15-03-2018

Práctica 4.
Efecto del pH en una reacción enzimática.

Dr. Sergio Huerta Ochoa.

Laboratorio Virtual de Ingeniería enzimática

NIETO DIAZ MARINA BELEN

MORALES OLVERA LUIS ARMANDO
HERNANDEZ MARTINEZ NOHEMI LIZBETH
MONTES DE OCA MARTINEZ AIDEE CITLALLI
TORRES ROBLES EDGAR

0
INTRODUCCIÓN.
Las enzimas tiene grupos ionizables que ganan o pierden protones en sus cadenas laterales y extremos
carboxilo y amino terminales. El estado protonado/desprotonado de la enzima, afecta las interacciones
con el sustrato en el sitio activo: en la unión del sustrato y/o en la catálisis. Por lo tanto el estado de
ionización de la enzima puede tener efectos tanto en la V máx como en KM. Los estados de ionización
dependen del pKa de cada grupo, éste es el pH al cual, el 50% de las moléculas están protonadas y el
otro 50% de las moléculas están desprotonadas. [1]

Cuando el grupo en cuestión, se encuentra a un pH por encima de su pKa, libera un protón, mientras
que lo gana cuando el pH se encuentra por debajo de su pKa. Así, el pKa indica el grado de afinidad de
cada grupo por los protones, o dicho de otra manera, es la tendencia de cada grupo funcional a tomar o
ceder protones, por ejemplo si dicho grupo tiene un pKa=3 se encontrará desprotonado a un pH>3. Las
curvas del estado de ionización de las enzimas suelen tener forma de campana, ya que son varios los
grupos con diferentes pKa presentes en su estructura. [1]

En la presente práctica se eligió una enzima deshidrogenasa, a continuación se explicará su

importancia. La demanda de d-lactato deshidrogenasas termoestables (d-LDH) se ha incrementado para
la producción de ácido d-láctico, pero no se han explorado mucho las d-DLH termoestables con
actividad industrialmente aplicable. El ácido láctico es un monómero requerido para la producción de
ácido poliláctico (PLA), principal producto final de la fermentación de los carbohidratos por bacterias
homofermentativas de ácido láctico. [2]

Dos isómeros de ácido láctico, el dextro rotatorio y levo rotatorio, pueden ser producidos por lactato
deshidrogenasas (LDHs). Los isómeros ópticamente puros se separan usando especificidad quiral. Las
d-LDHs catalizan la conversión de piruvato a ácido d-láctico NAD dependiente. Las L-LDHs han sido
ampliamente estudiadas por su uso en alimentos, cosméticos y medicina en contraste con las pocas
aplicaciones del ácido d-láctico. El incremento en el interés de los estéreo-complejos de PLA es debido
a sus mejores propiedades como mezcla racémica, tal como el incremento en el punto de fusión. [2]

Retomando las características de la enzima en general la LDH tiene un peso molecular de

aproximadamente 140 kDa y está compuesta por cuatro subunidades, cada una de aproximadamente 35
kDa que dan lugar a un tetrámero. En humanos se conocen tres tipos de subunidades: M (LDHA), H
(LDHB) y X (LDHC), las cuales presentan pequeñas diferencias en sus secuencias de aminoácidos. La
asociación de estas subunidades da lugar a la formación de diferentes isoenzimas. Estructuralmente la
LDH es muy similar entre especies, sin embargo las secuencias de aminoácidos en vertebrados y
nematodos contienen 20 residuos extras hacia el extremo amino-terminal en comparación con las
bacterianas. [3]

De acuerdo a un estudio realizado por Chanha Jun, Young Seung Sa, et al. sobre la D-lactato
deshidrogenasa de Lactobacillus jensenii, están enzima muestra actividad óptima en reacciones de
reducción a un pH=7 y para reacciones de oxidación se observa la actividad máxima a un pH=8. Otros
autores como Garvie et al. informan un pH óptimo de 7.8, otros huéspedes como L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, L. delbrueckii y Staphylococcus epidermidis muestran un pH óptimo de 7.8-8.5, para
Leuconostoc mesenteroides Hofvendahl y Hahn-Hagerdal han informado que el óptimo pH para la
producción de ácido láctico varía entre pH 5-7, en un estudio realizado por Ling Li, Hyun-Ju Eom, et
al. se encontró un pH óptimo de 7-8[2,4]

OBJETIVO.
1
Determinar el efecto del pH en la actividad enzimática.

PROCEDIMIENTO.

Con estos valores

Una vez con esta se trabajó
En el software Enzyme se determinó la
con una concentración de de
Lab se selecciono la concentración de
sustrato de 10 mM y pH de
enzima deshidrogenasa saturación y se
7; se midió Km y velocidad
utilizo esa misma
Máxima
para medir efecto
de pH

Se hizo el mismo análisis pero se

Se calcularon valores de fijo la concentración de sustrato en
pKa 12.44 mM (saturación) y el pH se
varió de 4.5 hasta diez aumentando
de cinco en cinco y haciendo cada
punto por duplicada excepto el
ultimo

RESULTADOS.
Datos introducidos en el software:
Enzima: Deshidrogenasa
Concentración: 0.2925mg/mL
Actividad específica: 0.8mM Producto/min*mg de enzima
Volumen de 1vial: 500µL
Volumen utilizado por ensayo: 20µL
[S]=25*KM=12.44mM
pH= 7
El software Enzyme Lab en el primer día de trabajo determinó una cinética de tipo Michaelis-Menten
para la enzima deshidrogensa los resultados del análisis cinético se muestran en la siguiente tabla:

RESULTADOS DEL ANÁLISIS CINÉTICO REGRESIÓN NO LINEAL

VALORES PUNTUAL INTERVALO
KM (mM) 0.4976 [0.4526-0.5426]
Vmáx (µM/min) 4.6822 [4.3810-4.9834]

Posteriormente el segundo día de trabajo se fijó la concentración de sustrato a 25*K M, que sería la
concentración de saturación de la enzima [S]=12.44mM, se varío el pH t y al como se muestra en la
siguiente tabla se obtuvieron diferentes valores de Vmáx.
2
 pH vs. Log Vmáx
pH Vmáx (µM/min) log Vmáx
4.5 0.2401 -0.6196
4.5 0.2448 -0.6112
5 0.6869 -0.1631
5 0.6852 -0.1642
5.5 1.6984 0.2300
5.5 1.6516 0.2179
6 2.9851 0.4750
6 2.9045 0.4631
6.5 4.3731 0.6408
6.5 4.3442 0.6379
7 4.5917 0.6620
7 4.2819 0.6316
7.5 4.7805 0.6795
7.5 4.5833 0.6612
8 4.8940 0.6897
8 4.9440 0.6941
8.5 4.2704 0.6305
8.5 4.6373 0.6663
9 4.6604 0.6684
9 4.6863 0.6708
9.5 3.3092 0.5197
9.5 3.7342 0.5722
10 2.2220 0.3467

Luego se realizó la estimación del pK1 y pK2 para los aminoácidos más importantes del sitio activo
por el método gráfico, la siguiente gráfica se realizó colocando los valores de pH en el eje x y el log
Vmáx en el eje y. Luego se ajustó con el uso del software Excel la curva polinómica de orden 2 de
mejor ajuste entre los puntos. Posteriormente se colocaron las tangentes a la curva correspondiente y se
obtuvo el siguiente gráfico.

3
En la gráfica anterior se observa que los valores de pK para los aminoácidos más importantes del sitio activo
son:
pk1 6.5
pk2 8.7
pH óptimo 8

DISCUSIÓN.
Los resultados obtenidos en la práctica para la deshidrogenasa por el método gráfico pK1=6.5 y
pK2=8.7, siendo el pH óptimo 8 parecen acordes a los estudios consultados mencionados en la
introducción ya que, los artículos mencionan un pH óptimo 7-8.5 en promedio y de acuerdo con
Hofvendahl y Hahn-Hagerdal para Leuconostoc mesenteroides el pH varía entre 5-7.

Comparando los valores obtenidos de pK de 9.3 y 6.9 para LDH-2 por Fregoso Peñuñuri, los cuales
corresponden a la histidina y su grupo imidazol respectivamente, se observa que los valores obtenidos
en la práctica son bastante cercanos. De acuerdo con la tesis de Fregoso Peñuñuri, otros autores como
Rabiu 2013 reportaron valores de pk de 6.7 y 7.4 que corresponden al grupo imidazol de la histidina y
al grupo hidroxil de la tirosina respectivamente de la LDH de músculo de pollo. Esto sugiere que la

4
histidina es uno de los aminoácidos responsables de la catálisis y/o de la unión del sustrato a la enzima.
Lo anterior tiene similitud también con el estudio realizado por Ling Li y cols. donde indica que el gen
codificante para la histidina se encuentra mayormente conservado en Leuconostoc mesenteroides.

Con respecto al KM obtenido dentro de un intervalo de 0.4526-0.5426mM (mostrado en los resultados)

en comparación con los valores obtenidos para la d-lactato deshidrogensa de Leuconostoc
mesenteroides por Ling Li, et al. para los sustrato NADH y piruvato KM 0.50 y 0.58mM
respectivamente, podemos observar que los valores son cercanos. Los valores de K M obtenidos por
Fregoso Peñuñuri para el sustrato NADH son de 0.57±0.01mM cercano al intervalo obtenido en la
práctica.

En el artículo de Chanha Jun, Young Seung Sa, et al. se presenta la siguiente tabla 1 donde se muestran
los aminoácido que componen la d-lactato deshidrogenasa, esto se incluye como dato para mostrar que
la histidina pertenece a la estructura y se encuentra una proporción menor del 10%. En su estudio ellos
trabajaron con enzimas recombinantes, obteniendo KM para la reducción a NADH y la oxidación a
NAD, mostrados en la tabla 5. (Ambas tablas fueron extraídas del artículo)

5
Comparados con nuestros resultados de KM [0.4526-0.5426 mM] observamos que son menores con
respecto a d-LDH1 y d-LDH2, la lactato deshidrogenasa más cercana es la d-LDH3 con respecto a KM.

CONCLUSIONES.
Podemos concluir que nuestros resultados corresponden a la enzima d-lactato deshidrogenasa y de
acuerdo con la bibliografía consultada el aminoácido más importante es la histidina y su grupo
imidazol.
Además los valores obtenidos concuerdan con valores en literatura para deshidrogenasa por lo que se
puede decir que las determinaciones tienen un buen rango de estimacion.

REFERENCIAS.
1. Lodeiro R. Aníbal. Catálisis Enzimática. Fundamentos Químicos de la Vida. Facultad de
ciencias exactas. Universidad Nacional de la Plata. Editorial de la Universidad de la Plata.
Disponible en:
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/59590/Documento_completo__.pdf-
PDFA.pdf?sequence=1#page=137
2. Chanha Jun, Seung Sa Young, Sol-A Gu, Jeong Chan Joo, Seil Kim, et al. Discovery and
characterization of a thermostable D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus jensenii
through genome mining. Process Biochemistry 48 (2013) 109-117pp.
3. Fregoso Peñuñuri Ambar Azeneth. Caracterización Bioquímica y cinética de la lactato
deshidrogenasa 2-LDH-2-recombinante del camarón blanco Litopeneaus vannamei. Tesis
como requisito parcial para obtener el grado de Maestría en Ciencias. Septiembre 2015.
Hermosillo, Sonora. Aprobada por la Coordinación de Tecnología de Alimentos de origen
animal. Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C.
4. Ling Li, Hyun-Ju Eom,Jung-Mi Park, Enyoung Seo, et al. Characterization of the major
dehydrogenase related to D-lactic acid synthesis in Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides ATCC8293. Enzyme and Microbial Technology 51 (2012) 274-279pp.