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Las construcciones de ADN de proteína fluorescente verde mejorada por citomegalovirus (CMV-
EGFP), obtenidas del Departamento de Ciencias Lecheras, el Instituto Politécnico de Virginia y la
Universidad Estatal (Blacksburg, VA, EUA), se usaron para microinyección. La construcción
transgénica WAP6FIX se produjo insertando una secuencia de ADNc de factor IX modificada entre
un promotor de proteína ácida de suero de leche murina (mWAP) y su región correspondiente 30
traducida. El promotor mWAP de 4,1 kpb se obtuvo por digestión de p227.6 (Henryk Lubon, Cruz
Roja Americana, Rockville, MD, EE. UU.) Con NotI, KpnI y HindIII, con los fragmentos resultantes
separados en gel de agarosa al 0,8%. El fragmento promotor se escindió del gel y se purificó
usando un kit de extracción en gel Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EE. UU.). El fragmento que
contenía el vector 30UTR y pUC NotI + se obtuvo por digestión parcial de pUCWAP con NotI, y
digestión completa con KpnI, y se purificó de forma similar. Los fragmentos resultantes se ligaron a
continuación con ADN ligasa de T4 (Stratagene, LaJolla, CA, EE. UU.) Para preparar pUCWAP6, y la
mezcla se usó para transformar células de E. coli JM109. El ADNc del factor IX utilizado en
WAP6FIX se modificó utilizando PCR para añadir sitios de enzima de restricción KpnI directamente
antes de la secuencia de inicio y después de la secuencia de detención. Las condiciones de
reacción para PCR fueron:
DOCUMENTO DOS
Métodos
Animales
Esta prueba se realizó en una estación experimental de la Universidad Agrícola de China. Estaba
ubicado en Beijing, China, a 40.13 ° de latitud norte y 116.65 ° de longitud este. Todo el
procedimiento se llevó a cabo en estricta conformidad con el protocolo aprobado por el Comité de
Bienestar Animal de la Universidad Agrícola de China (Número de permiso: XK662). Un total de 80
y 280 ovejas Suffolk de uno a tres años de edad fueron utilizados como donantes y receptores,
respectivamente, durante la temporada de reproducción natural en octubre (24 donantes, 90
receptores) y noviembre (19 donantes, 76 receptores) y los no época de reproducción en mayo
(22 donantes, 79 receptores) y junio (15 donantes, 65 receptores). Es importante señalar que 30
donantes se convirtieron en receptores después de la superovulación, por lo tanto, había 310
receptores en total. Las ovejas fueron provistas por Beijing Aoxin Animal Husbandry Company Co.,
Ltd. (Beijing, China)
Superovulación
La solución linearizada del vector del fragmento TLR4 consistió en el ADN y ddH2O (5pL,
refiriéndose a EPPendorf femtoject) se inyectó en los embriones transferibles que la zona pelúcida
era transparente, el citoplasma estaba uniformado y el pronúcleo era visible, bajo una
concentración final de 10 ng / μL, que contienen aproximadamente 2.39 × 10-8 pmol de TLR4.
Después de la microinyección, los embriones se colocaron en un medio de retención y se
transfirieron a los receptores una hora después de comenzar la operación de laparotomía. De los
280 destinatarios, 30 ovejas fueron donantes reutilizados como receptores después de la
superovulación anterior. Los receptores se sincronizaron mediante la inserción de 12 días de
dispositivos CIDR que se eliminaron 10 h antes que en los donantes, y se inyectaron 280 UI de
PMSG Li y otros a cada receptor. Journal of Animal Science and Biotechnology (2016) 7:38 Página 2
de 8 (Ningbo Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd., Ningbo, China). A las 36 h después de la retirada
de CIDR, el estro se detectó mediante el uso de carneros vasectomizados. Se trasplantaron de dos
a cuatro embriones en un receptor común y los donantes se utilizaron también como oviducto
receptor en el transcurso de una hora después del inicio de la operación de laparotomía. El
embarazo se diagnosticó por ecografía transabdominal a los 60 días de la transferencia del
embrión.
Las ovejas transgénicas se identificaron mediante Southern blot, usando ADN genómico extraído
del tejido de la oreja. El ADN genómico purificado (20 μg) se digirió con Hind III (NEB, Beverly, MA,
EE. UU.) Para obtener un fragmento con un tamaño de 2771 pb que se transfirió a una membrana
de Nylon (Boehringer Mannheim, Alemania). La amplificación por PCR se usó para generar una
sonda marcada con digoxigenina específica (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El tamaño
de la sonda TLR4 utilizada para la hibridación del sur fue de 671 pb, y los cebadores para TLR4
fueron los siguientes: 5'-ACTGGTAAAGAACTTGGAGGAGG-3 'hacia adelante y reversa
5'-CCTTCACGACATTCAACAGACC-3 '. La expresión de TLR4 se determinó mediante PCR en tiempo
real. Brevemente, se recogió la sangre de cinco ovejas positivas transgénicas machos y diez ovejas
negativas transgénicas maternas de medio hermano a los 6 meses de vida de las venas yugulares,
y se aislaron monocitos de la sangre mediante un medio de separación de linfocitos (TBD, Tianjin,
China). El ARN se extrajo de los monocitos usando el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen), y luego se
transcribió de forma inversa en el ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand
(Thermo). Se usó β-actina como el gen representativo de mantenimiento de la casa para la
normalización. Los cebadores de TLR4 para qPCR fueron los siguientes: 5'-ATTTTA directo
CACCATATTGCCGTCT-3 'y 5'-CCTTGCATTCCTTTGGCGAGA-3' inverso, y los cebadores para β-actina
fueron 5'-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-3 'directo e inverso 5'- CCAATCTCATCTGCTTTTCTG -3 '. Las
reacciones de qPCR se realizaron en el instrumento Mx3000P (Agilent Technologies, Santa Clara,
CA, EE. UU.) Y los datos de amplificación se analizaron utilizando el software Mx3000P. La
expresión relativa se determinó usando el método comparativo 2-ΔΔCT.
análisis estadístico