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Centrifugación para la visualización de pronúcleos

Cúmulos de células se eliminaron de presuntos cigotos mediante agitación vorticial. Para


determinar la combinación óptima de fuerza centrífuga, duración de la centrifugación e intervalo
posterior a la inseminación para obtener el porcentaje más alto de cigotos con pronúcleos visibles,
los cigotos presuntivos se centrifugaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 12, 14, 16 o 18 X
103 X g durante 13, 14, 15 o 16 min a las 14, 15, 16, 17 o 18 h postinseminación (hpi) en una
centrífuga de alta velocidad (Sigma Modelo 3K30, Osterode am harz, Alemania). Dado que el
porcentaje de cigotos en el que uno o dos pronúcleos eran visibles se obtuvo después de la
centrifugación a 14,000 x g durante 15 min a 16 hpi, este protocolo se utilizó para todos los
estudios posteriores. La capacidad de desarrollo de los zigotos sometidos a este tratamiento se
determinó cultivándolos durante 8 días después de la diseminación en gotículas de 20 ml (1-4
cigotos / gotas) del medio IVC, que consistió en medio Charles Rosenkrans modificado con
aminoácidos (mCR2aa) [12]. ], 0,8% BSA y 10% FBS. Cada 48 h, la mitad del medio se reemplazó
con medio IVC nuevo. La tasa de escisión se registró en el Día 2 (Día 0 = día de la nomenclatura) y
se registró el desarrollo de las etapas de mórula y blastocisto en los Días 7 y 8. Para determinar la
viabilidad embrionaria, se determinó el número total de células mediante tinción de embriones
con Hoechst 33342.

2.3. Microinyección de pronúcleos


Para microinyecciones, cigotos fueron clasificados en las siguientes cuatro categorías basadas en el
número de pronúcleos visibles después de la centrifugación: 0, 1, 2, y> 2 PN para no, uno, dos, o
tres o pronúcleo o pronúcleos más visible. Zygotes en la categoría> 2 PN fueron descartados. La
microinyección se administró solo en un único pronúcleo de 1 y 2 cigotos PN. Para algunos
experimentos, presuntos zigotos PN se procesaron como 1 y 2 cigotos PN, pero sin ninguna
microinyección.

Las construcciones de ADN de proteína fluorescente verde mejorada por citomegalovirus (CMV-
EGFP), obtenidas del Departamento de Ciencias Lecheras, el Instituto Politécnico de Virginia y la
Universidad Estatal (Blacksburg, VA, EUA), se usaron para microinyección. La construcción
transgénica WAP6FIX se produjo insertando una secuencia de ADNc de factor IX modificada entre
un promotor de proteína ácida de suero de leche murina (mWAP) y su región correspondiente 30
traducida. El promotor mWAP de 4,1 kpb se obtuvo por digestión de p227.6 (Henryk Lubon, Cruz
Roja Americana, Rockville, MD, EE. UU.) Con NotI, KpnI y HindIII, con los fragmentos resultantes
separados en gel de agarosa al 0,8%. El fragmento promotor se escindió del gel y se purificó
usando un kit de extracción en gel Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EE. UU.). El fragmento que
contenía el vector 30UTR y pUC NotI + se obtuvo por digestión parcial de pUCWAP con NotI, y
digestión completa con KpnI, y se purificó de forma similar. Los fragmentos resultantes se ligaron a
continuación con ADN ligasa de T4 (Stratagene, LaJolla, CA, EE. UU.) Para preparar pUCWAP6, y la
mezcla se usó para transformar células de E. coli JM109. El ADNc del factor IX utilizado en
WAP6FIX se modificó utilizando PCR para añadir sitios de enzima de restricción KpnI directamente
antes de la secuencia de inicio y después de la secuencia de detención. Las condiciones de
reacción para PCR fueron:

100 ml de volumen total, 30 ng de plantilla de plásmido (pMCDSFIX: obtenido de Darryl Stafford,


Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC, EE. UU.), 0,5 µM de cada cebador (hum
FIX50KpnI, 50 GCTAGGTACCATGCCATGCAGCGCG y FIX30 KpnI, 50 GTCAGGTACCTTAAGTGAGCT),
DNTP 200 mM, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, tampón IX, con la mezcla de reacción
sometida a 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 20 s, hibridación a 50ºC durante 1
minuto y elongación a 75ºC durante 5 minutos y 45 segundos. Después de ciclar, el producto se
purificó y se cortó con KpnI. El fragmento resultante se clonó en pUC18 (Stratagene) y el inserto se
sometió a secuenciación. El cDNA de FIX modificado se cortó con KpnI y se ligó en el sitio KpnI de
pUCWAP6 para preparar pUCWAP6FIX. La mezcla resultante se usó para transformar células E. coli
JM109 (Stratagene). El plásmido se purificó a partir de células cosechadas mediante absorción en
columna (Maxi prep, Qiagen Inc.). La construcción de ADN lineal se escindió con NotI, se separó de
la electroforesis en gel de agarosa, se purificó por absorción de perlas de silicona (Ultraclean 15,
MoBio, Encinitas, CA, EE. UU.) Y se diluyó a 5 mg / ml en Tris 10 mM y EDTA 0,25 mM (pH 7.4) para
microinyección.

La construcción transgénica CMV-EGFP se produjo mediante la eliminación del sitio de entrada


inter-ribosoma de pIRESEGFP (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, EE. UU.) Mediante digestión
con endonucleasa BamHI. Los productos de restricción se separaron y el fragmento que contenía
el vector se sometió a ligación. Los productos de ligación se usaron para transformar E. coli XL-Blue
(Stratagene), con selección en placas de ampicilina. El plásmido se aisló y se purificó por absorción
en columna (preparación Maxi). La construcción de ADN lineal se escindió con NruI y XhoI, se
separó del plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó por absorción de perlas
de silicona (Ultraclean 15, MoBio, Encinitas, CA, EE. UU.) Y se diluyó a 5 mg / ml en Tris 10 mM y 1
mM EDTA (pH 8.0) para microinyección. Se inyectó el fragmento de ADNc de EGFP (5 mg / ml) en
aproximadamente 2 pL de la solución tampón (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) con la ayuda
de un microinyector (IM300, Narishige, Tokio, Japón). La hinchazón del pronúcleo indicó el éxito
de la microinyección. En aproximadamente el 15-20% de los cigotos microinyectados, los signos de
lisis se observaron inmediatamente, y los cigotos se descartaron.

2.4. Diseño experimental


Para examinar los efectos del daño de la membrana causado por la penetración del capilar de
inyección en el desarrollo posterior, los cigotos centrifugados se sometieron a perforación (con un
capilar de inyección) solo a la membrana plasmática, o a perforar tanto el plasma como las
membranas pronucleares. Para determinar los efectos de la inclusión de ADN en el material
inyectado en los pronúcleos en el desarrollo posterior, se inyectaron cigotos centrifugados con
tampón solo o con tampón que contenía 5 mg / ml de ADN; mCR2aa se usó como el medio IVC en
todos estos experimentos. Para comparar la eficacia de tres medios diferentes de VCI para apoyar
el desarrollo de cigotos microinyectados en la etapa de blastocito, estos se cultivaron durante
hasta 8 días después de la diseminación en mCR2aa o fluido oviductal sintético modificado que
contenía aminoácidos (mSOFaa), o en TCM-199 y co -cultivo con células epiteliales oviductales de
búfalo (BOEC). Cada uno de estos medios contenía 10% de SFB; cada 48 h, la mitad del medio fue
reemplazado por medio fresco. El constructo de ADN WAP6FIX se usó para la microinyección
pronuclear en todos los experimentos mencionados anteriormente. La expresión de GFP se evaluó
usando un microscopio de fluorescencia (Modelo Diaphot, Nikon, Tokio, Japón), con excitación a
488 nm y detección a 500-530 nm. Los embriones que eran verdes (células verdes claras u oscuras)
se consideraron positivos para GFP.
2.5. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con SYSTAT 7.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). El ANOVA de
dos vías se usó para determinar los efectos principales de la fuerza de centrifugación, la duración y
su interacción sobre el porcentaje de presuntos cigotos de búfalo con uno o dos pronúcleos
visibles recuperados después de la centrifugación. Además, se utilizó un ANOVA de dos vías para
determinar los efectos principales de los tipos de medio de cultivo in vitro, cigoto y su interacción
en el desarrollo de zigotos de búfalo microinyectados. La prueba de LSD de Fisher se usó para
localizar diferencias significativas. El análisis de Chi cuadrado fue
utilizado para determinar los efectos de la centrifugación en el desarrollo de zigotos de búfalo,
mientras que la prueba exacta de Fisher se utilizó para determinar los efectos de la centrifugación
en el número total de células de los embriones. Se usó ANOVA de una vía para estudiar los efectos
de: (i) perforar solo la membrana plasmática, o tanto el plasma como las membranas
pronucleares, de inyectar solo tampón o tampón que contenga ADN; y (ii) el número de
pronúcleos visibles en el momento de la microinyección de ADN en el desarrollo de cigotos
microinyectados. Los efectos de uno o dos pronúcleos visibles en el momento de la microinyección
de ADN sobre el desarrollo de embriones que expresan GFP y los patrones de expresión de
embriones que expresan GFP en términos de una expresión completa o en mosaico se
compararon mediante una prueba t de Student. Los valores porcentuales, donde sea que se usen,
se sometieron a una transformación de arco sin pecado antes del análisis. Para todos los análisis, P
<0.05 se consideró significativo.

DOCUMENTO DOS

Métodos
Animales
Esta prueba se realizó en una estación experimental de la Universidad Agrícola de China. Estaba
ubicado en Beijing, China, a 40.13 ° de latitud norte y 116.65 ° de longitud este. Todo el
procedimiento se llevó a cabo en estricta conformidad con el protocolo aprobado por el Comité de
Bienestar Animal de la Universidad Agrícola de China (Número de permiso: XK662). Un total de 80
y 280 ovejas Suffolk de uno a tres años de edad fueron utilizados como donantes y receptores,
respectivamente, durante la temporada de reproducción natural en octubre (24 donantes, 90
receptores) y noviembre (19 donantes, 76 receptores) y los no época de reproducción en mayo
(22 donantes, 79 receptores) y junio (15 donantes, 65 receptores). Es importante señalar que 30
donantes se convirtieron en receptores después de la superovulación, por lo tanto, había 310
receptores en total. Las ovejas fueron provistas por Beijing Aoxin Animal Husbandry Company Co.,
Ltd. (Beijing, China)

Superovulación

Ochenta (43 ovejas en la temporada de cría y 37 ovejas en la estación no reproductiva) fueron


tratadas con CIDR + FSH. Oestrus se sincronizó mediante la inserción de dispositivos CIDR durante
12 días (Eazi-Breed CIDR, InterAg, Hanilton, Nueva Zelanda). Cada oveja fue superovulada bajo el
tratamiento de 230 UI de FSH (Ningbo Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd., Ningbo, China) a partir
del noveno día. La FSH consistió en ocho dosis crecientes, dos veces por día. El CIDR se eliminó en
el momento del séptimo tratamiento con FSH. Durante 24 h y 48 h después de la eliminación de
CIDR, los donantes se analizaron con carneros vasectomizados para confirmar su celo, y cada oveja
recibió 130 IU de LH a las 2 h después de la prueba (Ningbo Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd.,
Ningbo, China) . La inseminación laparoscópica del cuerno uterino se llevó a cabo con semen
fresco diluido de dos carneros de Suffolk a las 54 h después de la extracción de CIDR. Los ovocitos
/ embriones se eliminaron del oviducto mediante laparotomía y se recogieron en placas de Petri a
las 16 h después de la inseminación. Se examinó el número de ovocitos / embriones para cada
donante en un estereomicroscopio y se centrifugó brevemente (10.000 × g, 10 min) para visualizar
los pronúcleos para confirmar la fertilización.

Microinyección y transferencia de embriones

La solución linearizada del vector del fragmento TLR4 consistió en el ADN y ddH2O (5pL,
refiriéndose a EPPendorf femtoject) se inyectó en los embriones transferibles que la zona pelúcida
era transparente, el citoplasma estaba uniformado y el pronúcleo era visible, bajo una
concentración final de 10 ng / μL, que contienen aproximadamente 2.39 × 10-8 pmol de TLR4.
Después de la microinyección, los embriones se colocaron en un medio de retención y se
transfirieron a los receptores una hora después de comenzar la operación de laparotomía. De los
280 destinatarios, 30 ovejas fueron donantes reutilizados como receptores después de la
superovulación anterior. Los receptores se sincronizaron mediante la inserción de 12 días de
dispositivos CIDR que se eliminaron 10 h antes que en los donantes, y se inyectaron 280 UI de
PMSG Li y otros a cada receptor. Journal of Animal Science and Biotechnology (2016) 7:38 Página 2
de 8 (Ningbo Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd., Ningbo, China). A las 36 h después de la retirada
de CIDR, el estro se detectó mediante el uso de carneros vasectomizados. Se trasplantaron de dos
a cuatro embriones en un receptor común y los donantes se utilizaron también como oviducto
receptor en el transcurso de una hora después del inicio de la operación de laparotomía. El
embarazo se diagnosticó por ecografía transabdominal a los 60 días de la transferencia del
embrión.

Identificación de ovejas transgénicas y cuantificación de genes

Las ovejas transgénicas se identificaron mediante Southern blot, usando ADN genómico extraído
del tejido de la oreja. El ADN genómico purificado (20 μg) se digirió con Hind III (NEB, Beverly, MA,
EE. UU.) Para obtener un fragmento con un tamaño de 2771 pb que se transfirió a una membrana
de Nylon (Boehringer Mannheim, Alemania). La amplificación por PCR se usó para generar una
sonda marcada con digoxigenina específica (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El tamaño
de la sonda TLR4 utilizada para la hibridación del sur fue de 671 pb, y los cebadores para TLR4
fueron los siguientes: 5'-ACTGGTAAAGAACTTGGAGGAGG-3 'hacia adelante y reversa
5'-CCTTCACGACATTCAACAGACC-3 '. La expresión de TLR4 se determinó mediante PCR en tiempo
real. Brevemente, se recogió la sangre de cinco ovejas positivas transgénicas machos y diez ovejas
negativas transgénicas maternas de medio hermano a los 6 meses de vida de las venas yugulares,
y se aislaron monocitos de la sangre mediante un medio de separación de linfocitos (TBD, Tianjin,
China). El ARN se extrajo de los monocitos usando el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen), y luego se
transcribió de forma inversa en el ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand
(Thermo). Se usó β-actina como el gen representativo de mantenimiento de la casa para la
normalización. Los cebadores de TLR4 para qPCR fueron los siguientes: 5'-ATTTTA directo
CACCATATTGCCGTCT-3 'y 5'-CCTTGCATTCCTTTGGCGAGA-3' inverso, y los cebadores para β-actina
fueron 5'-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-3 'directo e inverso 5'- CCAATCTCATCTGCTTTTCTG -3 '. Las
reacciones de qPCR se realizaron en el instrumento Mx3000P (Agilent Technologies, Santa Clara,
CA, EE. UU.) Y los datos de amplificación se analizaron utilizando el software Mx3000P. La
expresión relativa se determinó usando el método comparativo 2-ΔΔCT.

Análisis de crecimiento y parámetros sanguíneos

Se midieron el peso corporal, la longitud corporal, la altura y la circunferencia torácica de cinco


ovejas positivas transgénicas machos y diez ovejas negativas transgénicas maternas de halfsib
paterno a la edad de 0, 1, 2 meses, estas ovejas nacieron todas individualmente. Además, se
midieron algunos parámetros fisiológicos sanguíneos de las cinco ovejas transgénicas machos y
diez ovejas negativas transgénicas maternas a los 6 meses de edad, incluyendo glóbulos rojos
(RBC), hemoglobina (HGB), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV) , hemoglobina
corpuscular media (MCH), concentración media de hemoglobina corpuscular (MCHC), plaquetas
(PLT), glóbulos blancos (WBC), porcentaje de neutrófilos segmentado (SEG%), porcentaje de
neutrófilos en banda (BAND%), porcentaje de monocitos (MON%) , porcentaje de linfocitos (%
LYM), porcentaje de eosinófilos (EOS%) y porcentaje de basófilos (BAS%). Los parámetros
fisiológicos de la sangre se registraron en el autoanalizador RA-1000 (Technicon, Tarrytown, NY,
EE. UU.).

análisis estadístico

En este estudio, el tamaño de la muestra para la temporada de cría y no reproductiva es 43 y 37,


respectivamente. Se usaron pruebas t de muestras independientes (SAS Institute, EE. UU.) Para
comparar todos los resultados excepto el no. de embriones de oviducto izquierdo y derecho
recuperados que se evaluaron mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la
comparación de la tasa de parición entre reutilización de donantes como receptores y receptor
ordinario se realizó mediante la prueba χ2. Hubo cuatro observaciones (Temporada de
reproducción: 2, temporada no reproductiva: 2) de la tasa de preñez y la tasa de parición para
cada clasificación de CL no. (1, 2, 3) y embriones transferidos (2, 3, 4), respectivamente. La tasa de
embarazo y la tasa de parición también se analizaron mediante el ANOVA. La tasa de multipletes
se analizó como se indicó anteriormente. Los resultados se expresaron como media ± DE y las
diferencias se consideraron significativas a P <0,05.

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