Universidad Veracruzana

Microbiología ambiental

Giseth Damaris Higinio Santander

IA-2-V

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante

información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración de
las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para
que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es el
responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud
de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. Para aprovechar
esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan las
características morfológicas de los microorganismos. Existe una gran variedad de tinciones que
pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas
o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el
laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un
auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción
característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la
molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores
de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico,
la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho
más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a
determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias.
Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se
utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más
de un color porque se utiliza más de un colorante Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando
se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular
en particular (inmunocitoquímico).
Algunas técnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes de su proceso la fijación de
las muestras. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente, aunque también
puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación
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se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando después
éste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
generalmente el encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las células
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido
fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
A continuación se mencionarán las principales técnicas de tinción utilizadas en microbiología.
Tinciones simples
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el
contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija el
espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el
exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de
dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza
otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas
tinciones son muy utilizadas en microbiología.
Tinciones específicas
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares,
entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.
Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra
en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante
y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución
de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
Tinción indirecta
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es
el ácido tánico.
Tinción directa
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro
tratamiento previo.
Tinción naranja de acridina
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede
variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como
colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto.
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Tinción de Gram
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células
fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros
colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En
este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente
activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra
en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después
de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo
yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en
la resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía
azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se
utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o
la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras
que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar
micobacterias y actinomicetos, que tienen un
alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos
y que no pueden ser calificadas por la tinción de
Gram. Para empezar se hecha sobre el
portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en
la que la fucsina hace de colorante rosa y el
fenol de mordiente. Las células se tiñen de
rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como
las resistentes. Después se usa un decolorante
orgánico que hace que las bacterias ácido –
alcohol sensibles se decoloren mientras que las
ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de
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contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de
color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.

Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el
portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se lava
con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde.
Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas
continúan con su color verde del verde malaquita.

Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan
sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que
se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para
la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal
como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La
tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está
en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células
bacterianas.

Tinción de azul algodón de lactofenol

El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de las diferentes
especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones que logren preservar la integridad
de las estructuras fúngicas. La tinción de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción
diferencial, sin embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada identificación. El fenol
inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye la flora
acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como
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mordiente cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras
fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera
una película protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina
presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.2 Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por medio de
una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura utilizando
una cinta adhesiva transparente).

Preparación de la impronta
1. Colocar el material necesario en la campana de seguridad
tipo.
2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente
aproximadamente de 1 cm2.
4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
5. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de
hongo.
7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner
otra gota de azul de algodón.
8. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
9. Observar en 40x.

Bibliografía
En línea:
Técnicas de tinción. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:26 horas.
http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf
Métodos y técnicas de tinción. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:42 horas.
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/metodos-y-tecnicas-de-tincion.html
Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Recuperado el 5 de octubre a las 18:04
horas.

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf