Codón Sesgo y La Dinámica de Plegado de La Fibrosis Quística Regulador de La Conductancia Transmembrana

2017610 Codón sesgo y la dinámica de plegado de la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana
Cell Mol Biol Lett . 2016; 21: 23. PMCID: PMC5415761
Publicado en línea 2016 octubre 19. doi: 10.1186 / s116580160025x
Codón sesgo y la dinámica de plegado de la fibrosis quística regulador de la conductancia
transmembrana
Rafal Bartoszewski , # 1 Jaroslaw Króliczewski , # 2 Arkadiusz Piotrowski , 1 Anna Janaszak Jasiecka , 1 Sylwia Bartoszewska , 3 Briana VecchioPagan , 4
Lianwu Fu , 6, 8 Aleksandra Sobolewska , 1 Sadis Matalon , 5, 6, 8 Garry R. Cutting , 4 Steven M. Rowe , 6, 7, 8 y James F. Collawn # 6, 8
1
Departamento de Biología y Botánica Farmacéutica de la Universidad Médica de Gdansk, Hallera 107, 80416 Gdansk, Polonia
2
Laboratorio de Química Biológica, Facultad de Biotecnología de la Universidad de Wroclaw, Wroclaw, Polonia
3
Departamento de Química Inorgánica de la Universidad Médica de Gdansk, Gdansk, Polonia
4
Instituto de Medicina Genética de la Facultad de Medicina, Baltimore, EE.UU. Universidad Johns Hopkins
5
Departamento de Anestesiología y Medicina perioperatoria, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, EE.UU.
6
Departamento de celular, de desarrollo y Biología Integrativa de la Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, EE.UU.
7
Departamentos de Medicina y Pediatría, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, EE.UU.
8
Gregory Fleming James Centro de Fibrosis Quística, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, EE.UU.
Rafal Bartoszewski, Tel: +48 58 349 32 14, correo electrónico: rafalbar@gumed.edu.pl .
Información colaborador .
Autor correspondiente.
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Recibido 2016 14 Sep; Aceptado 2016 13 Oct.
Derechos de autor © El Autor (s) 2016
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Abstracto Ir:
Sinónimo mutaciones silenciosas o se pasan por alto en los análisis genéticos para las mutaciones causantes de la enfermedad a menos que se
asocian directamente con potenciales defectos de empalme. Estudios más recientes, sin embargo, indican que algunos polimorfismos de
polinucleótidos individuales sinónimos (sSNPs) se asocian con cambios en la expresión de proteínas, y en algunos casos, plegamiento de
proteínas y de función. El impacto de uso de codones de ARNm y los cambios estructurales en las tasas de traducción de proteínas y cómo
pueden afectar a la estructura y función de proteínas está empezando a ser apreciado. Se dan ejemplos aquí que demuestran cómo las
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5415761/ 1/17
mutaciones sinónimas alteran la cinética de traslación y proteínas plegamiento y / o función. El mecanismo de cómo se produce este se basa
en un modelo en el que el uso de codones modula la tasa de traslación mediante la introducción de pausas causadas por codones no óptimos
o raras o mediante la introducción de cambios en la estructura de ARNm, y esto a su vez influye plegables cotraduccional. Dos ejemplos de
esto incluyen la proteína de resistencia a múltiples fármacos (pglicoproteína) y la transmembrana de la fibrosis gen regulador de la
conductancia quística (CFTR). CFTR también se utiliza aquí como modelo para ilustrar cómo las mutaciones sinónimo puede ser examinada
usando in silico métodos predictivos para identificar qué sSNPs tienen el potencial de cambiar la estructura de proteínas. La metodología que
se describe aquí se puede utilizar para ayudar a identificar las mutaciones sinónimas “no silenciosos” en otros genes.
material complementario electrónico
La versión en línea de este artículo (doi: 10.1186 / s116580160025x) contiene material suplementario, que está disponible para los
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Palabras clave: sinónimo mutaciones, polimorfismo de nucleótido único (SNP), el uso de codones, mRNA plegables, velocidad de
traducción, in silico predicciones, CFTR
Fondo Ir:
Lo silenciosa polimorfismos pueden alterar la función de proteínas
Polimorfismos de nucleótido único sinónimos (sSNPs) son una característica común del genoma humano, sin embargo, que a menudo se
pasa por alto en los análisis genéticos a menos que estén cerca de los cruces de ARNm de corte y empalme. Hoy en día, sin embargo, se ha
vuelto cada vez más claro que las mutaciones sinónimas afectan a un número de otros procesos celulares importantes, incluyendo la
estabilidad del ARNm, y la expresión de proteínas, plegamiento y la función [ 1 5 ]. Mientras que el papel de las mutaciones sinónimas en
defectos de empalme se discute en otra parte [ 4 ], aquí nos centramos en cómo influyen estos otros procesos. Nuestro enfoque es citar una
serie de ejemplos que ilustran cómo las mutaciones sinónimas afectan a la expresión y función de proteínas, y luego discutir la forma en
silico métodos se pueden utilizar para ayudar a identificar estos tipos de mutaciones.
Sinónimo mutaciones han sido demostrado que tiene efectos en una serie de enfermedades y trastornos, incluyendo la esclerosis lateral
amiotrófica [ 6 ], el aumento de la sensibilidad al dolor [ 7 ], melanoma [ 8 ], la esquizofrenia [ 9 ], enfermedad cardíaca congénita [ 10 ], la
resistencia a fármacos [ 1 ], y la fibrosis quística [ 11 13 ]. Los detalles que describen cómo estas mutaciones sinónimas tienen sus efectos
se describen a continuación.
La esclerosis lateral amiotrófica (ALS) o enfermedad de Lou Gehrig es una enfermedad neurológica mortal rápidamente progresiva con
etiología poco clara, aunque las mutaciones en cobre / zinc superóxido dismutasa (SOD1) se asocian a menudo con esta enfermedad.
Michael Strong y colegas demostraron que tipo salvaje SOD1 mRNA forma complejos de ribonucleoproteína con homogeneizados de
proteínas de los tejidos neuronales que estabilizan la SOD1 mRNA, mientras que los ARNm que contienen mutaciones sin sentido ALS
fallar para formar estos complejos y, posteriormente, tener menos estable mRNA [ 6 ]. Más interesante, 4 mutaciones silenciosas que se han
identificado en la ELA, Gly11 (C / T) [ 14 ], Ser60 (T / C; rs373888553) [ 15 ], Thr117 (A / G) [ 16 ], y Ala141 (T / a; rs143100660) [ 15 ],
y todos estos fallan para formar los complejos de ribonucleoproteína de una manera similar a la observada para las mutaciones de sentido
erróneo [ 6 ]. Los resultados de estos estudios indican que la pérdida de ribonucleoproteína resultados de unión en una pérdida de la
estabilidad del ARNm. Esto ilustra un mecanismo interesante e inesperado de cómo un sinónimo mutación puede afectar los niveles de
expresión de proteínas.
Otro ejemplo se encuentra en la catecol O metiltransferasa ( COMT gen). COMT regula la percepción del dolor y hay tres haplotipos de la
COMT gen que se asocian con la percepción del dolor y en desarrollo trastorno de la articulación temporomandibular [ 17 ]. Los tres
haplotipos se componen de cuatro SNPs, uno situado en la región promotora, y el otro 3 en las regiones de codificación. Dos son sinónimo
mutaciones, uno a His62 (C / T; rs4633) y otro en Leu136 (C / G; rs4818), y la tercera es una mutación sin sentido, Val158Met (A / G;
rs4680) [ 7 ]. Curiosamente, los cambios sinónimos representan el mayor cambio en la actividad enzimática [ 7 ]. Diatchenko y colegas se
centraron en la comprensión de cómo estas mutaciones sinónimas causado esta pérdida de expresión de proteínas y sugirieron que las
diferencias se asociaron con diferencias estructurales de ARNm secundarias. Para probar esta idea, se analizaron las estructuras secundarias
de ARNm con los algoritmos de predicción Mfold [ 18 ] y Afold [ 19 ]. Este estudio también ilustra que las in silico métodos predictivos
para el plegado mRNA fueron confirmados mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio para desestabilizar las estructuras de tallobucle
predichos. Esta manipulación desestabilizó las estructuras de ARNm predichas y resultó en un aumento de las actividades de proteínas y
enzimas, estableciendo que las estructuras secundarias de ARNm muy estable o los menos propensos a desplegarse fácilmente durante la
traducción se asocian con la proteína menos traducido [ 19 ].
Incluso en el campo de la genómica del cáncer, el papel de las mutaciones sinónimas ahora está empezando a ser apreciado. Yardena
Samuels y sus colegas identificaron mutaciones somáticas en 29 muestras de melanoma y se encontró una mutación sinónimo interesante en
la proteína Bcl2como 12 ( BCL2L12 gen) que es como un factor antiapoptóticos (un cambio de C a T en la posición 51 (F17F) ) [ 8 ].
Esta mutación conduce a un aumento BCL2L12 ARNm y los niveles de proteína. En la caracterización de esta mutación silenciosa,
encontraron que esta mutación se produjo en 10 de 256 melanomas y que las elevaciones en el ARNm y la proteína no fuera debido al
empalme o traducción de cambios o a cambios en la estabilidad de la proteína [ 8 ]. Ellos encontraron que la mutación provoca una
acumulación en el ARNm y la proteína y esta señalización antiapoptótica promovido en las células de melanoma [ 8 ]. Análisis de los
mecanismos implicados reveló el sorprendente hallazgo de que esta sinónimo de mutación niveles elevados de mRNA debido a la diferencia
de orientación de tipo salvaje y mutante BCL2L12 por hsamiR6715p [ 8 ]. Curiosamente, este tipo de efecto se observó previamente entre
las mutaciones sinónimas y alterado miARN de unión en la familia GTPasa relacionadas con la inmunidadM ( IRGM gen) en la
enfermedad de Crohn [ 20 ].
Un examen extremadamente exhaustivo e interesante de la resistencia a múltiples fármacos 1 ( MDR1 gen) indicó que un SNP sinónimo en
este gen alterado del fármaco y del inhibidor de las interacciones en el producto del gen, Pglicoproteína [ 1 ]. Pglicoproteína es una bomba
de eflujo de ATP impulsada que contribuye a la resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas. Una particular, sinónimo SNP,
C3435T, que era una parte de un haplotipo común se asoció con alteración de la actividad de Pglicoproteína, y Chava KimchiSarfaty
analizó esta mutación en detalle en una amplia gama de líneas celulares y se encontró ningún cambio en el nivel de ARNm o proteínas en las
células que expresan este sSNP [ 1 ]. Sus resultados, sin embargo, indicaron que esta sSNP introdujo un codón raro que altera la estructura y
función de proteínas, lo que sugiere que la traducción fue alterada en presencia de la rara codón [ 1 ].
Tal vez la razón más grande que las mutaciones sinónimas a menudo se pasa por alto es que la gran mayoría de ellos, al menos en la mayoría
de los casos, son funcionalmente neutral. En un estudio en el receptor de dopamina D2 humano gen ( DRD2 ), sin embargo, Gejman y
colegas examinaron las propiedades funcionales de seis conocidos de origen natural mutaciones sinónimas y encontrado sorprendentemente
que dos tenían efectos funcionales [ 9 ]. C957T se predijo para alterar el plegamiento ARNm y esto afectó a la estabilidad del ARNm y la
traducción, y de manera importante, una respuesta debilitada a la dopamina inducida sobre regulación de DRD2 [ 9 ]. La otra mutación
sinónimo, G1101, no tuvo un efecto en sí mismo, pero lo hizo bloquear los efectos de la mutación C957T en el clon compuesto C957T /
G1101A, lo que demuestra que el Compuesto sinónimo mutaciones puede tener consecuencias inesperadas [ 9 ]. Dado que los receptores de
dopamina son dianas de fármacos en las terapias de la esquizofrenia, enfermedades de Parkinson y de Huntington [ 9 ], la importancia en el
análisis de mutaciones sinónimas en este gen son evidentes.
En la enfermedad cardíaca congénita humano, se conocen las mutaciones en los genes de factores de transcripción específicos cardíacos que
la función de proteínas de impacto y el factor de transcripción NK2 relacionados, locus 5 gen ( NKX25 ) proporciona un buen ejemplo [ 10
] de la presente. En NKX25 , más de 40 se han identificado mutaciones en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva. En un estudio
reciente realizado por Jurgen Borlak y colegas, analizaron biopsias cardiacas de 28 pacientes y se identificaron una mutación sin sentido en
el NKX25 gen, A119E, junto con dos mutaciones sinónimas encis, c.543G> A (Q181Q) y c .63A> G (E21E) [ 10 ]. En los análisis
funcionales in vitro de la actividad transcripcional de NKX25 usando plásmidos informadores reveló que la mutación A119E resultó en
tanto como una reducción del 40% en la actividad, y la adición de una o dos mutaciones sinónimas redujo la actividad transcripcional aún
más, lo que sugiere que las mutaciones sinónimas exacerban el fenotipo de la mutación sin sentido A119E [ 10 ]. Además, utilizando el
algoritmo de plegamiento de ARN de Viena para la predicción de estructura de ARNm, los autores encontraron que el ARNm estructura
secundaria A119E mutante difería de ARNm de tipo salvaje y que la adición de las dos mutaciones sinónimas cambió la estructura aún más [
10 ]. Estos estudios sugieren que, en algunos casos, las mutaciones sinónimas, aunque quizá no sea causal en y por sí mismas, pueden
exacerbar los efectos de una mutación sin sentido [ 10 ].
El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ( CFTR gen) y el F508del Ir:
mutación
Estudios anteriores por Bebok y colegas encontraron un efecto similar en el CFTR gen [ 12 ]. Examinamos una mutación sinónima de la
mutación más común en el CFTR gen, F508del , una deleción fuera del marco de la fenilalanina que crea una mutación sinónimo de
isoleucina en la posición 507 [ 12 ]. El humano CFTR gen es particularmente interesante dado que se codifica para una proteína que es
altamente sensible a cotraduccional de plegado [ 1 , 21 23 ]. CFTR es un canal de cloruro y bicarbonato y regulador clave de funciones
epiteliales [ 24 27 ]. Las mutaciones en el CFTR gen conducen a la reducción o la proteína CFTR disfuncional y causar fibrosis quística
(CF), un exocrinopatía generalizada que afecta a múltiples órganos, sino que está más notablemente asociada con la enfermedad pulmonar [
28 ].
La proteína CFTR consiste en una estructura modular compuesta de dos dominios que abarcan la membrana (MSD1 y MSD2, que
comprenden cada una seis regiones transmembrana), dos dominios de unión de nucleótidos (NBD1 y NBD2), y un dominio único entre
casete de unión a ATPtransportadores (ABC) llamado el dominio regulador (R) (Fig. 1 ) [ 24 ]. NBD1 y NBD2 participan en la unión de
ATP y la hidrólisis, mientras que la fosforilación del dominio R regula canal gating [ 24 ]. El logro de la conformación apropiada de los
dominios individuales y las interacciones entre estos dominios durante la síntesis de proteínas es crítica para el montaje CFTR adecuado [ 21
, 22 , 29 , 30 ].
Higo. 1
Un modelo esquemático de la estructura propuesta de la fibrosis quística regulador de la
conductancia transmembrana (CFTR) usando RasMol 2.7.5.2 ( http://www.openrasmol.org ),
basado en la base de datos PDB RSCB coordenadas depositado para el CFTR humano. El
modelo de dominios son ...
Con el fin de llegar a su estructura terciaria nativa, moléculas de CFTR se someten a procesos de plegado jerárquica complejos y
modificaciones posteriores a la traducción [ 31 33 ]. La velocidad de tipo salvaje y la traducción F508del CFTR en riñón embrionario
humano transfectadas (HEK 293), las células se ha calculado para ser 2.7 residuos por segundo en base a una tasa de traducción media de
9,2 min [ 34 ]. Esto es más lento en comparación con la tasa promedio de traducción de otras proteínas de 45 residuos por segundo [ 35 ], lo
que sugiere que la tasa de traducción CFTR es inusual [ 21 ]. Plegable CFTR comienza cotraduccionalmente [ 21 ], y se completa después
de la traducción [ 22 , 31 , 32 ]. Du et al. (2009) sugieren que los dominios individuales lograr conformaciones ligeramente dobladas co
traduccionalmente, pero la estructura terciaria nativa final requiere la finalización de las interacciones de dominio adecuados [ 22 ]. Montaje
dominio CFTR se ha estimado que tomar ~ 30120 min [ 36 ].
Desde traducción CFTR y el plegado se producen simultáneamente, la elección de los codones puede afectar a la cinética de traslación
durante la síntesis de proteínas, pero la forma en que está vinculada a plegamiento de proteínas está empezando a ser apreciado [ 37 ]. Se
cree que la cinética de traslación a controlar, al menos en parte, por los codones óptimos y no óptimas (revisado en [ 37 ]). Codones óptimos
se postulan para ser traducido más rápido, mientras que no óptimo se traducen más lento, con codones no óptimos colocados
estratégicamente para reducir la velocidad de traducción y promover la cotraduccional de plegado. Dado el plegamiento de cotraducción de
CFTR y su velocidad de traducción lento, se investigó el modo de uso de codones se predice para influir en la tasa de traslación de CFTR en
función de su utilización óptima de los codones y no óptimas, y cómo se prevé que estos cambios afectan a la cotraduccional plegable
dentro de los dominios individuales de CFTR. También se analizaron los sSNPs CFTR conocidos que se han identificado con el fin de
predecir cómo podrían afectar a la cinética de traslación CFTR, una estructura de ARNm, y los cotranslacional cambios de plegamiento de
proteínas.
En silico métodos predictivos para identificar mutaciones sinónimo de que la función de proteínas Ir:
impacto
Los genes altamente expresados a menudo contienen codones que son reconocidos por los ARNt más abundantes y se consideran óptimos o
rápido, ya que se traducen más rápido [ 38 ]. CFTR, por otro lado, se expresa en cantidades extremadamente bajas, y la tasa de traducción
parece ser más lenta que la media [ 34 ]. Proteínas complejas generalmente utilizan codones raros que a menudo se localizan en las interfaces
de dominio de dominio estratégicas [ 39 ], y estos codones raros (o grupos de codones raros) promueven pausas de ribosomas que pueden
contribuir a los cambios en las vías de plegado [ 39 ]. Desde CFTR es una proteína transmembrana complejo y multidominio con
transmembrana distinta y regiones citoplásmicas, se analizó la composición de los codones utilizados en CFTR humano y determinamos si
los codones fueron óptimas o raro, y cómo su colocación correspondieron a las estructuras secundarias predichas y dominio CFTR
organización.
Con el fin de identificar las regiones de traslación rápida y lenta predichos en CFTR, se utilizó el método relativa codón sinónimo de uso
(RSCU) [ 40 43 ] para calcular el impacto potencial de codones en la velocidad de traducción (para los métodos, véase la disposición 1 ).
El análisis revela que el sesgo de codón de CFTR consiste claramente de las regiones rápidos y lentos de traslación, mientras que la
transmembrana Nterminal de dominio MSD1 muestra el más alto contenido de codones lentos Translating (Fig. 2a , números de RSCU
logaritmo negativo, que se compararon con la molécula entera CFTR que se normalizó a 1). Esto es particularmente evidente al final de
MSD1, que es crítica a la degradación retículoasociado de escape endoplasmático (ERAD) y también la ubicación responsable de la unión
a la CFTR mal plegamiento de drogas corrector, VX809 [ 44 ]. El RSCU registro de los dominios de CFTR individuales se muestra en la
Fig. 2b . Todas estas regiones se compararon con toda la molécula CFTR que se normalizó a 1. Los resultados mostrados en la Fig. 2b
indican que transmembrana MSD1 y MSD2 se prevé que sean las regiones más lentos traducidas en CFTR (~ 5 veces más lenta que la tasa
media de CFTR). Otras regiones predichas para ser traducido lentamente incluir las secuencias entre MSD1 y NBD1 (MSD1 / NBD1) y
entre MSD2 y NBD2 (MSD2 / NBD2), y la región de la cola carboxiterminal (C '). Las predicciones RSCU también indican que la región
terminal de N (N '), NBD1 y NBD2, la región entre NBD1 y el dominio R (NBD1 / R), y el dominio R se traducen significativamente más
rápido que la media CFTR. La secuencia entre NBD1 y dominio R tiene el valor más alto RSCU de registro en CFTR (Fig. 2b ). Estos
datos predicen que la traducción CFTR da comienzo relativamente rápido, se ralentiza mientras se forma el dominio MSD1 y luego acelera
de nuevo durante la síntesis del NBD1 y dominios R. La traducción dominio MSD2 es lento, y la tasa de traslación más lento predicho es en
la interfaz entre MSD2 y NBD2 (MSD2 / NBD2). Después de esto, la traducción de NBD2 se predice para proceder rápidamente de nuevo,
antes de disminuir de nuevo en el extremo Cterminal (C ') (Fig. 2b ).
Higo. 2
una La distribución de codones óptimos y raras en CFTR. El logaritmo transformado mediana de
los valores RSCU (ventana ácido 3amino) que se mueve sugiere la presencia de lenta / no
óptima (valores de RSCU log negativo) y óptimas parches rápidos / (positivos) traducidas dentro
...
Ambos dominios transmembrana (MSD1 y MSD2) se componen de membrana que abarca hélices alfa conectados por bucles extracelulares
y citosólicos. Dado que estas dos regiones parecen ser traducido más lentamente que el promedio para CFTR, examinamos estas regiones
con más detalle. Como se muestra en la Fig. 3a , casi toda la MSD1 se predice que estar compuesto de los codones de traslación
relativamente lentas a excepción de bucle citosólico 2 (CL2) y el bucle externo 3 (EL3). Las regiones de traslación más lentas de MSD1 son
hélices 2 y 6 y bucle externo 1 (EL1) (Fig. 3a ). El sesgo MSD2 codón es similar a MSD1 excepto que la predicción es que hélices 1' y 4' y
externos bucles 4 y 6 (EL4 y EL6) se traducen más rápido que sus contrapartes en MSD1 (Fig. 3b ). Curiosamente, tanto en TME, la
predicción es que los bucles externos finales se traducen muy rápidamente (EL3 y EL6), mientras que las hélices finales se traducen muy
lentamente (hélices 6 y 6' ), sugiriendo que la desaceleración de la traducción es importante al final de estos dos dominios transmembrana.
Higo. 3
La tasa de traslación relativa de los subdominios dentro de MSD1 ( una ) y MSD2 ( b ). Los
subdominios de MSD1 y MSD2 medianas se normalizaron a toda CFTR RSCU mediana (valor
1)
efectos de uso de codones en la cinética de traslación Ir:
Hay 128 sSNPs reportados en la secuencia de CFTR mRNA humano y analizaron los cambios en el valor RSCU introducidas por estos
sSNPs para ver cómo podrían afectar a la cinética de traslación (archivo adicional 2 : Tabla S1). El valor de la mediana ΔRSCU para la
SNPs era 0.075, y casi un tercio de las analizadas (42 sSNPs) presentó valores de RSCU ya sea significativamente más altos o más bajos
(resaltada en gris claro en el archivo adicional 2 : Tabla S1). Para determinar si estas sSNPs se prevé que alteran la velocidad de traslación,
se analizaron cada sSNP en 3, 5, y las ventanas RSCU de 10 aminoácidos como se describe en el archivo adicional 1 . Como se muestra en
la Tabla 1 , sólo 5 de los sSNPs seleccionados (mostrado en negrita en la Tabla 1 ) se prevé que alterar la velocidad de traslación (una
derivación estándar por encima o por debajo de la mediana para todos ventana 3 RSCU análisis: c .1098A> G (G366 en la interfaz MSD1 /
NBD1); c1641A> T ( T547 en NBD1); c.3472C> a (R1158 en la interfaz MSD2 / NBD2); c.3772 T> C (L1258 en NBD2); y c.3789 T> C
(T1263 en NBD2) (Tabla 1 ). los otros sSNPs enumerados en la tabla 1 mostró efectos en al menos 2 de los 3 ventanas RSCU, y
dependiendo de su ubicación, podría potencialmente afectar a la cinética de traslación CFTR.
tabla 1
sSNPs seleccionan cambio significativo en motivos codón sesgo locales analizado para grupos de
3, 5 y 10aa
Papel de sSNPs en cambios estructurales de ARNm Ir:
La ubicación sSNP dentro del dominio, sin embargo, no puede ser el único factor decisivo que afecta el plegamiento de proteínas. Aquí
examinamos cómo los cambios de uso de codones puede alterar potencialmente la estructura de ARNm dado que los cambios estructurales
de ARNm puede afectar a la tasa y la proteína de la función de traducción [ 12 , 13 ]. El uso de software RNAsnp [ 45 , 46 ] para determinar
si cualquiera de los SNPs potencialmente podría influir en la estructura CFTR mRNA (archivo adicional 3 : Tabla S2), 8 SNPs fueron
identificados como potenciales candidatos. Todas las identificadas 8 SNPs introdujeron cambios en la estructura secundaria del mRNA
mediante la introducción de curvas cerradas, o mediante la reorganización o eliminación de ellos (que se muestra en el archivo adicional 4 :
Figura S1).
patogenicidad predicho de los sSNPs utilizando CADD Ir:
En el tercer tipo de análisis, se utilizó una herramienta descrito recientemente para la estimación de la patogenicidad relativa de variantes
genéticas humanas basado en el método de agotamiento dependiente anotación combinado (CADD) [ 47 ]. CADD estima la patogenicidad
relativa de variantes basadas en anotaciones de una variedad de fuentes y la combinación de ellos en una sola medida que se expresa como
un Cscore [ 47 ]. Los Cpuntuaciones calculadas se asemejan a los resultados de ambos métricas basadas en la conservación y métricas
funcionales subconjunto relevante. Curiosamente, la distribución sSNP en CFTR se caracteriza por significativamente más altos de C
puntuaciones medias que las observadas en la distribución de SNP del genoma entero (archivo adicional 5 : Figura S2) [ 47 ]. El examen de
este para CFTR , hemos considerado sólo los valores Cscore que eran significativamente más alto que todo el genoma media sSNP
(6,36866 + 3,701498 = 10,07) [ 47 ], y esto condujo a la selección inicial de 47 SNPs. (Archivo adicional 5 : Figura S2; archivo adicional 6
: Tabla S3). Curiosamente, 4 de estas sSNPs también se presentó en los cambios estructurales de ARNm de análisis, y uno de éstos se
presentaron en los 3 análisis, c.3472C> A (R1158), es decir en la interfaz MSD2 / NBD2 (tabla 2 ).
Tabla 2
sSNPs seleccionados como significativa por al menos 2 tipos de análisis independientes (RSCU,
una estructura de ARNm y CADD)
Las tarifas de traducción y el plegamiento de proteínas Ir:
CFTR encaja bien en el modelo clásico de plegamiento de proteínas que sugiere que las regiones transmembrana se traducen más lento que
las regiones citosólicas. En efecto, si se tiene un vistazo más de cerca a la composición de los dominios transmembrana CFTR (Fig. 3 ), es
claro que las hélices se forman muy lentamente, en particular como los aminoácidos salen de la región transmembrana. MSD2 está formada
ligeramente más rápido que MSD1 y ambos de estos dominios comparten características comunes. Los últimos bucles externos de estos
dominios transmembrana (EL3 y EL6) contienen codones óptimos mientras que el último hélices (6 y 6 '), así como la interfaz entre la
membrana que abarca dominios y los NBDs (MSD1 / NBD1 y MSD2 / NBD2) son compuesto de codones raros. Es evidente que la
formación de MSD1 y montaje bucle citosólico son cruciales tanto para co y posttraduccional de plegado CFTR. Por lo tanto, los cambios
en la preferencia de codones en estas regiones, especialmente en hélices entrar o salir de la membrana introducida por mutaciones o sSNPs
podría afectar a la eficiencia de plegado CFTR significativamente y por lo tanto los niveles y / o función de la proteína madura.
Pausas de traducción es una estrategia general que se emplea en la cotraduccional plegamiento de dominios individuales en una proteína
multidominio. La separación en el tiempo proporcionada por la pausa permite la terminación de los procesos sin interrupción, lo que ayuda
a evitar problemas en el plegamiento de proteínas y la agregación [ 48 ]. Interferir con este proceso con el cambio de codones introducidos
por sSNPs puede conducir a efectos aguas abajo. Por ejemplo, los codones cambiantes se ha demostrado en un número de casos para alterar
la estructura y función de proteínas [ 1 , 3 , 39 , 49 , 50 ]. Se han propuesto SNPs para dar lugar a vías de plegado alternativa a través
ribosome estancamiento, una menor concentración de tRNAs afines (uso de codón), o mediante la alteración de la estructura de ARN [ 12 ,
13 , 39 , 51 ]. Estructuras secundarias ARN alterado han sido demostrado que influyen en la longitud de los ciclos de pausa y la tasa de la
traducción [ 52 ]. Por lo tanto, el ARNm cambios relacionados con estructurales en la dinámica de traslación de integración membrana
probable influencia y cotraduccional de plegado de las proteínas que abarcan múltiples de membrana como CFTR [ 21 , 53 ]. Nuestros
estudios anteriores demuestran que los cambios estructurales de ARNm asociados con el I507 SNP introducidos por la mutación resultados
F508del CFTR en una disminución de la frecuencia de traslación de F508del CFTR [ 12 ]. Además, una variante de un solo nucleótido
sinónimo de la F508del CFTR (Ile507ATC), que revierte I507 ATT triplete a ATC original que se encuentra en la secuencia de tipo salvaje,
tiene niveles de expresión mejorados tipo similar salvaje estructura CFTR mRNA y cuando se compara con nativo F508del CFTR [ 12 ].
Más importante aún, esta sustitución también afecta a la función de la proteína [ 13 ] y la sensibilidad a fármacos [ 11 ].
Plegable CFTR parece ser extremadamente complejo (revisado en [ 36 ]). La tasa de traducción predicho lento para el TME tiene sentido ya
que los modelos de homología predicen una estructura de intercambio de dominio complejo de dos haces helicoidales de seis abarcan
contienen transmembranas 12, 912 y transmembranas 78, 36 que se retuercen alrededor de una poro conductor de iones central de [ 36 ,
54 ]. Además, CFTR hélices transmembrana contienen un número de residuos cargados que pueden ser importantes para este arreglo
complejo de TMDS, y esto en combinación con los aminoácidos hidrófobos y los codones no óptimas podrían reducir la velocidad de
traducción, y al hacerlo, proporcionar la necesaria tiempo para el montaje correcto para esta compleja estructura, formación de poros. Con
suerte, este tipo de in silico de análisis y discusión proporciona un marco para el análisis de por dónde empezar sinónimo polimorfismos y
establece el concepto de que este tipo de cambios no deben ser pasados por alto en las pantallas de genética futuras.
Las perspectivas Ir:
¿Cómo de uso de codones y la estructura mRNA afectan a las tasas de la traducción de proteínas están empezando a ser entendido.
Algoritmos para ARNm de predicciones de la estructura identifican la estructura de energía más baja entre una mezcla de estructuras que sin
duda existen en equilibrio [ 45 , 55 , 56 ]. Incluso si se identifica la estructura correcta, apoyando evidencia bioquímica por estudios de
dicroísmo circular o ensayos de plegado de ARNm tal como el ensayo SHAPE necesitan ser realizados para confirmar las predicciones [ 12
]. Esto también significa que las líneas celulares clonales se han de establecer para la prueba de estos efectos, y el ARNm y los niveles de
proteína de expresión y estabilidades necesitan ser probados. En el caso de I507ATC> ATT, encontramos este cambio de codón sinónimo
alterado la estructura del mRNA y de expresión de proteínas niveles [ 12 ], el aumento de las propiedades de estabilidad y canal gating
térmicas como grabaciones de patchclamp de células enteras de verificación y las grabaciones de canales individuales , respectivamente [ 13
], y una alteración de la sensibilidad de la canal a fármacos [ 11 ]. En este caso particular, el I507 sSNP exacerba el efecto de la F508del
mutación. Esto sugiere la intrigante posibilidad de que otros polimorfismos silenciosos tienen el potencial de exacerbar o incluso apaciguar a
mutaciones causantes de enfermedad, o en casos extremos, incluso puede ser causante de la enfermedad a sí mismos. Dado el gran número
de polimorfismos silenciosos que se encuentran en la mayoría de los genes, y la cantidad de trabajo requerido para determinar si un
polimorfismo en realidad tiene ningún efecto, la bioinformática enfoques como los descritos aquí seguirán siendo un aspecto importante de
futuros estudios que determinan qué silencio polimorfismos alterar la expresión y / o función de la proteína.
conclusiones Ir:
Un aspecto interesante de estos estudios es el hecho de que las tasas individuales de traducción de los diferentes dominios de CFTR se prevé
que sean muy diferentes y son consistentes con la idea de que los dominios se pliegan cotraduccional. ¿Cómo estas sSNPs realidad afectan
la cinética de traslación, sin embargo, sólo puede ser determinado experimentalmente. Una posibilidad interesante, sin embargo, es que los
sSNPs, especialmente en combinación con mutaciones conocidas, podría exacerbar o apaciguar a la severidad de la mutación a través de su
influencia sobre la cinética de traslación del dominio de sí mismo o dentro de una interfaz de dominio de dominio.
Archivos adicionales
Archivos adicionales Ir:
Archivo adicional 1: (37K, docx)
métodos suplementarios. (DOCX 36 kb)
Disposición adicional 2: Tabla S1. (30K, xlsx)
efectos SNPs en CFTR RSCU Los SNP con valores significativos ΔRSCU están marcados en gris. Dependiendo de la cobertura de la
base de datos la base de datos dbSNP (rs #) e identificadores de bases de datos de mutaciones CFTR para SNPs se utiliza. (XLSX 30
kb)
Archivo adicional 3: Tabla S2. (37K, xlsx)
Efectos SNPs en estructura secundaria CFTR mRNA. Los SNPs con significativa p valores (<0.2) están marcados en gris. Además,
sSNPs con p valor p  <0,05 en al menos un modo de análisis y p  <0,2 en el segundo modo de análisis se consideraron más (marcada
en negrita) [ 8 , 9 ]. (XLSX 37 kb)
Archivo adicional 4: Figura S1. (5.2M, tif)
estructuras de ARNm predicho que ilustra cómo los sSNPs afectan a la estructura de ARNm local. La secuencia de tipo salvaje se
muestra en el panel izquierdo y sSNP en la derecha. Los modelos estructurales se obtuvieron con software RNAsnp, dentro de una
región 200 nt centrada alrededor de la sSNP. (TIF 5393 kb)
Archivo adicional 5: Figura S2. (1,7 M, tif)
A. Comparación de los Cscore valores de distribuciones calculadas para CFTR sSNPs en comparación con todo el genoma humano.
Los valores medianos están marcados con líneas continuas, las barras de error representan las desviaciones estándar. B. Distribución de
sSNPs relacionadas valores Cscore dentro de la estructura primaria CFTR, los anteriores línea continua representan valores que eran
significativamente más alto que todo el genoma sSNP media + SD (6,36866 + 3,701498 = 10,07), mientras que los sSNPs con parte
superior C 25% Resultado valores están marcados con triángulos negros sólidos. La ubicación de dominio CFTR está marcada por
encima de la gráfica. (TIF 1790 kb)
Archivo adicional 6: Tabla S3. (29K, xlsx)
análisis CADD de CFTR SNPs. SNPs que pueden afectar empalme están marcados en negrita. SNPs con Cpuntuación
significativamente más alta que la mediana de todo el genoma están marcados de color gris claro, mientras que los SNP con el cuartil
más alto de Cresultados están marcados de color gris oscuro. (XLSX 28 kb)
Expresiones de gratitud Ir:
Agradecemos al Dr. Bożena Króliczewska ayuda técnica con los análisis estadísticos.
Fondos
Este trabajo ha sido financiado por el Programa Nacional del OPUS Centro de Ciencias bajo contrato 2015/17 / B / NZ3 / 01485 (RB), NIH
subvención DK 44003 (GRC) y CUTTIN13A2 beca de la Fundación CF (a GRC)
Este estudio fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencia, Polonia, otorga N N401 633640 (LK) y 2015/19 / B / NZ7 / 03830 (RB).
La disponibilidad de datos y materiales
Los sSNPs CFTR analizados se obtuvieron mediante la combinación de datos de la fibrosis quística mutación de base de datos (CFTR1;
http://www.genet.sickkids.on.ca/app ) y la base de polimorfismo de nucleótido único (dbSNP) de secuencias de nucleótidos Variación
(NCBI) ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP ).
Contribuciones de los autores
Concebido y diseñado los experimentos: RB, JK, AP, realizado los experimentos: RB, AJJ, SB. Analizados los datos: RB, AP, GC, BVP,
LF, AS. reactivos Contribuido / materiales / herramientas de análisis: RB, JC, GC. Escribió el documento: RB, JC, SM, GC, SR. Todos los
autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
El consentimiento para la publicación
No aplica.
Ética aprobación y el consentimiento para participar
No aplica.
notas Ir:
Este trabajo fue apoyado por la subvención (s) siguiente:
Narodowe Centrum Nauki 2015/17 / B / NZ3 / 01485 a Rafal Bartoszewski.
Institutos Nacionales de Salud DK 44003 a Garry R. Cutting.
Fundación de Fibrosis Quística CUTTIN13A2 a Garry R. Cutting.
Información colaborador Ir:
Rafal Bartoszewski, Tel: +48 58 349 32 14, correo electrónico: rafalbar@gumed.edu.pl .
Jaroslaw Króliczewski, email: jarekk@ibmb.uni.wroc.pl .
Arkadiusz Piotrowski, email: arpiotr@gumed.edu.pl .
Anna Janaszak Jasiecka, email: ajanaszak@gumed.edu.pl .
Sylwia Bartoszewska, Email: sylwiabart@gumed.edu.pl .
Briana VecchioPagan, email: briana.vecchio@gmail.com .
Lianwu Fu, email: lianwufu@uab.edu .
Aleksandra Sobolewska, email: aleksandrasobolewska@gumed.edu.pl .
Sadis Matalon, Email: sadis@uab.edu .
Garry R. Cutting, email: gcutting@jhmi.edu .
Steven M. Rowe, Email: SRowe@peds.uab.edu .
James F. Collawn, email: jcollawn@uab.edu .
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Artículos de Cellular & Molecular Biology Letters se proporcionan aquí por cortesía de BioMed Central

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