LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI

ACARA 1
TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI
DOSEN PENGAMPU :
RIZKI NISFI RAMDHINI, M. Si

DI SUSUN OLEH:
KELOMPOK 4

D3 KEPERAWATAN
SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN (STIKes) MUHAMMADIYAH
PRINGSEWU LAMPUNG
TAHUN 2018

1
 NAMA ANGGOTA KELOMPOK :

NAMA NIM
1. DWI YULIANI 144012017
2. ELSA OKFIANTI 144012017
3. FEBYKA MILLENIA 144012017
4. KESIH APRIYANTI 144012017022
5. MIAWATI 144012017
6. RIDHO SAPUTRA 144012017
7. RIRIN 144012017
8. TONI SAPUTRA 144012017
9. TRISNA WIRANTI SUKMA 144012017
10. YOLA RENAZARIA 144012017

2
1. DASAR TEORI

A. TEKNIK PEWARNAAN
Bakteri sangat sulit diamati jika menggunakan mikroskop cahaya biasa.
Hal tersebut dikarenakan sifat mikroorganisme yang tidak mampu mengabsobsi
dan membiaskan cahaya. Oleh karena itu bakteri hanya akan tampak tembus
pandang dan hal tersebut akan mempersulit proses pengidentifikasian. Untuk
mengatasi permasalahan tersebut diperlukan teknik pewarnaan agar terdapat
kontras antara sel bakteri dan latar belakangnya.
Pewarnaan bertujuan untuk mengamati morfologi sel bakteri. Sebelum
dilakukan pewarnaan, perlu dilakukan penyiapan olesan dan fiksasi bakteri.
Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya
dengan metanol. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan bakteri pada gelas objek,
mematikan bakteri serta sel bakteri supaya terlihat jelas setelah diwarnai.

B. PEWARNAAN GRAM (DEFERENSIAL)

Pewarnaan gram paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri yang
menggunakan lebih dari satu jenis pewarna. Dengan menggunakan teknik ini
dapat dibedakan dua kelompok besar bakteri diantaranya bakteri yang dapat
menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium hingga akhir prosedur
yang ditandai sel-sel bakteri tampak biru ungu, koloni tersebut adalah bakteri
gram positif. Sedangkan bakteri yang kehilangan kompleks warna ungu kristal
pada saat pembilasan dengan alcohol, yang selanjutnya diwarnai dengan pewarna
tandingan safranin akan menghasilkan sel yang bewarna merah yang disebut
sebagai koloni bakteri gram negatif.
Berdasarkan kemampuan yang dapat membedakan kelompok-kelompok
bakteri, pewarnaan gram juga disebut sebagai pewarnaan deferensial. Adanya
perbedaan hasil pewarnaan tersebut disebabkan komposisi dinding sel bakteri
yang berbeda sehingga akan menimbulkan reaksi yang berbeda. Dinding pada
bakteri gram positif memiliki peptidoglikan lebih tebal daripada gram negatif dan
memiliki asam teikoik yang tertanam pada dinding sel. Sedangkan gram negatif
memiliki peptidoglikan lebih tipis dan tidak memiliki asam teikoik, namun
memiliki membran luar yang terdiri dari lipopolisakarida.

3
2. TUJUAN PRAKTIKUM
Mempelajari teknik pewarnaan gram positif dan negatif untuk pengamatan
mikroorganisme.

3. BAHAN DAN ALAT

1) Mikroskop
untuk mengamati mikroorganisme yang tidak dapat dilihat oleh mata telanjang.
2) Gelas benda
untuk tempat bakteri.
3) Jarum Ose
Untuk inokulasi dari media pada ke cair atau sebaliknya.
4) Rak cat
untuk tempat tabung reaksi.
5) Pembakar spiritus
sebagai pemanas dalam skala kecil dan pengkondisian steril.
6) Suspensi bakteri
Sample bakteri jinak.
7) Cat Gram A (crystal violet)
indikator untuk pewarna primer.
8) Cat Gram B (iodine)
indikator untuk memperkuat warna.
9) Cat Gram C (etanol 95%)
indikator untuk melunturkan lemak.
10) Cat Gram D (safranin)
Indikator untuk pewarna sekunder.
11) Air
Indikator untuk pewarna sekunder.

4
4. CARA KERJA
1) Persiapan Kaca Benda
a. Bersihkan kaca benda dengan menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan
alkohol 70 %
b. Buatlah lokasi bentuk oval 3 x 2 cm dengan spidol permanent di bagian bawah
kaca benda
c. Dengan menggunakan pensil 2b berilah nama kultur bakteri pada kiri atas
gelas benda

2) Smear
Smear dapat dilakukan dari medium cair maupun dari koloni pada medium padat.
Semear pada medium cair (Gambar 1a, b, c, g dan h)
a. Kocoklah tabung suspensi biakan bakteri
b. Ambillah dengan menggunakan ose mata 1-2 kali kemudian letakkan
dibagian atas kaca benda, diratakan pada lokasi oval yang telah dibuat
(lakukan dengan cara aseptis)
c. Kering anginkan pada suhu ruang, sampai terlihat selaput putih
d. Setelah benar benar kering, lakukan fiksasi 3x kali diatas api dengan cepat

Smear dengan menggunakan koloni pada medium padat (Gambar 1d, e, f, g

dan h)
a. Taruhlah 1-2 tetes larutan fisiologis diatas kaca benda
b. Ambillah koloni bakteri pada medium padat dengan menggunakan ose
mata, kemudian letakkan dibagian atas kaca benda, diratakan pada lokasi
oval yang telah dibuat (lakukan dengan cara aseptis)
c. Kering anginkan pada suhu ruang, sampai terlihat selaput putih
d. Setelah benar benar kering, lakukan fiksasi 3x kali diatas api dengan cepat

3) Pengecatan Gram
a. Letakkan kaca benda hasil smear diatas rak yang telah disiapkan
b. Lakukan pengecatan dengan cara menggenangi kaca benda dengan cat
utama (Primary stain) berupa kristal violet yang terdapat dalam Gram A
selama 3 menit (Gambar 2a)
c. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2b)
5
d. Genangi dengan Gram B yang berisi dengan iodin yang berfungsi sebagai
Mordant selama 1 menit (Gambar 2c)
e. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2d)
f. Dekolorisasi (Decolorize) dengan etanol 95 % yang terdapat pada Gram C
dengan cara mengalirkan dari bagian atas kaca benda (Gambar 2e)
g. Dengan cepat langsung cuci dengan air mengalir (Gambar 2f)
h. Genangi dengan Gram D yang berisi safranin dan berfungsi sebagai
Counterstain selama 3 menit (Gambar 2g)
i. Cuci dengan air mengalir (Gambar 2h)
j. Bersihkan dengan menggunakan tisue, hati hati jangan sampai menggosok
bagian yang telah tercat, karena akan menghapus bakteri
k. Setelah kering, tetesi dengan minyak imersi
l. Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x.

6
4) Skema Cara Kerja

Gambar 1. Smear bakteri: dari medium cair dan dari koloni pada medium
padat

7
Gambar 2. Prosedur Pengecatan Gram

8
5. HASIL PENGAMATAN
1) Struktur Dinding Bakteri

No Spesies Gram Gambar dan keterangan

(+/-)
1 Positif (+)
streptococcus

9
 2) Pengamatan Pewarnaan

Teknik Pewarnaan Keterangan

(Gram Positif/Negatif)
Gram positif Nama Spesies: Streptococus
Jenis bakteri : Staphylococcus
Perbesaran: 100 kali
Reagen : 4
Warna bakteri: Ungu
Bentuk bakteri: coccus
Gram : Positif (+)

6. PEMBAHASAN
1) Tujuan Praktikum
Membedakan gram positif dan gram negatif dengan melihat dinding sel.

2) Fungsi dari setiap alat-alat yang digunakan

◦ Mikroskop
untuk mengamati mikroorganisme yang tidak dapat dilihat oleh mata
telanjang.
◦ Jarum Ose
Untuk inokulasi dari media pada ke cair atau sebaliknya.
◦ Bunsen
sebagai pemanas dalam skala kecil dan pengkondisian steril.

3) Fungsi dari setiap zat warna dan larutan yang digunakan

a) Cat Gram A (crystal violet)

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram
A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme
target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna
ungu sesuai warna cat Gram A.

10
b) Cat Gram B (iodine)
Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu
cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap
mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan
warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

c) Cat Gram C (etanol 95%)

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat
sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :
 Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan
terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan
oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram
positif.
 Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol.
Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri
yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.

d) Cat Gram D (safranin)

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat
ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat
sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer.
Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :
 Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh
mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat
Gram D.
 Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya
telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat
Gram D

11
 4. Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan negative

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negative

(-)
Komposisi dinding Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
sel (1-4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies Relatif sederhana
relatif kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

5. Analisis hasil pengamatan

Dari data hasil pengamatan bakteri yang terdapat pada sampel berbentuk
coccus. Dengan penataan diduga jenis staphylococcus. Dan bakteri tersebut
termasuk gram positif. Hal ini karena pada saat tahap pewarnaan gram setelah
diberi larutan kristal violet,lugol,safranin dan dilakukan pencucian dengan
alkohol bakteri yang terlihat berwarna ungu.
7. PENUTUP
1. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilaksanakan praktikan dapat menarik kesimpulan bakteri
yang ditemukan berbentuk coccus dengan penataan diduga jenis staphylococcus.
Dan bakteri tersebut termasuk gram positif karena berwarna ungu. Disebabkan
menyusutnya pori-pori dinding sel sehingga pori-pori menutup dan menghasilkan
warna ungu.

2. Saran
Saat pelaksanaan praktikum pewarnaan bakteri, praktikan harus teliti dan berhati-
hati dalam pemberian larutan warna pada bakteri. Untuk itu perlu mengikuti
prosedur yang telah ditetapkan.

12
 DAFTAR PUSTAKA

Madigan, M.T. et al., 2012. Brock Biology of Microorganisms 13th ed., San
Francisco: Benjamin Cummings.

Pollack, R.A. et al., 2009. laboratory exercises in microbiology, USA: JOHN WILEY
& SONS, INC.

Prescott & Harley, 2002. Laboratoy exercises in microbiology fifth., United States:
McGraw-Hill.

Willey, J.M., Sherwood, L.M. & Woolverton, C.J., 2009. Prescott’s Principles of
Microbiology, New York: McGraw-Hill.

13