merekatkan sel mikroba pada gelas objek.
b. Membunuh mikroorganisme secara cepat dengan tidak menyebabkan
perbahan-perubahan bentuk dan strukturnya.
c. Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna.
d. Membuat sel-sel mikroba lebih kuat (keras).
e. Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi gugu reaktif NH3+ yang akan
bereaksi dengan gugus –OH dari zat warna.
f. Mencegah otolisis sel, yaitu pecahnya sel yang disebabkan olehenzim-enzim
yang dikandungnya sendiri.
g. Mempertinggi sifat reaktif gugus-gugus tertentu (karboksil amino primer dan
sulfhidril).
2. Pelunturan zat warna
Pelunturan zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel
yang telah diwarnai. Ini berfungsi untuk mengahsilkan kontras yang baik pada
bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan anatara sel dengan zat warna,
maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan alcohol, tahan air dan
lain-lain. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat oleh sel
sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam, begitu juga dengan tahan
alcohol dan tahan air masing-masing tidak dapat dilunturkan oleh alcohol dan air.
Ada beberapa macam peluntur zat warna, antara lain:
a. Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran asam-
asam tersebut dengan alcohol.
b. Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan garam-garam
basa.
c. Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air minya cengkeh, aseton dan
gliserin.
d. Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.

3
 e. Garam-garam logam riangan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain
3. Identifikasi pewarnaan
Zat warna dapat diidentifikasikan dengan beberapa cara misalnya dengan
mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperature pewarnaan 60-90oC dan
menambahkan suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat
menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan
dengan cara pewarnaan tanpa diberi mordan. Ada beberapa mordan, yaitu:
a. Mordan basa.
b. Mordan asam.
4. Substrat
Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel dapat dibedakan:
a. Sel-sel basofil.
b. Sel-sel asidofil/oksifil.
c. Sel-sel yang sudanofil.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna penutup adalah suatu zat warna basa yang berada warnanya dengan
zat warna mula-mula yang digunakan. Fungsi dari zat warna punutup adalah
memberkan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula.
Zat warna punutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan
kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama.

Pembuatan Preparat
Sebelum dilakukan pewarnaan pada sel mikroba, harus dilakukan praparat oles.
Preparat oles yang baik merupakan prasyarat berhasilnya pewarnaan. Adapun teknik
pewarnaan yang tepat yaitu:
1. Olesan tidak terlalu tebal, pada olesan yang tebal sel-sel bakteri akan bertumpuk-
tumpuk sehingga sulit untuk menentukan bentuk sel individu.
2. Olesan tidak terlalu tipis karena dapat menylulitkan pengamatan secara
mikroskopis.

4
3. Kaca objek yang dipakai tidak boleh tergores dan harus bersih betul. Hal ini
disebabkan ukuran sel bakteri amat kecil, maka goresan atau partikel debu pada
kaca objek dapat dikelirukan sebagai mikroba.
4. Preparat bakteri harus benar-benar kering udara sebelum difiksasi dengan panas.
5. Penggunakan teknik aseptic, untuk menghindakan kontaminasi preparat yang
dibuat dan melindungi diri sendiri (Waluyo, 2008).

Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana atau pewaraan tunggal adalah salah satu cara pewarnaan
yang hanya menggunakan satu macam zat warna. Tujuan pewarnaan ini yakni untuk
meningkatkan kontraas antara mikroorganisme dengan sekelilingnya. Zat warna yang
digunakan adalah metilen blue, gentian violet (kristal violet), karbol fuksin, safranin,
hijau malakhit dan lain-lain. Pewarnaan sederhana mudah dan cepat sehingga
pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan
mikroorganisme. Pewarnaan sederhana dapat memperlihatkan penataan bakteri,
misalnya seperti rantai (streptokokus), seperti buah anggur (stafilokokus), berbentuk
kubus (sarcina). Disamping itu dengan pewarnaan sederhana dapat pula mengamati
struktur tertentu misalnya endospora (Waluyo, 2008).

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram memilah bakteri menjadi 2 kelompok, yakni bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Bakteri gram positif berwarna ungu yang disebabkan
kompleks warna Kristal violet-iodium tetap diperthankan meskipun diberi larutan
pemucat. Sedangkan bakteri gram negative berwarna merah karena kompleks warna
tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mangambil zat warna
kedua yang berwarna merah (Waluyo, 2008).
Penyebab perbedaan pewarnaan gram kemungkinan karena komposisi dinding
sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih
tebal pada bakteri gram positif menyusut leh perlakuan alcohol karena terjadi dehidrasi,
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks zat
ungu Kristal iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan bakteri gram negative

5
memiliiki kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding sel dan lipid tersebut dapat
larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh zat pemucatan yang digunakan dalam
pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah penyebab proses
pemucatan antara dinding sel gram negative lebih cepat (Waluyo, 2008).
Mikroba kelompok gram positif dapat memperhatikan ciri gram negative bila
mengalami pemucatan berlebihan. Faktor yang mempengaruhi antara lain:
1. Pelaksanaan fikasai panas terhadap olesan
Olesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan pecahnya
dinding sel bakteri. Dalam keadaan demikian, maka sel bakteri gram positif akan
melepaskan warna primer dan menerima warna tandingan.
2. Ketetapan sel pada olesan
Olesan yang baik henydaknya tidak terlalu tebal atau terlalu tipis. Pada
pewarnaan gram, olesan yang terlampau tebal tidak akan memucat secepat seperti
olesan dengan kerapatan sel yang normal.
3. Jenis dan konsentrasi reagen yang digunakan pewarnaan
Larutan etanol 95% bekerja paling lambat sebagai larutan pemucat, sedangkan
aseton paling cepat.
4. Jenis medium pertumbuhan
Bakteri gram positif bila terlalu lama ditumbuhakan dalam medium yang
mengandung bahan yang mudah terfermentasi dapat berubah menjadi bakteri gram
negative. Demikian pula bila bakteri gram positif bila ditambah perlakuan khusus,
misalnya ditambah larutan pekat AND dapat berubah menjadi gram positif.
5. Umur biakan
Pewarnaan gram memberikan hasil baik bila menggunakan biakan segar yang
berumur 24-48 jm. Bila menggunakan biakan tua maka kemungkinan besar terjadi
penyimpangan hasil pewarnaan gram (Waluyo, 2008).

Bentuk Bakteri
Berdasarkan benuk morfologinya, maka bakteri dapat dibagi menjadi 3 golongan
yaitu basil, kokus dan spiral.

6
1. Basil (dari basillus) berbentuk serupa tongkat pendek, silindris. Sebagian besar
bakteri berupa basil. Basil dapat bergandeng-gandengan panjang, bergandengan
dua-dua atau terlepas atu sama lain. Yang bergandeng-gandeng panjang disebut
streptobasil, yang dua-dua disebut diplobasil. Ujung-ujung basil yang terlepas satu
sama lain itu tumpul, sedangkan ujung-ujung yang masih bergandengan itu tajam.
2. Kokus (dari coccus) adalah bakteri yang bentuknya serupa bola-bola kecil.
Golongan ini sebanyak golongan basil. Kokus ada yang bergandengan panjang
serupa tali leher, ini disebut streptokokus, ada yang bergandengan dua-dua ini
disebut diplokokus, ada yang mengelompok berempat ini disebut tertrakokus,
kokus mengelompok merupakan suatu untaian disebut stafilokokus sedangkan
kokus yang mengelompok serupa kubus disebut sarsina.
3. Spiral (dari spirillum) ialah bakteri yang bengkok atau berbengkok-bengkok serupa
spiral. Bakteri yang berbentuk spiral itu tidak benyak terdapat. Golongan ini
merupakan golongan yang paling kecil, jika dibandigkan dengan golongan kokus
maupun golongan basil (Dwidjoseputro, 2005).

METODE PRAKTIKUM
Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 08 Juli 2015, pukul 14.00-15.00
WITA, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Politeknik Kesehatan Kementerian
Keesehatan Kalimantan Timur.

Alat dan Bahan

1. Mikroskop
2. Object glass
3. Biakan bakteri
4. Gentian violet 2%
5. Lugol iodine
6. Aseton alkohol
7. Safranin 0,25%
8. Pipet tetes

7
9. Air
10. Oil imersi

Prosedur Kerja
1. Menyiapkan mikroskop, serta membersihkan object glass.
2. Mengambil biakan bakteri.
3. Meratakan setipis mungkin di bagian tengah object glass.
4. Membubuhkan cat gram A (crystal violet) sampai menutup seluruh suspensi
bakteri. Membiarkan satu menit. Buang dan aliri dengan air (dibiaskan di tangan,
tidak boleh langsung).

5. Membubuhkan cat gram B (lugol iodine) sampai menutup seluruh suspensi bakteri.
Membiarkan satu menit. Buang dan aliri dengan air (dibiaskan di tangan, tidak
boleh langsung).

6. Membubuhkan cat gram C (aseton alkohol) sampai menutup seluruh suspensi

bakteri. Membiarkan satu menit. Buang dan aliri dengan air (dibiaskan di tangan,
tidak boleh langsung).

8
7. Membubuhkan cat gram D (safranin) sampai menutup seluruh suspensi bakteri.
Membiarkan satu menit. Buang dan aliri dengan air (dibiaskan di tangan, tidak
boleh langsung).

8. Lap dengan tisu.

9. Letakkan object glass di meja benda mikroskop.

10. Olesi object glass dengan oil imersi.
11. Amati sel bakteri yang terlihat pada mikroskop dengan perbesaran 100x.

Hasil Pengamatan
1. Klebsiella
Gram : Negatif
Warna : Merah muda
Bentuk : Basil

9
 Pembesaran : 100x
2. Streptokokus
Gram : Positif
Warna : Ungu
Bentuk : Kokus

Pembesaran : 100x
3. Salmonella
Gram : Negatif
Warna : Merah
Bentuk : Basil
Pembesaran : 100x

10
4. Escherichia Coli
Gram : Negatif
Warna : Merah
Bentuk : Basil pendek

Pembesaran : 100x
5. Stafilokokus
Gram : Positif
Warna : Biru
Bentuk : Kokus
Pembesaran : 100x

Pembahasan
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana
sel-sel bakteri tersebut disuspensikan oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan
menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan
teliti. Pewarnaan akan menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras bewarna dengan
sekelilingnya, sehingga akan terlihat lebih jelas (Sutedjo, 1991).

11
 Pewarnaan sel bakteri ini dapat menyebabkan dua kemungkinan yaitu bakteri
bersifat gram positif dan gram negatif tergantung pada responnya bila diwarnai dengan
pewarnaan bakteri menurut gram. Kadar lipid dalam sel bakteri gram negatif lebih besar
dibanding sel bakteri gram positif. Bakteri gram positif mempunyai susunan dinding sel
yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas
dinding sel lebih besar, sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks ungu
kristal-Iodium.
Serangkaian pewarnaan yang dilakukan pada sel bakteri dengan memberikan zat
pewarna pertama samapai zat pewarna penutup memberikan fungsinya masing-masing.
Cat gram A (crystal violet) berfungsi untuk memberikan warna ungu pada biakan
karena zat warna diserap dalam dinding sel dan sitoplasma. Cat gram B (lugol iodine),
zat ini bewarna coklat yang menyebabkan terbentuknya kompleks ungu kristal-iodium
dan untuk memfiksasi zat warna yang sudah diserap sehingga lebih kuat pengikatannya.
Cat gram C (aseton alkohol), zat ini tidak bewarna yang berfungsi untuk melunturkan
zat warna sebelumnya yang diserap mikroba, pencucian dengan alkohol menyebabkan
terjadinya diferensiasi dan dua macam bakteri yaitu, bakteri akan tetap bewarna ungu
karena tahan terhadap pemberian alkohol atau bakteri tidak bewarna karena tidak tahan
terhadap pemberian alkohol sehingga zat warna dilunturkan (larut) dan keluar dari sel
bakteri. Cat gram D (safranin) sebagai pewarna kontras, zat ini bewarna merah untuk
memberikan warna pada bakteri yang tidak bewarna. Jika bakteri sudah tidak lagi
menyerap atau mengikt cat gram D (safranin) karena bakteri tersebut sudah jenuh
mengikat cat gram A (crystal violet) yang bewarna ungu maka bakteri tersebut bersifat
sebagai bakteri gram positif. Sedangkan bakteri gram negatif adalah jika bakteri
mengikat cat gram D (safrnain) yang bewarna merah karena zat warna sebelumnya
sudah luntur akibat pencucian dengan alkohol.
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan Bakteri Escherichia coli bersifat gram
negatif karena tidak dapat mempertahankan warna ungu sehingga luntur pada saat
pencucian dengan alkohol, karena bakteri ini tidak tahan terhadap asam dan kemudian
bakteri tersebut mengikat zat warna safranin sehingga bewarna merah. Morfologi
bakteri Escherichia coli yang didapat dari hasil pengamatan dengan menggunakan
mikroskop adalah berbentuk kokus (bulat) yang tidak beraturan dan tampak bewarna

12
merah. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop,
bakteri E. Coli termasuk gram negatif yang ditunjukkan dengan adanya warna merah,
dan memiliki bentuk bulat. Bacillus subtilis termasuk gram positif, hal ini ditunjukkan
dengan adanya warna ungu, dan berbentuk batang.
Perbedaan relatif dari bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif adalah
struktur dinding sel Gram positif sekitar 15-80 nm dan berlapis tunggal sedangkan
Gram negatif lebih tipis yaitu sekitar 10-15 nm dan berlapis tiga. Komposisi dinding sel
Gram positif memiliki kandungan lipid rendah (1-4%) dan Gram negatif lebih tinggi
(11-22%). Gram positif lebih rentan terhadap penisilin dibandingkan dengan Gram
negatif. Pertumbuhan Gram positif dihambat oleh zat-zat warna dasar misalnya ungu
kristal sedangkan Gram negatif tidak begitu dihambat. Persyaratan nutrisi Gram positif
relatif rumit pada banyak spesies sedangkan Gram negatif relatif sederhana. Gram
positif lebih resisten terhadap gangguan fisik dibandingkan Gram negatif.
Pengenceran juga dilakukan pada percobaan ini. Pengenceran ini dilakukan
menggunakan tabung reaksi sebagai wadah pengenceran. Sampel yang telah diencerkan
tadi kemudian dipindahkan ke cawan petri dan diinkubasi selama 60 jam, dimana
dihasilkan koloni duplo dan triplo setelah dilakukan penghitungan pada coloni counter.
Adapun hasil perhitungan koloni untuk sampel yang pertama pada 10-1 terhitung ada 18
koloni, untuk diplonya terhitung 18 koloni, serta untuk triplonya terhitung ada 57
koloni. Hasil perhitungan untuk sampel yang kedua pada 10-2 terhitung 2 koloni, untuk
diplo 1 koloni dan triplonya 10 koloni. Sedangkan untuk sampel yang ketiga 10-3
terhitung 15 koloni, untuk diplo 2 koloni dan triplonya ada 8 koloni.

Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

Perbedaan Bakteri gram positif Bakteri gram negatif
Dinding sel: Lapisan Lebih tebal (20- Lebih tipis11-22 %
peptidoglikan kadar lipid 80nm)1-4 %
Resistensi terhadap alkali Tidak larut Larut
(1% KOH)
Kepekaan terhadap Iodium Lebih peka Kurang peka

13
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bentuk sel Bulat, batang atau Bulat, oval, batang lurus
filamen atau melingkar seperti tanda
koma, heliks atau filament,
beberapa mempunyai
selubung atau kapsul
Reproduksi Pembelahan biner Pembelahan biner, kadang-
kadang pertunasan
Metabolisme Kemoorganoheterotrof Fototrof, kemolitoautotrof,
atau kemoorganoheterotrof
Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka
Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam
Kepekaan terhadap Lebih peka Kurang peka
penisilin
Kepekaan terhadap Tidak peka Peka
streptomisin
Motilitas Kebanyakan nonmotil, Motil atau nonmotil. Bentuk
bila motil tipe flagella dapat bervariasi
flagelanya adalah
petritikus
(petritrichous)
Anggota tubuh Biasanya tidak Dapat memiliki pili,
memiliki apandase fimbriae, tangkai
Endospora Beberapa grup dapat Tidak dapat membentuk
membentuk endospora endospore
Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana
Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

14
KESIMPULAN
1. Bakteri Streptokokus dan Stafilokokus termasuk ke dalam bakteri gram positif.
Sedangkan bakteri Klebsiella, Escherichia Coli, dan Salmonella termasuk ke dalam
bakteri gram negatif.
2. Bakteri gram positif mempunyai ciri berwarna ungu karena mengikat warna pada
pewarna dasar yang tidak terhapus oleh pencucian alcohol serta tidak menyerap
pewarna kontras sedengkan bakteri gram negative mempunyai ciri terhapuskan oleh
pencucian dengan alcohol serta meyerap pewarna kontras.

DAFTAR PUSTAKA
http://maulidafarmasi.blogspot.com/2012/07/pewarnaan-mikroba.html

15
 LEMBAR PENGESAHAN

Samarinda, 09 Juli 2015

Mengetahui,
Dosenpembimbing Praktikan

Tim Dosen
KetuaKelompok

16