19-03-2018

Práctica 5.
Efecto de la temperatura en una reacción
enzimática.

Dr. Sergio Huerta Ochoa.

Laboratorio Virtual de Ingeniería enzimática

NIETO DIAZ MARINA BELEN

MORALES OLVERA LUIS ARMANDO
HERNANDEZ MARTINEZ NOHEMI LIZBETH
MONTES DE OCA MARTINEZ AIDEE CITLALLI
TORRES ROBLES EDGAR

1
INTRODUCCIÓN
La inactivación térmica es una limitación importante para cualquier enzima que se use en bioprocesos
industriales. La exposición a altas temperaturas induce el despliegue parcial de la estructura de la
enzima. Cuando se observa un comportamiento exponencial de la constante de velocidad con respecto
a la temperatura la ley empírica que lo describe es la ecuación de Arrhenius [1, 2]:

Donde Ea es la energía de activación, que es la energía mínima promedio que deben alcanzar los
reactivos para convertirse en productos. Si Ea es independiente de la temperatura su integración
conduce a [1]:

Esta ecuación se aplica a intervalos no muy amplios de temperatura dado que en general la Ea depende
de la temperatura. Si en el intervalo de trabajo se observa que es aplicable se obtiene la gráfica lnk
versus 1/T donde se observa una dependencia lineal, cuya pendiente es igual a –Ea/R, así puede
evaluarse la Ea. [1]
En la presente práctica la enzima seleccionada es la maltasa [EC 3.2.1.20] que cataliza la hidrólisis de
la maltosa y se usa ampliamente en la síntesis de diversos alimentos y productos farmacéuticos. La
maltasa es una de las enzimas económicamente más valiosas que cataliza la reacción de hidrólisis de
maltosa mediante la escisión de enlaces glucosídicos α-1,4 encontrados entre restos de glucosa y
produce α-D-glucosa como producto final. [2]
Esta hidrolasa desempeña un papel fundamental en los sistemas biológicos y también tiene numerosas
aplicaciones en el procesamiento de alimentos, la elaboración de cerveza, la destilación y las industrias
farmacéuticas. La maltasa también se emplea durante el proceso de hidrólisis del almidón y libera
glucosa que se utiliza para la preparación de jarabes de glucosa. Este producto se utiliza además como
un ingrediente principal en el proceso de producción de bebidas gaseosas y en la síntesis de productos
de panadería. [2]
En un estudio realizado por Muhammad Asif Nawaz, et al. examinaron la estabilidad de la maltasa libre
y atrapada después de pre-incubarlas a diversas temperaturas (45-80 °C) durante 180.0 min. Se
recuperaron alícuotas de la enzima después de 30.0min y se calcularon las actividades residuales
porcentuales. Se observó que la maltasa libre y atrapada presentaba excelentes propiedades de
estabilidad térmica a 45 °C; en el caso de la maltasa atrapada esta retuvo el 60% de actividad a 50 °C
después de 150.0min mientras que la maltasa libre perdió completamente su actividad catalítica. La
maltasa atrapada mostró un 44% y un 37% de actividad residual a 55 °C y 60 °C, respectivamente,
incluso después de 180.0 min. La maltasa atrapada tenía una tolerancia térmica admirable que
conservaba un 30%, 24%, 17% y 3% de actividad a 65 °C, 70 °C, 75 °C y 80 °C, respectivamente,
incluso después de 180.0 min del período de incubación. Fue evidente que el soporte de polímeros
proporciona principalmente el efecto de protección a la biomolécula atrapada y evita su
desnaturalización en condiciones extremas. [2]

2
OBJETIVO
Determinar el efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
PROCEDIMIENTO
Paso 2. Los datos utilizados fueron:
Paso 1. Escoger el Laboratorio de investigación,
Sustrato: Maltosa al 100% (condición de
hacer clic en restablecer y borrar toda la gráfica.
saturación)

Producto: Glucosa

Enzima: Maltasa a una concentración de 20mM

pH: 7

La temperatura es la variable independiente

desde 10°C-70°C como se muestra en la tabla de
resultados.

Paso 3. Se dio click en el botón de inicio y la

reacción se llevó a cabo durante 2minutos.

Paso 4. Se registraron las velocidades de

Paso 5. Posteriormente se analizaron los reacción a las diferentes temperaturas como se
datos conforme al tema visto en clase muestra en la tabla de resultados.

RESULTADOS.
En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de Vmáx a diferentes temperaturas. Luego de
registrar los valores, se transformó el valor de la temperatura a Kelvin y se determinaron los inversos
de la temperatura 1/T y el lnVmáx.
TABLA DE RESULTADOS
T (°C) Vmáx (µM/min) T (K) 1/T (K-1) ln Vmáx
10 1.40 283 3.53E-03 0.3365
20 3.17 293 3.41E-03 1.1537
30 6.32 303 3.30E-03 1.8437
35 9.01 308 3.25E-03 2.1983
40 12.19 313 3.19E-03 2.5006
45 12.00 318 3.14E-03 2.4849
50 11.21 323 3.10E-03 2.4168
60 5.88 333 3.00E-03 1.7716
70 1.13 343 2.92E-03 0.1222

3
La siguiente gráfica se obtiene de la tabla de resultados, se observa la forma de campana y la
temperatura óptima a 40°C.

Por definición la velocidad máxima es igual al:

Por lo revisado en la teoría si el comportamiento de la constante de velocidad kcat con respecto a la

temperatura es exponencial la ley empírica que lo describe es la ecuación de Arrhenius y suponiendo
que la Ea es independiente de la temperatura su integración conduce a la siguiente ecuación, como se
indicó en la introducción:

Por lo revisado hasta ahora en el curso la Vmáx= [E] kcat sustituyendo kcat por la ecuación anterior
obtenemos:

Al linealizar la ecuación se gráfica en el eje y lnVmáx y en el eje x se colocan los valores de 1/T (K)

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En la siguiente gráfica se muestra la ecuación de la recta y el valor del coeficiente de determinación:

El valor de la constante de los gases utilizado para calcular el valor de la energía de activación Ea es
R=1.987cal/mol*K, y obtenemos los siguientes resultados:

m (-Ea/R) -6453.24334 K
Ea 12822.5945 cal/mol

DISCUSIÓN
Por los valores observados en la tabla de resultados y en la gráfica Vmáx vs. T [°C] la Vmáx disminuye
conforme aumenta la temperatura después de la temperatura óptima de 40°C, a un pH=7. Luego en la
gráfica del LnVmáx vs. 1/ T (K) el coeficiente de determinación es cercano a 1 con un valor de
R2=0.9995 que indica que la relación entre las variables es lineal. El valor de la energía de activación es
Ea=12822.60cal/mol.
En un estudio realizado por Min-Sun Kang, Masayuki Okuyama, Haruhide Mori y Atsuo Kimura sobre
la caracterización de una enzima glucósido hidrolasa de Lactobacillus johnsonii NCC533, que mostró
la actividad más alta a pH de 5.7 y mantuvo más del 95% de su actividad máxima en el rango de pH 5-
7.1 a 38°C por 10min de reacción. La especificidad del sustrato fue mayor para nigerosa, maltulosa y
kojibiosa con valores de kcat/Km de 43.9, 32.1 y 26.1 s -1mM-1 respectivamente para cada sustrato
mencionado; en el caso de la maltosa kcat/Km=3.99s-1mM-1 dicho valor pequeño en comparación con
los anteriores muestra una baja eficiente de reacción, lo que implica baja actividad a bajas
concentraciones de sustrato. Por lo tanto la maltosa no parece ser sustrato fisiológico de este
microorganismo. Con la información, citada solamente como dato interesante, podemos decir que a
pesar de que la enzima está presente su especificidad sobre un sustrato depende de otros factores
fisiológicos del microorganismo aunque las condiciones de pH y temperatura sean las óptimas para la
enzima. [3]

5
Después de investigar varios artículos al respecto y consultar http://www.brenda-
enzymes.info/enzyme.php?ecno=3.2.1.122#REF. Se observa que de forma general la enzima lleva
acabo la reacción de hidrólisis de maltosa-6’-fostafo glucosidasa+H 2O a D-glucosa+D-glucosa-6-
fosfato a un pH óptimo de 7-7.5 y una temperatura óptima de 36-40°C, no se encontró el valor de la
energía de activación pero con respecto a la temperatura óptima y pH óptimo podemos decir que se
llevó la práctica virtual en condiciones adecuadas de reacción; a parte con respecto a los datos dados en
la introducción se puede decir que se encontró lo esperado, es decir, la disminución de la velocidad
máxima de reacción en condiciones de saturación del sustrato con respecto al aumento de temperatura
por encima de la temperatura óptima de 40°C.
CONCLUSIONES
De acuerdo con la referencia 2 en el estudio realizado por Muhammad Asif Nawaz, et al. la enzima
libre es principalmente incapaz de satisfacer la necesidad de procesos industriales debido a estabilidad
contra temperaturas extremas, pH y solventes orgánicos. La inestabilidad de la enzima contra estas
condiciones conduce a la desnaturalización enzimática. La estabilidad y la eficacia catalítica de la
enzima se pueden mejorar después de inmovilizar la enzima dentro de diferentes matrices. [2]
Asif Nawaz Muhammad, Asad Karim, et al. concluyen que el rendimiento máximo se alcanzó con un
76.11% de inmovilización en un gel de agarosa al 3%, donde el tamaño de las perlas era de 5mm. La
máxima actividad de maltasa libre se logró en 45 °C y después del atrapamiento la temperatura óptima
se desplazó 15°C hasta 60 °C. Este incremento en la temperatura indica que la maltasa atrapada
requirió más activación energía en comparación con su contraparte libre, y que la matriz también altera
la flexibilidad conformacional de la enzima. La maltasa inmovilizada también mostró un amplio perfil
de estabilidad de temperatura y mantuvo su actividad hasta 80 °C, mientras que la maltasa libre perdió
su completa actividad catalítica cuando la temperatura excedió a 65 ° C. Dicho artículo indica que
observaciones similares se han informado en el caso de α-glucosidasa inmovilizada de Saccharomyces
cerevisiae donde se incrementó la temperatura óptima de 30-40°C después de la inmovilización. [2]
Lo anterior indica como se dijo al inicio que la inmovilización favorece la estabilidad térmica de la
enzima, en el caso de la práctica virtual el efecto de la inmovilización no se observó por que no se
realizó pero los datos comparables fueron los de la temperatura óptima y los del pH óptimo como se
indicó en la discusión. En conclusión nuestros datos concuerdan con los de la literatura para una
enzima libre maltasa/ maltosa-6’-fosfato glucosidasa.
REFERENCIAS
1. Lodeiro R. Aníbal. Catálisis Enzimática. Fundamentos Químicos de la Vida. Facultad de ciencias
exactas. Universidad Nacional de la Plata. Editorial de la Universidad de la Plata. Disponible en:
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/59590/Documento_completo__.pdf-PDFA.pdf?
sequence=1#page=137
2. Asif Nawaz Muhammad, Asad Karim, Zinab Bibi, Haneef Ur Rehman, et al. Maltase entrapment
approach as an efficient alternative to increase the stability and recycling efficiency of free enzyme
within agarose matrix. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 64 (2016) 31-38pp.
3. Min-Sun Kang, Masayuki Okuyama, Haruhide Mori y Atsauo Kimura. The first α-1, 3-
glucosidase from bacterial origin belonging to glycoside hydrolase family 31. Biochemie 91 (2009)
1434-1442pp.