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MICROBIOLOGÍA
2017
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
CULTIVO DE
MICROORGANISMOS
FARMACIA
ÍNDICE
NUTRICION BACTERIANA ........................................................................................................... 1
1. CONCEPTOS BÁSICOS ...................................................................................................... 1
2. CLASES DE NUTRIENTES .................................................................................................. 2
2.1. Nutrientes Universales ............................................................................................. 2
2.2. Nutrientes Particulares ............................................................................................ 4
3. MEDIOS DE CULTIVO ....................................................................................................... 5
3.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN .. 6
3.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA .. 7
3.3. OTRA CLASIFICACIÓN ............................................................................................... 7
Tabla 1. Ejemplos de medios de cultivo usados para el cultivo de bacterias .................... 9
4. PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS .......................................................... 12
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ................................................................ 13
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 13
2. SIEMBRA Y FORMAS DE REALIZAR LA TRANSFERENCIA ................................................ 13
2.1. Cultivo en medio sólido ......................................................................................... 14
2.2. Cultivo en medio semisólido (siembra por picadura o punción) ........................... 14
2.3. Cultivo en medio líquido ........................................................................................ 15
3. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO .......................................................................................... 15
3.1. Métodos generales ................................................................................................ 15
3.2. Métodos Especiales ............................................................................................... 17
3.3. Siembra y aislamiento de microorganismos anaerobios ....................................... 18
TRABAJO EXPERIMENTAL ......................................................................................................... 19
Objetivos .............................................................................................................................. 19
1. Preparación de placas y tubos en condiciones asépticas ............................................. 19
2. Siembra de microorganismos ........................................................................................ 20
3. Siembra por dispersión en placa y recuento de microorganismos viables .................. 21
4. Análisis de resistencia a antibióticos por medio de antibiograma ............................... 22
CUESTIONARIO ......................................................................................................................... 23
PROBLEMAS .............................................................................................................................. 24
FARMACIA
NUTRICION BACTERIANA
1. CONCEPTOS BÁSICOS
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias
químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para
dos objetivos:
fines energéticos (reacciones de mantenimiento)
fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo)
La biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del
medio ambiente. Todo microorganismo necesita para vivir una fuente de carbono, una fuente de
energía y un dador de electrones. Según de donde obtenga estos requerimientos, estos pueden
clasificarse en:
FUENTE DENOMINACIÓN POSIBLE FUENTE
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FARMACIA
A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición distintos, desde
bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los
muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C,
incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre
los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono es la glucosa.
En los heterótrofos‐organótrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto
del material celular ‐CH2O‐) entran simultáneamente a:
metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con
otras sustancias no totalmente oxidadas);
metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).
Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias
que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3‐, NH3, SO4=,
fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen
tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los
microorganismos quimioautótrofos (o quimiolitoautótrofos): obtienen su energía de la oxidación de
sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales
inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que
muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos compuestos más
complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.
2. CLASES DE NUTRIENTES
Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:
2.1. Nutrientes Universales
Agua: Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden
considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el
punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:
el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones
bioquímicas).
Las fuentes de agua pueden ser:
endógena: procedente de procesos de óxido‐reducción;
exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas.
Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:
Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben, de modo más o menos
intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria.
Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O
que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo.
CO2: El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:
Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente
de energía la luz (en el caso de las fotoautótrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias
inorgánicas (los quimioautolitótrofos).
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Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones
procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:
CO2 + 4H2 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐> CH4 + 2H2O (ΔG'0<0)
Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de
electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas
anabólicas y catabólicas.
El origen del CO2 puede ser:
endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente
orgánica de carbono;
exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.
Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero algunas
bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas,
con 5‐10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el dióxido
de carbono; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.
Fósforo: Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden
usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos,
ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados
por fosfatasas extracelulares o (en las Gram‐negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El
fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece
también en coenzimas y en proteínas.
Sales minerales: Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl‐) y de cationes para la célula.
Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++,
Ca++, Fe++.
El ión potasio (K+):
interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la
síntesis de proteínas.
en Gram‐positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.
El ión magnesio (Mg++):
estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;
como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de
grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la
enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la misma.
Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.
El ión calcio (Ca++):
es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.
El hierro
Principalmente como ión ferroso, Fe++, suele estar complejado en la naturaleza, formando sales
insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de
captar ese hierro (p.ej., enterobactina).
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El hierro:
participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y
ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe‐S);
interviene como cofactor en ciertas enzimas.
Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan
minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como
micronutrientes o elementos traza.
El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.
El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si
suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).
El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN‐ y ARN‐
polimerasas.
El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de
nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de
las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.
El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.
2.2. Nutrientes Particulares
Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de
bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos)
pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades
biosintéticas.
Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:
el radical ‐NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas)
y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas);
el radical ‐SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA.
La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en forma
combinada inorgánica oxidada:
como NO3‐, merced a la actuación secuencial de nitrato‐reductasas y nitrito‐reductasas
asimilatorias.
como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente
sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S.
Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida:
de N inorgánico: amonio (NH4+)
de S inorgánico: sulfuros (S=, SH‐)
de N orgánico: aminoácidos, péptidos
de S orgánico: cisteína.
Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden
usar nitratos.
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Factores de crecimiento
Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad,
algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares
de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores,
vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda
de una ruta biosintética.
Ejemplos:
las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de
cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.
Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín‐nucleótidos.
En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas
bacterias:
Factor o vitamina Funciones principales
p‐aminobenzoico (PABA) Precursor del ácido fólico
Acido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de
grupos metilo.
Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2
Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de
desoxirribosa
Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en
reacciones redox
Riboflavina Precursor de FAD y FMN
Ácido pantoténico Precursor de la CoA
Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas.
Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos
Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas,
menaquinonas, etc.)
3. MEDIOS DE CULTIVO
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio.
Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de
macro‐ y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado
puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los
microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o
fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo. Un medio de cultivo es una solución
acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes
todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s).
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
a) de acuerdo a su composición :
Complejos o indefinidos
Sintéticos o definidos
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b) de acuerdo a su consistencia :
Sólidos
Semisólidos
Líquidos
Otra clasificación adicional permite caracterizarlos como:
Selectivos / No selectivos
Diferenciales / No diferenciales
3.1. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN
Medios complejos o indefinidos
Su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos
de materiales naturales complejos: Ejemplos:
Extracto de carne: resulta de la extracción de los productos solubles de la carne hervida o macerada
y luego concentrado hasta la consistencia de una pasta o polvo. Su composición es compleja,
contiene proteínas, muy pocos aminoácidos libres, bases nitrogenadas y glúcidos.
Extractos de levadura: resulta del líquido que contiene el protoplasma de las células lisadas. Se lo
seca y concentra a consistencia de polvo. Contiene gran cantidad de vitaminas.
Peptonas: se denominan peptonas a productos sin identidad química definida, obtenidos a partir de
la hidrólisis parcial de proteínas. Sometiendo las proteínas a hidrólisis se llega a las metaproteínas,
proteosas, peptonas, polipéptidos y finalmente a los aminoácidos. Entre estos distintos compuestos
no existe una línea neta de demarcación pasándose de unos a otros en forma gradual con la extensión
del proceso hidrolítico. No todos los productos de hidrólisis son iguales ni utilizados de la misma forma
por las bacterias. Para algunas bacterias la fuente de obtención de Nitrógeno pueden ser proteínas
parcialmente hidrolizadas, pero para otras el crecimiento depende o al menos es favorecido por la
presencia de aminoácidos libres que, por otra parte, si se encuentran en gran cantidad pueden actuar
como inhibidores del desarrollo. Las peptonas utilizadas normalmente contienen similar composición
química puesto que se preparan a partir de la misma materia prima y los mismos métodos de digestión
para elaborarlas. Las peptonas usadas comúnmente son las preparadas por las firmas: White, Parke‐
Davis, Merck, Difco y Microquim. Las más comunes son peptonas a partir de carne o de caseína (de la
leche).
Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que
pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal,
ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado,
suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e
incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N
orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control
nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos
nutrientes.
La presencia de al menos uno de los extractos enumerados es suficiente para clasificar al medio como
complejo o indefinido.
Medios sintéticos o definidos
Se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras,
orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria
que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades
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biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades
biosintéticas.
3.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA
Cualquiera que sea el tipo de medio podemos elaborar tres tipos de "versiones", según su estado físico
o consistencia:
• medios líquidos: sin gelificante
• medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en
estado de gel que solidifica (da consistencia) a esta solución.
• medios semisólidos: si se agrega una cantidad de coloide en estado de gel menor que la adicionada
a los medios sólidos.
El gelificante más usado es el agar‐agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen
versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa;
son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias
"contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional
de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los
100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias estudiadas, que son mesófilas. En
general se requiere una concentración mayor a 1% p/v para los medios sólidos y habitualmente 0,3‐
0,7% p/v a los medios semisólidos.
Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautótrofos) se suele recurrir a un gelificante
inorgánico, el silicagel o gel de sílice.
3.3. OTRA CLASIFICACIÓN
Medios selectivos o no selectivos
Los medios Selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de
microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que incorporan
ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de
otras. Medios que llevan violeta cristal, por ejemplo, inhiben el crecimiento de bacterias Gram‐
positivas.
Medios diferenciales o no diferenciales
Los medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de
bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese
comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora
presente en el medio.
Ejemplos:
en el medio EMB (eosina‐azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias
producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de la
fuente de carbono.
el medio llamado agar‐sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la
capacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas bacterias.
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el medio de Kempler & McKay permite identificar aquellas bacterias capaces de
metabolizar citrato. Entre sus componentes posee ferricianuro de potasio y citrato férrico. Cuando las
bacterias consumen el citrato, el hierro que queda libre reacciona con el ferricianuro dando el
complejo azul de Prusia; luego de 24 o 48 hs de incubación a 30°C las colonias que metabolizan citrato
adquieren color azul.
el medio llamado caldo tioglicolato permite diferenciar microorganismos en base a su
requerimiento de oxígeno. Contiene 0,075 % de agar para evitar que las corrientes de convección
transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa del caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente
reductor, disminuyendo el potencial de óxido‐reducción del medio. La presencia de una importante
variedad de nutrientes (caseína, extractos de levadura y carne, vitaminas, etc.) en el medio permite el
desarrollo de la mayor parte de las bacterias. Hay distintas fórmulas modificadas en las que se han
incluido otros componentes: un indicador de óxido‐reducción (Resazurina) el cual vira a rojo ante el
eventual aumento del contenido en oxígeno, Glucosa, Vitamina K1 y Hemina. El crecimiento en los
tubos se distingue por la presencia de turbidez a distintas profundidades: se observa que las bacterias
estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o
anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.
A continuación, puede observarse el comportamiento
de los distintos microorganismos con distinta tolerancia
o dependencia del oxígeno.
1. Aerobios estrictos
2. Anaerobios estrictos
3. Facultativos
4. Anaerobios aerotolerantes
5. Microaerófilos
Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales, por ej., el agar de MacConkey.
Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa,
peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.
Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram‐positivas debido a la inhibición del
violeta cristal y a las sales biliares, que contraseleccionan también a algunas gram negativas a
excepción de las enterobacterias. Las sales biliares son agentes tensioactivos que desorganizan
membranas, sin embargo, las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales
biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores) y pueden crecer en este medio.
En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de
Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias
fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca
que sus colonias y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro;
además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la
precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac‐, al no poder usar
la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto
carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el
indicador rojo neutro vira a amarillo.
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Tabla 1. Ejemplos de medios de cultivo usados para el cultivo de bacterias
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intestinal u otras Enterococcus: Colonias brillantes azul oscuro
muestras o negras, 1‐2 mm de diámetro.
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4. PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Algunas especies bacterianas son capaces de producir metabolitos secundarios. Estos compuestos
poseen un amplio rango de estructuras químicas y actividades biológicas, aunque no son esenciales para
el crecimiento. Las funciones biológicas que pueden cumplir son: agentes de defensa competitiva contra
otras bacterias, hongos, insectos y animales superiores, agentes de transporte de metales, hormonas
sexuales y efectoras de diferenciación, entre otras. Algunos de estos compuestos son coloreados y se
pueden distinguir fácilmente en el medio de cultivo.
Serratia marcescens es una bacteria Gram negativa, facultativa, baciliforme, de la familia
Enterobacteriaceae, que produce un metabolito secundario característico de color rojo, la prodigiosina.
El género Gram positivo Streptomyces también es un gran productor de metabolitos secundarios.
Dentro de este género la especie bacteriana S. coelicolor produce dos compuestos coloreados
característicos que presentan actividad antibiótica, la actinorhodina, que es de color azul y se libera al
medio extracelular y la undecilprodigiosina, que es rojo y permanece anclado a la membrana celular.
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SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es
necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros.
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células
fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.
Para obtener cultivos puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las
denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister
utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es
decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los
medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la
separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El
aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.
2. SIEMBRA Y FORMAS DE REALIZAR LA TRANSFERENCIA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en microbiología es necesario
mantener la habitación sin corrientes de aire, estar al lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm.
de distancia). También se puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz
UV.
Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el
crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa,
hisopo o pipeta estéril.
a) Medio líquido a medio líquido: pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo.
b) Medio líquido a medio sólido: pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e hisopo.
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c) Medio sólido a medio sólido: ansa o hilo (en el primer caso por estrías, en el segundo por punción).
d) Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo.
2.1. Cultivo en medio sólido
TUBOS CON AGAR INCLINADO (Pico de flauta)
Para sembrarlos, se mueve el ansa o el hilo suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento
en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. Se observará el aspecto
general del medio y la aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo
de microorganismos aerobios o facultativos y además se utiliza para almacenar cultivos durante cortos
períodos de tiempo a temperaturas de 4oC, o para la amplificación de un inóculo pequeño.
SIEMBRA EN PLACAS
Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o por mezcla (el inóculo con el
medio de cultivo agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45oC, se mezclan y se vierte en la placa
de Petri, como se explica en detalle más adelante).
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar
condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento
confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas
se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar. En general
cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la
muestra en tubos con suero fisiológico estéril.
2.2. Cultivo en medio semisólido (siembra por picadura o punción)
Se utilizan tubos sin inclinar. Este tipo de medio contiene una proporción menor de agar que los
medios sólidos, y la siembra se lleva a cabo con un ansa en hilo previamente esterilizada con el mechero.
El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo
posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.
En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer
caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura,
detectándose turbidez. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura.
Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que
se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana.
Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro de método de conservación de
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microorganismos facultativos.
2.3. Cultivo en medio líquido
Habitualmente se realiza en tubos o frascos o erlenmeyers. En estos casos, las bocas de los tubos,
erlenmeyers y frascos deben pasarse por la llama (flameado), destaparlos, sembrar con ansa flameada y
enfriada, y luego volverlos a tapar, siempre cerca del mechero. El flameado genera corrientes de
convección que previenen que los contaminantes del aire caigan dentro de los recipientes. El
calentamiento puede también matar los microorganismos que se encuentren en la boca de los
recipientes.
En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto no sirven como técnica
de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una población
microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. En
estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una
película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc.
3. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que contiene varios tipos.
En hábitats naturales raramente encontramos un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo
tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos
de microorganismos presentes. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien separadas (las
colonias se forman a partir de una sola “unidad formadora de colonias”) de las que se conseguirá un
cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características macroscópicas,
microscópicas, fisiológicas, etc. en un microorganismo en particular. Hay que tener en cuenta que siempre
el aislamiento se da en un medio sólido. El medio líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los
microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e
identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se
lleva a cabo un procedimiento que involucra una primera etapa de aumento del número de
microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población (enriquecimiento). Luego
se aisla por el método de estrías o por dilución y se identifica.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
A) Métodos generales
1‐.Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y posterior quemado y dilución)
2‐ Por mezcla.
B) Métodos especiales (calentamiento, agregado de álcali o ácido, por temperatura de incubación,
cambios en el pH y presencia de sales o colorantes). Estos métodos sirven cuando se desea aislar un
microorganismo que posea una característica especial (resistente al calor, anaerobio, etc)
3.1. Métodos generales
Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri
Es la técnica más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el mechero y enfriada
cerca del mismo, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre la superficie
de la placa con el medio agarizado, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar
a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida lo que evitará que el agua de condensación se
deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Mediante estas
técnicas se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de
bacterias.
‐ 15 ‐
FARMACIA
Existen distintos tipos de trazados tendientes a lograr una buena separación entre los gérmenes
sembrados. Se puede sembrar por:
Agotamiento de ansa: Se flamea el ansa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente,
se realizan estrías en dos placas en forma consecutiva sin recargar el ansa.
Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías se extienden sobre un área
pequeña de la superficie de la placa. Se retira el ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en
el interior de la placa se hacen nuevas estrías por otra zona tocando ligeramente la muestra
sembrada anteriormente. Este proceso puede repetirse sucesivamente, flameando y enfriando el
ansa al comienzo de las sucesivas siembras en estría, de acuerdo a la carga inicial de
microorganismos. Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la
placa inoculada, donde se puede estudiar la morfología colonial.
Dilución previa en solución fisiológica o caldo: Se toma la muestra para aislar y se la resuspende en
solución fisiológica o caldo nutritivo, preparando luego diluciones decimales en condiciones asépticas. Se
toman las diluciones y se estría con ellas una placa para cada una. En la dilución adecuada se obtendrán
colonias aisladas.
Extensión en superficie con espátula de Drigalski: Aquí también pueden prepararse diluciones decimales.
Se deposita sobre la superficie de la placa una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de
microorganismos problema y se extiende con ayuda de la espátula, previamente esterilizada por
flameado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.
Depósito y posterior quemado Extensión en superficie con espátula de Drigalski
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FARMACIA
Tras el período de incubación las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la
siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño,
forma, color, textura, etc. Esta técnica de siembra, además de permitir el aislamiento de colonias, permite
el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra
sembrado.
Por mezcla
Esta técnica tiene la ventaja de permitir el cálculo del número de bacterias presentes en la
muestra, si se trabaja con exactitud. En tubos un volumen conocido de distintas diluciones de la muestra,
inocular el medio de cultivo fundido y atemperado aproximadamente a 45oC. El contenido se
homogeneiza por rotación del tubo entre las manos, y luego se lo vierte en una placa de Petri. Tras la
homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se
incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida).
Otra variación de esta técnica consiste en depositar en una placa de Petri vacía un pequeño volumen
conocido de muestra y a continuación añadir el medio de cultivo fundido y atemperado, mezclando por
rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente en el
medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie
tendrán distintas características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se
desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos
que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la
profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque
con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de
microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son facultativos o microaerófilos.
3.2. Métodos Especiales
Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en cuenta que puede
haber gérmenes que poseen idénticos comportamientos frente a un mismo agente físico o químico.
i) Calentamiento: Se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no esporulados. Consiste
en calentar la suspensión a 100oC durante 10 min. y 85oC durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios
sólidos.
‐ 17 ‐
FARMACIA
ii) Agregado de álcali o ácido: Tratamiento de la muestra con algunos de estos agentes ya que existen
microorganismos que los resisten y otros que no.
iii) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas distintas
iv) Cambios en el pH: Existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios con pHs extremos.
v) Presencia de sales o colorantes: Debido a la capacidad de distintos microorganismos de crecer o no en
medios con sales, sustratos, colorantes o antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el fin de
lograr su aislamiento.
3.3. Siembra y aislamiento de microorganismos anaerobios
Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por el contacto con el
oxígeno, una vez que la muestra ingresa al laboratorio debe ser procesada evitando su exposición al
oxígeno atmosférico. Los medios de cultivo sólidos deben ser preparados inmediatamente antes de ser
usadas para evitar una posterior difusión de oxígeno al medio. Por el mismo motivo, los medios líquidos
deben ser regenerados por calentamiento a baño maría durante 10 min.
Los medios de cultivo que se utilizan contienen agentes reductores (convierten el O2 en H2O) como
por ejemplo la cisteína, glutatión, tioglicolato. Algunos son tapados con agentes semisólidos (una capa de
vaselina‐parafina o agar al 0,5%) para evitar el acceso de aire. Otros medios contienen trozos de tejidos,
lo que da una atmósfera reducida.
Métodos para incubar en anaerobiosis
Puede recurrirse al uso de tubos con pirogalol o velas,
pero más frecuentemente suelen usarse jarras anaerobias de las
cuales existen varios tipos (Brewer, Torbal, Gas Pack, etc.).
Generalmente todas ellas se basan en el mismo principio que es
extraer el oxígeno o, mejor dicho, consumirlo. El material de la
jarra suele ser plástico, vidrio o metal. Tiene además, una tapa
que asegura el cierre hermético.
La generación de hidrógeno permite la reducción del
oxígeno y da lugar a la formación de agua. Se utiliza el paladio
como catalizador, el cual es inactivado con el ácido sulfhídrico,
exceso de humedad y otros productos metabólicos volátiles de las
bacterias. Al catalizador se lo puede reactivar en horno de calor
seco a 160‐170 °C durante dos horas.
Como indicador de óxido‐reducción suelen utilizarse tiras de
papel embebidas con azul de metileno, las cuales son incoloras en
estado reducido o azuladas cuando están oxidadas.
Generadores de mezclas gaseosas:
Sobres comerciales de Gas Pack: son de aluminio y contienen dos tabletas: a) Ácido cítrico y
bicarbonato de sodio y b) borhidruro de sodio.
Al hidratarse el sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda H2. Si la jarra funciona bien al cabo de
una hora existe menos del 1% de O2
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FARMACIA
TRABAJO EXPERIMENTAL
Objetivos
Aprender las técnicas básicas que se utilizan para la siembra y el cultivo de microorganismos.
Ejercitarse en las técnicas de aislamiento de microrganismos a partir de muestras complejas.
Familiarizarse con el fundamento y la utilización de distintos medios de cultivo, incluyendo medios
de cultivos selectivos y/o diferenciales
1. Preparación de placas y tubos en condiciones asépticas
La asepsia se refiere a la exclusión continua de microorganismos no deseados. Un requisito fundamental
en el laboratorio de microbiología es trabajar con cultivos puros, para lo cual es primordial el manejo de
técnicas asépticas de manera de asegurar que durante la manipulación de los mismos no se permite el
ingreso de microorganismos contaminantes al cultivo.
Utilización de medios sólidos y semisólidos
Fundir en el microondas el medio de cultivo que ha sido esterilizado previamente en un frasco y, una
vez atemperado (aproximadamente 45oC), homogeneizar y verterlo en placas o tubos estériles en la
proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. Si se han de incorporar
compuestos termolábiles al medio ‐como vitaminas o antibióticos‐ éstos se esterilizarán por filtración y
se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado y atemperado.
Práctica
Preparar los siguientes materiales:
1. Una placa de LB Agar (LBA) por alumno. Volcar en condiciones de esterilidad 20 ml de LBA sobre la
base de una placa de Petri vacía. Tapar y dejar solidificar sobre la mesada.
2. Una placa de Agar Mac Conkey por grupo. Volcar en condiciones de esterilidad 20 ml de Agar Mac
Conkey sobre la base de una placa de Petri vacía. Tapar y dejar solidificar sobre la mesada.
Una vez solidificadas, poner a secar con la tapa entreabierta en el flujo laminar o estufa a 42oC.
3. Preparar un tubo con LBA en pico de flauta. Colocar aproximadamente 4 ml de medio LBA fundido
en un tubo de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar inclinado sobre un soporte (pico de flauta).
4. Preparar un tubo con medio SIM. Colocar aproximadamente 4 ml de medio SIM fundido a un tubo
de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar en posición vertical.
5. Preparar un tubo con caldo Tioglicolato por grupo. Calentar el medio de cultivo previamente
esterilizado en microondas para eliminar el oxígeno residual. Transvasar en las cercanías del
mechero aprox. 10 mL caldo Tioglicolato a un tubo de ensayo estéril y tapar.
Utilización de medios líquidos
El medio líquido previamente esterilizado se trasvasará desde el frasco hacia el tubo en las
proximidades de la llama de un mechero, utilizando las técnicas descriptas en el Trabajo Práctico 1. Al
igual que con los medios sólidos, los compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán por filtración en forma separada y se añadirán al medio de cultivo luego de la esterilización.
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FARMACIA
Práctica
1. Preparar un tubo con LB por grupo. Transvasar en las cercanías del mechero aprox. 3 mL de LB a
un tubo de ensayo esteril y tapar.
2. Siembra de microorganismos
Siembra por depósito y posterior quemado en placa
Con el objetivo de aislar microorganismos sobre una placa de LBA se realizará la siembra de los
microorganismos provistos por el docente, utilizando la técnica de depósito y posterior quemado (ver la
figura ilustrativa a continuación).
‐ 20 ‐
FARMACIA
El tubo con LBA en forma de pico de flauta se utiliza normalmente para el almacenaje y manutención
de cepas de uso corriente en el laboratorio. El mismo se inoculará por punción con hilo y posterior estriado
sobre la superficie del medio.
El caldo Tioglicolato se utiliza para observar la relación con el oxígeno de un microorganismo dado
(aerobio estricto, facultativo, aerotolerante, etc). Por ello, para evitar la difusión de oxígeno dentro del
mismo, el tubo de ensayo no debe ser agitado ni manipulado con brusquedad. Las muestras bacterianas
se sembrarán por punción en este medio.
Para realizar la inoculación por punción se procederá en todos los casos como sigue:
1. Flamear un hilo (ansa recta, ver figura pag. 14). Tener en cuenta que sólo la porción del hilo que
es flameada y llevada a rojo vivo es la que permanece libre de contaminación. Por ello, para evitar
el crecimiento de microorganismos no deseados, sólo esta parte del hilo debe ingresar al tubo.
2. Una vez frío, tomar una colonia aislada de la placa de los microorganismos (provista por los
docentes) en forma estéril.
3. Punzar cuidadosamente en el centro del tubo conteniendo el medio de cultivo sin llegar al fondo
y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción. En el caso
del tubo de LBA en forma de pico de flauta, al completar la punción, realizar además un estriado
sobre el resto de la superficie del medio de cultivo.
4. Tapar el tubo y flamear el hilo.
5. Incubar a 37°C, en posición vertical hasta observar desarrollo de los microorganismos.
Siembra de medio líquido
Para inocular medio de cultivo líquido que se utilizará para propagación del microorganismo (en este
caso tubo de ensayo conteniendo LB) se utilizando un ansa. Tener en cuenta que sólo la porción del ansa
que es flameada y llevada a rojo vivo es la que permanece libre de contaminación. Por ello, para evitar el
crecimiento de microorganismos no deseados, sólo esta parte del ansa debe ingresar al tubo de ensayo.
1. Flamear el ansa.
2. Una vez fría, tomar una colonia aislada de la placa de los microorganismos (provista por los
docentes) en forma estéril.
3. Introducir la punta en el medio cultivo y mover hasta observar el desprendimiento de los
microorganismos.
4. Flamear el ansa.
5. Incubar tapado a 37°C, con agitación (para permitir la oxigenación homogénea del mismo) y hasta
observar desarrollo de los microorganismos.
3. Siembra por dispersión en placa y recuento de microorganismos viables
A partir de una muestra suministrada por el docente y utilizando placa de LBA, se procederá de la
siguiente manera para realizar la siembra por dispersión en placas:
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FARMACIA
a) A partir de la suspensión bacteriana provista, realizar diluciones seriadas hasta un orden de 10‐7
en tubos eppendorf estériles.
b) Sembrar las diluciones 10‐5, 10‐6 y 10‐7 en placas de LBA utilizando espátula de Drigalsky.
c) Incubar una noche a 37oC, observar y hacer el recuento de colonias en la placa que corresponda.
4. Análisis de resistencia a antibióticos por medio de antibiograma
Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un
microorganismo ante distintos compuestos antimicrobianos. Las
distintas especies y cepas microbianas presentan distintos grados de
sensibilidad a estos agentes, de ahí que sea necesario hacer una
evaluación para poder seleccionar el compuesto más apropiado para el
tratamiento de una infección bacteriana.
a) Preparar el inóculo: suspensión del microorganismo al cual se
le determinará la sensibilidad al antibiótico (Bacillus subtilis JH642 o
MC530).
b) Sembrar 100 µl del inóculo de la cepa bacteriana en una placa de LB, utilizando la técnica de
diseminación en superficie con espátula de Drigalsky.
c) Agregar a cada disco de papel 5 µl de distintas concentraciones de Cloranfenicol 40 mg/ml, 5
mg/ml y 2.5 mg/ml, y 10 µl de Kanamicina 10 mg/ml. Luego depositarlos sobre la placa, como se muestra
en la imagen
d) Incubar 16 horas a 37oC y observar el desarrollo de crecimiento.
Durante la incubación el agente difunde desde el papel de filtro al agar: cuanto más se aleja del papel
menor es la concentración del agente. A una cierta distancia del disco se alcanza la concentración
inhibitoria mínima (CIM). Pasado ese punto, el microorganismo puede crecer ya que la concentración del
antimicrobiana no es suficiente para inhibirlo. Se crea por lo tanto una zona de inhibición, y el diámetro
de esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano añadida al disco y a la efectividad
del agente.
Este método se utiliza rutinariamente para determinar la sensibilidad de microorganismos patógenos
frente a distintos antibióticos, y por ende determinar qué medicamente suministrar al paciente que
presenta dicha infección.
‐ 22 ‐
FARMACIA
CUESTIONARIO
1. Defina medio de cultivo.
2. Clasifique el metabolismo de la bacteria Bacillus subtilis según la fuente de energía, el dador
de electrones y la fuente de carbono utilizadas.
3. ¿Con qué objetivo se utilizan los medios de cultivo sólidos y líquidos en un laboratorio de
microbiología?
4. ¿Qué significa que un medio de cultivo sea diferencial? Cite ejemplos
5. ¿Qué debe poseer un medio de cultivo para ser selectivo? Cite ejemplos
6. Si un medio es NO selectivo. ¿Esto quiere decir que el medio es diferencial?
7. ¿Qué diferencia existe entre medios de cultivo complejos y sintéticos?
8. ¿Qué sucedería si uno agrega los antibióticos al medio de cultivo previo al autoclavado del
mismo?
9. ¿Para qué se utiliza el medio de cultivo Mac Conkey? Clasifíquelo de acuerdo a su
composición, selectividad y diferencialidad. Justifique
10. Describa diferentes modos de aislar un microorganismo. ¿Para qué es necesario obtener
colonias aisladas?
11. ¿Qué significa que un microorganismo sea facultativo?
12. ¿Por qué es necesario utilizar una jarra de anaerobiosis para cultivar microorganismos
anaerobios estrictos?
13. ¿Qué diferencia encuentra entre el metabolismo de un anaerobio estricto y un
aerotolerante?
14. ¿Por qué deben realizarse diluciones para realizar el recuento de células viables?
15. ¿Cuándo se realiza un recuento de células viables, qué es lo que se cuenta y qué es lo que se
asume?
16. El antibiograma es una técnica que permite determinar la sensibilidad de un microorganismo
frente a un agente antibiótico. ¿Qué otra técnica podría utilizar para determinar este
parámetro? ¿Qué ventajas/desventajas presenta respecto al antibiograma?
17. En un antibiograma, el antibiótico A genera un halo más grande que el antibiótico B. ¿Esto
significa que el microorganismo es más resistente a A que a B?
‐ 23 ‐
FARMACIA
PROBLEMAS
1. El cloruro de sodio en concentración mayor de 6 % inhibe la mayoría de los gérmenes permitiendo
el crecimiento de Estafilococos. Dado el siguiente medio de cultivo:
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 10 g/l
NaCl 75 g/l
D‐Manitol 10 g/l
Agar 10 g/l
Rojo de fenol 25 mg/l
pH 7,4
A‐ ¿Cómo clasificaría este medio?
B‐ ¿Si hubiera fermentación de azúcar, se produciría algún cambio en el medio?
2. Dados los siguientes medios cuya composición se detallan a continuación:
Medio 1 Medio 2 .
Lactosa 5 g/l Triptona 5 g/l
Sacarosa 5 g/l Extracto de levadura 25 g/l
K2HPO4 2 g/l Glucosa 10 g/l
Eosina 0,4 g/l Agar 15 g/l
Azul de metileno 0,065 g/l pH 7
Agar 15 g/l
pH 7,4
A‐ ¿Qué medio usaría para realizar un recuento de microorganismos totales de un lote de pastillas?
B‐ ¿Qué razones tiene para haber hecho esa elección?
3. Sabiendo que el citrato de sodio y el desoxicolato de sodio inhiben el crecimiento de bacterias Gram
(+) y algunos otros microorganismos, y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella. Dado el
siguiente medio de cultivo:
Peptona 20 g/l
Glucosa 1 g/l
D‐Manitol 2 g/l
Citrato de sodio 5 g/l
Desoxicolato de sodio 5 g/l
K2HPO4 4 g/l
KH2PO4 1,5 g/l
NaCl 5 g/l
pH 7,4
¿Cómo clasificaría a este medio de cultivo? Fundamente su respuesta.
4. Se toma un inóculo de uno de los cultivos puros y se siembra por punción en un tubo que contiene
medio SIM, cuya composición es:
‐ 24 ‐
FARMACIA
Peptona de caseína 20,0 g/l
Peptona de carne 6,6 g/l
Citrato de amonio y Fe(III) 0,2 g/l
Tiosulfato de sodio 0,2 g/l
Agar 3,0 g/l
El medio SIM es:
a‐ Sólido y complejo
b‐ Líquido y sintético
c‐ Semisólido y complejo
d‐ Semisólido y sintético
e‐ Todo lo anterior es cierto
f‐ Nada de lo anterior es cierto
Luego de incubar a 37°C durante 12 horas se observa que el crecimiento se extiende sobre toda la
superficie del medio, pero no hay crecimiento en la punción.
De los resultados obtenidos usted puede deducir que se trata de un microorganismo:
a‐ Anaerobio estricto (movilidad +)
b‐ Facultativo (movilidad ‐)
c‐ Aerobio (movilidad +)
d‐ Todo lo anterior es cierto
e‐ Nada de lo anterior es cierto
5. El agar TCBS (agar‐tiosulfato‐citrato‐sales biliares‐sacarosa) se utiliza para el aislamiento de Vibrio
cholerae. Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato inhiben el crecimiento de
enterobacterias, mientras que la bilis y el colato inhiben a enterococos.
a‐ Dada la composición del medio, indique como lo clasificaría de una manera más completa, y
justifique.
Peptona de caseína 5 g/l
Peptona de carne 5 g/l
Extracto de levadura 5 g/l
Citrato de sodio 10 g/l
Tiosulfato de sodio 10 g/l
Bilis desecada 5 g/l
Colato de sodio 3 g/l
Sacarosa 20 g/l
Cloruro de sodio 10 g/l
Hierro (III) citrato 1 g/l
Azul de bromotimol 0,04 g/l
Azul de timol 0,04 g/l
Agar‐agar 14 g/l
b‐ De acuerdo a los requerimientos de fuente de carbono y energía, señale que clase de
microorganismos podrían cultivarse en el medio TCBS.
‐ 25 ‐
FARMACIA
1‐ Quimioorganoheterótrofo
2‐ Quimiolitoheterótrofo
3‐ Fotoautótrofo
4‐ Fotoheterótrofo
5‐ Todo lo anterior es cierto
6‐ Nada de lo anterior es cierto
6. Señale con una cruz qué tipo de medio de cultivo, de acuerdo a su consistencia, utilizaría para los
siguientes ensayos:
Líquido Semisólido Sólido
‐ Movilidad determinada
macroscópicamente ........... .............. ...........
‐ Obtener cultivos puros ........... .............. ...........
‐ Movilidad determinada
microscópicamente ........... .............. ...........
‐ Recuento de células viables ........... .............. ...........
‐ Realizar una curva de crecimiento ........... .............. ...........
por D.O.
7. Si una cepa de Escherichia coli posee un genotipo met‐ trp‐, dicha cepa:
a‐ Es auxótrofa para metionina y triptofano
b‐ Puede cultivarse en un medio de cultivo mínimo al cual se le adicionó metionina y triptofano.
c‐ Puede cultivarse en medio de cultivo complejo.
d‐ Es incapaz de sintetizar metionina y triptofano.
e‐ Todo lo anterior es cierto.
f‐ Nada de lo anterior es cierto.
8. Se desea obtener un cultivo puro de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis a partir de una mezcla
de microorganismos. ¿Cuál de los siguientes medios utilizaría?
Medio 1 Medio 2
Peptona 20 g/l extracto de levadura 5 g/l
NaCl 5 g/l triptona 10 g/l
Lactosa 10 g/l NaCl 5 g/l
Sales biliares 1,5 g/l agar 20 g/l
Rojo neutro 0,03 g/l
Violeta cristal 0,001 g/l
Agar 20 g/l
Justifique su respuesta. Clasifique ambos medios de cultivo.
9. Dado el siguiente medio de cultivo:
Hidrocloruro de cisteína 0.1 g/l
‐ 26 ‐
FARMACIA
Citrato de sodio 0.3g/l
Dextrosa 0.2 g/l
Fosfato diácido de potasio 1 g/l
Extracto de levadura 0.5 g/l
Cloruro de sodio 5 g/l
Agar 15 g/l
Rojo fenol 0,012 g/l
NH4Cl 1 g/l
pH 6.9
a. Se trata de un medio sintético, sólido, que permite el crecimiento de bacterias Gram (+) y (‐).
b. Se trata de un medio sólido, complejo, que permite el crecimiento de bacterias Gram (+).
c. Es un medio complejo, semisólido, diferencial y selectivo para Gram (+).
d. Es un medio sólido, diferencial, complejo, que impide el crecimiento de bacterias Gram (+).
10. Se desea conocer el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), de un cultivo
de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se realizaron tres diluciones 1:100, y una dilución 1:10.
Se sembraron con espátula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilución, por triplicado. En la tercera
dilución se contaron 50, 55 y 48 colonias, mientras que en la cuarta el recuento arrojó 1, 3 y 3 colonias.
a‐ ¿Qué significado tiene el término UFC/ml?
b‐ ¿Cuál de las dos diluciones se usa para calcular el número de UFC/ml? Justifique.
c‐ Calcule en número de UFC/ml del cultivo original.
d‐ Este método de cuantificación de microorganismos determina:
I. número total de microorganismos.
II. número de microorganismos viables.
III. número de microorganismos muertos.
11. Se necesita cuantificar la carga bacteriana de un polvo medicinal coloreado hidrosoluble. Para ello
disuelve 5 g de polvo en 5 ml agua estéril, logrando disolución completa. A partir de la mezcla inicial realiza
una primera dilución 1/20 y a partir de ella, 4 diluciones seriadas al décimo (1/10) más. Luego inocula, por
triplicado, 0,2 ml de cada una de las diluciones al décimo sobre placas conteniendo medio de cultivo.
Luego de la incubación, los resultados obtenidos fueron:
Número de colonias
Seriada 1 520 480 530
Seriada 2 60 54 62
Seriada 3 3 6 4
Seriada 4 0 1 0
a) Calcule el número de UFC/ml en la disolución inicial del polvo ¿Qué esperaría observar si siembra
la primera dilución, 1:20? Justifique
b) De las siguientes opciones seleccione que medio de cultivo utilizaría en las placas. Justifique su
elección.
i. sintético, sólido y diferencial
ii. complejo, sólido y selectivo
‐ 27 ‐
FARMACIA
iii. complejo y semisólido
iv. complejo, sólido, selectivo y diferencial
v. complejo y sólido
vi. sintético y sólido
vii. sintético y semisólido
12. Ud. cultiva en caldo peptonado una bacteria para la cual la relación con el oxígeno es desconocida.
Luego de 24 hs a 37 oC, saca el cultivo de la estufa sin agitación y observa que el microorganismo creció
a todo lo largo del tubo. Ud. concluye que es:
1. un aerobio obligado
2. un microaerófilo
3. un facultativo
4. un anaerobio obligado.
Justifique
‐ 28 ‐